CN108841803B

CN108841803B - 一种高效全降解聚己内酯的方法

Info

Publication number: CN108841803B
Application number: CN201810555051.9A
Authority: CN
Inventors: 丁少军; 刘敏
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2038-05-31
Also published as: CN108841803A

Abstract

本发明公开了一种高效全降解聚己内酯的方法，在聚己内酯降解中使用双功能融合酶进行降解，所述的双功能融合酶为含脂肪酶和角质酶活性的双功能融合酶Lip‑Cut，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的方法，所使用的双功能酶是基于角质酶和脂肪酶在水解机制上互补性而工程化构建获得，可以温和条件下协同作用发挥二种酶的催化性能，快速降解彻底PCL为6‑羟基己酸单体，便于回收再利用，在PCL降解和资源再生中具有良好的应用前景。

Description

一种高效全降解聚己内酯的方法

技术领域

本发明属于融合酶应用技术领域，具体涉及一种利用双功能融合酶Lip-Cut高效彻底降解聚己内酯(PCL)的方法。

背景技术

人工合成聚酯是一类使用领域非常广泛，消耗量非常巨大的高分子材料，在人工聚酯类产业迅速发展和广泛使用的同时，每年会出现大量聚酯类的废弃物。虽然这些废弃物毒性不大，不会直接危害环境及人类，但由于其数目庞大且自然条件下很难降解，因而此废弃物便成为全球性的环境污染有机物。聚己内酯(PCL)广泛应用作医用造型材料、工业、美术造型材料、玩具、有机着色剂、热复写墨水附着剂、热熔胶合剂等。虽然聚己内酯(PCL)被认为是一类可生物降解的高分子，但是自然界聚己内酯的降解仍然缓慢，造成环境污染。

角质酶是一种能够催化植物角质酯类聚合物和甘油三酯中酯键裂解的水解酶，部分角质酶展示出可有效降解聚酯PCL的特性。脂肪酶是催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯的类水解酶，一些脂肪酶也被确认为可以降解聚酯PCL。酶催化降解为PCL等聚酯类塑料污染问题提供了独特的解决方案，同时通过酶法降解成相应单体后，还可以回收利用，为PCL等聚酯类资源的再生利用提供可能，但目前基本处于探索的研究阶段，大多数酶的降解率不是很高，降解不彻底，降解产物组成复杂，不利于回收再生，仍需通过现代生物技术开发高效的酶法新降解方法。

发明内容

发明目的：针对自然界聚己内酯废弃物的降解缓慢、产生污染的问题，本发明的目的是提供一种高效全降解聚己内酯的方法，即利用基因工程技术提供一种工程化构建的高效双功能降解酶进行PCL降解的技术，该双功能酶法降解技术降解效率高，降解彻底，降解产物可再生利用，可望用于工业化PCL的降解和自然再生。本发明的另一目的是提供一种上述方法所使用的双功能融合酶Lip-Cut。本发明还有一目的是提供一种上述双功能融合酶Lip-Cut的制备方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效全降解聚己内酯的方法，在聚己内酯降解中使用双功能融合酶进行降解，所述的双功能融合酶为含脂肪酶和角质酶活性的双功能融合酶Lip-Cut，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的高效全降解聚己内酯的方法：在磷酸盐缓冲液中，加入聚己内酯和双功能融合酶Lip-Cut，在最适温度下水解8h以上，即可实现聚己内酯的全降解。

所述的磷酸盐缓冲液为pH＝8.0，0.05M的磷酸盐缓冲液。

所述的聚己内酯和双功能融合酶Lip-Cut的用量为400-500：1(重量比)。

所述的最适温度为40℃。

所述的双功能融合酶Lip-Cut的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种制备所述的双功能融合酶Lip-Cut的方法：将脂肪酶的基因片段和角质酶的基因片段通过来自草菇EG1的天然linker连接，获得融合基因，构建脂肪酶和角质酶的融合基因的表达载体，并在Pichia pastoris中表达，获得双功能融合酶。

