CN107059454B

CN107059454B - 一种利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法

Info

Publication number: CN107059454B
Application number: CN201710315856.1A
Authority: CN
Inventors: 丁少军; 刘敏; 杨舒雅
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2017-05-08
Filing date: 2017-05-08
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2037-05-08
Also published as: CN107059454A

Abstract

本发明公开了一种利用双功能融合酶Lip‑EG1CD进行废纸脱墨的方法，包括：废纸预处理，采用双功能融合酶脱墨处理，以及收集纸浆；其中，双功能融合酶为含内切型纤维素酶和脂肪酶活性的双功能融合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。本发明将内切型纤维素酶和脂肪酶通过linkers连接起来，构建出含内切型纤维素酶和脂肪酶活性的双功能融合酶，具有较好的热稳定性、pH耐受性，是一种工业化应用的优质酶源。可以在中性条件下同时协同发挥二种酶的脱墨作用，可以降低酶成本，提高脱墨效率，在工业化应用中具有良好的应用前景。

Description

一种利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法

技术领域

本发明属于融合酶应用技术领域，具体涉及一种利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法。

背景技术

由于资源、环境和能源的问题，二次纤维(废纸)在世界范围内已经成为制浆造纸工业一种重要的纤维来源。废纸回用的关键是油墨的脱除，因此脱墨技术也成为当今国内外研究的热点。传统的化学法脱墨需要使用含氯的化合物，以及氢氧化钠，碳酸钠等化学品，会带来二次污染等环境问题。利用生物酶进行脱墨是近年来发展起来的环境友好型技术，用于废纸脱墨的生物酶有纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、漆酶等，目前使用的这些微生物来源的酶为单功能的酶，即每一种酶只含有单一的催化活性，虽然它们单独使用具有一定脱墨效果，但单酶单独使用往往很难到达化学法的效果，因此常需要几种酶混合使用。但多种酶的混合使用会增加酶的数量和用量及使用成本，同时会增加脱墨技术的复杂性，导致工业化应用时经济竞争性下降，因此还不能满足使用需求。

发明内容

发明目的：针对传统化学脱墨方法存在能耗高、环境污染重、成本高；而酶法脱墨往往需要多种酶混合使用，酶使用成本高的问题，本发明的目的是提供一种利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法，具有条件温和，环境污染小，脱墨效率更高，成本更低等优点。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法，在废纸脱墨中使用的酶为双功能融合酶Lip-EG1CD，所述的双功能融合酶Lip-EG1CD为含内切型纤维素酶和脂肪酶活性的双功能融合酶Lip-EG1CD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法，包括以下步骤：

1)把废纸撕碎后放入5％浆浓的水桶里，常温浸泡，用ZQS 2打浆机疏解纸张，然后把纸浆用离心机甩干、分散纸浆、测浆料水分后储存于4℃条件下；

2)在反应容器中加入100mM pH 7.5磷酸钠缓冲液、水、纸浆、0.3％AEO-9、双功能融合酶，200rpm，35℃～55℃恒温震荡反应，反应结束后沸水灭活5min终止反应，取浆液用于测发色基团和还原糖释放量；

3)转移反应体系至浮选池，加入CaCl₂、0.3％AEO-9和水，浮选10min，之后用自来水冲洗并用60目筛收集纸浆。

所述的双功能融合酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的双功能融合酶的用量为4.5-6.5nmol。

一种制备所述的双功能融合酶Lip-EG1CD的方法，将内切型纤维素酶和脂肪酶通过linkers连接，获得融合基因，构建内切型纤维素酶和脂肪酶的融合基因的表达载体，并在Pichia pastoris中表达，获得双功能融合酶。

所述的制备双功能融合酶Lip-EG1CD的方法，包括以下步骤：

1)提取Thermomyces lanuginosus总RNA，采用引物5’-CGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-ATCACACTCTGAAATGGGAC-3’进行PCR扩增获得脂肪酶的cDNA全长，并将其亚克隆到pGEM-T上，随后采用引物5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGATCACACTCTGAAAT-3进行PCR扩增获得Lip基因序列；

2)以pBluescript-EG1质粒为模板，采用引物5’-TCCCCGCGGGGTGTCAACCAGGCTGGTGC-3’和引物5’-GCTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGCACGAATGGTTTCAAAGCCT-3’进行PCR扩增获得EG1CD基因序列；

3)以Lip基因序列为模板，采用引物5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-AGGTGGGGTTGGGTGCGCTGCTGGTTGTCGTAGGTCCATCACACTCTGAAAT-3’进行PCR扩增获得融合酶Lip-EG1CD的Lip片段，以EG1CD基因序列为模板，采用引物5’-ACCCAACCCCACCTCCAGTGGCTGCCCGAATGCCACCAAGTTCAGATTCTTCGGT-3’和引物5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGCACGAATGGTTTCAA-3’进行PCR扩增获得融合酶Lip-EG1CD的含linker的EG1CD片段，以Lip和EG1CD基因序列为模板，采用引物5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGCACGAATGGTTTCAA-3’进行PCR扩增获得表达双功能融合酶基因序列；

