CN104937015A - 用于再循环塑料制品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于再循环至少一种塑料制品的方法，所述方法包括使用酶将塑料制品的至少一种聚合物降解为单体并回收所得单体。本发明的方法可用于同时或依次降解塑料制品的至少两种不同的聚合物，和/或再循环至少两种塑料制品。

Description

用于再循环塑料制品的方法
技术领域
本发明涉及用于再循环塑料制品如废塑料的方法。更特别地，本发明涉及用于解聚塑料制品的至少一种聚合物并回收所得单体的生物方法，所述单体可以进一步再加工以合成新的聚合物和制造新的塑料制品。
背景技术
塑料是便宜且耐久的材料，其可以用于制造应用于大范围用途的各种产品，从而使得在过去十年里塑料的制造急剧增加。这些塑料的约40％用于一次性应用如包装、农用薄膜、一次性消费产品或者用于在制造一年内丢弃的短期产品。因为所涉及的聚合物的耐久性，大量的塑料在全世界的垃圾填埋场和自然栖息地堆积，从而产生越来越多的环境问题。即使可降解和可生物降解的塑料也可以随着当地的环境因素如紫外线照射水平、温度、合适微生物的存在等而存留几十年。
一种降低与塑料的累积相关的环境和经济影响的方案是其中将塑料材料机械再加工以制造新产品的闭环再循环。例如最常见的闭环再循环之一是聚对苯二甲酸(PET)再循环。对PET废品进行连续处理从而产生食物接触允许的再循环PET(rPET)，所述再循环PET被收集、分类、压制成包、压碎、洗涤、切成薄片、熔融并以小球的形式挤出，并且被出售。然后，可以将这些再循环PET用于制造用于服装行业或者新包装如瓶子或泡罩包装等的织物。
然而，通常将塑料废品收集在一起，从而使得塑料包(bale)包含不同塑料的混合物，所述塑料的组成可以随来源不同而变化，并且所述塑料的比例可以随着包的不同而变化。因此，再循环方法需要初步选择以根据它们的组成、尺寸、树脂类型、颜色、所用功能添加剂等而对塑料制品进行分类。
另外，实际的塑料再循环方法使用大量的电，特别是在挤出步骤期间，并且所用的设备也昂贵，从而导致与新塑料(virgin plastic)相比可能无竞争性的高价格。
用于再循环塑料的另一种可能的方法由允许回收聚合物的化学成分的化学再循环组成。然后可以将所得单体用于再制造塑料或者制备其他合成化学品。然而，迄今为止，这种再循环方法仅在纯化过的聚合物上进行过并且对由结晶和无定形的聚合物与添加剂的混合物构成的未加工的塑料制品并不有效。
因此，需要用于再循环塑料制品的升级方法，其不需要初步分类和昂贵的预处理，并且可以用于再循环不同的塑料材料。
发明内容
现在，本发明人提出用于以低能耗解聚至少一种塑料制品的至少一种聚合物的生物方法。本发明的方法允许回收形成塑料制品的原始聚合物的单体，使得可以对所述单体进行再加工以合成相同类型的新聚合物链。更特别地，本发明人提出使用特别的酶，所述酶能够解聚所述塑料制品的聚合物并生产形成原始聚合物的单体的混合物。
就这点而言，本发明的一个目的是提出用于再循环至少一种塑料制品的方法，所述方法包括使用酶将塑料制品的至少一种聚合物解聚为单体并回收所得单体。
本发明的另一个目的涉及用于再循环塑料制品的至少两种不同聚合物的方法，其中所述至少两种不同聚合物被同时或依次解聚，并且其中将所得单体进行回收。
本发明还涉及一种用于同时或依次再循环至少两种不同的塑料制品的方法，其中使用至少一种酶将各塑料制品的至少一种聚合物降解为单体，并且其中将所得单体进行回收。
优选地，所述塑料制品包含选自聚酯和聚酰胺的至少一种聚合物。
更优选地，所述聚酯选自：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)，聚对苯二甲酸乙二醇异山梨醇酯(PEIT)，聚乳酸(PLA)，聚(L-乳酸)(PLLA)，聚(D-乳酸)(PDLA)，聚(D,L-乳酸)(PDLLA)，PLA立构复合物(scPLA)，聚羟基烷酸酯(PHA)，聚(3-羟基丁酸酯)(P(3HB)/PHB)，聚(3-羟基戊酸酯)(P(3HV)/PHV)，聚(3-羟基己酸酯)(P(3HHx))，聚(3-羟基辛酸酯)(P(3HO))，聚(3-羟基癸酸酯)(P(3HD))，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)(P(3HB-共-3HV)/PHBV)，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)(P(3HB-共-3HHx)/(PHBHHx))，聚(3-羟基丁酸酯-共-5-羟基戊酸酯)(PHB5HV)，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯)(PHB3HP)，聚羟基丁酸酯-共-羟基辛酸酯(PHBO)，聚羟基丁酸酯-共-羟基十八酸酯(PHBOd)，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯-共-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-共-3HV-共-4HB))，聚丁二酸丁二醇酯(PBS)，聚丁二酸己二酸丁二醇酯(PBSA)，聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)，聚糠酸乙二醇酯(PEF)，聚己内酯(PCL)，聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)，以及这些材料的共混物/混合物。
并且所述聚酰胺优选选自：聚酰胺-6或聚(β-己内酰胺)或聚己酰胺(PA6)，聚酰胺-6,6或聚(己二酰己二胺)(PA6,6)，聚(11-氨基十一碳酰胺)(PA11)，聚十二碳内酰胺(PA12)，聚(己二酰丁二胺)(PA4,6)，聚(癸二酰戊二胺)(PA5,10)，聚(壬二酰己二胺)(PA6,9)，聚(癸二酰己二胺)(PA6,10)，聚(十二碳酰己二胺)(PA6,12)，聚(己二酰间二甲苯二胺)(PAMXD6)，聚己二酰己二胺/聚对苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6T)，聚己二酰己二胺/聚间苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6I)，以及这些材料的共混物/混合物。
有利地，对回收的单体进行进一步再加工以合成新的聚合物。
优选地，所述酶是适合于将所述塑料制品的至少一种聚合物解聚为单体的降解酶。
所述降解酶优选选自：角质酶(EC 3.1.1.74)，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，酯酶，羧酸酯酶(EC 3.1.1.1)，对硝基苯甲基酯酶，丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21.64)，蛋白酶，酰胺酶，芳基酰基酰胺酶(EC 3.5.1.13)，低聚物水解酶如6-氨基己酸酯环状二聚物水解酶(EC 3.5.2.12)、6-氨基己酸酯二聚物水解酶(EC 3.5.1.46)、6-氨基己酸酯-低聚物水解酶(EC 3.5.1.B17)，过氧化物酶，漆酶(EC 1.10.3.2)。
