CN101664404B - 玉竹二氢高异黄酮提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种玉竹二氢高异黄酮提取物及其制备方法，其中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和大于等于15％；本发明还公开了玉竹二氢高异黄酮提取物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病产品中的用途。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及玉竹二氢高异黄酮提取物及其制备方法，还涉及玉竹二氢高异黄酮提取物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病产品中的用途。
背景技术
糖尿病肾病是常见的糖尿病慢性微血管并发症之一，通常是指由于糖尿病引起的肾小球基底膜增厚，系膜扩张以及胞外基质增生，导致肾小球的高滤过和蛋白尿。早期表现为尿中排出微量白蛋白，继之出现临床蛋白尿，最后进展为慢性肾功能不全，已成为终末期肾衰的主要病因。DN发病与高血糖引起糖代谢异常相关的机制主要有蛋白质非酶糖基化终末产物生成增多、多元醇代谢途径异常和蛋白激酶C激活等。
已有大量证据表明，持续高血糖引起机体多种蛋白质非酶糖基化，由此形成的非酶糖基化终末产物在糖尿病肾病的发病机制中起重要作用，作为糖尿病肾病治疗的新靶点，蛋白质非酶糖基化终末产物抑制剂将成为一类新型的糖尿病肾病治疗药物。
玉竹始载于《神农本草经》，列为上品，源于百合科黄精属植物玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce的干燥根茎，为中国药典2005年版一部所收载。具有养阴润燥，生津止渴之功能，用于肺胃阴伤，燥热咳嗽，咽干口渴，内热消渴。迄今为止，从玉竹中分离鉴定了二氢高异黄酮(Wang Dongmei，等.Natural Product Research，2009，23(6)：580)，甾体皂苷(林厚文，等.药学学报，1994，29(3)：215)，二肽(秦海林，等.中国中药杂志，2004，29(1)：42)等类型化合物。玉竹二氢高异黄酮类化合物有促进乳腺癌细胞凋亡(Rafi MohamedM.，等.Food Chemistry，2007，104，332)和抗菌作用(Wang Dongmei，等.Natural ProductResearch，2009，23(6)：580)。关于玉竹二氢高异黄酮预防和/或治疗糖尿病肾病作用未见报道。
发明内容
本案发明人采用链脲佐菌素诱导实验性糖尿病大鼠模型探讨玉竹乙醇提取物对糖尿病大鼠肾脏保护作用研究中发现，玉竹乙醇提取物降低糖尿病大鼠血中糖化血红蛋白水平和尿白蛋白排泄率，抑制肾皮质蛋白质非酶糖基化终末产物的形成，同时改善肾脏病理病变。进一步采用活性指标指导下的导向分离方法研究玉竹预防和/或治疗糖尿病肾病作用物质基础，首次发现了玉竹二氢高异黄酮类化合物3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮对蛋白质非酶糖基化终末产物的形成具有明显地抑制作用。在此基础上，本案发明人制备了玉竹二氢高异黄酮提取物并发现了玉竹二氢高异黄酮提取物预防和/或治疗糖尿病肾病作用，因而完成了本发明。
本发明提供一种玉竹二氢高异黄酮提取物及其制备方法和用途。
本发明的玉竹二氢高异黄酮提取物，从玉竹根茎中提取。
本发明的玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和大于等于15％，上述成分是由下述式I-III表示的化合物。
本发明提供玉竹二氢高异黄酮提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：
a)玉竹根茎粗粉用第一溶剂回流提取，滤过，提取液合并，提取液减压浓缩；
b)将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
c)用第二溶剂洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
d)用第三溶剂洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩、干燥得玉竹二氢高异黄酮提取物。
在以上步骤中，其中步骤a)的第一溶剂为0～100％乙醇或丙酮水溶液；步骤b)大孔吸附树脂包括非极性或弱极性大孔吸附树脂。步骤c)的第二溶剂为10～50％乙醇水溶液，步骤d)的第三溶剂为60～100％乙醇水溶液。
本发明提供玉竹二氢高异黄酮提取物的制备方法，优选的包括以下步骤：
a)玉竹根茎粗粉加70～90％乙醇水溶液回流提取，滤过，提取液合并，减压回收乙醇；
b)将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
c)用20～40％乙醇水溶液洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
d)用60～80％乙醇水溶液洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，洗脱液液减压浓缩、干燥得玉竹二氢高异黄酮提取物。
本发明的玉竹二氢高异黄酮提取物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病产品中的用途。
本发明采用单次腹腔注射链脲佐菌素建立实验性糖尿病大鼠模型，这是目前国内外比较常用的一种造模方法，可以观察到糖尿病发病到肾脏损害的全过程，接近人类糖尿病肾病的发病情况。结果可见造模80天后大鼠血糖、糖化血红蛋白明显增高，体重明显下降，血清肌酐、尿素氮含量增高，尿蛋白排泄率明显增加，肾指数、肾小球体积明显增大，肾脏病理检查可见，肾小球肥大，肾小球基底膜增厚，系膜区增宽，肾小囊腔呈裂隙状，系膜基质增生，肾小管上皮细胞肥大，肾小管上皮细胞空泡化及颗粒变性，管腔变窄。肾小球囊玻璃滴状病变，位于肾小球毛细血管基底膜和内皮之间形成肾小球毛细血管帽状病变，导致肾小囊粘连，管腔狭窄及扩张。给予玉竹二氢高异黄酮提取物治疗后血清肌酐、尿素氮及尿蛋白排泄率明显降低，病理改变程度明显减轻，肾小球肥大、基底膜增厚，系膜区增宽，系膜基质增生等一系列病变均有不同程度改善，表明玉竹二氢高异黄酮提取物对减轻糖尿病大鼠肾脏病变程度有明显作用。造模80天后大鼠糖化血红蛋白和肾皮质蛋白质非酶糖基化终末产物含量明显增高，表明血糖持续增高后，蛋白质非酶糖基化反应增高；玉竹二氢高异黄酮提取物连续给药后可明显降低肾皮质中蛋白质非酶糖基化终末产物含量，但对血糖及糖化血红蛋白作用不明显，说明其保护作用可能不是通过对糖代谢的调节，而是通过改善高糖所诱导的肾组织中生物活性物质异常代谢实现的；糖化血红蛋白是非酶糖基化早期产物，玉竹二氢高异黄酮提取物明显降低蛋白质非酶糖基化终末产物含量，对血糖和糖化血红蛋白作用不明显，表明其对蛋白质非酶糖基化反应的抑制作用并非依赖于血糖浓度的降低，而是特异性阻断早期蛋白质非酶糖基化产物向蛋白质非酶糖基化终末产物的转化，从而减少蛋白质非酶糖基化终末产物的形成。肾脏免疫组化检测结果显示造模后肾小球囊及肾小管转化生长因子-β1表达均明显增高，玉竹二氢高异黄酮提取物连续给药后对其有明显抑制作用。mRNA及蛋白质印迹结果显示造模后肾皮质转化生长因子-β1表达均明显增高，玉竹二氢高异黄酮提取物对其有降低趋势。上述结果表明玉竹二氢高异黄酮提取物可用于制备预防和/或治疗糖尿病肾病产品，也可以含有玉竹二氢高异黄酮提取物的药物组合物制备预防和/或治疗糖尿病肾病产品中。
