CN114957181A - 一种高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物的方法，属于中药有效成分的高效制备技术领域，包括(1)鲜黄精药材经乙醇加热回流提取，得黄精乙醇粗提物；(2)采用AB‑8大孔树脂柱色谱法对黄精乙醇粗提物进行样品前处理，得黄精中等极性成分富集粗品；(3)将黄精中等极性成分富集粗品采用聚酰胺柱色谱法进行黄酮类成分的富集，采用不同洗脱液进行洗脱，收集各洗脱部位，回收溶剂，分析后得黄精中高异黄酮类粗提物；(4)对黄精中高异黄酮类粗提物，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到6种高异黄酮类化合物。本方法效率高，操作简单，制备量大，综合成本低，具有很好的推广使用价值。
Description
技术领域
本发明属于中药有效成分的高效制备技术领域，具体涉及一种高速逆流色谱分离纯化黄精中具有抗炎活性的六种高异黄酮的方法。
背景技术
黄精(Polygonti Rhizome)为百合科黄精属(Polygonti Mill.)的多年生草本植物。2020版《中华人民共和国药典》中记载滇黄精Polygonatumkingianum Coll,et Hemsl.、黄精Polygonatumsibiricum Red.或多花黄精Polygonatumcyrtonema Hua的干燥根茎统称为黄精，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效，是一种药食两用药材。黄精的化学成分研究报道黄酮类、皂苷类、多糖类成分为其主要活性成分，其中黄酮类成分主要为高异黄酮类，高异黄酮的母核结构比异黄酮多一个碳原子，高异黄酮类化合物在自然界中发现的不多，是黄精属植物的特征性成分，但目前对黄精中高异黄酮类化合物的研究报道较少，且对该类成分的分离多采用常规硅胶柱色谱法、高压制备柱色谱法等，但柱色谱法的缺点在于化合物的分离周期较长，且柱色谱所用填料通常与高异黄酮类化合物发生反应，使成分发生死吸附或者结构发生改变。
高速逆流色谱(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)是一种液-液分配色谱分离技术，在高速旋转的螺旋管内两相溶剂体系建立一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相溶剂系统作为固定相，另一相溶剂系统作为流动相，是一种连续高效的色谱分离技术。高速逆流色谱的特点在于不采用固体支撑体作固定相，避免了不可逆吸附所导致的样品死吸附、结构变化等，且样品回收率高，还可根据目标化合物的性质进行溶剂系统的筛选，是一种适用于天然产物研究的现代分离技术，具有目的性强、制备量大、高效快速等优点，在生化、生物工程、医药、天然产物化学、环境分析、食品、材料等领域得到了广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物的方法，从而克服现有技术的不足，提供一种操作简单，产品纯度高，样品损失量小的高效快速方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物的方法，步骤如下：
(1)黄精提取物的制备：取鲜黄精药材切片晒干，粉碎，乙醇加热回流提取，得黄精乙醇粗提物；
(2)将步骤(1)中得到的黄精乙醇粗提物溶于水，采用AB-8大孔树脂柱色谱法进行样品前处理，去除多糖类成分，得黄精中等极性成分富集粗品；
(3)黄精中高异黄酮类粗提物的制备：将步骤(2)中所得黄精中等极性成分富集粗品采用聚酰胺柱色谱法进行黄酮类成分的富集，采用不同洗脱液进行洗脱，收集各洗脱部位，回收溶剂，分析后得黄精中高异黄酮类粗提物；
(4)黄精中高异黄酮单体成分的分离：针对步骤(3)中黄精中高异黄酮类粗提物，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到6种高异黄酮类化合物。
第二方面，上述高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物，为disporopsin，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮(5,7-dihydroxy-8-methyl-3-(2′,4′-dihydroxybenzyl)chroman-4-one)，5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)色原-4-酮(5,7-dihydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman-4-one)，4′-demethyleucomin，brevifolin，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮(myricitrin2″-O-gallate)。
第三方面，上述高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物的方法得到的高异黄酮类化合物在制备抗炎药物中的应用，尤其是5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮(2)，4′-demethyleucomin(4)，brevifolin(5)，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮(6)，具有较好的抗炎活性，具有良好的抗炎药用前景。