4)将双功能融合酶基因序列与载体pPICZaA进行连接，转入巴斯德毕赤酵母KM71H，诱导表达，纯化酶液最终获得双功能融合酶。

所述的制备双功能融合酶Lip-EG1CD的方法所获得的双功能融合酶Lip-EG1CD。

所述的双功能融合酶Lip-EG1CD在进行废纸脱墨中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明将内切型纤维素酶和脂肪酶通过linkers连接起来，构建出含内切型纤维素酶和脂肪酶活性的双功能融合酶，并实现了其在Pichiapastoris中的高效异源表达，具有较好的热稳定性、pH耐受性，对多种金属离子和化学试剂有较好的耐受性，是一种工业化应用的优质酶源。该融合酶具备了内切型纤维素酶和脂肪酶双功能的催化活性，同时由于连接肽作用，使融合酶分子中两个功能域具有更好相互协同作用，其中脂肪酶的活性比单酶(Lip)提高4倍，具有条件温和，环境污染小，脱墨效率更高，成本更低等优点。可以在中性条件下同时协同发挥二种酶的脱墨作用，可以降低酶成本，提高脱墨效率，与单一脂肪酶相比，本发明双功能融合酶的脂肪酶活力更高，且双功能融合酶的脱墨能力高于单酶或单酶的混合。另外与混合多种单一酶相比，双功能融合酶具有脱墨成本低、生产周期短和环境污染小等优点，当融合酶的分子数分别达到5.53nmol时，融合酶分别在激光打印纸和报纸上表现出89％的脱墨效率和91％ISO和60％ISO纸张白度，并且手抄纸强度也得到明显改善。因此其在废纸回收中具有良好的应用前景。

附图说明

图1是纯化得到的Lip，EG1CD和Lip-EG1CD的12％SDS-PAGE电泳图；图中，M：Marker；1：Lip-EG1CD；2：Lip；3：EG1CD；

图2是温度对Lip，EG1CD和Lip-EG1CD活力的影响结果图；

图3是pH对Lip，EG1CD和Lip-EG1CD活力的影响结果图；

图4是对照，Lip，EG1CD，Lip/EG1CD和Lip-EG1CD处理激光打印纸和报纸后，纸张的油墨去除率和白度结果图；

图5是对照，Lip，EG1CD，Lip/EG1CD和Lip-EG1CD处理激光打印纸和报纸后，浆液中发色集团和还原糖的释放量结果图；

图6是对照，Lip，EG1CD，Lip/EG1CD和Lip-EG1CD处理激光打印纸和报纸后，纸张的物理性能结果图；

图7是对照，Lip，EG1CD，Lip/EG1CD和Lip-EG1CD处理激光打印纸后，纸浆的电镜扫描结果图；

图8是对照，Lip，EG1CD，Lip/EG1CD和Lip-EG1CD处理报纸后，纸浆的电镜扫描。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明

以下实施例所使用的材料和试剂如下：

菌株及载体：草菇V14(V.volvacea)由上海农科院提供，Thermomyceslanuginosus来自于芬兰VTTCC，工作质粒pGEM-T购自Promega公司，大肠杆菌DH5α、毕赤酵母KM71H(Muts,Arg+)及表达载体pPICZαA购自Invitrogen公司。

酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；IPTG(SIGMA),X-gal(SIGMA),Zeocin(Invitrogen),Yeast extract(OXOID)，Peptone(OXOID)，Tryptone(OXOID)，p-nitrophenyl acetate，p-nitrophenyl propionate，p-nitrophenyl butyrate，p-nitrophenyl valerate，p-nitrophenyl octanoate，p-nitrophenyl decanoate，p-nitrophenyl laurate，p-nitrophenyl myristate，p-nitrophenyl stearate购自Sigma公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

LB液体培养基：称取胰蛋白胨(Tryptone)l0g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl 5g，加水溶解并定容至1L(pH值7.0-7.5，用NaOH调节)，121℃灭菌20min。

LB+Zeocin固体培养基：各组分浓度与LB液体培养基相同。另外添加1.8％的琼脂，在121℃灭菌20min后，冷却至60℃左右加入终浓度为100μg/mL的Zeocin，然后倒入培养皿制成平板。

YPD液体培养基：在90mL dd H2O中溶解1g Yeast extract、2g蛋白胨(Peptone)，在121℃高温高压下灭菌20min，冷却后加入10mL 10×D，4℃保存。