本发明玉竹二氢高异黄酮提取物的制备方法工艺简单，操作方便，技术易掌握，能耗小，溶剂可回收循环使用，生产成本低。
本发明玉竹二氢高异黄酮提取物的制备方法优点为其中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和大于等于15％，这是以前技术尚未报道的，由于含量高，从而提高了疗效，满足制备预防和/或治疗糖尿病肾病产品的需要。
本发明玉竹二氢高异黄酮提取物可用于制备预防和/或治疗糖尿病肾病产品优点为作用机制明确，改善高糖所诱导的肾组织中生物活性物质异常代谢，特异性阻断早期蛋白质非酶糖基化产物向蛋白质非酶糖基化终末产物的转化，预防和/或治疗糖尿病肾病。
本发明还提供用本发明的玉竹二氢高异黄酮提取物以及药学上可接受的载体或赋形剂制备的药物制剂。这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂，注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂。
本发明的含有玉竹二氢高异黄酮提取物的药物制剂，在制备药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体来自：抗氧剂、鏊合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、溶剂、缓释材料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙等。
以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。
具体实施方式
实施例1
HPLC法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮含量的方法
色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以甲醇为流动相B，线性梯度洗脱：0min(A 60％，B 40％)→10min(A 40％，B 60％)→30min(A 30％，B 70％)→40min(A 0％，B 100％)；流速：1.0mLmin-1；检测波长为254nm。理论塔板数按3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮峰计算，不低于4000。
溶液的制备
对照品溶液的制备
精密称取3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮对照品适量，加甲醇制成每1mL含3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮12μg、3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮28μg、3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮10μg的溶液。
供试品溶液的制备
取玉竹二氢高异黄酮提取物0.1g，精密称定，加甲醇溶解，转移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取10ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
样品测定方法
精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，按色谱条件进样测定，外标一点法计算玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量。
实施例2
取玉竹根茎粗粉100Kg，加9倍量乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD100大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用50％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物642g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为18.28％。
实施例3
取玉竹根茎粗粉100Kg，加12倍量90％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD200大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用40％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用90％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物895g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为19.37％。
实施例4
取玉竹根茎粗粉100Kg，加8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用80％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物726g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为19.50％。
实施例5
取玉竹根茎粗粉100Kg，加10倍量50％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用20％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物985g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为16.11％。
实施例6
取玉竹根茎粗粉100Kg，加10倍量水回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于D101大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用10％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用60％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物1203g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为15.06％。
实施例7