本发明的有益效果：
本发明中的黄精提取物，经大孔树脂柱色谱和聚酰胺柱色谱法预处理后采用高速逆流色谱分离后得到各单体成分经HPLC进行纯度检测，可得到95％以上的纯品disporopsin(1)，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮(2)，5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)色原-4-酮(3)，4′-demethyleucomin(4)，brevifolin(5)，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮(6)。
本发明的高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物的方法适用于从黄精中快速纯化制备出高纯度的6种高异黄酮类化合物，操作简便，稳定性好。其中，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮(2)，4′-demethyleucomin(4)，brevifolin(5)，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮(6)具有较好的抗炎活性，具有良好的抗炎药用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中高速逆流色谱分离纯化聚酰胺柱色谱60％乙醇-水洗脱部位高异黄酮类成分的色谱图；
图2为本发明实施例中高速逆流色谱分离纯化聚酰胺柱色谱70％乙醇-水洗脱部位高异黄酮类成分的色谱图；
图3为本发明实施例中黄精聚酰胺柱色谱60％乙醇-水洗脱部位的高效液相色谱图；
图4为本发明实施例中黄精聚酰胺柱色谱70％乙醇-水洗脱部位的高效液相色谱图；
图5为本发明实施例中分离纯化得到disporopsin(1)，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮(2)，5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)色原-4-酮(3)，4′-demethyleucomin(4)，brevifolin(5)，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮(6)的结构式。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于现有对黄精中高异黄酮类化合物的研究报道较少，且传统的从黄精中提取高异黄酮类化合物存在的分离周期长以及填料与高异黄酮类化合物发生反应，影响高异黄酮类化合物的提取，本发明提出了一种高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物的方法。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物的方法，包括如下步骤：
(1)黄精提取物的制备：取鲜黄精药材切片晒干，粉碎，乙醇加热回流提取，得黄精乙醇粗提物；
(2)将步骤(1)中得到的黄精乙醇粗提物溶于水，采用AB-8大孔树脂柱色谱法进行样品前处理，去除多糖类成分，得黄精中等极性成分富集粗品；
(3)黄精中高异黄酮类粗提物的制备：将步骤(2)中所得黄精中等极性分富集粗品采用聚酰胺柱色谱法进行黄酮类成分的富集，采用不同洗脱液进行洗脱，收集各洗脱部位，回收溶剂，分析后得黄精中高异黄酮类粗提物；
(4)黄精中高异黄酮单体成分的分离：针对步骤(3)中黄精中高异黄酮类粗提物，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到6种高异黄酮类化合物。
该实施方式的一些实施例中，步骤(1)中，所述乙醇加热回流提取具体为：乙醇加热回流提取多次，合并滤液，减压旋蒸，得黄精乙醇粗提物。
采用乙醇进行加热回流，可以将黄精中的活性成分尽可能多的提取出来。
优选的，所述乙醇为体积比为60％～80％的乙醇，进一步优选为70％乙醇。
优选的，乙醇加热回流提取中，固液比为1：2，提取三次，时间分别为2h，1h，1h。采用此条件的加热回流提取操作，可以尽可能多的获得黄精中的活性成分，尤其是高异黄酮类化合物。
该实施方式的一些实施例中，步骤(2)中，所述采用AB-8大孔树脂柱色谱法进行样品前处理具体为：分别使用水、90％乙醇-水进行洗脱，收集90％乙醇-水洗脱部位，回收溶剂，得黄精中等极性成分富集粗品。
该实施方式的一些实施例中，步骤(3)中，所述采用不同洗脱液进行洗脱具体为：分别采用20％乙醇-水、50％乙醇-水、60％乙醇-水、70％乙醇-水、90％乙醇-水进行洗脱。
该实施方式的一些实施例中，步骤(3)中，所述分析后得黄精中高异黄酮类粗提物具体为：采用HPLC对各部位进行分析，通过高异黄酮的特征紫外吸收明确高异黄酮类成分富集的洗脱部位。
优选的，高异黄酮的特征紫外吸收明确高异黄酮类成分富集于60％乙醇-水和70％乙醇-水洗脱部位。
进一步优选的，针对60％乙醇-水洗脱部位得到的高异黄酮类粗提物，溶剂系统为体积比为4:5:4:5的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率66.4％，紫外检测器检测波长280nm，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到3种高异黄酮类化合物，经NMR确证，结构分别为disporopsin，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮，5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)色原-4-酮。