在另一个特定实施方式中，所述酶可以为产生和/或激活适合于将塑料制品的至少一种聚合物解聚为单体的至少一种中间分子的中间酶。
在一个特定实施方式中，所述方法包括下列步骤：
a)使所述塑料制品与至少一种表达和分泌解聚酶或中间酶的微生物接触；
b)将由所述塑料制品的至少一种聚合物的解聚得到的单体进行回收。
在一个特定实施方式中，所述表达和分泌所述酶的微生物为具有防止所得单体消耗的改良的代谢的重组微生物。
在另一个特定实施方式中，所述微生物为表达和分泌重组降解酶的重组微生物。
在另一个特定实施方式中，所述方法包括下列步骤：
a)使所述塑料制品与至少一种解聚酶接触；
b)将由所述塑料制品的至少一种聚合物的解聚得到的单体进行回收。
根据本发明，所述降解酶可以与至少一种亲脂性和/或亲水性试剂一起使用。
在降解之前，可以对塑料制品进行预处理。更特别地，预处理可以包括塑料制品的机械/物理改性如切削和冲击、压碎和研磨、分馏、低温冷却步骤、干燥、脱水、凝聚或造粒。
在一个特定实施方式中，在降解之前，可以对塑料制品进行进一步分类、洗涤和/或生物清洁。
在对包括以一般术语给出的本发明优选实施方式的本发明进行详细说明之后，本发明的这些和其他目的与实施方式会变得更加显而易见。
附图说明
图1示出根据本发明的方法在塑料小球中包含的聚乳酸聚合物的水解之后的乳酸的产生。对pH进行调节以将其保持在8左右使得即使在48小时或72小时之后也可以增加单体产生；
图2示出可以通过本发明的方法水解塑料制品中包含的聚对苯二甲酸乙二醇酯并且可以回收对苯二甲酸单体；
图3示出PET塑料制品的粒子尺寸对本发明方法的效率的影响。
具体实施方式
本发明涉及一种完全再循环方法，所述方法用于通过解聚构成塑料制品的至少一种聚合物而将所述塑料制品再循环，其中产生并回收可再聚合的单体混合物。
定义
通过参考下列定义，将会最好地理解本公开内容。
在本发明的上下文中，术语“塑料制品”是指由包含至少一种聚合物的至少一种塑料材料诸如塑料片、塑料管、塑料棒、塑料异型材、塑料成型材、塑料大块、塑料纤维等以及可能的其他物质或添加剂如增塑剂、矿物或有机填料制成的任意物品。优选地，塑料制品由半结晶和/或无定形的聚合物、或半结晶的聚合物和添加剂的混合物构成。更优选地，塑料制品是制成品如包装、农用薄膜、一次性物品等。本发明的塑料材料包括合成的、可降解的和可生物降解的塑料。在本发明的上下文中，天然橡胶和合成橡胶不被视为塑料材料，并且将橡胶产品排除在本发明的范围外。
“聚合物”是指结构由经共价化学键连接的多个重复单元构成的化学化合物或化合物的混合物。在本发明的上下文中，术语聚合物包括天然或合成的聚合物，其由一种重复单元构成(即均聚物)或者由不同重复单元的混合物构成(即嵌段共聚物和无规共聚物)。
关于塑料制品的“再循环方法”是指如下的方法，通过该方法将所述塑料制品的至少一种聚合物降解以生产可再聚合的单体，所述单体被恢复以便再次使用。
在本说明书中，“重组微生物”是指其基因组通过至少一个核酸序列或单元的插入而被改良的微生物。通常，插入的核酸序列或单元并不天然地存在于微生物的基因组中。使用重组DNA技术(也称作基因克隆或分子克隆)，将所述核酸序列或单元组装和/或插入在所述微生物或其祖系体中，所述重组DNA技术是指将DNA从一个生物转移到另一个生物体的技术。核酸序列或单元可以整合到微生物染色体中，或者可以存在于质粒上。“重组微生物”还指基因组通过至少一个核酸序列或单元的失活或缺失而被改良的微生物。所得的重组微生物可以通过各种方法制造，并且一旦被制得，则可以在不使用另外重组DNA技术的情况下进行复制。否则，重组微生物可以产生于宏基因组文库。
术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核苷酸序列”可交换使用，并且是指脱氧核苷酸和/或核苷酸的序列。核苷酸序列可以首先通过例如重组、酶和/或化学技术来制备，并随后在宿主细胞或体外系统中进行复制。核苷酸序列优先包含编码(多)肽的开放阅读框。核苷酸序列可以包含附加的序列如转录终止子、信号肽、内含子等。
在本发明的上下文中，关于酶或(多)肽的术语“衍生自微生物”表明酶或(多)肽是从这种微生物进行分离，或者酶或(多)肽包含从这种微生物分离或表征的酶或(多)肽的氨基酸序列的全部或生物活性部分。
术语“载体”是指被用作运载体以将重组基因材料转移到宿主细胞中的DNA分子。载体的主要类型为质粒、噬菌体、病毒、粘粒和人工染色体。载体自身通常为由插入物(异源核酸序列，转基因)和用作载体的“骨架”的更大序列组成的DNA序列。将遗传信息转移到宿主的载体的目的通常为在靶细胞中分离、繁殖(multiply)或表达插入物。称作表达载体(表达构建体(expression construct))的载体具体地适合于异源序列在靶细胞中的表达，并且通常具有驱动编码多肽的异源序列的表达的启动子序列。通常，存在于表达载体中的调控元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和任选存在的操纵子。优选地，表达载体还包括用于宿主细胞中的自主复制的复制源、可选择的标记物、有限量的有用的限制性酶切位点和高拷贝数的可能性。表达载体的实例为克隆载体、改良的克隆载体，特别设计的质粒和病毒。在不同宿主中提供合适水平的多肽表达的表达载体是本领域中熟知的。本领域中熟知的细菌表达载体包括pET11a(Novagen)，lamda gt11(Invitrogen)。
可以使用标准技术将表达载体引入到宿主细胞中。这种技术的实例包括转化、转染、脂肪转染(lipotransfection)、原生质体融合和电穿孔。在例如如下的文献中提供了用于将核酸引入到细胞中并表达核酸以制造蛋白质的技术的实例：Ausubel，分子生物学实验室指南(CurrentProtocols in molecular biology)，John wiley，1987-1998和Sambrook等人，分子克隆(Molecular cloning)，实验室手册第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989。
塑料制品
本发明提出将塑料制品进行降解直至单体水平，使得可以将所述单体重新使用以重新聚合聚合物并进一步制造新的塑料制品。
本发明的方法可以用于将利用几种不同塑料材料制成的塑料制品再循环。例如，塑料制品可以包含连续层的不同塑料材料。
本发明的再循环方法可以用于降解所有种类的塑料制品，而不需要进行初步塑料分类和/或清洁。更特别地，本发明的方法可以直接应用于来自塑料废品收集的塑料制品。例如，本发明的方法可以应用于包括塑料瓶、塑料袋、塑料包装、纺织废品等的家用塑料废品的混合物。
本发明方法的目标塑料制品可以包括不同种类的塑料材料，包括源自石油化学产品的合成塑料材料，或者生物基塑料材料(即全部或大量部分由生物制品构成)。