取玉竹根茎粗粉100Kg，加8倍量90％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于D101大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物780g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为20.19％。
实施例8
取玉竹根茎粗粉100Kg，加10倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用90％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物826g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为19.48％。
实施例9
取玉竹根茎粗粉100Kg，加12倍量70％丙酮回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用90％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物756g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为21.87％。
实施例10
取玉竹根茎粗粉100Kg，加9倍量丙酮回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD100大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用50％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物509g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为21.21％。
实施例11
取玉竹根茎粗粉100Kg，加8倍量90％丙酮回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于D101大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物636g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为23.71％。
实施例12
取玉竹根茎粗粉100Kg，加12倍量90％丙酮回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD200大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用40％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用90％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物777g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为21.26％。
实施例13
取玉竹根茎粗粉100Kg，加8倍量70％丙酮回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用80％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物849g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为18.99％。
实施例14
取玉竹根茎粗粉100Kg，加10倍量50％丙酮回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于AB8大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用20％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物920g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为17.34％。
实施例15
取玉竹根茎粗粉100Kg，加10倍量10％丙酮回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收得提取物。取提取物加水溶解，加于D101大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用10％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用60％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹二氢高异黄酮提取物924g。采用实施例1的方法测定玉竹二氢高异黄酮提取物中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮的含量之和为16.33％。
实施例16
玉竹二氢高异黄酮提取物用药学上可接受的载体或赋形剂制备的药物制剂。这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂，注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂，在制备药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体来自：抗氧剂、鏊合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、溶剂、缓释材料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙。上述制备工艺均为本领域常规操作，在此不加赘述。
实施例17
玉竹二氢高异黄酮提取物为原料制得的药物制剂不仅包括单独使用玉竹二氢高异黄酮提取物的药物制剂，还包括添加玉竹二氢高异黄酮提取物作为活性成分的药物制剂。
实施例18
玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠血糖和糖化血红蛋白的影响
Wistar大鼠禁食12小时后，一次性腹腔注射链脲佐菌素(临用时以0.1mol/L pH 4.5枸橼酸缓冲液配成0.6％浓度)60mg/kg，5天后血糖大于16.7mmol/L的大鼠作为实验性糖尿病模型用于实验，随机均分3组，分别为模型对照组，盐酸氨基胍25mg/kg组，玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组。分组后各组大鼠每天灌胃给药一次，连续80天，正常对照组及模型对照组给予同体积蒸馏水(10ml/kg)。连续给药40和80天，大鼠尾尖采血，测血糖(GLU)含量，连续给药80天测糖化血红蛋白(GHb)含量。结果见表1。
表1玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠血糖和糖化血红蛋白的影响
同模型对照组比较：**P＜0.01，***P＜0.001.