所述的制备双功能融合酶Lip-Cut的方法，包括以下步骤：

1)以Lip基因序列为模板，采用引物5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-AGGTGGGGTTGGGTGCGCTGCTGGTTGTCGTAGGTCCATCACACTCTGAAAT-3’进行PCR扩增获得融合酶Lip-Cut的Lip片段；以Cut基因序列为模板，采用引物5’-ACCCAACCCCACCTCCAGTGGCTGCCCGAATGCCACCAAGGCCCCAACACAGCCA-3’和引物5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGAGCATCACCAATCTT-3’进行PCR扩增获得融合酶Lip-Cut的含linker的Cut片段；

2)以双功能融合酶Lip-Cut的Lip片段和Cut片段为模板，采用引物5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGAGCATCACCAATCTT-3’进行PCR扩增获得融合基因Lip-Cut，其中5'端的Lip通过来自EG1的天然连接序列与3'端的Cut连接；将融合基因Lip-Cut克隆到载体pPICZaA中，转入巴斯德毕赤酵母KM71H，诱导表达，纯化酶液最终获得双功能融合酶Lip-Cut。

所述的双功能融合酶Lip-Cut的制备方法所获得的双功能融合酶Lip-Cut。

所述的双功能融合酶Lip-Cut在PCL降解中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明所构建双功能酶，含脂肪酶和角质酶双功能活性，由于底物特异性和催化模式的互补性，构建的双功能融合酶Lip-Cut可以通过两部分的协同作用增强了催化性能。Lip，Cut，Lip/Cut混合酶和融合酶Lip-Cut存在下长时间孵育的PCL膜的重量损失率。来自T.lanuginosus的Lip处理的PCL膜的降解进行缓慢，降解48h后达到34％。在初始阶段，来自T.Terrestris的Cut处理的PCL膜的降解像Lip作用一样缓慢，但在30h后降解速度加快。Lip/Cut混合酶的降解模式与Cut相似，尽管降解48h后获得了更高的重量损失率(78％对65％)。在初始阶段，通过融合酶Lip-Cut处理的PCL膜的降解明显比Lip/Cut混合酶更有效和快速。PCL膜在被融合酶Lip-Cut降解约6h后，其质量损失率可达91.95％，相当于Lip、Cut、Lip/Cut处理后的14.35、12.77、6.67倍，其降解率的提高是由于融合酶Lip-Cut中两个部分之间的分子内的协同作用。这些结果表明，融合酶Lip-Cut在生物可降解塑料的再循环中具有潜在的应用，且可明显降低降解过程中的反应时间。通过GC-MS鉴定PCL膜的降解产物，经鉴定发现，除了对照样品外，分别由Lip-Cut处理的样品中主要降解产物为6-羟基己酸单体。可见该融合酶相比角质酶和脂肪酶单独使用相比，可以协调作用极大地提高了降解PCL的效率，并且降解产物主要为6-羟基己酸单体，便于回收再利用，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是Lip-Cut、Lip、Cut表达及纯化的SDS-PAGE图；图中，条带1、Lip-Cut；条带2、Lip；条带3、Cut；条带M、标准分子量蛋白marker；

图2是Lip，Cut，Lip/Cut混合酶和融合酶Lip-Cut降解PCL的质量损失率变化图；

图3是Lip，Cut，Lip/Cut混合酶和融合酶Lip-Cut降解后PCL膜的电镜扫描图，放大150×：(A)无酶降解后的PCL膜；(B)Lip降解48h后的PCL膜；(C)Cut降解48h后的PCL膜；(D)Lip/Cut混合酶降解48h后的PCL膜；(E)Lip-Cut降解4h后的PCL膜；