目标塑料制品可以包含一种或几种聚合物，和添加剂。一种塑料制品可以由设置在不同层中或熔融在一起的几种聚合物构成。此外，塑料制品可以由半结晶聚合物或者半结晶和无定形聚合物的混合物以及添加剂构成。
在一个特定实施方式中，塑料制品仅由包含饱和线性碳主链的聚合物组成，所述聚合物可还包含饱和或不饱和的环如芳环。
在一个特定实施方式中，目标塑料制品包含聚酯和/或聚酰胺。优选地，塑料制品仅包含聚酯和/或聚酰胺。优选的聚酯为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)，聚对苯二甲酸乙二醇异山梨醇酯(PEIT)，聚乳酸(PLA)，聚(L-乳酸)(PLLA)，聚(D-乳酸)(PDLA)，聚(D,L-乳酸)(PDLLA)，PLA立构复合物(scPLA)，聚羟基烷酸酯(PHA)，聚(3-羟基丁酸酯)(P(3HB)/PHB)，聚(3-羟基戊酸酯)(P(3HV)/PHV)，聚(3-羟基己酸酯)(P(3HHx))，聚(3-羟基辛酸酯)(P(3HO))，聚(3-羟基癸酸酯)(P(3HD))，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)(P(3HB-共-3HV)/PHBV)，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)(P(3HB-共-3HHx)/(PHBHHx))，聚(3-羟基丁酸酯-共-5-羟基戊酸酯)(PHB5HV)，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯)(PHB3HP)，聚羟基丁酸酯-共-羟基辛酸酯(PHBO)，聚羟基丁酸酯-共-羟基十八酸酯(PHBOd)，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯-共-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-共-3HV-共-4HB))，聚丁二酸丁二醇酯(PBS)，聚丁二酸己二酸丁二醇酯(PBSA)，聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)，聚糠酸乙二醇酯(PEF)，聚己内酯(PCL)，聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)，以及这些材料的共混物/混合物；并且优选的聚酰胺为聚酰胺-6或聚(ε-己内酰胺)或聚己酰胺(PA6)，聚酰胺-6,6或聚(己二酰己二胺)(PA6,6)，聚(11-氨基十一碳酰胺)(PA11)，聚十二碳内酰胺(PA12)，聚(己二酰丁二胺)(PA4,6)，聚(癸二酰戊二胺)(PA5,10)，聚(壬二酰己二胺)(PA6,9)，聚(癸二酰己二胺)(PA6,10)，聚(十二碳酰己二胺)(PA6,12)，聚(己二酰间二甲苯二胺)(PAMXD6)，聚己二酰己二胺/聚对苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6T)，聚己二酰己二胺/聚间苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6I)，以及这些材料的共混物/混合物。
在一个特定实施方式中，塑料制品由脂族聚酯如聚乳酸、且更特别地半结晶聚乳酸构成。
在另一个实施方式中，塑料制品由芳族聚酯如聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸丙二醇酯、更特别地半结晶的聚对苯二甲酸乙二醇酯和/或聚对苯二甲酸丙二醇酯构成。
塑料降解
本发明的目的是提供适合于水解塑料制品的至少一种聚合物的单体之间的化学键的降解酶。
根据本发明，根据待水解的聚合物，这种降解酶可以为角质酶，脂肪酶，酯酶，羧酸酯酶，对硝基苯甲基酯酶，丝氨酸蛋白酶，蛋白酶，酰胺酶，芳基酰基酰胺酶，低聚物水解酶，过氧化物酶，漆酶等。
例如，可以将丝氨酸蛋白酶(如源自白色念球菌(Tritirachium album)的蛋白酶K或源自拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的PLA解聚酶)或脂肪酶(如源自南极假丝酵母(Candida antarctica)或隐球菌(Cryptococcus sp.)或黑曲霉(Aspergillus niger)的脂肪酶)或酯酶(如源自Thermobifidahalotolerans的酯酶)用于解聚包含聚乳酸(PLA)的塑料制品。可以将角质酶(如源自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)或纤维素酶产生菌(Thermobifida alba)或豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶)或脂肪酶(如源自洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)的脂肪酶PS)用于解聚包含PET或PTT的塑料制品。可以将角质酶(如源自腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的角质酶)或芳基酰基酰胺酶(如源自鼻疽诺卡菌(Nocardia farcinica)的芳基酰基酰胺酶)或低聚物水解酶(如源自节杆菌(Arthrobacter sp.)的6-氨基己酸酯低聚物水解酶)或酰胺酶(如源自布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)的酰胺酶)用于解聚包含PA6或PA6,6的塑料制品。
在一个特定实施方式中，使待再循环的塑料制品与降解酶接触，所述降解酶可以为天然的或合成的。
例如，降解酶可以通过重组技术制造，或者在自然产生时，其可以从天然来源分离或提纯，或者其可以人工制造。酶可以为可溶形式，或者为固相。特别地，可以例如以珠、柱、板等的形式将其结合至细胞膜或脂囊泡，或者结合至合成载体如玻璃、塑料、聚合物、过滤器、膜。
酶优选为分离或提纯的形式。优先地，本发明的酶由微生物表达、衍生、分泌、分离或提纯。酶可以通过本领域中本身已知的技术提纯，并在常规技术下储存。可以将酶进一步改良以提高例如其稳定性或活性。
在另一个实施方式中，使待再循环的塑料制品与合成和分泌降解酶的微生物接触。在本发明的上下文中，所述酶可以被分泌到培养基中或者分泌到其中所述酶可以被锚固的微生物的细胞膜。
所述微生物可以自然合成降解酶，或者其可以为其中使用例如载体插入了编码降解酶的重组核苷酸序列的重组微生物。
例如，将编码目标降解酶的核苷酸分子插入到载体如质粒、重组病毒、噬菌体、附加体、人工染色体等。有利地，核苷酸分子在特定启动子的控制之下。然后将载体转染到宿主微生物中以形成重组微生物。在适合于宿主的培养条件下对宿主进行进一步培养，从而获得包含本发明的酶的重组细胞。适合于宿主的培养条件是本领域技术人员熟知的。