同正常对照组比较，模型对照组大鼠血糖和糖化血红蛋白明显增高。玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组和盐酸氨基胍25mg/kg组同模型对照组比较无明显差异。
实施例19
玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠肾功能的影响
Wistar大鼠禁食12小时后，一次性腹腔注射链脲佐菌素(临用时以0.1mol/L pH 4.5枸橼酸缓冲液配成0.6％浓度)60mg/kg，5天后血糖大于16.7mmol/L的大鼠作为实验性糖尿病模型用于实验，随机均分3组，分别为模型对照组，盐酸氨基胍25mg/kg组，玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组。分组后各组大鼠每天灌胃给药一次，连续80天，正常对照组及模型对照组给予同体积蒸馏水(10ml/kg)。实验结束时苦味酸法测定血清肌酐(Cr)含量，脲酶连续检测法测定血清尿素氮(BUN)含量。实验结束前一天大鼠禁食禁水，代谢笼收集24小时尿液，考马斯亮蓝法测定尿蛋白浓度，根据公式：尿蛋白浓度×24小时尿量计算尿蛋白排泄率。结果见表2。
表2玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠肾功能的影响
同模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.
同正常对照组比较，模型对照组大鼠血清肌酐和尿素氮水平明显增高，尿蛋白排泄率明显增高。玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组和盐酸氨基胍25mg/kg组同模型对照组比较可明显降低血清肌酐和尿素氮含量，同时尿蛋白排泄率明显降低。
实施例20
玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠体重、肾指数、肾小球体积的影响
Wistar大鼠禁食12小时后，一次性腹腔注射链脲佐菌素(临用时以0.1mol/L pH 4.5枸橼酸缓冲液配成0.6％浓度)60mg/kg，5天后血糖大于16.7mmol/L的大鼠作为实验性糖尿病模型用于实验，随机均分3组，分别为模型对照组，盐酸氨基胍25mg/kg组，玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组。分组后各组大鼠每天灌胃给药一次，连续80天，正常对照组及模型对照组给予同体积蒸馏水(10ml/kg)。根据公式肾重量(g)/体重(g)·100计算肾指数。结果见表3。
表3玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠体重、肾指数、肾小球体积的影响
同模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.
同正常对照组比较，模型对照组大鼠体重明显增长明显减慢，肾指数及肾小球体积明显增大。玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组和盐酸氨基胍25mg/kg组同模型对照组比较体重增长明显加快，肾指数明显减小，肾小球体积有明显降低趋势。
实施例21
玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠肾皮质AGEs含量的影响
Wistar大鼠禁食12小时后，一次性腹腔注射链脲佐菌素(临用时以0.1mol/L pH 4.5枸橼酸缓冲液配成0.6％浓度)60mg/kg，5天后血糖大于16.7mmol/L的大鼠作为实验性糖尿病模型用于实验，随机均分3组，分别为模型对照组，盐酸氨基胍25mg/kg组，玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组。分组后各组大鼠每天灌胃给药一次，连续80天，正常对照组及模型对照组给予同体积蒸馏水(10ml/kg)。肾皮质糖基化终末产物AGEs测定：
1)组织处理：参考Soulis-Liparota的方法进行。步骤如下：取适量肾皮质，剪碎，在冷的PBS液中制成匀浆，6500rpm，4℃离心30min；弃上清液，沉淀中加入氯仿-甲醇(2：1)5ml，4℃轻轻搅拌，放置过夜去除脂质；加入甲醇2ml和蒸馏水0.5ml水化，自然沉淀；6500rpm，4℃离心30min，弃上清液；沉淀用甲醇5ml洗涤2次；蒸馏水5ml洗涤3次；沉淀悬浮于含1mg/ml胃蛋白酶的0.5M冰醋酸溶液中，4℃孵育18小时去除非胶原蛋白；6500rpm，4℃离心30min；弃上清液；沉淀用含0.1MCaCl2和0.05％甲苯的0.02Mtris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤2次；加入含IV型胶原酶0.1mg/ml和蛋白酶K0.1mg/ml的0.02M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)2ml，37℃轻轻振荡60h；6500rpm，4℃离心30min，上清液用于AGEs测定。
2)上清液中羟脯氨酸含量以样本碱水解法试剂盒测定。
3)AGEs的荧光测定：取部分胶原提取液以0.1mg/ml的IV型胶原酶和0.1mg/ml蛋白酶K为空白对照，测定胶原相关的荧光(激发波长370nm/发射波长440nm)，以1mg/ml羟脯氨酸的荧光值为一个AFU，其它荧光值与之相比所得之值即为该样品的荧光单位。最终结果用AFU/mg胶原蛋白(AFU/mg coll)表示。结果见表4。
表4玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠肾皮质AGEs含量的影响
同模型对照组比较：**P＜0.01.