图4是PCL膜降解产物的GC-MS色谱图；图中，1：6-己内酯；2：6-羟基己酸；

图5是Lip-Cut处理样品的降解产物1即6-己内酯的质谱图；

图6是Lip-Cut处理样品的降解产物2即6-羟基己酸的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明

以下实施例所使用的材料和试剂如下：

菌株及载体：Thielavia terrestris来自于ATCC38088，Thermomyceslanuginosus来自于芬兰VTTCC，大肠杆菌DH5α、毕赤酵母KM71H(Mut^s,Arg⁺)及表达载体pPICZαA购自Invitrogen公司。

酶类及其它生化试剂：rTaq DNA Ploymerase(Takara)，Pfu DNA Ploymerase(Takara)，T4 DNA Ligase、EcoRI、XbaI、SacI(Promega)，IPTG(SIGMA)，X-gal(SIGMA)，Zeocin(Invitrogen)，dNTP(Takara)，Rnase和Dnase Away(BBI)，酵母提取物(Yeastextract)、细菌蛋白胨(Peptone)、胰蛋白胨(Tryptone)购自Oxoid公司，p-nitrophenylbutyrate，p-nitrophenyl octanoate购自Sigma公司；其余分析纯试剂购自国外或国内公司。

LB培养基(L^-1)：称取Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 5g，用800mL H₂O溶解后定容至1L，需配制固体平板时可在以上的基础上再加入20g Agar，必要时可以向其中加入一定浓度(100μg/mL)的抗生素溶液(Zeocin)，于121℃灭菌20min；用于菌种短期保存、活化培养及基因工程操作。

YPD培养基(L^-1)：称取Peptone 20g，Yeast extract 10g，Glucose 20g，用800mLH₂O溶解后定容至1L，需配制固体平板时可在以上的基础上再加入20g Agar，必要时可以向其中加入一定浓度(100μg/mL)的抗生素溶液(Zeocin)，于115℃灭菌30min；用于菌种短期保存、活化培养及基因工程操作。

10×YNB(13.4％Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without aminoAcids)：称取YNB 13.4g，用80mL H₂O溶解后定容至100mL，过滤除菌后4℃冰箱保存备用。

1M,pH 6.0磷酸(KH₂PO₄-K₂HPO₄·3H₂O)缓冲液：称取KH₂PO₄ 13.609g，用80mL H₂O溶解后定容至100mL，用22.822g/100mL的K₂HPO₄·3H₂O调节pH至6.0。过滤除菌后4℃保存。

BMGY培养基：称取Peptone 1g，Yeast extract 0.5g，甘油0.5mL，用20mL H₂O溶解后定容至40mL，121℃灭菌20min。冷却至室温后加入1M,pH 6.0的磷酸钾缓冲液和10×YNB溶液各5mL。

BMMY培养基：称取Peptone 0.5g，Yeast extract 0.25g，用10mL H₂O溶解后定容至20mL，121℃灭菌20min。冷却至室温后加入1M,pH 6.0的磷酸钾缓冲液和10×YNB溶液各2.5mL。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1基因的克隆

以Lip基因序列(来自T.lanuginosus，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)为模板，采用引物5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-AGGTGGGGTTGGGTGCGCTGCTGGTTGTCGTAGGTCCATCACACTCTGAAAT-3’进行PCR扩增获得融合酶Lip-Cut的Lip片段；以Cut基因序列(来自T.Terrestris，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)为模板，采用引物5’-ACCCAACCCCACCTCCAGTGGCTGCCCGAATGCCACCAAGGCCCCAACACAGCCA-3’和引物5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGAGCATCACCAATCTT-3’进行PCR扩增获得融合酶Lip-Cut的含linker的Cut片段；以双功能融合酶Lip-Cut的Lip片段和Cut片段为模板，采用引物5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGAGCATCACCAATCTT-3’进行PCR扩增获得融合基因Li p-Cut，其中5'端的Lip通过来自EG1的天然连接序列与3'端的Cut连接。将融合基因Lip-Cut克隆到载体pPICZaA 中，转入巴斯德毕赤酵母KM71H，诱导表达，纯化酶液最终获得双功能融合酶Lip-Cut，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该蛋白的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。利用思普金公司快速PCR产物纯化试剂盒回收纯化扩增得到的含有双酶切位点的Lip，Cut和Lip-Cut基因片段。将这些基因克隆到载体pPICZaA中，大肠杆菌E.coli DH5α扩增，然后送南京思普金生物科技有限公司测序，测序结果显示正确。