进一步优选的，针对70％乙醇-水洗脱部位得到的高异黄酮类粗提物，溶剂系统为体积比为5:5:5:5的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率62.5％，紫外检测器检测波长280nm，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到3种高异黄酮类化合物，经NMR确证，结构分别为4′-demethyleucomin，brevifolin，myricitrin 2″-O-gallate。
本发明的另一种典型实施方式，提供上述高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物的方法得到的高异黄酮类化合物。
本发明的第三种典型实施方式，提供上述高异黄酮类化合物在制备抗炎药物中的应用，优选的，所述高异黄酮类化合物为5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮，4′-demethyleucomin，brevifolin，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物
(1)黄精提取物的制备：取鲜黄精药材2Kg切片晒干，粉碎至20-40目，70％乙醇加热回流提取，固液比为1:2，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，得黄精乙醇粗提物(100g)。
(2)采用大孔树脂柱色谱法对所得黄精乙醇粗提物进行前处理，除去多糖等高极性成分：
将所得100g黄精乙醇提取物溶于水，采用AB-8大孔树脂填料1000g置于玻璃色谱柱中，分别使用水、90％乙醇-水进行洗脱，每种溶剂洗脱体积为5L，收集90％乙醇-水洗脱部位，回收溶剂，得黄精中极性成分的富集粗品(28g)。
(3)黄精中高异黄酮类粗提物的制备：应用聚酰胺树脂柱色谱法对所得黄精中等极性成分的富集粗品进行前处理，富集目标高异黄酮类成分：
将步骤(2)中所得黄精中等极性成分的富集粗品溶于水，采用聚酰胺树脂填料500g置于玻璃色谱柱中，分别使用水、20％乙醇-水、50％乙醇-水、60％乙醇-水、70％乙醇-水、90％乙醇-水进行洗脱，首先采用水洗脱至流出液无色，随后每种梯度乙醇溶剂洗脱体积为2.5L，收集各个梯度溶剂洗脱部位，回收溶剂，得到不同极性黄精成分；
采用HPLC对20％乙醇-水、50％乙醇-水、60％乙醇-水、70％乙醇-水、90％乙醇-水部位进行分析，通过高异黄酮的特征紫外吸收明确高异黄酮类成分富集于60％乙醇-水和70％乙醇-水洗脱部位。
(4)黄精中高异黄酮单体成分的分离：
应用高速逆流色谱对所得60％乙醇-水高异黄酮类成分富集部位进行3个高异黄酮类成分的分离纯化：
针对所得60％乙醇-水洗脱部位高异黄酮类成分，溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4:5:4:5,v/v)，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率66.4％，紫外检测器检测波长280nm，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到3种高异黄酮类化合物；
经NMR确证，结构分别为disporopsin，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮，5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)色原-4-酮；
具体的操作步骤是：按溶剂系统石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4:5:4:5,v/v)溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，平衡后得到上下两相溶剂系统，上相作为固定相，下相作为流动相，取5mL上相和5mL下相，将0.25g黄精60％乙醇-水洗脱部位溶解于其中作为样品溶液。采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，首先将固定相用泵以30mL/min的流速泵入色谱柱，待有上相流出后，使色谱柱正转，转速设置为800rpm；待转速达到800rpm后，以2.0mL/min的流速泵入流动相，直至下相流出，设置紫外检测器波长为280nm，将配好的样品溶液注入进样阀，由load变为inject，使样品进入高速逆流色谱仪。然后根据紫外光谱图(图1)接收目标成分，得3种高异黄酮类化合物。
应用高速逆流色谱对所得70％乙醇-水高异黄酮类成分富集部位进行3个高异黄酮类成分的分离纯化：
针对所得70％乙醇-水洗脱部位高异黄酮类成分，溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:5:5,v/v)，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率62.5％，紫外检测器检测波长280nm，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到3种高异黄酮类化合物；