同正常对照组比较，模型对照组大鼠肾皮质AGEs含量明显增加。玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组和盐酸氨基胍25mg/kg组同模型对照组比较可使大鼠肾皮质增高的AGEs含量明显降低。
实施例22
玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠肾脏TGFβ1表达的影响Wistar大鼠禁食12小时后，一次性腹腔注射链脲佐菌素(临用时以0.1mol/L pH 4.5枸橼酸缓冲液配成0.6％浓度)60mg/kg，5天后血糖大于16.7mmol/L的大鼠作为实验性糖尿病模型用于实验，随机均分3组，分别为模型对照组，盐酸氨基胍25mg/kg组，玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组。分组后各组大鼠每天灌胃给药一次，连续80天，正常对照组及模型对照组给予同体积蒸馏水(10ml/kg)。分别进行免疫组化染色肾组织TGF-β1表达测定，蛋白质印迹杂交(Western blot)肾皮质TGF-β1表达测定和逆转录多聚酶连反应(RT-PCR)肾皮质TGF-β1表达测定，结果见表5-7。
表5免疫组化染色半定量分析
玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠肾脏TGFβ1表达的影响
同模型对照组比较：***P＜0.001.
模型组对照组阳性表达为皮髓交界处肾小球毛细血管袢周边部及肾小囊脏层上皮细胞(足细胞)，在细胞胞浆内出现棕黄色颗粒，与肾脏损害，足细胞空泡变性、足突融合有关且染色明显高于背景的细胞为阳性细胞。部分区域肾小管上皮细胞及肾间质，亦见相似表达，尤其在靠近肾盏的髓质部。玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组和盐酸氨基胍25mg/kg组同模型对照组比较，在肾小球囊阳性表达普遍较弱，并呈节段性深浅不一，光镜检查可见不连续性中弱阳性表达。部分病例出现单一细胞表达，且染色较深，说明个别肾小球局灶节段性硬化，足细胞增生。在髓质部肾小管区，阳性表达较为弥散，着色强度亦普遍较弱。综合评分结果可见，模型对照组同正常对照组比较肾小球囊和肾小管染色强度明显增强，玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组和盐酸氨基胍25mg/kg组同模型对照组比较大鼠肾小球囊及肾小管染色程度明显减轻，且低于正常对照组。
表6蛋白质印迹杂交测定
玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠肾皮质TGFβ1mRNA表达的影响
同模型对照组比较：**P＜0.01.
模型对照组同正常对照组比较mRNA表达有所增高。盐酸氨基胍25mg/kg组同模型对照组比较mRNA表达明显降低，玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组同模型对照组比较mRAN表达有降低趋势，同正常对照组接近。
表7逆转录多聚酶连反应(RT-PCR)检测
玉竹二氢高异黄酮提取物对实验性糖尿病模型大鼠肾皮质TGFβ1蛋白表达的影响
同模型对照组比较：*P＜0.05.