实施例2Lip，Cut和Lip-Cut在P.pastoris KM71H中的表达及纯化

将测序正确的阳性克隆DH5α接种于含3mL LB液体培养基的试管中，37℃，200rpm/min振荡培养12h左右。重组表达质粒pPICZαA-Lip，pPICZαA-Cut和pPICZαA-Lip-Cut的小量提取使用北京全式金生物技术有限公司的质粒小提试剂盒(EasyPure Plasmid MiniPrepKit)进行提取。将提取好的重组表达质粒pPICZαA-Lip，pPICZαA-Cut和pPICZαA-Lip-Cut转入P.pastoris KM71H，涂布含有100μg/mL Zeocin的平板筛选阳性克隆，将筛选到的阳性克隆，接入含100μg/mL Zeocin的3mL YPD液体培养基中摇床培养16-18h；将培养的菌液按1:100-1:50的比例接种于50mL灭菌的BMGY培养基中，28℃，200rpm/min振荡培养至OD₆₀₀＝6.0-8.0；将菌液3000rpm/min离心5min收集菌体，弃上清液，将菌体用25mL BMMY培养基重新悬浮，28℃，200rpm/min摇床培养4-5d，期间每天补加甲醇至终浓度为0.8％(v/v)，以使其诱导表达。诱导表达结束后，将菌液10000rpm/min离心10min收集上清，将上清液装入透析袋中，4℃下在Lysis buffer中透析24h，期间更换2-3次透析液。酶液的纯化参照Ni-NTAAgarose(Qiagen)的方法。将纯化得到的蛋白利用10％SDS-PAGE进行检测。结果如图1所示，可见重组体Lip，Cut和Lip-Cut在P.pastoris KM71H中得到成功表达，经Ni-NTA agarose纯化后的重组体Lip，Cut和Lip-Cut的分子量分别约为34kDa，23kDa和53kDa，其分子量与它们的理论分子量是一致的。

实施例3

利用双功能融合酶Lip-Cut进行PCL降解，其步骤为：

1)称取1g聚己内酯(PCL)溶解于100mL三氯甲烷中，利用磁力搅拌器RH-KT/C将各种多聚酯分别搅拌均匀约12h；

2)将完全溶解的各种溶液分别放入聚四氟乙烯容器里自然蒸发后备用；

3)将制备的各种聚合物膜从容器里剥离，并将其剪成约5×10mm²的样品，然后于恒温干燥箱中干燥、保存、备用；

4)在反应容器中加入1mLpH8.00.05M磷酸盐缓冲液(K₂HPO₄-KH₂PO₄)、准确称重后的各种聚合物膜、相同分子数的Lip、Cut和Lip-Cut(0.869nmol)，在最适温度下(35℃Lip、40℃Lip-Cut、40℃Lip/Cut、50℃Cut)150rpm/min下分别水解48h，实验进行期间，定时取样，对照组用水代替酶液，其余条件完全一样；