YPD固体培养基：各组分浓度与YPD液体培养基相同。另外添加1.8％的琼脂，在121℃灭菌20min后，倒入培养皿制成平板。

YPDS+Zeocin固体培养基：将各组分浓度与YPD液体培养基相同。另外添加1.8％的琼脂，在121℃灭菌20min后，冷却至60℃左右加入终浓度为100μg/mL的Zeocin，倒入培养皿制成平板。

10×YNB(13.4％Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without aminoAcids)：称取13.4g YNB(含硫酸铵不含氨基酸)溶解在100mL dH₂O中，过滤除菌，4℃保存。

BMGY培养基：在700mL dH₂O中溶解10g酵母提取物、20g蛋白胨，121℃灭菌20min。冷却至室温后加入100mL磷酸钾缓冲液(1M,pH 6.0)，10×YNB 100mL，500×B 2mL，10×G100mL。混匀后4℃保存。

BMMY培养基：在700mL dH₂O中溶解10g酵母提取物、20g蛋白胨，121℃灭菌20min。冷却至室温后加入100mL磷酸钾缓冲液(1M,pH 6.0)，10×YNB 100mL，500×B 2mL，10×M100mL。混匀后4℃保存。

PDA培养基：称取酵母提取物5.0g，可溶性淀粉20.0g，橄榄油18.3g，K₂PO₄ 5.0g，CaCl₂ 0.15g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，琼脂15.0g，水1000mL搅拌混匀装入培养瓶，121℃下灭菌20min。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1基因的克隆

Thermomyces lanuginosus总RNA的提取(采用TRizol试剂提取)：将在PDA平板上培养的Thermomyces lanuginosus菌种，用接种铲将边缘生长旺盛的菌丝块接种到PDA培养基上50℃培养48h收集菌丝并用液氮将其研磨成粉末。取80-100mg粉末加入1mL TPI溶液，用枪头吹吸数次，12000g 4℃离心5min；小心吸取上清，将上清平分至两个新的1.5mLRNase-free离心管中(400-500uL)；向上清中加入等体积的TPII，颠倒混匀数次，加入1/4上清体积的氯仿，再次颠倒混匀数次，室温静置5min；12000g 4℃离心5min；小心吸取上清；向上清中加入等体积异丙醇，颠倒混匀室温静置5min；12000g 4℃离心10min。弃上清，此时在管侧和管底形成胶状沉淀；加入1mL 75％乙醇，剧烈涡旋；10000g 4℃离心5min，弃上清，室温晾干沉淀；加入30-40μL RNA溶解沉淀，保存样品于-80℃以备长期使用。

以提取好的Thermomyces lanuginosus总RNA稀释100倍为模板，采用引物1(5’-CGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’)和引物2：(5’-ATCACACTCTGAAATGGGAC-3’)进行PCR扩增获得脂肪酶(Lip)的cDNA全长并将其亚克隆到pGEM-T上，随后采用引物3(5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’)和引物4(5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGATCACACTCTGAAAT-3’)进行PCR扩增获得Lip基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，共846bp，含5’端的酶切位点gaattc序列和3’端的酶切位点catcatcatcatcatcat序列。

以pBluescript-EG1质粒为模板，采用引物5(5’-TCCCCGCGGGGTGTCAACCAGGCTGGTGC-3’)和引物6(5’-GCTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGCACGAATGGTTTCAAAGCCT-3’)进行PCR扩增获得EG1CD基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，共1005bp，含5’端的酶切位点ccgcgg序列和3’端的酶切位点catcatcatcatcatcat序列。

首先以Lip基因序列为模板，采用引物7(5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’)和引物8(5’-AGGTGGGGTTGGGTGCGCTGCTGGTTGTCGTAGGTCCATCACACTCTGAAAT-3’)进行PCR扩增获得融合酶Lip-EG1CD的Lip片段，其次后以EG1CD基因序列为模板，采用引物9(5’-ACCCAACCCCACCTCCAGTGGCTGCCCGAATGCCACCAAGTTCAGATTCTTCGGT-3’)和引物10(5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGCACGAATGGTTTCAA-3’)进行PCR扩增获得融合酶Lip-EG1CD的含linker的EG1CD片段，最后以Lip和EG1CD基因序列为模板，采用引物7和引物10进行PCR扩增获得融合酶Lip-EG1CD片段，即为双功能融合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，共1827bp，含5’端的酶切位点gaattc序列和3’端的酶切位点catcatcatcatcatcat序列。

PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。使用思普金公司快速PCR产物纯化试剂盒回收纯化扩增得到的含有双酶切位点的Lip，EG1CD和Lip-EG1CD基因片段。将这些基因片段与载体pPICZaA进行连接，大肠杆菌E.coli DH5α扩增，然后送南京思普金生物科技有限公司测序，测序结果显示正确。