本发明的核苷酸分子可以为分离或提纯形式，并且通过本领域中本身已知的技术如cDNA文库的克隆和表达、扩增、酶合成或重组技术而制备、分离和/或操作。还可以通过熟知的化学合成技术在体外合成核苷酸分子。该发明的核苷酸分子可以包含附加的核苷酸序列如调节区，即，可以用于引起或调节酶在选择的宿主细胞或系统中的表达的启动子，增强子，沉默子，终止子等。
可以直接使用重组微生物。另外，或此外，可以从培养基中提纯重组酶。可以将任何常用的分离/提纯手段如盐析、凝胶过滤、疏水作用色谱法或离子交换色谱法用于该目的。
在特定实施方式中，可以使用已知用于合成和分泌降解酶的微生物。例如，可以将合成和分泌角质酶的米曲霉(Aspergillus oryzae)，特异腐质酶(Humicola insolens)，桔青霉(Penicillium citrinum)，腐皮镰刀菌和Thermobifida cellulolysitica用于降解包含PET的塑料制品。以相同的方式，南极假丝酵母/疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)和小麦(Triticumaestivum)合成解聚PET的脂肪酶。可以将拟无枝酸菌K104-1和K104-2、白色念球菌ATCC 22563、解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillusamylolyticus)TB-13、荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)JCM7912、外外安德糖丝菌(Saccharothrix waywayandensis)JCM 9114、东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)IFO 12362、角蛋白降解放线菌(Actinomadura keratinilytica)T16-1用于降解包含PLA的塑料制品。可以将烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)NKCM1706、淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca)BFM-X1用于降解包含PBS的塑料制品。可以将褐色高温单孢菌(Thermomonospora fusca)K13g和K7a-3、玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)NKCM1712用于降解包含PBAT的塑料制品。可以将产生锰过氧化物酶的烟管菌(Bjerkandera adusta)用于降解包含的PA的塑料制品。
根据本发明，可以将几种微生物和/或提纯酶和/或合成酶一起使用或依次使用以解聚在相同塑料制品或不同塑料制品中包含的不同种类的聚合物。
有利地，本发明的微生物显示改良的代谢以便防止消耗由聚合物降解获得的单体。例如，微生物是其中使降解所述单体的酶缺失或敲除的重组微生物。另外，本发明的方法可以在包含至少一种微生物可用的碳源的培养基中进行，使得所述微生物优先消耗该碳源而不是单体。
有利地，使塑料制品与包含微生物、作为碳源的葡萄糖等以及可被微生物同化的氮源的培养基接触，所述氮源包括有机氮源(例如，蛋白胨，肉浸液，酵母提取物，玉米浆)或无机氮源(例如，硫酸铵，氯化铵)。如果必要，培养基可还包含无机盐(例如，钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、硫酸根离子、氯离子、磷酸根离子)。此外，培养基还可以补充有痕量成分如维他命、少量元素(oligo-element)和氨基酸。
再循环方法参数
根据本发明，塑料制品可以通过如下再循环：使所述塑料制品与靶向所述塑料制品的至少一种聚合物的降解酶接触和/或与合成和分泌这种降解酶的微生物接触。
本发明的方法特别有用于降解塑料制品中包含的半结晶聚合物，所述塑料制品包含所述半结晶聚合物并最终包含一种或几种其他半结晶和/或无定形的聚合物和/或添加剂。
在一个特定实施方式中，可以对塑料制品进行初步处理以物理改变其结构，从而增加聚合物和酶之间的接触表面。例如，可以将塑料制品转变成乳液或粉末，将其添加到包含微生物和/或酶的液体培养基中。另外，可以在添加到包含微生物和/或酶的液体培养基中之前，将塑料制品机械研磨、造粒、制成小球等以降低材料的形状和尺寸。
塑料制品的降解所需要的时间可以随塑料制品自身(即，塑料制品的性质和来源，其组成、形状等)、所用的微生物/酶的类型和量、以及各种方法参数(即，温度、pH、添加剂等)而变化。本领域的技术人员可以容易地使方法参数适合于塑料制品和/或降解酶。
有利地，在20℃和80℃之间的温度，更优选在25℃和60℃之间的温度下实施该方法。优选地，至少在解聚步骤期间将温度保持在25℃和50℃之间。更一般地，将温度保持在失活温度之下，所述失活温度对应于酶失活和/或微生物不再合成降解酶的温度。令人惊讶地，本发明人发现，本发明的方法可以在低于目标聚合物的Tg的温度下实施。根据本发明，用于解聚步骤的酶的添加量可以为塑料制品的至少0.005重量％，优选至少0.1重量％且更优选至少1重量％。并且添加量有利地至多为塑料制品的15重量％且更优选至多5重量％。有利地，降解酶的量在塑料制品的0.005重量％～15重量％的范围内，优选在0.1重量％～10重量％的范围内，且更优选在1重量％～5重量％的范围内。
培养基的pH可以在4～10的范围内。有利地，根据目标聚合物/酶对对pH进行调节以提高方法效率。更特别地，对pH进行调节以保持在酶的最佳pH下。确实，聚酯和聚酰胺的解聚产生引起pH下降的酸性单体。稀释的碱的添加可以用于补偿该酸化并将pH保持为最佳pH。
在一个特定实施方式中，将至少亲脂性试剂和/或亲水性试剂添加到培养基中以改善解聚步骤。可以将诱导物如明胶添加到培养基中以提高酶产生。可以将表面活性剂如吐温(Tween)添加到培养基中以调整聚合物和酶或微生物之间的界面能量并提高降解效率。可以使用有机物质以使聚合物溶胀并提高其对微生物或酶的可接近性(accessibility)。
有利地，在没有任何降解加速剂的情况下进行本发明的方法。在一个特定实施方式中，在仅包含降解酶和水的降解液体中进行本发明的方法。在一个特定实施方式中，在没有有机溶剂的情况下进行本发明的方法。
用于解聚塑料制品的至少一种聚合物的反应时间有利地在5小时和72小时之间。这种反应时间可以使得解聚充分地进行，并且不会是经济不利的。
回收的单体的处理和重新使用
可以在解聚步骤的最后依次或连续回收由目标聚合物的解聚获得的单体的混合物。根据被解聚的聚合物和/或再循环的塑料制品的不同，可以回收单一单体或几种不同的单体。
可以使用所有合适的提纯方法对单体进行进一步提纯，并以可再聚合的形式对其进行调节。提纯方法的实例包括汽提方法、通过水溶液分离、蒸汽选择性凝结、生物处理之后的过滤和培养基的浓缩、分离、蒸馏、真空蒸发、萃取、电渗析、吸附、离子交换、沉淀、结晶、浓缩和加酸脱水和沉淀、纳米过滤、酸催化剂处理、半连续模式蒸馏或连续模式蒸馏、溶剂萃取、蒸发浓缩、蒸发结晶、液/液萃取、氢化、共沸蒸馏方法、吸附、柱层析、简单真空蒸馏和微量过滤，这些方法可以组合使用或单独使用。