5)降解实验结束后，用去离子水将各种聚合物膜充分洗涤3次；

6)将冲洗后的膜于恒温干燥箱中干燥、称重。

通过测量各种聚合物膜的重量损失率来评价Lip、Cut、Lip/Cut和Lip-Cut降解各种聚合物膜活性。降解后各种聚合物膜的重量损失率用以下公式计算：

重量损失率(％)＝100×(W降解前膜重量–W降解后膜重量)/W降解前膜重量，W是膜重量，mg。

结果如图2所示，表明PCL膜在被融合酶Lip-Cut降解约6h后，其质量损失率可达91.95％，相当于Lip、Cut、Lip/Cut处理后的14.35、12.77、6.67倍，其降解率的提高是由于融合酶Lip-Cut中两个部分之间的分子内的协同作用。通过GC-MS鉴定PCL膜的降解产物，主要降解产物为6-羟基己酸单体。这些结果表明，融合酶Lip-Cut在生物可降解塑料的再循环中具有潜在的应用，且可明显降低降解过程中的反应时间。

实施例4

Lip，Cut，Lip/Cut混合酶和融合酶Lip-Cut降解后PCL膜的电镜分析，其步骤为：

1)降解后PCL膜用去离子水洗涤三次，在覆盖玻璃上干燥，涂覆金颗粒；

2)用Hitachi S-4800(Hitachi，Tokyo，Japan)电镜，在15kV下，以150×的放大倍数对PCL膜进行电镜扫描。

结果如图3所示，看出，对照样品的PCL膜表面相当平滑和完整，表明没有发生降解。在Lip处理48h后，PCL膜表面出现一些裂纹。在Cut处理48h后，PCL膜表面的部分区域开始出现孔洞而另一些区域仍存在裂纹的外观。在Lip/Cut混合酶处理48h后，PCL膜的表面变得粗糙，并且孔洞尺寸显示出增大趋势。通过融合酶Lip-Cut处理4h，PCL膜的表面变得更加粗糙且出现更多更大尺寸的孔洞，此结构说明融合酶Lip-Cut具有更为有效的PCL降解活性。

实施例5

PCL膜降解产物的GC-MS分析，其步骤为：

1)用乙酸乙酯萃取反应混合物中的降解产物：

2)使用Agilent 6890GC/5975MS进行GC-MS分析：GC-MS分析使用直径0.25mm×长度30m的DB-5毛细管色谱柱。温度程序如下：初始温度60℃(保持1min)，60-300℃，温度上升15℃/min；氦气作为载气，流速为1mL/min，气化温度设定在280℃；MS测量用的电离能量为70eV，离子源温度设定在230℃，质谱扫描范围为10-650amu。通过将其相对保留时间和质谱与已建立的标准(GC-MS系统的NIST文库数据)进行比较来鉴定降解产物组分。

通过GC-MS鉴定PCL膜的降解产物，如图4、5、6所示，除了对照样品外，分别由Lip-Cut处理的样品中的主要降解产物为6-羟基己酸和微量6-己内酯单体。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种高效全降解聚己内酯的方法

<130> 100

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 508

<212> PRT

<213> 双功能融合酶Lip-Cut的蛋白序列(Artificial)

<400> 1

Arg Pro Val Arg Arg Ala Val Pro Gln Asp Leu Leu Asp Gln Phe Glu

1 5 10 15

Leu Phe Ser Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Ala Asn Asn His

20 25 30

Ala Pro Val Gly Ser Asp Val Thr Cys Ser Glu Asn Val Cys Pro Glu

35 40 45

Val Asp Ala Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Leu Gly Asp Val Thr Gly Leu Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu

65 70 75 80

Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Val Glu Asn Trp Ile Ala

85 90 95

Asn Leu Ala Ala Asp Leu Thr Glu Ile Ser Asp Ile Cys Ser Gly Cys

100 105 110

Glu Gly His Val Gly Phe Val Thr Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr

115 120 125

Ile Arg Glu Gln Val Gln Asn Ala Val Asn Glu His Pro Asp Tyr Arg

130 135 140

Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Ile Ala

145 150 155 160

Ala Ala Ala Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Ile Asp Val Phe Ser Tyr