实施例2Lip，EG1CD和Lip-EG1CD在巴斯德毕赤酵母KM71H中的表达及纯化

将测序正确的阳性克隆DH5α接种于3mL LBZ液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。重组表达质粒pPICZαA-Lip，pPICZαA-EG1CD和pPICZαA-Lip-EG1CD的小量提取使用北京全式金生物技术有限公司的质粒小提试剂盒(EasyPure Plasmid MiniPrep Kit)进行提取。将提取好的重组表达质粒pPICZαA-Lip，pPICZαA-EG1CD和pPICZαA-Lip-EG1CD转入巴斯德毕赤酵母KM71H，涂布含有100μg/mL Zeocin的平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆接种于含有3mL YPDZ液体培养基的试管中，28℃，200rpm过夜培养；将过夜培养的菌液按1：50接入含有50mL灭菌的BMGY液体培养基中，28℃，200rpm培养至OD₆₀₀为6.0左右；将菌液3000rpm离心5min收集菌体，弃上清液，将菌体用25mL BMMY诱导培养基重新悬浮，28℃，200rpm条件下诱导表达，每天取样并补加甲醇至终浓度为0.8％(v/v)。诱导表达一定时间后，将菌液10000rpm离心10min收集上清，将上清液装入透析袋中，4℃下在Lysisbuffer中透析24h，其间更换2-3次透析液。酶液的纯化参照Ni-NTA Agarose(Qiagen)的方法。将纯化得到的蛋白利用SDS-PAGE进行检测。结果如图1所示，可见重组Lip，EG1CD和Lip-EG1CD在巴斯德毕赤酵母中得到了表达，经Ni-NTA Agarose纯化后为一条带分子量分别约为34kDa，37kDa和71kDa。

实施例3Lip，EG1CD和Lip-EG1CD的活性分析

对Lipase和内切型纤维素酶Endoglucanase酶活的测定方法：Endoglucanase酶活定义为在55℃、pH 7.5条件下，水解底物CMC每分钟产生1μmol还原糖所需酶量为1个酶活力单位(U)。酶解底物为2.0％(w/v)CMC。取900μL 0.1M pH 7.5的磷酸钾缓冲液，加入500μLCMC溶液，置于55℃预热5min，加入上述制备的100μL EG1CD酶液。将混合物于55℃下反应30min后，加入500μL Somogyi，沸水灭活10min终止反应，室温冷却后加入500μL Nelson。在520nm下测定还原糖生成量，同时，以灭活酶液作对照。Lipase酶活定义为在35℃、pH 7.5条件下，水解底物p-nitrophenyl octanoate每分钟产生1μmol p-nitrophenol所需酶量为1个酶活力单位(U)。酶解底物为2mM p-nitrophenyl octanoate。取1600μL 0.1M pH 7.5的磷酸钾缓冲液，加入200μL p-nitrophenyl octanoate溶液，置于35℃预热5min，加入上述制备的100μL Lip酶液。将混合物于35℃下反应10min后，加入100μL Triton X-100终止反应，室温冷却后在410nm下测定p-nitrophenol生成量，同时，以灭活酶液作对照。

1)Lip，EG1CD和Lip-EG1CD的最适温度和热稳定性的测定

Endoglucanase最适温度测定：以2.0％(w/v)CMC为底物，pH 7.5的0.1M磷酸钠缓冲液分别在20-65℃的条件下测酶活。Endoglucanase热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中(40℃、50℃、60℃下)保温0-2h。以CMC为底物，反应30min测定endoglucanase的剩余酶活，以未处理的酶液作为对照。结果表明：EG1CD和Lip-EG1CD的endoglucanase最适温度均为55℃(图2B)，EG1CD和Lip-EG1CD中的EG1CD部分具有相似的稳定性，40℃下孵育2h后，两种内切葡聚糖酶活性几乎没有变化，但在50℃和60℃下孵育2h后剩余活性下降到初始活性的60％和15％(图2D)。

Lipase最适温度测定：以2mM p-nitrophenyl octanoate为底物，pH 7.5的0.1M磷酸钠缓冲液分别在20-65℃的条件下测酶活。Lipase热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中(35℃、40℃、45℃下)保温0-4h。以p-nitrophenyl octanoate为底物，反应10min测定lipase的剩余酶活，以未处理的酶液作为对照。结果表明：Lip和Lip-EG1CD的lipase最适温度均为35℃(图2A)，与亲本Lip相比，Lip-EG1CD中的Lip部分在35-45℃的温度范围内更稳定，在35-45℃下孵育4h后仍能保持90％以上的脂肪酶活性(图2C)。

