KR20080107049A

KR20080107049A - 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한화합물을 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20080107049A
Application number: KR1020070054855A
Authority: KR
Inventors: 정상훈; 이은하; 판철호; 김철영; 엄병헌; 이동언; 송대근; 이주영
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2007-06-05
Filing date: 2007-06-05
Publication date: 2008-12-10
Also published as: WO2008150074A2; WO2008150074A3; KR100926454B1

Abstract

본 발명은 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 물, 알코올, 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 옻나무 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물은 당뇨병 합병증의 원인인 소르비톨 축적을 일으키는 알도스 환원효소 억제효과 및 최종당화산물 억제효과를 나타내며, 또한 세포독성이 없는 안정한 물질로 확인되었으므로 당뇨 합병증 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

옻나무, 당뇨병 합병증, 알도스 환원효소 억제효과, 최종당화산물 억제효과

Description

옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물을 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 조성물{The composition comprising the extracts, fractions and the isolated compounds of Rhus verniciflua for prevention and treatment of diabetic complications}

본 발명은 옻나무(Rhus verniciflua) 추출물을 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 물, 알코올, 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않아 혈중 포도당 농도가 높아져 소변에 포도당을 배출하는 질환으로 당뇨병이 인간사회에서 문제가 되는 것은, 그 특유한 합병증 때문이다. 인슐린이 개발되기 전 시대의 당뇨병은 혼수, 감염증 등이 인류의 생명을 위협했으나 현재의 화학 및 생화학의 발전에 힘입어 식사요법, 혈당강하제요법, 인슐린요법 등으로 갑작스런 생명의 위협을 막을 수 있게 되었다. 따라서 현재의 당뇨병 환자에게 장해를 미치는 것은 당뇨병에 특유한 만성합병증, 즉 당뇨병 망막병증(retinopathy), 당뇨병성 신장병증(nephropathy), 신경병증(neuropathy)이 주체가 되었다.

당뇨 합병증의 약 반수 이상이 당뇨병성 망막병증이며 성인 실명의 가장 큰 발병 원인이다. 증세로는 시력장애, 녹내장, 시력상실 등이 있다. 또한, 당뇨병성 신경병증으로 탄수화물 및 지질 중간대사의 이상으로 인해 말초신경장애가 생긴다. 건반사(腱反射)의 저하, 소실, 지각장애, 사지동통 등의 증세가 나타난다. 특히 하지에 야간의 근육통과 같은 증세를 호소하는 일이 있고 발바닥의 작열감(灼熱感), 통각과민 및 촉각둔마 등을 호소하기도 한다. 보통은 좌우대칭성이며 운동장애는 드물다. 그 밖에 자율신경장애로서 동공의 좌우부동, 발한 이상, 음위(陰蔿), 잔뇨감, 배뇨지연, 요폐(尿閉), 변비 및 설사 등을 볼 수 있다. 신장병증 역시 매우 흔하여 당뇨병 합병증의 가장 중요한 사망 원인으로 꼽히고 있다. 당뇨병이 지속하면 전신의 혈관들이 손상을 입으며 이 과정에서 손상된 신장의 혈관은 신장의 주기능인 혈액 여과에 장애를 유발하여, 체내에 과다한 수분 및 독성 물질을 축적시키게 된다. 증세로는 사구체경화증, 단백뇨, 신부전 등이 있다. 신장 합병증은 과다한 알도스 환원효소 또는 산화적 스트레스에 의해 유발되는 것으로 보고되고 있다.

이러한 당뇨합병증을 유발하는 기전으로는 크게 단백질의 비효소적 당화반응(non-enzymatic glycation of protein)과 폴리올 경로(polyol pathway)의 기작 변화에 의한 삼투압 스트레스 및 자유 라디칼에 의한 산화적 스트레스(oxidative stress) 등으로 설명되고 있다.

