JP4625900B2 - 好熱性ポリエステル分解菌 - Google Patents
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Description
1.受託番号FERM BP−10827,FERM BP−10828,FERM BP−10829,及びFERM P−21507である各菌株より選ばれる菌株。
2.上記1の菌株であって,ポリエステル分解性を有し,該ポリエステルが芳香族脂肪族ポリエステル又は脂肪族ポリエステルであってよいものである,菌株。
3.該芳香族脂肪族ポリエステルが,芳香族ジカルボン酸としてテレフタル酸を,ジオールとしてグリコールモノマーまたはオリゴマーを,及び脂肪族ジカルボン酸としてHOC(O)(CH2)nC(O)OH(ここに,nは0〜10の整数を表す。)を含んでなるモノマーの重合したポリエステルである,上記2の菌株。
4.該芳香族脂肪族ポリエステルがバイオマックス又はエコフレックスである,上記2又は3の菌株。
5.該バイオマックスが,バイオマックス4024,4026又は4027であり,該エコフレックスがF又はSグレードである,上記4の菌株。
6.上記1ないし5の何れかの菌株を,分解処理すべきポリエステルの表面及び/又は該ポリエステルを埋設する堆肥に適用し,該ポリエステルを該堆肥中に埋設することにより,該菌株による該ポリエステルの促進された生分解反応を行なわせることを特徴とする,ポリエステルの分解処理方法。
7.該芳香族脂肪族ポリエステルが,芳香族ジカルボン酸としてテレフタル酸を,ジオールとしてグリコールモノマーまたはオリゴマーを,及び脂肪族ジカルボン酸としてHOC(O)(CH2)nC(O)OH(ここに,nは0〜10の整数を表す。)を含んでなるモノマーの重合したポリエステルである,上記6の方法。
8.該芳香族脂肪族ポリエステルがバイオマックス及びエコフレックスである,上記6又は7の方法。
9.該バイオマックスが,バイオマックス4024,4026又は4027であり,該エコフレックスがエコフレックF及びSグレードである,上記8の方法。
(1) 該ポリエステルのフィルムに菌体懸濁液を塗り付け,内部温度60 C前後の堆肥に埋設し,約2週間後に回収して何も塗布していないフィルムと比較して分解促進を肉眼観察と分子量測定で判定する。
(2) 該ポリエステル粉末をオートクレーブ(121 C,6時間)処理して部分水解し,部分水解物を得る(元のポリマー粒子は水中で直ぐに沈殿し懸濁液を作らないが,この条件での部分水解に付したポリマー粒子は,水中で懸濁状態を形成するものと沈殿するものとに分離する。このうち,懸濁状態を保った上清を沈殿から分離して,部分水解物とする。部分水解物には元の分子量に近いポリマーからオリゴマーまでが含まれる。)。この部分水解物を無機塩培地に添加し,これに菌体を加えて,濁度の減少を観察する。
(3) 上記(2)の培地に生成するテレフタル酸の増加を260nmの吸光度で測定する。
これらの方法に基づき,分解菌を分離する。分離された菌は,16S rDNA解析に基づき同定を行うことができる。これら3種の分解確認方法の全てで分解が確認されたものを,目的のポリエステル分解菌とする。〔但し,この項目(3)は細菌に関しては除外する。細菌の生育は濁度を増加させるため,ポリマー濁度の減少と相殺されるためである。〕
1.分解菌の探索及び同定
芳香族脂肪族ポリエステルとしてバイオマックス〔Biomax(登録商標)〕4024,4026及び4027製の市販のフィルム(0.040mm厚)を入手した。バイオマックスはエコフレックス〔Ecoflex(登録商標),BASF製〕よりも耐熱性がはるかに高く,より難生分解性である。当該フィルムを7×7cmのサイズに切断し,メッシュ袋に入れ,これをプラスチック製の鎖に括りつけて,内部温度約60℃の堆肥に埋設し,約2〜3週間放置した後,フィルムを取り出した。外観を観察し,何れのフィルムも,フィルムの一部,特に周辺部が分解していることが確認された。各フィルムから付着している菌を採取し,以下に述べるようにして16S rDNAに基づく変性剤ゲル濃度勾配電気泳動(DGGE;Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)により解析した。DGGE用プライマーとしては、配列番号1及び2に示すものを用いた。