2)Lip，EG1CD和Lip-EG1CD的最适pH和pH稳定性的测定

Endoglucanase和Lipase最适pH测定：在55℃下测量endoglucanase和在35℃下测量lipase分别在0.1M磷酸钠缓冲液pH 5.0-11.0中反应的酶活。Endoglucanase和LipasepH稳定性测定：将酶在不同的pH条件下(广泛缓冲液pH 5.0-11.0)室温保存24h。分别以CMC和p-nitrophenyl octanoate为底物，在最适温度和pH下测它们的剩余酶活，以未处理的酶液作为对照。结果表明：融合酶Lip-EG1CD在pH 7.5显示与亲本Lip和EG1CD相同的最大内切葡聚糖酶和脂肪酶活性(图3A-B)。融合酶Lip-EG1CD中的部分在pH 5.0-11.0范围内显示与亲本Lip和EG1CD类似的pH稳定性(图3C-D)。

3)Lip，EG1CD和Lip-EG1CD的金属离子和化学试剂耐受性

酶的金属离子和化学试剂耐受性测定：金属离子Ca²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Fe³⁺，Ni²⁺，Co²⁺，NH₄ ⁺(1mM，5mM)和EDTA(0.1mM，0.5mM)用于确定金属离子和化学试剂对内切葡聚糖酶和脂肪酶活性的影响，以相同条件处理但未加金属离子和化学试剂的酶液作为对照。经金属离子和化学试剂处理后，除Ni²⁺轻微增强融合酶Lip-EG1CD的脂肪酶活性之外，其余金属离子对亲本Lip和融合酶Lip-EG1CD的脂肪酶活性具有相似的影响(表2)。Zn²⁺活化了融合酶Lip-EG1CD的内切葡聚糖酶活性，同时比与亲本Lip和EG1CD相比，Lip-EG1CD对EDTA的耐受性更强(表2)。

表2 Lip，EG1CD和Lip-EG1CD的金属离子和化学试剂耐受性结果

4)Lip，EG1CD和Lip-EG1CD的底物特异性的测定

重组Lip，EG1CD和Lip-EG1C底物特异性测定：脂肪酶和内切葡聚糖酶的底物特异性在最适温度和pH的条件下进行，脂肪酶底物特异性的测定分别以对硝基苯基乙酸酯，对硝基苯基丙酸酯，对硝基苯基丁酸酯，对硝基苯基戊酸酯，对硝基苯基辛酸酯，对硝基苯基癸酸酯，对硝基苯基月桂酸酯，对硝基苯基肉豆蔻酸酯，对硝基苯基硬脂酸酯为底物，反应10min，测定其酶活。内切葡聚糖酶底物特异性的测定分别以CMC，滤纸，磷酸润胀纤维素为底物，反应30min，测定其酶活。结果表明：亲本Lip和融合酶Lip-EG1CD的脂肪酶活性对对硝基苯基辛酸酯的活性最高，其次是对硝基苯基癸酸酯，对硝基苯基月桂酸酯，对硝基苯基肉豆蔻酸酯等。亲本EG1CD和融合酶Lip-EG1CD的内切葡聚糖酶活性对CMC的活性最高，其次是磷酸润胀纤维素和滤纸。融合酶Lip-EG1CD的脂肪酶活性明显高于亲本Lip(表3)，同时Lip-EG1CD对CMC的内切葡聚糖酶活性与亲本EG1CD相似。

表3 Lip，EG1CD和Lip-EG1CD的比活力结果

5)Lip，EG1CD和Lip-EG1CD的动力学常数的测定

重组Lip，EG1CD和Lip-EG1C动力学常数测定：动力学常数(V_max和K_m)的测定在最适温度和pH的条件下，添加不同浓度的CMC(0.2-4.0mg mL^-1)及p-nitrophenyl octanoate(0.2-4.0mmol mL^-1)为底物，反应5min，测定其酶活。数据利用Graphpad Prism 5.0软件进行非线性回归分析计算该酶的动力学常数。结果表明：对p-nitrophenyl octanoate融合酶Lip-EG1CD的脂肪酶活性(V_max)大于亲本Lip，然而，融合酶Lip-EG1CD的内切葡聚糖酶活性(V_max)与亲本EG1CD相似(表4)。