단백질의 비효소적 당화반응에서는 단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹이 환원당과 효소 작용 없이 축합 및 교차반응 하여 최종당화산물(advanced glycation endproducts, AGEs)을 생성한다. 최종당화산물은 비가역적인 반응 산물이므로, 일단 생성되면 혈당이 정상으로 회복되어도 분해되지 않고 단백질 생존기간 동안 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시킨다(Vinson JA et al., J Nutritinal Biochemistry , 7, 559-663, 1996; Smith PR et al., Eur . J Biochem., 210, 729-739, 1992). 비효소적 단백질 당화반응에 의하여 기저막, 혈장 알부민, 수정체 단백질, 피브린, 콜라겐 등의 단백질에서 당화가 일어나며, 생성된 최종당화산물이 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 당뇨병 망막병증(retinopathy), 당뇨병 백내장(cataract), 당뇨병 신증(nephropathy), 당뇨병 신경병증(neuro pathy) 등의 만성 당뇨합병증을 유발시킨다. 또한, 고혈당 상태에서 최종당화산물이 생성되는 과정에서 지질대사에 이상이 일어나고 동시에 생성되는 유해한 산소 자유라디칼에 대한 방어시스템 기능이 저하되어 산화적 스트레스가 유발된다고 보고된바 있다(Yokozawa T et al., J of Trad . Med., 18, 107-112, 2001). 이처럼 비효소적 당화반응과 산화적 스트레스(oxidative stress) 작용 기전이 서로 연관되어 있다.

폴리올은 알도스(aldose)나 케토스(ketose)로부터 알도스 환원효소(aldose reductase, AR)에 의해 환원된 알코올을 의미한다. 일반적으로 정상 혈당에서는 대부분의 세포내 글루코즈(glucose)는 헥소키나아제(hexokinase)에 의해 글루코즈-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)로 인산화(phosphorylation) 되고, 인산화되지 않은 소량(약 3%)의 글루코즈(glucose)가 소위, 폴리올 경로(polyol pathway)를 거치게 된다. 폴리올 경로(Polyol pathway)에는 알도스 리덕타아제(aldose reductase ,AR)와 솔비톨 디하이드로제나아제(sorbitol dehydrogenase, SDH)의 두 효소가 관여한다. 이 효소들은 사람의 조직 중 특히 신경(peripheral nerves), 망막(reti na), 각막(cornea), 홍채(iris), 렌즈(lens), 신장(kidneys), 적혈구(erythrocyte) 세포 등에 분포하며 글루코즈(glucose)를 흡입(uptake)시 인슐린 없이 확산에 의해 세포내로 유입된다. 이들 세포 내부의 글루코즈(glucose) 농도가 높게 되면, 기질의 농도에 강하게 의존하는 폴리올 경로(polyol pathway)의 특성에 의해 글루코즈(glucose)를 솔비톨(sorbitol)로 환원하는 율속효소인 알도스 환원효소(aldose reductase, AR)의 활성이 증가하고 이에 따라 그 산물인 솔비톨(sorbitol)과 프럭토오즈(fructose)의 세포 내 축적이 일어나, 이러한 폴리올의 축적으로 병원성 삼투압(pathogenic osmority)에 의해 세포의 미오이노시톨(myoinositol, MI)의 흡입(uptake)이 줄고, 이로 인한 Na+, K+/ATPase 활성이 감소하는 등 결과적으로 운동신경 전달속도(motor nerve conduction velocity, MNCV)가 감소하여 신경증과 같은 당뇨성 합병증이 유발되는 것으로 알려져 있다. 이중, 신장 합병증은 매우 흔하여 당뇨병 합병증의 가장 중요한 사망 원인으로 꼽히고 있다. 또한 당뇨병 환자는 정상인에 비해 신부전증의 위험이 약 20배 높은 것으로 확인되고 있다. 신장 합병증 치료제로 알도스 환원효소 억제제인 AS-3201, 톨레스 타트(Tolrestat), 포날레스타트(Ponalrestrat) 및 에팔레스타트(Epalrestat)가 개발되어 있으나, 이들의 치료효과에 대한 연구는 여전히 진행 중에 있다.