165 170 175

Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala

180 185 190

Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val

195 200 205

Pro Arg Leu Pro Pro Arg Asp Trp Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu

210 215 220

Tyr Trp Val Thr Ser Gly Asn Asp Val Pro Val Thr Ala Asn Asp Ile

225 230 235 240

Thr Val Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Gly Asn

245 250 255

Ile Pro Asp Ile Pro Ser His Leu Trp Tyr Phe Gly Pro Ile Ser Glu

260 265 270

Cys Asp Gly Pro Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Asn Pro Thr Ser Ser

275 280 285

Gly Cys Pro Asn Ala Thr Lys Ala Pro Thr Gln Pro Ala Gly Glu Ala

290 295 300

Ala Val Glu Ala Arg Gln Leu Phe Ser Asp Thr Ala Asn Asp Leu Glu

305 310 315 320

Asn Gly Val Ser Ser Asn Cys Pro Lys Val Ile Phe Ile Cys Ala Arg

325 330 335

Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn Leu Gly Ser Ser Val Cys Pro Glu Val

340 345 350

Ala Asn Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Pro Asn Gln Leu Trp Val Gln Gly

355 360 365

Val Gly Gly Ala Tyr Thr Ala Asp Leu Ala Ser Asn Ala Leu Pro Gly

370 375 380

Gly Thr Ser Thr Ala Ala Met Gln Glu Ala Ala Asn Met Phe Asn Leu

385 390 395 400

Ala Gln Gln Lys Cys Pro Asn Ala Ser Val Ala Ala Gly Gly Tyr Ser

405 410 415

Gln Gly Thr Ala Val Val Ala Gly Gly Ile Gln Ser Leu Ser Ala Ala

420 425 430

Ala Lys Asp Gln Ile Lys Gly Val Val Leu Phe Gly Tyr Thr Gln Ala

435 440 445

Gln Gln Asn His Asp Thr Ile Pro Asn Phe Pro Val Asp Lys Thr Met

450 455 460

Ile Phe Cys Ala Gln Gly Asp Leu Val Cys Asn Gly Thr Leu Ile Val

465 470 475 480

Thr Ala Ala His Phe Ser Tyr Ile Thr Asn Gly Asp Ala Ser Thr Lys

485 490 495

Gly Pro Ala Trp Leu His Glu Lys Ile Gly Asp Ala

500 505

<210> 2

<211> 1524

<212> DNA

<213> 双功能融合酶Lip-Cut的核苷酸序列(Artificial)