表4 Lip，EG1CD和Lip-EG1CD的动力学常数结果

实施例4含内切型纤维素酶和脂肪酶活性的双功能融合酶进行废纸脱墨

双功能融合酶进行废纸脱墨的方法：分别把激光打印纸和报纸撕成1cm²放入5％(w/v)浆浓的水桶里，常温浸泡24h，用ZQS 2打浆机疏解纸张后，把纸浆用离心机甩干、分散纸浆并储存于4℃条件下；反应容器为1000mL玻璃瓶，在反应容器中加入100mM pH 7.5磷酸钠缓冲液、水、纸浆、0.3％(v/v)AEO-9、相同分子数的Lip、EG1CD和Lip-EG1CD(5.53nmol)，200rpm，35℃Lip、40℃Lip-EG1CD、40℃Lip/EG1CD、55℃EG1CD，分别恒温震荡反应3h，对照用水代替酶，沸水灭活5min终止反应，取一些浆液用于测发色基团和还原糖释放量；转移反应体系至实验室自制浮选池中，加入CaCl₂(0.3％,w/w干浆重)、0.3％(v/v)AEO-9和水，浮选10min，之后用自来水冲洗并用60目筛收集纸浆。分别将两种纸浆制备成60g/m²的手抄纸(TAPPI T 205)，之后测手抄纸的油墨去除率、白度、耐破指数(TAPPI T 403)、拉伸指数(TAPPI T 494)、撕裂指数(TAPPI T 414)、纸浆液中的发色基团和还原糖释放量以及纸浆的纤维形态(图4-8)。

结果表明：融合酶分别在激光打印纸和报纸上表现出89％的脱墨效率和91％ISO和60％ISO纸张白度，并且手抄纸强度也得到明显改善。因此它揭示了加强内切葡聚糖酶和脂肪酶在废纸上的协同作用可以通过构建适当的融合酶，其在废纸回收中具有良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法

<130> 100

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 双功能融合酶Lip-EG1CD的蛋白序列

<400> 1

Arg Pro Val Arg Arg Ala Val Pro Gln Asp Leu Leu Asp Gln Phe Glu

1 5 10 15

Leu Phe Ser Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Ala Asn Asn His

20 25 30

Ala Pro Val Gly Ser Asp Val Thr Cys Ser Glu Asn Val Cys Pro Glu

35 40 45

Val Asp Ala Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Leu Gly Asp Val Thr Gly Leu Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu

65 70 75 80

Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Val Glu Asn Trp Ile Ala

85 90 95

Asn Leu Ala Ala Asp Leu Thr Glu Ile Ser Asp Ile Cys Ser Gly Cys

100 105 110

Glu Gly His Val Gly Phe Val Thr Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr

115 120 125

Ile Arg Glu Gln Val Gln Asn Ala Val Asn Glu His Pro Asp Tyr Arg

130 135 140

Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Ile Ala

145 150 155 160

Ala Ala Ala Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Ile Asp Val Phe Ser Tyr

165 170 175

Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala

180 185 190

Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val

195 200 205

Pro Arg Leu Pro Pro Arg Asp Trp Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu

210 215 220

Tyr Trp Val Thr Ser Gly Asn Asp Val Pro Val Thr Ala Asn Asp Ile

225 230 235 240

Thr Val Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Gly Asn

245 250 255

Ile Pro Asp Ile Pro Ser His Leu Trp Tyr Phe Gly Pro Ile Ser Glu

260 265 270

Cys Asp Gly Pro Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Asn Pro Thr Ser Ser

275 280 285

Gly Cys Pro Asn Ala Thr Lys Phe Arg Phe Phe Gly Val Asn Gln Ala

290 295 300

Gly Ala Glu Phe Gly Glu Asn Val Ile Pro Gly Glu Leu Gly Thr His

305 310 315 320

Tyr Thr Trp Pro Ser Pro Ser Ser Ile Asp Tyr Phe Val Asn Gln Gly

325 330 335

Phe Asn Thr Phe Arg Val Ala Phe Lys Ile Glu Arg Leu Ser Pro Pro

340 345 350

Gly Thr Gly Leu Thr Gly Pro Phe Asp Gln Ala Tyr Leu Asn Gly Leu

355 360 365

Lys Thr Ile Val Asn Tyr Ile Thr Gly Lys Asn Ala Tyr Ala Val Leu

370 375 380

Asp Pro His Asn Tyr Met Arg Tyr Asn Gly Asn Val Ile Thr Ser Thr

385 390 395 400

Ser Asn Phe Gln Thr Trp Trp Asn Lys Leu Ala Thr Glu Phe Arg Ser

405 410 415

Asn Thr Arg Val Ile Phe Asp Val Met Asn Glu Pro Tyr Gln Ile Asp

420 425 430

Ala Ser Val Val Phe Asn Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn Gly Ile Arg