이 밖에도, 당뇨병 합병증 치료제를 개발하기 위한 일환으로 알도스 환원효소 억제활성을 보이면서, 동시에 항 당뇨, 항산화성 및 혈당강하 효능을 가진 천연물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

일단 당뇨병이 발생하여 혈당이 금방 떨어지지 않으면 당뇨합병증 예방제를 복용하여 당뇨합병증을 예방하여야 한다. 현재, 단백질 당화 억제제로 유일한 합성제제인 아미노구아니딘 HCl(aminoguanidine HCl)은 친핵성 히드라진(hydrazine)으로 축합반응의 산물과 결합하여 단백질과의 교차결합을 방지함으로써 최종당화산물의 생성을 억제하여 합병증으로 진전되는 것을 지연 또는 방지한다(Brownlee M et al., Sciences, 232, 1629-1632, 1986; Edelstein D et al., Diabetes, 41, 26-29, 1992). 아미노구아니딘 HCl은 당뇨합병증의 예방 및 치료에 가장 유망한 합성 의약품으로 제 3상 임상실험까지 진행되었으나, 장기간 투여 시 독성이 유발되는 문제점이 있어 보다 안전한 약제의 개발이 요망되고 있다.

한편, 옻나무(Rhus verniciflua)는 옻나무과(Anacardiaceae)에 속하는 낙엽 활엽수 교목으로 아열대 또는 열대에 분포하는 60속 400종의 나무가 있고, 이중 한국에는 옻나무, 개옻나무, 붉나무 등 5종이 서식하고 있다. 수액은 옻 또는 건칠이라 하여 공업용과 약용에 쓰이며, 특히 한방과 민간에서 인체의 기혈 순환을 촉진하는 효과, 강장 효과, 통경, 진해 등에 약재로 쓰이고 옻닭과 같이 전통식품으로 이용되어 왔다. 옻나무 추출물에 대한 생리활성에 대한 연구가 일부 보고된 바 있 으며, 옻나무에서 분리된 물질들에 대한 항균 작용, 플라보노이드 성분과 수액의 우루시올 성분에 대한 항산화작용, 항암작용이 보고되었다.

그러나 알도스 환원효소 및 최종당화산물을 억제함으로써 당뇨병 합병증 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 옻나무 추출물을 함유하는 조성물에 관한 보고는 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 종래의 치료제들의 부작용 등의 문제점을 극복하고자 천연물에서 알도스 환원효소 및 최종당화산물 억제제를 검색하던 중, 옻나무 추출물 및 분획물이 당뇨병 합병증에 대한 알도스 환원효소 및 최종당화산물에 대한 억제효과를 나타내어 당뇨병 합병증 예방 또는 치료제로 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 폴리올 경로의 기작변화 및 비효소적 당화반응에 의해 유발되는 당뇨병 합병증을 예방 및 치료하기 위하여 알도스 환원효소 및 최종당화산물의 억제에 효과적으로 사용될 수 있는 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출된 옻나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 옻나무 추출물을 n-헥산, 염화메틸렌, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 순으로 추출하여 각 단계에서 얻은 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 부테인 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출된 옻나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 옻나무 추출물을 n-헥산, 염화메틸렌, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 순으로 추출하여 각 단계에서 얻은 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 부테인 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 유효성분인 옻나무 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물은 하기의 단계들을 포함하는 분리정제 방법에 의해 제조된다.

1) 건조한 옻나무를 추출용매로 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 옻나무의 추출물을 여과 및 농축하는 단계;

3) 단계 2)의 농축물을 유기용매로 용해시키는 단계;

4) 단계 3)의 용해물을 분획하여 분획물을 수득하는 단계;

5) 단계 4)의 분획물을 유기용매로 용해시키는 단계; 및

6) 단계 5)의 용해물을 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 활성 화합물을 수득하는 단계,