然后，可以将可再聚合的单体重新使用以合成聚合物。有利地，将相同性质的聚合物再聚合。然而，可以将回收的单体与其他单体和/或低聚物混合以合成新的共聚物。
在一个特定实施方式中，在允许聚合反应的合适条件下使用水解酶进行再聚合。可以向单体溶液添加引发剂以有助于聚合反应。本领域技术人员可以容易地使方法参数适合于单体和要合成的聚合物。
在下列实施例中将公开本发明的其他方面和优势，所述实施例应被看作是例示性的并且不限制本申请的范围。
实施例
A]利用酶的脂族聚酯再循环
由于本发明的方法，可以将包含脂族聚酯如PLA的塑料制品再循环。本实验示出通过利用蛋白酶K处理由半结晶PLA构成的塑料制品而回收乳酸。
塑料制品和预处理
从NaturePlast(PLLA 001)购得PLA小球并使用通用研磨机ConduxCUM 100研磨成粒径小于500μm的粉末。
在铝盘中，在10℃/分钟的扫描速度下，在氮气氛(50mL/分钟)下，从-50℃到300℃，使用Q 100TA-RCS 90仪器，对约8mg样品，使用差式扫描量热法(DSC)试验以确定塑料制品中的聚合物的玻璃化温度(Tg)和结晶度。
PLA粉末具有59℃的Tg并且是结晶度为14.9％的半结晶。
水解反应
利用来自白色念球菌的蛋白酶K(Sigma)进行PLA粉末的水解以回收乳酸。在pH为8、具有CaCl25mM的Tris 20mM中，以10mg/mL的浓度制备酶溶液。在7天期间，利用磁力搅拌，以5mL的最终体积，在37℃下，通过在pH为8、具有5mM CaCl2的Tris HCl 20mM中的200μg蛋白酶K对20mg PLA进行处理。
在实验中，在温育期间，利用NaOH 0.5M将pH保持在pH 8(对应于蛋白酶K的最佳pH)下以补偿由乳酸产生造成的酸化。将实验同样地进行三次。
使用i)无酶的缓冲液中的PLA；ii)无PLA的缓冲液中的酶作为对照。
乳酸(LA)分析
在每次分析时取样160μL的反应培养基。在0℃下以16000g将样品离心3分钟。将用于分析的上清液进行0.45μm过滤，并将20μL注入HPLC中。所用的HPLC为Ultimate-3000(Dionex，ThermoScientific)，具有用恒温器控制到10℃的自动进样器，用恒温器控制到50℃的柱室。对于LA的分析，使用Aminex H+HPX-87H柱。利用5mMH2SO4作为洗脱液进行分析。将流速设定为0.5mL/分钟，并将柱保持在50℃的温度下。在220nm下利用可变波长检测器进行LA的检测。考虑到利用溶解在pH为8的Tris HCl 20mM中的来自Sigma的L-乳酸(L-1750)制备的、在0-300mM浓度范围的标准物，定量是可能的。
结果
通过蛋白酶K水解PLA粉末并回收乳酸。在控制中未检测到乳酸。如图1中所示，当没有实现pH调节时，在水解72小时之后获得乳酸的最大浓度。当对pH进行控制时，乳酸浓度保持增大直至反应7天。在水解期间将pH保持为pH 8允许在72小时回收5.87±0.92mM LA，相反，在没有pH调节的情况下回收3.47±0.57mM LA。因此，由此可以将pH调节用作调节方法效率的参数。
B]利用酶的芳族聚酯再循环
由于本发明的方法，可以将包含芳族聚酯如PET和/或PTT的塑料制品再循环。本实验示出通过处理包含PET和/或PTT的塑料制品而对对苯二甲酸进行回收。
塑料制品和预处理
使用不同的基材：
-PET膜，购自Goodfellow(ES 301445)，厚度0.25mm，是无定形的
-PTT小球，购自杜邦公司(DuPont)(3301 NC010)
-PET瓶(之前含有在商标下的矿泉水)
将PET膜切成10mg(约0.5cm x 1cm)的碎片。以三个连续步骤对其进行洗涤以除去任何蛋白质或脂质污染物：在第一步骤中，利用5g/LTriton-X 100对其进行洗涤；在第二步骤中，利用100mM Na2CO3对其进行洗涤；最后，利用去离子水对其进行洗涤。将各洗涤步骤在50℃下进行30分钟。然后，利用压缩空气对PET膜进行干燥。
在5分钟期间通过使用切削研磨机SM-2000(Retsch)将PTT研磨成粉末，然后在10分钟期间以1.5mm的振幅利用筛子AS 200(Retsch)对其进行筛分以获得1mm的粉末。
将整个瓶子预处理以增大PET和酶之间的接触表面。在5分钟期间，通过使用切削研磨机SM-2000(Retsch)将它们机械研磨成不同粒径的粉末。然后，在10分钟期间以1.5mm的振幅利用筛子AS 200(Retsch)对收集的粉末进行筛分以获得粒径分别为1mm、500μm和250μm的3种粉末。
在铝盘中，在10℃/分钟的扫描速度下，在氮气氛(50mL/分钟)下，从-50℃到300℃，使用Q 100TA-RCS 90仪器，对约8mg样品，使用差式扫描量热法(DSC)试验以确定塑料制品中的聚合物的玻璃化温度(Tg)和结晶度。
PTT和PET瓶粉末分别具有50.6℃和77.2℃的Tg，并分别是结晶度为36％和30％的半结晶。
角质酶制造
Thermobifida cellulosilytica DSM44535得自德国生物材料资源中心(German Resource Centre for Biological Material)(DSMZ，德国)。将菌株保持在LB琼脂板上并在37℃和160rpm下，在500mL摇瓶(200mL LB培养基)中培养24小时。通过在3200g和4℃下离心20分钟而收获细胞。
将载体pET26b(+)(Novagen，德国)用于在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21-Gold(DE3)(Stratagene，德国)中表达来自Thermobifidacellulosytica的角质酶THC_Cut2。
通过标准聚合酶链反应(PCR)，从T.cellulosilytica DSM44535的基因组DNA扩增角质酶的编码基因Thc_cut2。基于编码来自T.fusca YX的角质酶的基因的已知序列(Genbank登录号YP_288944和YP_28894333)，设计了两种引物5’-CCCCCGCTCATATGGCCAACCCCTACGAGCG-3’(SEQ ID 1–正向引物)和5’-GTGTTCTAAGCTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCCAGGCACTGAGAGTAGT-3’(SEQ ID 2–反向引物)，使得可以在没有信号肽的情况下扩增各个基因并在角质酶的C端引入6xHis-Tag。设计的引物包含用于将基因克隆到载体pET26b中的限制位点NdeI和HindIII。利用基因组DNA作为模板、0.4μM各引物、0.2mM dNTP、5单位的Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)和由供应商提供的1X反应缓冲液，以50μL的体积进行PCR。在Gene Amp PCR 2200热循环仪(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)，美国)中进行PCR。进行35个循环，每个循环将反应混合物依次曝露于98℃(30s，变性)、63℃(30s，退火)和72℃(30s，延伸)。通过Qiagen DNA提纯试剂盒(Qiagen，德国)对质粒和DNA片段进行提纯。根据制造商的说明，将由此获得的提纯的扩增的PCR产物利用限制性内切核酸酶NdeI和HindIII(New England Biolabs，美国)进行消化，利用碱性磷酸酶(Roche，德国)脱磷酸并利用T4DNA-连接酶(Fermentas，德国)连接到pET26b且在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)中转化。