<400> 2

cggcctgttc gacgagcggt tccgcaagat ctgctcgacc agtttgaact cttttcacaa 60

tattcggcgg ccgcatactg tgcggcaaac aatcatgctc cagtgggctc agacgtaacg 120

tgctcggaga atgtctgccc tgaggtagat gcggcggacg caacgtttct ctattctttt 180

gaagattctg gattaggcga tgttaccggc cttctcgctc tcgacaacac gaataaactg 240

atcgtcctct ctttccgcgg ctctcgttca gtagagaact ggatcgcgaa cctcgccgcc 300

gacctgacag aaatatctga catctgctcc ggctgcgagg ggcatgtcgg cttcgttact 360

tcttggaggt ctgtagccga cactataagg gagcaggtgc agaatgccgt gaacgagcat 420

cccgattacc gcgtggtctt taccggacat agcttgggag gcgcactggc aactattgcc 480

gcagcagctc tgcgaggaaa tggatacaat atcgacgtgt tctcatatgg cgcgccccgc 540

gtcggtaaca gggcatttgc agaattcctg accgcacaga cgggcggcac cctgtatcgc 600

atcacccata ccaatgatat cgtccctaga ctccctcctc gagactgggg ttacagccac 660

tctagcccgg agtactgggt cacgtctggt aacgacgtcc cagtgaccgc aaacgacatc 720

accgtcgtgg agggcatcga ttccaccgac gggaacaacc aggggaatat cccagacatc 780

ccttcgcatc tatggtattt cggtcccatt tcagagtgtg atggacctac gacaaccagc 840

agcgcaccca accccacctc cagtggctgc ccgaatgcca ccaaggcccc aacacagcca 900

gctggggaag ccgccgtgga agcaaggcaa ttgttctctg atactgctaa cgatctggaa 960

aatggtgtga gtagtaactg tcccaaggtc atctttattt gtgctcgagg ttctactgaa 1020

accggaaact tagggtcctc tgtatgtccc gaagtggcta atggattgaa aaattactac 1080

cctaaccaac tatgggttca aggtgtcggt ggagcataca ctgctgattt agcaagtaat 1140

gcattacctg gaggaacctc tacagcagcc atgcaagagg cagctaacat gtttaacctt 1200

gctcaacaga aatgtccaaa tgcatctgtt gctgctggtg gttattctca gggaaccgca 1260

gtcgtggccg gtggtataca aagtctttct gccgcagcta aagatcagat caagggcgtt 1320

gttttgtttg gatacacaca agcccaacaa aaccacgata ccatacccaa tttccctgtt 1380

gacaaaacta tgattttttg cgcccaagga gacttggttt gtaatgggac attaatcgtt 1440

acagccgccc acttctcata tattactaac ggtgacgctt ctacaaaggg tccagcctgg 1500

ttacacgaga agattggtga tgct 1524

<210> 3

<211> 822

<212> DNA

<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 3

cggcctgttc gacgagcggt tccgcaagat ctgctcgacc agtttgaact cttttcacaa 60

tattcggcgg ccgcatactg tgcggcaaac aatcatgctc cagtgggctc agacgtaacg 120

tgctcggaga atgtctgccc tgaggtagat gcggcggacg caacgtttct ctattctttt 180

gaagattctg gattaggcga tgttaccggc cttctcgctc tcgacaacac gaataaactg 240

atcgtcctct ctttccgcgg ctctcgttca gtagagaact ggatcgcgaa cctcgccgcc 300

gacctgacag aaatatctga catctgctcc ggctgcgagg ggcatgtcgg cttcgttact 360

tcttggaggt ctgtagccga cactataagg gagcaggtgc agaatgccgt gaacgagcat 420

cccgattacc gcgtggtctt taccggacat agcttgggag gcgcactggc aactattgcc 480

gcagcagctc tgcgaggaaa tggatacaat atcgacgtgt tctcatatgg cgcgccccgc 540

gtcggtaaca gggcatttgc agaattcctg accgcacaga cgggcggcac cctgtatcgc 600

atcacccata ccaatgatat cgtccctaga ctccctcctc gagactgggg ttacagccac 660

tctagcccgg agtactgggt cacgtctggt aacgacgtcc cagtgaccgc aaacgacatc 720

accgtcgtgg agggcatcga ttccaccgac gggaacaacc aggggaatat cccagacatc 780

ccttcgcatc tatggtattt cggtcccatt tcagagtgtg at 822

<210> 4

<211> 639

<212> DNA

<213> Thielavia terrestris

<400> 4

gccccaacac agccagctgg ggaagccgcc gtggaagcaa ggcaattgtt ctctgatact 60

gctaacgatc tggaaaatgg tgtgagtagt aactgtccca aggtcatctt tatttgtgct 120

cgaggttcta ctgaaaccgg aaacttaggg tcctctgtat gtcccgaagt ggctaatgga 180

ttgaaaaatt actaccctaa ccaactatgg gttcaaggtg tcggtggagc atacactgct 240

gatttagcaa gtaatgcatt acctggagga acctctacag cagccatgca agaggcagct 300

aacatgttta accttgctca acagaaatgt ccaaatgcat ctgttgctgc tggtggttat 360

tctcagggaa ccgcagtcgt ggccggtggt atacaaagtc tttctgccgc agctaaagat 420

cagatcaagg gcgttgtttt gtttggatac acacaagccc aacaaaacca cgataccata 480

cccaatttcc ctgttgacaa aactatgatt ttttgcgccc aaggagactt ggtttgtaat 540

gggacattaa tcgttacagc cgcccacttc tcatatatta ctaacggtga cgcttctaca 600

aagggtccag cctggttaca cgagaagatt ggtgatgct 639

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物序列(Artificial)