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 옻나무는 뿌리, 줄기, 잎이 모두 사용가능하나 옻나무 줄기의 껍질이 가장 바람직하며, 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 한다. 상기 알코올로는 C₁ 내지 C₄ 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출시 에탄올 수용액을 건조된 옻나무 분량에 5 내지 15배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 10배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 에탄올 수용액을 가한 후 환류 냉각하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출시 물중탕의 물의 온도 60 ~ 100℃인 것이 바람직하며, 80℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 2 ~ 6 시간이 바람직하며, 4 시간이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 방법에 의하여 옻나무를 추출, 여과한 뒤 여과액을 농축 및 동결건조 하여 옻나무 추출물을 수득하였 다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 3)의 유기용매는 n-헥산, 염화메틸렌, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 순으로 가하는 것이 바람직하다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 4)의 분획물은 분별깔때기를 이용하여 분획하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 각 유기용매 층의 분획물을 모두 이용하는 것이 바람직하며, 아세테이트 층의 분획물을 이용하는 것이 가장 바람직하다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 5)의 유기용매는 디클로로메탄-메탄올(CH₂Cl₂ -MeOH) 또는 헥산-에틸아세테이트(Hexane-EtOAc)인 것이 바람직하며, 역상크로마토그래피로 실시할 경우에는 물-아세토니트릴(H₂O-Acetonitrile)도 가능하다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 6)의 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성화합물을 분리 및 정제할 수 있다. 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 6)에 의해 활성 화합물로 분리된 화합물은 부테인(butein, 2',3,4, 4'-Tetrahydroxychalcone)이었으며, 본 발명의 실시예에서는 기기분석을 통해 부테인의 구조를 결정하였다(화학식 1 참조).

본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제를 제공한다.

본 발명의 실시예에서는 옻나무 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 부테인이 알도스 환원효소 억제에 나타내는 효과를 알아보기 위하여, 흰쥐의 수정체의 효소 침전물을 대상으로 하는 실험을 수행하였다. 또한, 최종당화산물에 대한 효과를 측정하기 위하여 비효소적 보빈세럼 알부민(Bovine serum albumin)과 글루코즈(glucose)의 교차결합으로 이루어지는 부산물을 형광분석기로 측정하였다. 구체적으로 흰쥐의 수정체를 적출하여 알도스 환원효소원을 준비하고, 준비한 알도스 환원효소원에 각각 옻나무 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 부테인을 가한 후, DL-글리세르알데하이드를 기질로 반응시켜 340nm에서의 NADPH 흡 광도 감소율을 측정하였다. 최종당화산물은 단백질원으로 보빈 세럼 알부민(Bovine serum albumin)과 당원으로 글루코즈(glucose)를 사용하여 2일간 60℃에서 반응시키고 여기(勵起, excitation) 파장은 360nm, 방출(emission)파장은 440nm에서 형광분석기로 측정하였다. 그 결과, 상기 옻나무의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 부테인이 모두 알도스 환원효소 및 최종당화산물 억제효과가 있음을 확인하였으며, 여러 유기용매를 순차적으로 가하여 분획한 분획물들 중 에틸아세테이트 층에서 분획한 분획물이 가장 높은 억제효과가 있음을 확인하였다(표 1, 2, 3 참조).

따라서, 본 발명의 옻나무 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 부테인은 폴리올 경로의 기작 변화에 의한 삼투압 스트레스 및 단백질의 비효소적 당화반응에 기인한 당뇨병 합병증의 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.

상기 당뇨병 합병증은 당뇨성 망막 병증, 당뇨성 신경병증 또는 당뇨성 신장병증인 것을 특징으로 한다.

상기 당뇨성 신경병증은 말초 신경장애 또는 자율 신경장애인 것을 특징으로 하며, 상기 당뇨성 신장병증은 사구체 경화증, 단백뇨 또는 신부전인 것을 특징으로 한다(Michael Brownlee, Nature, 414, p813, 2001).

본 발명의 당뇨병 합병증 예방 및 치료제는 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 부테인에서 하나 이상을 선택적으로 함유할 수 있으며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유 할 수 있다.

본 발명의 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 부테인은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 당뇨병 합병증 예방 및 치료제는 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 치료제는 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 치료제의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏이고, 바람직하기로는 0.0001 g ~ 5 g/kg이며, 하루 1~6회 투여될 수 있다.

본 발명의 당뇨병 합병증 예방 및 치료제를 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 2 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단된다. 본 발명의 당뇨병 합병증 예방 및 치료제는 당뇨병 합병증 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 부테인을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 약학적 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람 직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 약학적 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 부테인은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 옻나무 추출물의 제조

<1-1>옻나무의 에탄올 추출물의 제조

건조된 옻나무를 경동시장으로부터 구입하여, 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 옻나무 1.5 kg과 95 % 에탄올 수용액 총 16.0ℓ를 가하여 환류 냉각(물중탕의 물의 온도는 80 ℃) 하였고, 거름종이로 여과하여 추출물을 얻었다. 추출과정은 4 시간씩 4회 반복하였고, 이후 용매를 감압 농축하여 130.0 g의 에탄올 추출물을 수득하였다.