使用引物5’-GAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAA-3’(SEQ ID3)和5’-CAGCTTCCTTTCGGGCTTTGT-3’(SEQ ID 4)，通过DNA测序确定基因的序列。DNA的测序为自定义服务(Agowa，德国)。利用载体NTi Suite 10(Invitrogen，美国)进行DNA序列的分析和处理。使用Clustal W程序(Swiss EMBnet节点服务器)对蛋白质的序列进行比对。分离的基因的核苷酸序列已经以登录号HQ147786(Thc_cut2)存放于GenBank数据库。
使用新转化的大肠杆菌BL21-Gold(DE3)细胞接种补充有40μg/mL卡那霉素的20mL LB-培养基，在37℃和160rpm下培养过夜。使用过夜培养物对具有40μg/mL卡那霉素的200mL LB-培养基进行接种至OD600＝0.1，并且进行温育，直至达到OD600＝0.6-0.8。之后，将培养物冷却到20℃，并利用IPTG以0.05mM的最终浓度进行诱导。在20℃和160rpm下进行诱导20小时。通过离心(20分钟，4℃，3200g)收获细胞。
将来自200mL细胞培养物的细胞团块重新悬浮在30mL结合缓冲液(20mM NaH2PO4*2H2O，500mM NaCl，10mM咪唑，pH 7.4)中。在冰冷却下，利用3次30-s脉冲将重新悬浮的细胞超声3次(Vibra Cell，Sonics Materials，Meryin/Satigny，瑞士)。将裂解物离心(30分钟，4℃，4000g)并通过0.2μm膜过滤。使用具有HisTrap FF柱的提纯系统(洗脱缓冲液20mM NaH2PO4*2H2O，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)对细胞裂解物进行提纯。为了表征角质酶，通过使用PD-10脱盐柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))，用100mM Tris HCl pH 7.0与HisTag洗脱缓冲液进行交换。
通过Bio-Rad蛋白质检测试剂盒(Bio-Rad Laboratories GmbH)和作为蛋白质标准的牛血清白蛋白来确定蛋白质浓度。对应于Laemmli(Laemmli，英国，自然(Nature)1970，227(5259)，680–685)进行SDS-PAGE并利用考马斯亮蓝R-250对蛋白质进行染色。
所有化学品都是来自Sigma(德国)的分析级。
水解反应
如下进行塑料制品的水解。在每个样品中，在50℃下，以300rpm的振荡，在舒适型恒温混匀仪(Thermomixer Comfort)(Eppendorf)中，在pH为7.0的1mL缓冲液K2HPO4/KH2PO4100mM中，将10mg塑料制品与5μM角质酶温育6小时～72小时。将所有实验同样地进行三次。
使用i)无酶的缓冲液中的塑料制品；ii)无塑料制品的缓冲液中的酶作为对照。
对苯二甲酸(TA)测定法
在酶处理之后，使用1:1(v/v)绝对甲醇(默克(Merck))将蛋白质沉淀在冰上。在0℃下以16000g将样品离心(Hettich MIKRO 200R，Tuttlingen，德国)15分钟。使用于测定的上清液进入HPLC小瓶中并通过添加3.5μL的6N HCl而将其酸化。所用的HPLC为DIONEX P-580PUMP(Dionex Cooperation，森尼维尔，美国)，具有ASI-100自动样品注射器和PDA-100光二极管阵列检测器。对于TA的分析，使用反相柱RP-C18(Discovery HS-C18，5μm，150x 4.6mm，具有前置柱，Supelco，Bellefonte，美国)。利用60％水、10％0.01N H2SO4和30％甲醇作为洗脱液，逐渐(15分钟)变为50％甲醇和10％酸，逐渐(20分钟)变为90％甲醇和酸，保持2分钟，然后逐渐变为初始位置，运行5分钟，进行分析。将流速设定为1mL/分钟并将柱保持在25℃的温度下。注入体积为10μL。以241nm的波长利用光电二极管阵列检测器进行TA的检测。使用以不同浓度(1、5、10、50、100、250μM)在1:1的缓冲液：MetOH中稀释的对苯二甲酸(默克编码：800762)的标准物可以进行定量，所述标准物通过与样品相同的方式制备。
结果
本实验示出，可以使用本发明的方法将用聚合物和添加剂配制的塑料制品再循环。此外，为了提高单体回收，可以有利地进行塑料制品的机械预处理，其提高塑料制品和酶的表面接触。
更特别地，在72小时期间通过角质酶对PET膜进行水解以获得TA。反应时间越长，制造的TA越多(图2)。
通过角质酶对PTT进行水解：在24小时内获得4.087±0.122μMTA。
通过角质酶对粒径为1mm的粉末形式的PET瓶进行水解：在24小时内获得7.301±0.162μM TA。因此，本发明的方法也可以应用于用添加剂配制的PET塑料，如在塑料废品中发现的塑料那样。
在24小时内通过角质酶对PET瓶粉末的不同尺寸的粒子进行水解以获得TA。通过机械研磨降低粒径提高了酶效率，从而制得更多的TA：在粒径为250μm的情况下15.296±1.012μM TA，而在粒径为1mm的情况下7.301±0.162μM TA(图3)。
C]利用酶的聚酰胺再循环
由于本发明的方法，可以将包含聚酰胺的塑料制品再循环。本实施例示出通过利用由大肠杆菌的重组菌株表达的聚酰胺酶处理由PA构成的塑料制品而对己二酸进行回收。
塑料制品和预处理
商购的聚酰胺织物购自罗地亚公司(Rhodia)(瑞士)：PA6,6，63g/m2，切成3cm x 3cm的碎片。利用Na2HPO4、2H2O、5mM将其洗涤30分钟以除去表面抛光剂。
聚酰胺酶制造