〔反応液組成〕
DNA溶液・・・・・・5μL
5× Ampdirect・・・10μL
dNTP・・・・・・・4μL
16S-338-f-GC ・・・・2.5μL
16S-517-r ・・・・・・2.5μL
ExTaq ・・・・・・・・0.25μL
超純水・・・・・・・25.75μl
全量・・・・・・・・50μL
〔反応温度及び時間〕
(1) 94℃2分,次いで
(2) 94℃30秒,55℃1分及び72℃1分の35サイクル,及び
(3) 72℃2分
〔反応液組成〕
DNA溶液・・・・・・・・1μL
10× ExTaq緩衝液・・・・1.5μL
dNTP(25mM)・・・1.2μL
16S-338-f-GC ・・・・・・0.75μL
16S-517-r ・・・・・・・・0.75μL
ExTaq ・・・・・・・・・・0.25μL
超純水・・・・・・・・・・9.55μL
全量・・・・・・・・・・15μL
〔反応温度及び時間〕
(1) 94℃2分,次いで
(2) 94℃30秒,55℃30分及び72℃1分の25サイクル,及び
(3) 72℃2分
(1)上記ポリマーのフィルム(各7×7cm)のそれぞれに,上記で分離した各菌体懸濁液(培養液換算で4〜5mL/片面)を塗り付けた。これらの菌体塗布フィルムと,無処置のフィルム(対照フィルム)とを,メッシュ袋に入れ,これをプラスチック製の鎖に括りつけたものを,内部温度約60℃の堆肥に埋設し,約2〜3週間放置した後,フィルムを取り出した。菌の懸濁液を塗布したフィルムと,何も塗布しなかった対照フィルムの外観を肉眼観察して比較すると共に,分子量測定により判定した。方法及び判定基準は次のとおりである。
〔分子量測定方法〕
分子量測定は,ゲル濾過クロマトグラフィー(GPC:gel permeation chromatography)により,以下の条件で行い,対照フィルムと比べて分子量低下の認められたものを分解促進と判定した。
GPC装置:Shodex GPC104
カラム:Shodex GPC HFIP606M ×2(2本連結)
溶出液:5mMトリフルオロ酢酸ナトリウム含有ヘキサフルオロイソプロパノール
速度:0.3mL/分
カラム温度:40℃
検出:RI
分子量標準:ポリメタクリル酸メチル(Polymer Laboratories, USA)
(2)上記ポリマー粉末の部分水解物(調製方法は前記に同じ。)を下記の無機塩培地にポリマー濃度約0.1%(A610 約1.0)になるように添加して分散させた。これに予めLB培地で生育させておいた菌を数%接種して,50〜60℃にて2週間培養し,懸濁状態のポリマー粉末の分解による濁度の減少を観察した。
〔無機塩培地〕
KH2PO4 ・・・・・・・・・・ 4.5g
Na2HPO4 ・・・・・・・・・ 4.7g
NH4Cl ・・・・・・・・・・・ 1.0g
MgSO4・7H2O ・・・・・・ 0.5g
クエン酸第二鉄アンモニウム ・・ 50.0mg
CaCl2・2H2O ・・・・・・・ 5.0mg
酵母エキス ・・・・・・・ 0.5g
カゼイン加水分解物 ・・・・・・・ 0.1g
pH 7.5
(3)上記(2)の培地に生成するテレフタル酸の増加を260nmの吸光度で測定した。
注2)この方法は,菌が分解物に生育する場合は菌体による濁度増加とポリマー粒子の減少が相殺されるため,利用できない。放線菌は菌糸をつくるため,濁度への影響は小さいが,細菌は粒子と細胞の区別がつかない。N.D.:菌体増殖と相殺されて測定不可能。
注3)対照と比べて,260nmの吸収が顕著に認められたものを「+」とした。
注4)上記1)〜3)の結果と分解で生じるテレフタル酸への生育から総合的に判定。
寄託菌の16S rDNA登録(DDBJ)
(1)AHK109: AB300432(配列番号6)
(2)AHK119: AB298783(配列番号7)
(3)BHK25: AB300774(配列番号8)
(1)菌株AHK109: FERM BP−10828
(2)菌株AHK119: FERM BP−10829
(3)菌株BHK25: FERM BP−10827
(1)菌株AHK109: Streptomyces sp.