经NMR确证，结构分别为4′-demethyleucomin，brevifolin，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮；
具体的操作步骤是：按溶剂系统石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:5:5,v/v)溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，平衡后得到上下两相溶剂系统，上相作为固定相，下相作为流动相，取5mL上相和5mL下相，将0.25g黄精70％乙醇-水洗脱部位溶解于其中作为样品溶液。采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，首先将固定相用泵以30mL/min的流速泵入色谱柱，待有上相流出后，使色谱柱正转，转速设置为800rpm。待转速达到800rpm后，以2.0mL/min的流速泵入流动相，直至下相流出，设置紫外检测器波长为280nm，将配好的样品溶液注入进样阀，由load变为inject，使样品进入高速逆流色谱仪。然后根据紫外光谱图(图2)接收目标成分，得3个高异黄酮类成分(4-6)。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters-C18(250×4.6mm,5μm)，紫外检测波长280nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用乙腈(A)和水溶液(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0-10min,5％A to 15％A；10-20min,15％A to 25％A；20-30min,25％A to 35％A；30-40min,35％A to 55％A；40-50min,55％A to 70％A。
图5为实施例1得到的六种高异黄酮类化合物的结构式，disporopsin(1)，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮(2)，5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)色原-4-酮(3)，4′-demethyleucomin(4)，brevifolin(5)，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮(6)。
实施例2：对分离得到的单体成分进行结构鉴定
结构鉴定：对分离得到的单体成分应用Agilent 5973N质谱仪和Burker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，NMR谱的测定，所得数据如下：
Disporopsin(1)：ESI-MS,m/z 303[M+H]+.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:4.23(1H,dd,J＝4.4,11.6,H-2a),4.09(1H,dd,J＝7.6,11.6,H-2b),2.93(1H,m,H-3),5.88(2H,overlapped,H-6,H-8),3.01(1H,dd,J＝4.8,13.6Hz,H-9a),2.47(1H,dd,J＝10.0,13.6Hz,H-9b),6.32(1H,d,J＝2.0Hz,H-3′),6.82(1H,d,J＝8.0Hz,H-5′),6.17(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6′).
13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:69.5(C-2),44.8(C-3),198.7(C-4),101.6(C-4a),164.2(C-5),96.4(C-6),167.2(C-7),95.2(C-8),163.3(C-8a),27.1(C-9),115.0(C-1′),156.6(C-2′),103.0(C-3′),157.5(C-4′),106.6(C-5′),131.6(C-6′).
5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮(2)：ESI-MS,m/z 317[M+H]+.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:4.24(1H,dd,J＝4.4,11.6,H-2a),4.10(1H,dd,J＝7.6,11.6,H-2b),2.90(1H,m,H-3),5.99(1H,s,H-6),2.99(1H,dd,J＝4.8,13.2Hz,H-9a),2.46(1H,dd,J＝10.0,13.2Hz,H-9b),6.31(1H,d,J＝2.4Hz,H-3′),6.81(1H,d,J＝8.4Hz,H-5′),6.15(1H,dd,J＝2.4,8.4Hz,H-6′).
13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:69.6(C-2),44.6(C-3),198.9(C-4),102.7(C-4a),161.7(C-5),95.7(C-6),165.0(C-7),102.9(C-8),160.2(C-8a),27.0(C-9),115.0(C-1′),156.6(C-2′),102.9(C-3′),157.5(C-4′),106.5(C-5′),131.6(C-6′),7.9(Me-C8).