435 440 445

Ala Ser Gly Ala Thr Ser Gln Leu Ile Leu Val Glu Gly Thr Ala Trp

450 455 460

Thr Gly Ala Trp Ser Trp Glu Ser Ser Gly Asn Gly Ala Val Phe Gly

465 470 475 480

Ala Ile Arg Asp Pro Asn Asn Asn Thr Ala Ile Glu Met His Gln Tyr

485 490 495

Leu Asp Ser Asp Ser Ser Gly Thr Ser Ala Thr Cys Val Ser Ser Thr

500 505 510

Val Gly Val Glu Arg Leu Arg Val Ala Thr Asp Trp Leu Arg Arg Asn

515 520 525

Asn Leu Lys Gly Phe Leu Gly Glu Met Gly Ala Gly Ser Asn Asp Val

530 535 540

Cys Ile Ala Ala Val Lys Gly Ala Leu Cys Ala Met Gln Gln Ser Gly

545 550 555 560

Val Trp Ile Gly Tyr Leu Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Thr

565 570 575

Tyr Phe Gln Ser Ile Glu Pro Pro Asn Gly Ala Ser Ile Ala Arg Ile

580 585 590

Leu Pro Glu Ala Leu Lys Pro Phe Val

595 600

<210> 2

<211> 1827

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 双功能融合酶Lip-EG1CD的核苷酸序列

<400> 2

gaattccggc ctgttcgacg agcggttccg caagatctgc tcgaccagtt tgaactcttt 60

tcacaatatt cggcggccgc atactgtgcg gcaaacaatc atgctccagt gggctcagac 120

gtaacgtgct cggagaatgt ctgccctgag gtagatgcgg cggacgcaac gtttctctat 180

tcttttgaag attctggatt aggcgatgtt accggccttc tcgctctcga caacacgaat 240

aaactgatcg tcctctcttt ccgcggctct cgttcagtag agaactggat cgcgaacctc 300

gccgccgacc tgacagaaat atctgacatc tgctccggct gcgaggggca tgtcggcttc 360

gttacttctt ggaggtctgt agccgacact ataagggagc aggtgcagaa tgccgtgaac 420

gagcatcccg attaccgcgt ggtctttacc ggacatagct tgggaggcgc actggcaact 480

attgccgcag cagctctgcg aggaaatgga tacaatatcg acgtgttctc atatggcgcg 540

ccccgcgtcg gtaacagggc atttgcagaa ttcctgaccg cacagacggg cggcaccctg 600

tatcgcatca cccataccaa tgatatcgtc cctagactcc ctcctcgaga ctggggttac 660

agccactcta gcccggagta ctgggtcacg tctggtaacg acgtcccagt gaccgcaaac 720

gacatcaccg tcgtggaggg catcgattcc accgacggga acaaccaggg gaatatccca 780

gacatccctt cgcatctatg gtatttcggt cccatttcag agtgtgatgg acctacgaca 840

accagcagcg cacccaaccc cacctccagt ggctgcccga atgccaccaa gttcagattc 900

ttcggtgtca accaggctgg tgctgagttt ggcgagaacg tgatcccagg cgaacttggc 960

acccactaca catggccaag cccaagctcg attgattact tcgttaacca gggcttcaac 1020

accttccgtg tcgcgttcaa gattgagcga ctgagcccac caggaaccgg tctgactggc 1080

cccttcgacc aggcctacct gaatggtctt aagacgattg tcaactacat tactggcaag 1140

aatgcatatg cagtgcttga tccccacaac tacatgcgtt acaatggcaa tgtaatcaca 1200

agcacctcca acttccagac ctggtggaat aagctagcca ccgaattcag gagcaacacc 1260

cgtgtcattt ttgatgtcat gaacgagcct taccaaatcg atgctagcgt cgtcttcaac 1320

cttaaccaag ctgccatcaa tggtatccga gctagcggtg ctacaagcca gctcattctt 1380

gtagaaggaa ctgcatggac aggagcatgg tcttgggaat ctagcggaaa cggtgcagtc 1440

ttcggtgcca ttcgagatcc taacaacaat acggccatcg agatgcacca atacctcgac 1500

tctgatagtt ctggtacctc tgccacttgc gtgtcatcga cggttggcgt agagcgtctc 1560

agagttgcaa ctgactggct caggaggaac aacctcaagg gcttcctcgg tgagatgggt 1620

gcagggtcca acgatgtttg catcgctgct gttaagggtg cactttgcgc tatgcaacaa 1680

tctggtgtct ggatcggata cttatggtgg gcagctggtc catggtgggg tacatacttc 1740

caatctatcg agcctcccaa tggtgcttca atcgcccgca ttctcccaga ggctttgaaa 1800

ccattcgtgc atcatcatca tcatcat 1827

<210> 3

<211> 846

<212> DNA

<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 3

gaattccggc ctgttcgacg agcggttccg caagatctgc tcgaccagtt tgaactcttt 60

tcacaatatt cggcggccgc atactgtgcg gcaaacaatc atgctccagt gggctcagac 120

gtaacgtgct cggagaatgt ctgccctgag gtagatgcgg cggacgcaac gtttctctat 180

tcttttgaag attctggatt aggcgatgtt accggccttc tcgctctcga caacacgaat 240

aaactgatcg tcctctcttt ccgcggctct cgttcagtag agaactggat cgcgaacctc 300

gccgccgacc tgacagaaat atctgacatc tgctccggct gcgaggggca tgtcggcttc 360