(2)菌株AHK119: Thermobifida alba
(3)菌株BHK25: Ureibacillus thermosphaericus
(なお上記国際寄託の申請に際して,菌株AHK119の分類学上の位置をThermomonospora sp.としたが,その後の16S rDNA及び生理試験の結果に基づき上記のThermobifida albaに修正し,2007年6月26日付で上記国際寄託について当該変更を届け出てある。)
(1)ISP培地No.2(イースト・麦芽寒天培地)
イーストエキス ・・・・・・ 4g
麦芽エキス ・・・・・・・ 10g
グルコース ・・・・・・・・ 4g
脱イオン水 ・・・・・ 1000mL
寒天 ・・・・・・・・ 15〜20g
pH7.3
(2)ISP培地No.3(オートミール寒天培地)
オートミール ・・・・・・・・ 20g
微量塩液* ・・・・・・・・・・・ 1mL
脱イオン水 ・・・・・・・ 1000mL
寒天 ・・・・・・・・・・・・ 18g
pH7.2
オートミールを脱イオン水1000mL中で20分間煮た後,チーズ濾布で濾過し,減量分を脱イオン水で補う。これに微量塩液を加えてpHを調整した後,寒天を加える。
*)微量塩液
FeSO4・7H2O ・・・・・ 0.1g
MnCl2・4H2O ・・・・・ 0.1g
ZnSO4・7H2O ・・・・・ 0.1g
脱イオン水 ・・・・・・・・ 100mL
(3)ISP培地No.4(スターチ・無機塩寒天培地)
液I:可溶性デンプン10gを少量の冷脱イオン水でペースト状とし,さらに薄めて500mLとする。
液II:
K2HPO4 ・・・・・・・・・ 1g
MgSO4・7H2O ・・・・・・ 1g
NaCl ・・・・・・・・・・・ 1g
(NH4)2SO4 ・・・・・・・ 2g
CaCO3 ・・・・・・・・・・ 2g
脱イオン水 ・・・・・・・・ 500mL
微量塩液(上記(2)に同じ)・・・ 1mL
上記液I及び液IIを混合し,寒天15〜20gを加える。
(4)ISP培地No.5(グリセリン・アスパラギン寒天培地)
グリセリン ・・・・・・・・・・ 10g
L−アスパラギン ・・・・・・・・ 1g
K2HPO4 ・・・・・・・・・・・ 1g
脱イオン水 ・・・・・・・・ 1000mL
微量塩液(上記(2)に同じ)・・・ 1mL
寒天 ・・・・・・・・・・・・・・ 15〜20g
pH7.0〜7.4
(5)ISP培地No.6(ペプトン・イースト・鉄寒天培地)
(I)ペプトン・鉄寒天* ・・・・・・ 36.58g
(II)イーストエキス ・・・・・・・・ 1g
(III)脱イオン水 ・・・・・・・ 1000mL
pH7.0〜7.2
上記(I)〜(III)を混和しpH7.0〜7.2とする。
*)ペプトン・鉄寒天
ペプトン ・・・・・・・・・・・ 15g
プロテオース・ペプトン ・・・・・ 5g
クエン酸鉄アンモニウム ・・・・・ 0.5g
K2HPO4 ・・・・・・・・・・・ 1g
Na2S2O3 ・・・・・・・・・・ 0.08g
寒天 ・・・・・・・・・・・・・ 15g
(6)ISP培地No.7(チロシン寒天培地)
グリセリン ・・・・・・・・・・ 15g
L−チロシン ・・・・・・・・・・ 0.5g
L−アスパラギン ・・・・・・・・ 1g
K2HPO4 ・・・・・・・・・・ 0.5g
MgSO4・7H2O ・・・・・・ 0.5g
NaCl ・・・・・・・・・・・・ 0.5g
FeSO4・7H2O ・・・・・・ 10mg
脱イオン水 ・・・・・・・・ 1000mL
微量塩液(上記(2)に同じ)・・・ 1mL
寒天 ・・・・・・・・・・ 15〜20g
pH7.2〜7.4
(7)ISP培地No.9(プリドハム・ゴトリーブ寒天培地)
(NH4)2SO4 ・・・・・・・・・・ 2.64g
KH2PO4 ・・・・・・・・・・・・・ 2.38g
K2HPO4 ・・・・・・・・・・・・・ 5.65g