<400> 5

agagaggctg aagctgaatt ccggcctgtt cgacgagcgg t 41

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 引物序列(Artificial)

<400> 6

aggtggggtt gggtgcgctg ctggttgtcg taggtccatc acactctgaa at 52

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 引物序列(Artificial)

<400> 7

acccaacccc acctccagtg gctgcccgaa tgccaccaag gccccaacac agcca 55

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物序列(Artificial)

<400> 8

gagatgagtt tttgttctag aaatcaatga tgatgatgat gatgagcatc accaatctt 59

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物序列(Artificial)

<400> 9

agagaggctg aagctgaatt ccggcctgtt cgacgagcgg t 41

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物序列(Artificial)

<400> 10

gagatgagtt tttgttctag aaatcaatga tgatgatgat gatgagcatc accaatctt 59

Claims

1.一种高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于，在聚己内酯降解中使用双功能融合酶进行降解，所述的双功能融合酶为含脂肪酶和角质酶活性的双功能融合酶Lip-Cut，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。

2.根据权利要求1所述的高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于：在磷酸盐缓冲液中，加入聚己内酯和双功能融合酶Lip-Cut，在最适温度下水解8h以上，即可实现聚己内酯的全降解。

3.根据权利要求2所述的高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液为pH=8.0，0.05M的磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求2所述的高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于：所述的聚己内酯和双功能融合酶Lip-Cut的重量比为400-500：1。

5.根据权利要求2所述的高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于：所述的最适温度为40℃。

6.根据权利要求1或2所述的高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于：所述的双功能融合酶 Lip-Cut 的编码基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。

7.双功能融合酶 Lip-Cut在聚己内酯降解中的应用；所述的双功能融合酶 Lip-Cut由以下方法制备获得：将脂肪酶的基因片段和角质酶的基因片段通过来自草菇 EG1 的天然linker 连接，获得融合基因，构建脂肪酶和角质酶的融合基因的表达载体，并在 Pichia pastoris 中表达，获得双功能融合酶；包括以下步骤：

1）以Lip基因序列为模板，采用引物 5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCcggcctgttcgacgagcggt-3’ 和引物 5’-AGGTGGGGTTGGGTGCGCTGCTGGTTGTCGTAGGTCCATCACACTCTGAAAT-3’ 进行PCR 扩增获得融合酶 Lip-Cut 的 Lip 片段；以 Cut 基因序列为模板，采用引物 5’-acccaaccccacctccagtggctgcccgaatgccaccaagGCCCCAACACAGCCA-3’ 和引物 5’-gagatgagtttttgttctagaAATCAATGATGATGATGATGATGAGCATCACCAATCTT-3’ 进行 PCR 扩增获得融合酶Lip-Cut 的含 linker 的 Cut 片段；

2）以双功能融合酶 Lip-Cut 的 Lip 片段和 Cut 片段为模板，采用引物 5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCcggcctgttcgacgagcggt-3’和引物 5’-gagatgagtttttgttctagaAATCAATGATGATGATGATGATGAGCATCACCAATCTT-3’ 进行 PCR 扩增获得融合基因 Lip-Cut，其中 5'端的 Lip 通过来自 EG1 的天然连接序列与 3' 端的 Cut 连接；将融合基因 Lip-Cut 克隆到载体 pPICZaA 中，转入巴斯德毕赤酵母 KM71H，诱导表达，纯化酶液最终获得双功能融合酶 Lip-Cut。