gttacttctt ggaggtctgt agccgacact ataagggagc aggtgcagaa tgccgtgaac 420

gagcatcccg attaccgcgt ggtctttacc ggacatagct tgggaggcgc actggcaact 480

attgccgcag cagctctgcg aggaaatgga tacaatatcg acgtgttctc atatggcgcg 540

ccccgcgtcg gtaacagggc atttgcagaa ttcctgaccg cacagacggg cggcaccctg 600

tatcgcatca cccataccaa tgatatcgtc cctagactcc ctcctcgaga ctggggttac 660

agccactcta gcccggagta ctgggtcacg tctggtaacg acgtcccagt gaccgcaaac 720

gacatcaccg tcgtggaggg catcgattcc accgacggga acaaccaggg gaatatccca 780

gacatccctt cgcatctatg gtatttcggt cccatttcag agtgtgatca tcatcatcat 840

catcat 846

<210> 4

<211> 1005

<212> DNA

<213> Volvariella volvacea

<400> 4

ccgcggggac ctacgacaac cagcagcgca cccaacccca cctccagtgg ctgcccgaat 60

gccaccaagt tcagattctt cggtgtcaac caggctggtg ctgagtttgg cgagaacgtg 120

atcccaggcg aacttggcac ccactacaca tggccaagcc caagctcgat tgattacttc 180

gttaaccagg gcttcaacac cttccgtgtc gcgttcaaga ttgagcgact gagcccacca 240

ggaaccggtc tgactggccc cttcgaccag gcctacctga atggtcttaa gacgattgtc 300

aactacatta ctggcaagaa tgcatatgca gtgcttgatc cccacaacta catgcgttac 360

aatggcaatg taatcacaag cacctccaac ttccagacct ggtggaataa gctagccacc 420

gaattcagga gcaacacccg tgtcattttt gatgtcatga acgagcctta ccaaatcgat 480

gctagcgtcg tcttcaacct taaccaagct gccatcaatg gtatccgagc tagcggtgct 540

acaagccagc tcattcttgt agaaggaact gcatggacag gagcatggtc ttgggaatct 600

agcggaaacg gtgcagtctt cggtgccatt cgagatccta acaacaatac ggccatcgag 660

atgcaccaat acctcgactc tgatagttct ggtacctctg ccacttgcgt gtcatcgacg 720

gttggcgtag agcgtctcag agttgcaact gactggctca ggaggaacaa cctcaagggc 780

ttcctcggtg agatgggtgc agggtccaac gatgtttgca tcgctgctgt taagggtgca 840

ctttgcgcta tgcaacaatc tggtgtctgg atcggatact tatggtgggc agctggtcca 900

tggtggggta catacttcca atctatcgag cctcccaatg gtgcttcaat cgcccgcatt 960

ctcccagagg ctttgaaacc attcgtgcat catcatcatc atcat 1005

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物1序列

<400> 5

cggcctgttc gacgagcggt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物2序列

<400> 6

atcacactct gaaatgggac 20

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物3序列

<400> 7

agagaggctg aagctgaatt ccggcctgtt cgacgagcgg t 41

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物4序列

<400> 8

gagatgagtt tttgttctag aaatcaatga tgatgatgat gatgatcaca ctctgaaat 59

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物5序列

<400> 9

tccccgcggg gtgtcaacca ggctggtgc 29

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物6序列

<400> 10

gctctagatc aatgatgatg atgatgatgc acgaatggtt tcaaagcct 49

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物7序列

<400> 11

agagaggctg aagctgaatt ccggcctgtt cgacgagcgg t 41

<210> 12

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物8序列

<400> 12

aggtggggtt gggtgcgctg ctggttgtcg taggtccatc acactctgaa at 52

<210> 13

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物9序列

<400> 13

acccaacccc acctccagtg gctgcccgaa tgccaccaag ttcagattct tcggt 55

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物10序列

<400> 14

gagatgagtt tttgttctag aaatcaatga tgatgatgat gatgcacgaa tggtttcaa 59

Claims

1.一种利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法，其特征在于，在废纸脱墨中使用的酶为双功能融合酶Lip-EG1CD，所述的双功能融合酶Lip-EG1CD为含内切型纤维素酶和脂肪酶活性的双功能融合酶Lip-EG1CD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；包括以下步骤：

2.根据权利要求1利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法，其特征在于，所述的双功能融合酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法，其特征在于，所述的双功能融合酶的用量为4.5-6.5nmol。

4.一种制备权利要求1所述的双功能融合酶Lip-EG1CD的方法，其特征在于，将内切型纤维素酶和脂肪酶通过linkers连接，获得融合基因，构建内切型纤维素酶和脂肪酶的融合基因的表达载体，并在Pichia pastoris中表达，获得双功能融合酶；包括以下步骤：

5.权利要求4制备所述的双功能融合酶Lip-EG1CD的方法所获得的双功能融合酶Lip-EG1CD。