MgSO4・7H2O ・・・・・・・・・ 1g
脱イオン水 ・・・・・・・・・・・ 1000mL
プリドハム・ゴトリーブ微量塩液* ・・・ 1mL
*)プリドハム・ゴトリーブ微量塩液
CuSO4・5H2O ・・・・・0.64g
FeSO4・7H2O ・・・・・0.11g
MnCl2・4H2O ・・・・・0.79g
ZnSO4・7H2O ・・・・・0.15g
脱イオン水 ・・・・・・・・・・100mL
〔培養条件〕
培地 LB寒天(Becton Dickinson, MD, USA)
培養温度 50℃
培養時間 24時間
1.分解菌の探索及び同定
実施例1と同様の手順で,バイオマックス〔Biomax(登録商標)〕フィルムを堆肥に長期間埋設しておいた後に取り出し,付着菌を分離して,菌液(懸濁液)を,バイオマックスの粉末の部分水解物を含有するLB寒天培地に塗布し,培養して,出現したコロニーを観察し,1個のコロニーを同寒天培地上で繰り返し培養して純培養を得た。こうして得られた分離菌(AHK190)について,実施例1と同様の方法で,バイオマックスに対する分解能力を確認した。結果を表5に示す。
AHK190: AB376228(配列番号9)
16S rDNA配列と生理試験に基づいて、当該菌株の分類学上の位置をSaccharomonospora viridis.と判定した。
得られた菌は,2008年2月13日付けで,独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに,受託番号FERM P−21507を以って国内寄託されている。
Claims (9)
- 受託番号FERM BP−10827,FERM BP−10828,FERM BP−10829,及びFERM P−21507である各菌株より選ばれる菌株。
- 請求項1の菌株であって,ポリエステル分解性を有し,該ポリエステルが芳香族脂肪族ポリエステル又は脂肪族ポリエステルであってよいものである,菌株。
- 該芳香族脂肪族ポリエステルが,芳香族ジカルボン酸としてテレフタル酸を、ジオールとしてグリコールモノマーまたはオリゴマーを、及び脂肪族ジカルボン酸としてHOC(O)(CH2)nC(O)OH(ここに,nは0〜10の整数を表す。)を含んでなるモノマーの重合したポリエステルである,請求項2の菌株。
- 該芳香族脂肪族ポリエステルがバイオマックス(Biomax,登録商標)又はエコフレックス(Ecoflex,登録商標)である,請求項2又は3の菌株。
- 該バイオマックス(Biomax,登録商標)が,バイオマックス(Biomax,登録商標)4024,4026又は4027であり、該エコフレックス(Ecoflex,登録商標)がF又はSグレードである,請求項4の菌株。
- 請求項1ないし5の何れかの菌株を,分解処理すべきポリエステルの表面及び/又は該ポリエステルを埋設する堆肥に適用し,該ポリエステルを該堆肥中に埋設することにより,該菌株による該ポリエステルの促進された生分解反応を行なわせることを特徴とする,ポリエステルの分解処理方法。
- 該芳香族脂肪族ポリエステルが,芳香族ジカルボン酸としてテレフタル酸を、ジオールとしてグリコールモノマーまたはオリゴマーを、及び脂肪族ジカルボン酸としてHOC(O)(CH2)nC(O)OH(ここに,nは0〜10の整数を表す。)を含んでなるモノマーの重合したポリエステルである,請求項6の方法。
- 該芳香族脂肪族ポリエステルがバイオマックス(Biomax,登録商標)又はエコフレックス(Ecoflex,登録商標)である,請求項6又は7の方法。
- 該バイオマックス(Biomax,登録商標)が,バイオマックス(Biomax,登録商標)4024,4026又は4027であり、該エコフレックス(Ecoflex,登録商標)がエコフレックス(Ecoflex,登録商標)F及びSグレードである,請求項8の方法。
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