<1-2>옻나무의 물 추출물의 제조

옻나무 1.5 kg과 물 16.0ℓ를 가하여 90 ~ 100 ℃ 사이에서 4 시간씩 2회 반복하였고, 거름종이로 여과하여 추출물을 얻었다. 이후 용매를 감압 농축하여 120.0 g의 물 추출물을 수득하였다.

<1-3>옻나무의 메탄올 추출물의 제조

옻나무 1.5 kg과 메탄올 총 16.0ℓ를 가하여 환류 냉각(물중탕의 물의 온도는 80 ℃)하였고, 거름종이로 여과하여 추출물을 얻었다. 추출과정은 4 시간씩 4회 반복하였고, 이후 용매를 감압 농축하여 128.0 g의 메탄올 추출물을 수득하였다.

< 실시예 2> 옻나무 추출물로부터 분획물 제조

상기 < 실시예 1>에서 제조한 옻나무 추출물을 분별깔때기를 이용하여 n-헥산(34.0g), 염화 메틸렌(13.3g), 에틸 아세테이트(21.9g), n-부탄올(7.5g) 및 물(2 9.9g) 분획물로 계통분획하였다.

< 실시예 3> 분획물로부터 화합물 제조

상기 < 실시예 2>의 에틸 아세테이트 분획물 9 g을 내경 6 cm의 컬럼에서 실리카겔 컬럼크로마토그래피(Kiesel 60, Merck)를 이용하여 전개하였다. 전개용매는 디클로로메탄-메탄올(CH₂Cl₂-MeOH) 농도구배를 이용하였으며, 디클로로메탄 : 메탄 올이 8 : 2의 구배조건에서 용출된 분획을 결정화하였다. 핵자기공명(nuclear magnetic resonance, NMR)으로 구조결정한 결과 이는 부테인인것으로 확인되었으며, 이를 표준품과 비교하여 확인하였다(화학식 1 참조).

< 실험예 1> 옻나무의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물의 알도스 환원효소 억제효과 측정

본 발명자들은 상기 조성물의 알도스 환원효소 억제효과를 측정하기 위하여 흰쥐의 수정체의 효소 침전물을 대상으로 하는 실험을 수행하였다. 먼저, 알도스 환원효소를 수득하기 위하여 흰쥐의 수정체를 적출하여 그 습증량에 따라 일정량의 인산완충액을 가한 후, 수정체를 균질화하였다. 4℃에서 균질액을 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상등액에 암모늄설페이트(ammonium sulphate)를 가하여 최종 농도가 40%가 되도록 하였다. 그 후, 다시 원심분리하여 상등액을 수거한 다음 여기에 암모늄 설페이트를 최종 농도 70%로 가한 후, 한 시간 정도 혼합하였다. 이를 원심분리하여 수득한 침전물을 PBS 완충액에 현탁하여 1일간 투석하여 알도스 환원효소원을 수득하였다. 이후 준비한 알도스 환원효소원에 각각의 분획물을 가하고, DL-글리세르알데하이드를 기질로 반응시켜 340 nm에서의 NADPH 흡광도 감소율을 측정하였다. 대조군은 테트라메틸렌 글루타르산(T3385, Sigma)을 이용하였다. 340nm에서 1분 간격으로 흡광도를 측정하여 7분간 반응하였으며 1분 동안의 흡광도의 변화량을 토대로 하여 계산하였다.

억제율 계산방법: (Δ시료미처리-Δ시료처리)/(Δ시료미처리-Δ기질미처리)×100

그 결과, 표 1 및 표 3에 나타난 바와 같이, 모든 상기 옻나무의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물이 억제효과가 있음을 확인하였으며, < 실시예 2>의 분획물들 중 에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 억제효과가 있음을 확인하였다.