5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)色原-4-酮(3)：ESI-MS,m/z 287[M+H]+.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:4.24(1H,dd,J＝4.8,11.6,H-2a),4.06(1H,dd,J＝8.0,11.6,H-2b),2.93(1H,m,H-3),5.87(2H,overlapped,H-6,H-8),3.01(1H,dd,J＝5.2,14.0Hz,H-9a),2.57(1H,dd,J＝9.6,14.0Hz,H-9b),7.02(2H,d,J＝8.0Hz,H-2′,6′),6.70(2H,d,J＝8.0Hz,H-3′,5′).
13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:69.3(C-2),46.0(C-3),198.1(C-4),101.5(C-4a),164.2(C-5),96.5(C-6),167.6(C-7),95.3(C-8),163.2(C-8a),31.6(C-9),128.5(C-1′),130.4(C-2′,6′),115.7(C-3′,5′),156.4(C-4′).
4′-demethyleucomin(4)：ESI-MS,m/z 285[M+H]+.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:5.34(2H,d,J＝1.6,H-2),5.92(1H,J＝2.4Hz,H-6),5.88(1H,J＝2.4Hz,H-8),7.67(1H,s,H-9),7.32(2H,d,J＝8.0Hz,H-2′,6′),6.90(2H,d,J＝8.0Hz,H-3′,5′).
13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:67.6(C-2),126.6(C-3),184.7(C-4),102.1(C-4a),164.9(C-5),96.7(C-6),167.7(C-7),95.4(C-8),162.3(C-8a),137.0(C-9),125.2(C-1′),133.3(C-2′,6′),116.3(C-3′,5′),160.0(C-4′).
Brevifolin(5)：ESI-MS,m/z 301[M+H]+.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:4.28(1H,dd,J＝4.4,11.2,H-2a),4.09(1H,dd,J＝8.4,11.2,H-2b),2.92(1H,m,H-3),6.00(1H,s,H-8),3.00(1H,dd,J＝4.8,13.6Hz,H-9a),2.58(1H,dd,J＝9.6,13.6Hz,H-9b),7.03(2H,d,J＝8.0Hz,H-2′,6′),6.70(2H,d,J＝8.0Hz,H-3′,5′),1.24(3H,s,Me-C6).
13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:69.3(C-2),45.9(C-3),198.4(C-4),101.5(C-4a),161.7(C-5),102.8(C-6),165.5(C-7),95.8(C-8),160.1(C-8a),31.6(C-9),128.2(C-1′),130.4(C-2′,6′),115.7(C-3′,5′),156.4(C-4′),7.9(Me-C6).
5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮(6)：ESI-MS,m/z317[M+H]+.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:4.26(1H,dd,J＝4.4,11.2,H-2a),4.12(1H,dd,J＝7.6,11.2,H-2b),2.94(1H,m,H-3),6.01(1H,s,H-6),3.03(1H,dd,J＝5.2,13.6Hz,H-9a),2.52(1H,dd,J＝9.6,13.6Hz,H-9b),6.42(1H,d,J＝2.4Hz,H-3′),6.33(1H,dd,J＝2.4,8.4Hz,H-5′),6.95(1H,d,J＝8.4Hz,H-6′),1.86(3H,s,Me-C8).
13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:69.6(C-2),44.5(C-3),198.9(C-4),101.5(C-4a),161.7(C-5),95.7(C-6),165.1(C-7),102.7(C-8),160.2(C-8a),27.0(C-9),117.0(C-1′),156.7(C-2′),101.7(C-3′),159.4(C-4′),104.6(C-5′),131.7(C-6′),7.9(Me-C8).