编码来自诺卡菌IFM 10152(NCBI保藏编号NC 006361)的聚酰胺酶的基因是如下的密码子，其为了在大肠杆菌(GeneArt AG，德国)中表达而被优化并被融合至允许在蛋白质的C端引入6xHisTag的核苷酸序列。根据制造商的说明，将所述基因利用限制性内切核酸酶NdeI和HindIII(New England Biolabs，美国)进行消化，利用碱性磷酸酶(Roche，德国)脱磷酸，提纯，利用T4 DNA-连接酶(Fermentas，德国)连接到pET26b(+)(Novagen，Merck KGaA，德国)且在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)中进行转化。将来自Qiagen(德国)的质粒小试剂盒用于制备质粒DNA。通过Qiagen DNA提纯试剂盒(Qiagen，德国)对质粒和DNA片段进行提纯。使用新转化的细胞接种补充有40μg/mL卡那霉素的20mL LB-培养基。将培养物在30℃和160rpm下在旋转振荡器上生长过夜。然后，将1mL过夜培养物转移到包含200mL相同液体培养基的500mL摇瓶中并在30℃下温育，直至达到0.6和0.8之间的光学密度(600nm)。将培养物冷却到20℃，并以0.05mM的最终浓度利用IPTG进行诱导。将诱导的培养物在20℃和160rpm下温育过夜。通过离心(3200g，4℃，20分钟)收获细胞。
根据制造商的协议(IBA GmbH，德国)，通过重力流色谱法，使用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行提纯，不同之处在于将100mM咪唑用于洗脱蛋白质。为了表征聚酰胺酶，通过使用PD-10脱盐柱(AmershamBiosciences)，用100mM Tris HCl pH 7.0与HisTag洗脱缓冲液进行交换。
通过来自Interchim(法国)的Uptima BC Assay蛋白质定量试剂盒和作为蛋白质标准的牛白蛋白来确定蛋白质浓度。根据Laemmli(Laemmli，英国，自然(Nature)1970，227(5259)，680–685)进行SDS-PAGE并利用考马斯亮蓝R-250对蛋白质进行染色。
水解反应
在100mL柠檬酸盐磷酸盐缓冲液(25mM，pH 5.0)中对聚酰胺织物与2mg/mL聚酰胺酶进行温育。在水解之后，利用碳酸钠(9.4mM，pH 9.5)对织物进行洗涤，然后利用蒸馏水进行四个冲洗步骤以除去吸附的蛋白质。将所有步骤在30℃下进行30分钟。在最后的步骤之后，在室温下将织物干燥过夜。
使用i)无酶的缓冲液中的塑料制品；ii)无塑料制品的缓冲液中的酶作为对照。
己二酸测定法
在酶处理之后，使用Carrez沉淀将蛋白质沉淀。因此，样品的pH必须在4和6之间。将2％溶液C1(0.252M K4[Fe(CN)6]3，H2O)添加到样品中，在涡流和温育1分钟之后，添加2％溶液C2(1mM ZnSO4,7H2O)。在涡流和温育5分钟之后，将样品离心(30分钟，16000g，25℃)。将上清液通过0.45μm滤膜直接过滤到玻璃瓶中以用于HPLC分析(Hewlett Packard Series 1100，折射率检测器：Agilent Series 1100)。使用柱ION-300(Transgenomic,Inc.)，将流速设定为0.1mL/分钟并使用0.01N H2SO4作为流动相。将温度设定为45℃，并且注入体积为40μL。在220nm的波长下实现检测。使用己二酸标准溶液实现校准。
结果
PA被聚酰胺酶水解：在48小时内获得9.4μM己二酸。
D]利用重组微生物的脂族聚酯再循环
由于本发明的方法，可以如实施例A中那样利用酶以及利用表达和分泌解聚酶的重组微生物将包含脂族聚酯如PLA的塑料制品再循环，所述重组微生物具有防止所得单体的消耗的改良的代谢。可以通过基因缺失或者通过基因破坏或敲除而获得改良的代谢。本实验示出通过利用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或大肠杆菌的重组菌株对由半结晶PLA构成的塑料制品进行处理而回收乳酸。也可以对其他微生物进行实施例中示出的菌株改良。
塑料制品和预处理
从NaturePlast(PLLA 001)购得PLA小球并使用通用研磨机Condux CUM 100研磨成粒径小于500μm的粉末。
在铝盘中，在10℃/分钟的扫描速度下，在氮气氛(50mL/分钟)下，从-50℃到300℃，使用Q 100 TA-RCS 90仪器，对约8mg样品，使用差式扫描量热法(DSC)试验以确定塑料制品中的聚合物的玻璃化转变温度(Tg)和结晶度。
PLA粉末具有59℃的Tg并且是结晶度为14.9％的半结晶。通过SEC测定，其质量特性为Mw 71000g/mol和Mn 45000g/mol。
乳酸乳球菌构建
根据“分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约”中所述的经典方法，将乳酸乳球菌MG1363的野生型菌株与编码源自拟无枝酸菌K104-1的PLA解聚酶的基因pld(SEQ ID 5)进行重组(Nakamura等人，2001-Appl.Environ.Microbiol.67:345-353)。因此，在pNZ8048质粒中实现同源重组(Kuipers等人，1998-J.Biotechnol.64:15-21)。将具有pld基因的重组质粒称作“pNZ-pld”。根据“Ho等人，1995-通过电穿孔将乳球菌进行转化(Transformation of Lactococcusby electroporation)-Methods Mol.Biol.47:195-199”中所述的经典方法，通过电穿孔经由pNZ-pld质粒对乳酸乳球菌菌株进行转化。重组乳酸乳球菌菌株被称作MG1363-pNZ-pld。阴性对照对应于利用空质粒pNZ8048转化的乳酸乳球菌MG1363菌株。
大肠杆菌构建
大肠杆菌K12-MG1655包含3种乳酸酯脱氢酶(LDH)。一种LDH对于D-乳酸酯异构体是特异性的。另一种LDH在厌氧条件下将丙酮酸酯转化成乳酸酯。最后一种LDH对于L-乳酸酯异构体是特异性的并允许在该底物上生长(Haugaard，N.(1959)大肠杆菌的D-和L-乳酸氧化酶。Biochim Biophys Acta 31，66-77；Kline，E.5.和Mahler，E.R.(1965)。大肠杆菌的乳酸脱氢酶，Ann N Y Acad Sci 119,905-917)。对于再循环方法，为了在没有任何乳酸消耗的情况下对其进行回收，必须抑制该最后一种LDH的表达。
对编码大肠杆菌中的LDH的lldD基因(SEQ ID 6)的破坏允许抑制乳酸消耗。为了破坏lldD基因，如由Datsenko和Wanner(2000)所述的，利用引物DlldD-F(SEQ ID 7)和DlldD-R(SEQ ID 8)，通过同源重组将源自pKD4质粒的氨苄西林(Amp)amp抗性基因插入在lldD基因的序列中，所述引物DlldD-F和DlldD-R具有与lldD基因的序列同源的序列和与amp基因同源的序列。然后选择Amp抗性转化株，并利用合适的引物通过PCR分析以及通过DNA测序对突变位点的染色体结构进行验证，所述引物与lldD基因(SEQ ID 9和SEQ ID 10)的上游和下游序列同源。