추출물 및 유기용매 분획물 각각의 알도스 환원효소 억제율(%)

조성물		농도(μg/mL)	억제율(%)	IC₅₀(μg/mL)
대조군	TMG	10	96.00	0.02
실시예<1-1>	에탄올 추출물	10	95.65	1.61
실시예<1-2>	물 추출물	10	92.05	2.08
실시예<1-3>	메탄올 추출물	10	93.56	1.70
실시예 2	n-헥산 분획물	10	32.24	-
	염화 메틸렌 분획물	10	86.96	4.47
	에틸아세테이트 분획물	10	99.99	0.56
	n-부탄올 분획물	10	86.96	3.48
	물 분획물	10	16.12	-

IC₅₀ : 알도스 환원효소 50% 억제농도

TMG : 테트라메틸렌 글루타르산(tetramethylene glutaric acid) 대조군

< 실험예 2> 옻나무의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물의 최종당화산물 억제효과 측정

최종당화산물은 단백질원으로 보빈 세럼 알부민(Bovine serum albumin)과 당원으로 글루코즈(glucose)를 사용하여 2일간 60℃에서 반응시키고 여기(excitatio n) 파장은 360nm, 방출(emission)파장은 440nm에서 형광분석기로 측정하였다(표 2 및 표 3참조)(C.-H. Wong, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 11, p5317, 2003). 대조군으로 아미노구아니딘(aminoguanidine)을 사용하였고, 2.5mM농도에서 78.4%의 억제율을 나타내었으며, IC₅₀값은 960μM 이었다.

추출물 및 유기용매 분획물 각각의 최종당화산물 억제율(%)

조성물		농도(μg/mL)	억제율(%)	IC₅₀(μg/mL)
대조군	아미노구아니딘	200	76.0	95.0
실시예<1-1>	에탄올 추출물	200	29.2	-
실시예<1-2>	물 추출물	200	25.0	-
실시예<1-3>	메탄올 추출물	200	26.5	-
실시예 2	n-헥산 분획물	200	40.5	-
	염화 메틸렌 분획물	200	19.0	-
	에틸아세테이트 분획물	200	71.8	135.5
	n-부탄올 분획물	200	12.1	-
	물 분획물	200	-	-

IC₅₀ : 최종당화산물 50% 억제농도

Butein 의 알도스환원효소 및 최종당화산물 억제율(%)

조성물		활성	농도 (μM)	억제율 (%)	IC₅₀(μM)
실시예 2	부테인	알도스환원효소	1	93.0	0.46
실시예 2	부테인	최종당화산물	200	67.55	96.53

< 실험예 3> 옻나무의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물의 세포 독성 검사

상기한 실시예로부터 수득한 옻나무의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물의 활성을 검증하여 세포내 미치는 독성을 확인하기 위하여 공지의 방법(Korba, B, E, et al ., 19, 55-70, 1992)을 이용하여 세포 독성을 하기와 같이 조사하였다.

24-웰 플레이트에 웰당 2 X 10⁴개의 세포를 100 ㎕ 부피로 첨가하고 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음 여러 농도의 옻나무의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물을 3일 동안 세포주에 처리하였다. 배양액을 제거하고 20 ㎕의 염색 용액[테트라졸리움 화합물(tetrazolium compound), 염(inner salt) 및 페나진에톨설페이트(phenazine ethosulfate)]을 분주하고 1시간 동안 배양기에서 반응시켰다. 이후 인산 완충용액으로 2회 세척하여 여분의 염색 용액을 제거하고 20 ㎕의 정착용액[50% 에탄올, 1% 차가운 아세트산(glacial acetic aci d)]을 가하여 30분 동안 교반시켰다. 510 nm에서의 흡광도를 스펙트로포토메터로 측정하였으며 추출물이 첨가되지 않은 음성 대조군 세포의 흡광도와 비교하여 50%의 흡광도 감소를 유발하는 추출물의 농도를 CC₅₀(50% 세포독성 농도 : cytotoxic concentration)으로 결정하였으며, 그 결과 세포독성 농도가 낮은 수치로 나타남을 확인하였다(표 4 참조).