实施例3：药理学实验：
抗炎活性实验：
取RAW264.7小鼠巨噬细胞，计数，按1×105/孔接种于96孔细胞培养板。培养基为DMEM培养基，并含有10％牛胎血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，将细胞在37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中贴壁24h。抗炎实验设置空白对照组，LPS组，给药组和阳性对照药地塞米松(DEX)组，其中空白对照组细胞只添加培养基，LPS组中只添加1μg/mL LPS，给药组添加1μg/mL的LPS和5个不同浓度的待测样品(50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.75μM)，阳性对照药DEX组添加1μg/mL的LPS和5个不同浓度的地塞米松(50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.75μM)，给药后细胞继续培养24h，随后取上清液50μL，加入GriessⅠ和Ⅱ试剂30分钟后，用酶标仪570nm测定OD(光密度)值，计算相应的抑制率和IC50值。
结论：采用MTT法测定6个化合物和地塞米松对LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞NO释放的抑制作用，阳性对照药地塞米松的IC50值为4.5μM，其中5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮(2)，4′-demethyleucomin(4)，brevifolin(5)，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮(6)具有抗炎活性，IC50值分别为30.6μM，16.2μM，17.1μM和33.8μM，disporopsin(1)和5,7-dihydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman-4-one(3)的抗炎活性较弱，其IC50值大于100μM。上述结果表明，化合物4′-demethyleucomin(4)，brevifolin(5)的抗炎活性较强，化合物5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮(2)和5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮(6)的抗炎活性中等，disporopsin(1)和5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)色原-4-酮(3)的抗炎活性较弱。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.一种高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物的方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)黄精提取物的制备：取鲜黄精药材切片晒干，粉碎，乙醇加热回流提取，得黄精乙醇粗提物；
(2)将步骤(1)中得到的黄精乙醇粗提物溶于水，采用AB-8大孔树脂柱色谱法进行样品前处理，去除多糖类成分，得黄精中等极性成分富集粗品；
(3)黄精中高异黄酮类粗提物的制备：将步骤(2)中所得黄精中等极性成分富集粗品采用聚酰胺柱色谱法进行黄酮类成分的富集，采用不同洗脱液进行洗脱，收集各洗脱部位，回收溶剂，分析后得黄精中高异黄酮类粗提物；
(4)黄精中高异黄酮单体成分的分离：针对步骤(3)中黄精中高异黄酮类粗提物，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到6种高异黄酮类化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)中，所述乙醇加热回流提取具体为：乙醇加热回流提取多次，合并滤液，减压旋蒸，得黄精乙醇粗提物；
优选的，所述乙醇为体积比为60％～80％的乙醇，进一步优选为70％乙醇；
优选的，乙醇加热回流提取中，固液比为1：2，提取三次，时间分别为2h，1h，1h。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(2)中，所述采用AB-8大孔树脂柱色谱法进行样品前处理具体为：分别使用水、90％乙醇-水进行洗脱，收集90％乙醇-水洗脱部位，回收溶剂，得黄精中其他成分富集粗品。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(3)中，所述采用不同洗脱液进行洗脱具体为：分别采用20％乙醇-水、50％乙醇-水、60％乙醇-水、70％乙醇-水、90％乙醇-水进行洗脱。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是，步骤(3)中，所述分析后得黄精中高异黄酮类粗提物具体为：采用HPLC对各部位进行分析，通过高异黄酮的特征紫外吸收明确高异黄酮类成分富集的洗脱部位。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是，高异黄酮的特征紫外吸收明确高异黄酮类成分富集于60％乙醇-水和70％乙醇-水洗脱部位。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是，针对60％乙醇-水洗脱部位得到的高异黄酮类粗提物，溶剂系统为体积比为4:5:4:5的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率66.4％，紫外检测器检测波长280nm，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到3个高异黄酮类化合物，经NMR确证，结构分别为disporopsin，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮，5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)色原-4-酮。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是，针对70％乙醇-水洗脱部位得到的高异黄酮类粗提物，溶剂系统为体积比为5:5:5:5的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率62.5％，紫外检测器检测波长280nm，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到3个高异黄酮类化合物，经NMR确证，结构分别为4′-demethyleucomin，brevifolin，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮。
9.权利要求1-8任一项所述高速逆流色谱分离纯化黄精中高异黄酮类化合物的方法得到的高异黄酮类化合物。
10.权利要求9所述的高异黄酮类化合物在制备抗炎药物中的应用；
优选的，所述高异黄酮类化合物为5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′,4′-二羟基苯基)色原-4-酮，4′-demethyleucomin；brevifolin，5,7-二羟基-8-甲基-3-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-色原-4-酮。
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