然后，根据“分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约”中所述的经典方法，将大肠杆菌与编码源自拟无枝酸菌K104-1(SEQ ID 5)的PLA解聚酶的基因pld进行重组(Nakamura等人，2001–Appl.Environ.Microbiol.67:345-353)。因此，在pNZ8048质粒中实现同源重组(Kuipers等人，1998-J.Biotechnol.64:15-21)。将具有pld基因的重组质粒称作“pNZ-pld”。通过pNZ-pld质粒对被破坏的lldD大肠杆菌菌株进行转化。重组的被破坏的大肠杆菌菌株被称作K12DlldD-pNZ-pld。阴性对照对应于利用空质粒pNZ8048转化的大肠杆菌菌株。
水解反应
在30℃下，在R2培养基中，在2L生物反应器中，对2种乳酸乳球菌的菌株MG1363-pNZ-pld和MG1363-pNZ与2种大肠杆菌的菌株K12DlldD-pNZ-pld和K12DlldD-pNZ8048进行培养。将各培养物再细分为2个亚培养物：批次1没有PLLA且批次2具有0.1％(m/v)PLLA。
乳酸测定法
在培养2天之后，取样2mL各反应培养基。在0℃下，以16000g将样品离心3分钟。将用于分析的上清液进行0.45μm过滤，并将20μL注入HPLC中。所用的HPLC为Ultimate-3000(Dionex，ThermoScientific)，具有用恒温器控制到10℃的自动进样器，用恒温器控制到50℃的柱室。对于LA的分析，使用Aminex H+HPX-87H柱。利用5mMH2SO4作为洗脱液进行分析。将流速设定为0.5mL/分钟，并将柱保持在50℃的温度下。在220nm处利用可变波长检测器进行LA的检测。考虑到利用溶解在pH为8的Tris HCl 20mM中的来自Sigma的L-乳酸(L-1750)制备的、在0-300mM浓度范围的标准物，定量是可能的。
结果
仅表达PLA解聚酶的重组乳酸乳球菌MG1363-pNZ-pld和重组的被破坏的大肠杆菌菌株K12DlldD-pNZ-pld由PLA制造乳酸。乳酸酯脱氢酶破坏使得可以在乳酸没有被菌株消耗的情况下回收乳酸。

Claims (15)

1.一种用于再循环至少一种塑料制品的方法，所述方法包括使用酶将所述塑料制品的至少一种聚合物解聚为单体并回收所得单体。
2.权利要求1的方法，其中所述酶是适合于将所述塑料制品的至少一种聚合物解聚为单体的降解酶。
3.权利要求2的方法，其中所述降解酶为角质酶(EC 3.1.1.74)，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，酯酶，羧酸酯酶(EC 3.1.1.1)，对硝基苯甲基酯酶，丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21.64)，蛋白酶，酰胺酶，芳基酰基酰胺酶(EC3.5.1.13)，低聚物水解酶如6-氨基己酸酯环状二聚物水解酶(EC3.5.2.12)、6-氨基己酸酯二聚物水解酶(EC 3.5.1.46)、6-氨基己酸酯-低聚物水解酶(EC 3.5.1.B17-.-)，过氧化物酶，漆酶(EC 1.10.3.2)。
4.前述权利要求任一项的方法，包括使所述塑料制品与至少一种表达和分泌所述酶的微生物接触。
5.权利要求4的方法，其中所述微生物为具有防止所得单体消耗的改良的代谢的重组微生物。
6.权利要求4或5的方法，其中所述微生物为表达和分泌重组降解酶的重组微生物。
7.前述权利要求任一项的方法，其中在降解之前对所述塑料制品进行预处理。
8.权利要求7的方法，其中所述预处理包括所述塑料制品的机械/物理改性，优选所述塑料制品的研磨。
9.前述权利要求任一项的方法，其中将至少一种亲脂性和/或亲水性试剂与所述酶一起使用。
10.前述权利要求任一项的方法，还包括提纯所述单体并对所述提纯的单体进行再加工。
11.前述权利要求任一项的方法，其中所述塑料制品包含选自无定形和/或半结晶的聚酯和聚酰胺中的至少一种聚合物。
12.权利要求11的方法，其中所述聚酯选自：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)，聚对苯二甲酸乙二醇异山梨醇酯(PEIT)，聚乳酸(PLA)，聚(L-乳酸)(PLLA)，聚(D-乳酸)(PDLA)，聚(D,L-乳酸)(PDLLA)，PLA立构复合物(scPLA)，聚羟基烷酸酯(PHA)，聚(3-羟基丁酸酯)(P(3HB)/PHB)，聚(3-羟基戊酸酯)(P(3HV)/PHV)，聚(3-羟基己酸酯)(P(3HHx))，聚(3-羟基辛酸酯)(P(3HO))，聚(3-羟基癸酸酯)(P(3HD))，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)(P(3HB-共-3HV)/PHBV)，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)(P(3HB-共-3HHx)/(PHBHHx))，聚(3-羟基丁酸酯-共-5-羟基戊酸酯)(PHB5HV)，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯)(PHB3HP)，聚羟基丁酸酯-共-羟基辛酸酯(PHBO)，聚羟基丁酸酯-共-羟基十八酸酯(PHBOd)，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯-共-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-共-3HV-共-4HB))，聚丁二酸丁二醇酯(PBS)，聚丁二酸己二酸丁二醇酯(PBSA)，聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)，聚糠酸乙二醇酯(PEF)，聚己内酯(PCL)，聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)，以及这些材料的共混物/混合物。
13.权利要求11的方法，其中所述聚酰胺选自：聚酰胺-6或聚(β-己内酰胺)或聚己酰胺(PA6)，聚酰胺-6,6或聚(己二酰己二胺)(PA6,6)，聚(11-氨基十一碳酰胺)(PA11)，聚十二碳内酰胺(PA12)，聚(己二酰丁二胺)(PA4,6)，聚(癸二酰戊二胺)(PA5,10)，聚(壬二酰己二胺)(PA6,9)，聚(癸二酰己二胺)(PA6,10)，聚(十二碳酰己二胺)(PA6,12)，聚(己二酰间二甲苯二胺)(PAMXD6)，聚己二酰己二胺/聚对苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6T)，聚己二酰己二胺/聚间苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6I)，以及这些材料的共混物/混合物。
14.前述权利要求任一项的方法，其中所述塑料制品的至少两种不同的聚合物被同时或依次解聚。
15.前述权利要求任一项的方法，其中至少两种塑料制品被同时或依次再循环。
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