模型对照组同正常对照组比较肾皮质TGFβ1蛋白表达有所增高。盐酸氨基胍25mg/kg组同模型对照组比较肾皮质TGFβ1蛋白表达明显降低，玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组同模型组比较肾皮质TGFβ1蛋白表达有降低趋势，同正常对照组接近。
实施例23
Wistar大鼠禁食12小时后，一次性腹腔注射链脲佐菌素(临用时以0.1mol/L pH 4.5枸橼酸缓冲液配成0.6％浓度)60mg/kg，5天后血糖大于16.7mmol/L的大鼠作为实验性糖尿病模型用于实验，随机均分3组，分别为模型对照组，盐酸氨基胍25mg/kg组，玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组。分组后各组大鼠每天灌胃给药一次，连续80天，正常对照组及模型对照组给予同体积蒸馏水(10ml/kg)。肾脏以10％中性甲醛固定，石蜡包埋标本切成4μm切片，烤片30min，二甲苯脱蜡，经梯度酒精至水洗，苏木素染细胞核，清水冲洗，盐酸酒精分化，氨水返蓝。清水浸泡5min，伊红染细胞浆，梯度酒精脱伊红，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜观察，用点计数法测量肾小球截面积[A]，每个肾脏至少测量30个肾小球，按V＝β/K×[A]3/2，式中β＝1.38，K＝1.10。
正常对照组肾小球结构基本正常，少数动物出现肾小球肥大，即血管球直径增大，肾小囊狭窄，考虑为肥胖导致的损害，模型对照组，部分动物(3/8)肾小球毛细血管袢肥大，肾小囊腔呈裂隙状，基底膜轻度增厚，系膜轻度增生，肾小管上皮细胞空泡化及颗粒变性；部分动物(3/8)肾小球毛细血管基底膜弥漫增厚，系膜基质增生，少量系膜细胞增生，形成弥漫性糖尿病肾小球硬化症，部分可见KW结节形成，形成结节性糖尿病肾小球硬化症；部分病例(2/8)可见肾小球囊玻璃滴状病变，位于肾小球毛细血管基底膜和内皮之间形成肾小球毛细血管帽状病变，导致肾小囊粘连，管腔狭窄及扩张。玉竹二氢高异黄酮提取物40mg/kg组和盐酸氨基胍25mg/kg组同模型对照组比较上述病理改变程度均明显减轻，2/8动物肾小球结构趋于正常，3/8动物出现肾小球肥大，血管球直径增大，肾小囊狭窄，盐酸氨基胍组2/8动物肾小球毛细血管袢肥大，肾小囊腔呈裂隙状，基底膜轻度增厚，系膜轻度增生，1/8动物肾小球毛细血管基底膜弥漫增厚，系膜基质增生，少量系膜细胞增生，形成弥漫性糖尿病肾小球硬化症；玉竹二氢高异黄酮提取物组较盐酸氨基胍组略重。
Claims (5)
1.玉竹二氢高异黄酮提取物，其特征在于从玉竹根茎中提取，其中3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮(I)，3-(4’-羟苯甲基)-5，7-二羟基-6，8-二甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮(II)和3-(4’-甲氧苯甲基)-5，7-二羟基-6-甲基-8-氧甲基-苯丙二氢吡喃-4-酮(III)的含量之和大于等于15％，上述成分是由下述式I-III表示的化合物。
2.权利要求1所述的玉竹二氢高异黄酮提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a)玉竹根茎粗粉用0～100％乙醇或丙酮水溶液回流提取，滤过，提取液合并，提取液减压浓缩；
b)将步骤a)获得的提取物加水溶解，经非极性或弱极性大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
c)用10～50％乙醇水溶液至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
d)用60～100％乙醇水溶液洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩、干燥得玉竹二氢高异黄酮提取物。
3.根据权利要求2所述的玉竹二氢高异黄酮提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a)玉竹根茎粗粉加70～90％乙醇水溶液回流提取，滤过，提取液合并，减压回收乙醇；
b)将步骤a)获得的提取物加水溶解，经非极性或弱极性大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
c)用20～40％乙醇水溶液洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
d)用60～80％乙醇水溶液洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，洗脱液液减压浓缩、干燥得玉竹二氢高异黄酮提取物。
4.权利要求1所述的玉竹二氢高异黄酮提取物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病产品中的用途。
5.含有权利要求1所述的玉竹二氢高异黄酮提取物的药物组合物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病产品中的用途。
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