구분	CC₅₀(㎍/㎖)
에탄올 추출물	532
물 추출물	498
메탄올 추출물	512
n-핵산 분획물	454
염화 메틸렌 분획물	412
에틸 아세테이트 분획물	404
n-부탄올 분획물	410
물 분획물	420
부테인	410

< 실험예 4> 옻나무의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물의 경구투여 급성 독성실험

본 발명자들은 옻나무의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성 독성실험을 실시하였다. 옻나무의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물을 각각 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 2 g/kg/15 ㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 실험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상 증상, 체중 변화를 관찰하여 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다.

실험 결과, 실험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학검사, 부검소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다.

그 결과, 랫트에서 2 g/kg까지 독성 변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소 치사량 (LD₅₀)은 2 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

< 제제예 1> : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

옻나무의 추출물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

옻나무의 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

옻나무의 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 환의 제조

옻나무의 추출물 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

5. 과립의 제조

옻나무의 추출물 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

< 제제예 2> : 식품의 제조

본 발명의 옻나무 추출물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 옻나무의 추출물 20~95 중량부로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

본 발명의 옻나무의 추출물 0.2~1.0 중량부를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 옻나무의 추출물 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 옻나무의 추출물 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

본 발명의 옻나무의 추출물 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 옻나무의 추출물 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 옻나무의 추출물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 옻나무의 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

옻나무의 추출물에서 분리한 화합물의 건조분말(3 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

< 제제예 3> : 음료의 제조

1. 건강음료의 제조

옻나무 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

2. 야채쥬스의 제조

본 발명의 옻나무의 추출물 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

3. 과일쥬스의 제조

본 발명의 옻나무의 추출물 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖ 에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

본 발명의 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 알도스 환원효소를 억제함으로써 당뇨병의 합병증으로 흔히 나타나는 신장장해 및 신경손상(신경병증)의 근본적인 발병원인인 소르비톨 축적 억제하고, 비효소적 당화를 억제함으로써 최종당화산물을 억제하며, 독성이 없으므로 당뇨병 합병증 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출된 옻나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
제 1항에 있어서, 상기 옻나무 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
제 2항에 있어서, 상기 유기용매는 n-헥산, 염화메틸렌, 에틸아세테이트 또는 n-부탄올인 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
제 3항에 있어서, 유기용매는 에틸아세테이트인 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
부테인 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
제 5항에 있어서, 상기 부테인은 하기 화학식 1로 표시되는 2',3,4,4'-테트라하이드록시찰콘(etrahydroxychalcone)인 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.

<화학식 1>
제 1항에 있어서, 알코올은 C₁ 내지 C₄ 저급 알코올인 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
제 7항에 있어서, 저급 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
1) 옻나무를 물, 알코올 또는 이의 혼합물을 가하여 추출물을 수득하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 에틸아세테이트 분획물을 디클로로메탄-메탄올(CH₂Cl₂-MeOH) 또는 헥산-에틸아세테이트를 가해서 용해시키는 단계;및

4) 단계 3)의 용해물을 컬럼 크로마토그래피를 통해 부테인을 분리하는 단계를 포함하는 옻나무 추출물로부터 부테인을 정제하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병 합병증은 폴리올 경로(polyol pathway)의 기작 변화에 의한 삼투압 스트레스에 의한 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병 합병증은 단백질의 비효소적 당화반응(non-enzymatic glycation of protein)에 의한 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병 합병증은 당뇨성 망막 병증, 당뇨성 신경병증 또는 당뇨성 신장병증인 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
제 12항에 있어서, 당뇨성 신경병증은 말초신경장애 또는 자율신경장애인 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
제 12항에 있어서, 당뇨성 신장병증은 사구체경화증, 단백뇨 또는 신부전인 것을 특징으로 당뇨병 합병증 예방 및 치료제.
물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출된 옻나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 개선용 건강식품.
제 15항에 있어서, 상기 옻나무 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 개선용 건강식품.
제 16항에 있어서, 상기 유기용매는 n-헥산, 염화메틸렌, 에틸아세테이트 또는 n-부탄올인 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 개선용 건강식품.
제 17항에 있어서, 유기용매는 에틸아세테이트인 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 개선용 건강식품.
부테인 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 개선용 건강식품.
제 19항에 있어서, 상기 부테인은 하기 화학식 1로 표시되는 2',3,4,4'-테트라하이드록시찰콘(etrahydroxychalcone)인 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 개선용 건강식품.

<화학식 1>