CN108424894A - 一种嗜热真菌角质酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜热真菌角质酶及其编码基因与应用。该角质酶是如下1)或2)或3)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)序列表序列2自氨基末端第17至215位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有角质酶活性的蛋白质。将该蛋白质的编码基因导入巴斯德毕赤酵母中构成的重组菌在5L发酵罐中进行高密度发酵，发酵液的酶活力可达12536U/mL，蛋白质含量为10.8mg/mL。该角质酶能够水解黄油制备奶味香精；催化短碳链醇和酸的酯化反应合成风味酯。该角质酶热稳定性好，产酶水平高，具有工业化生产及应用的潜力。

Description

一种嗜热真菌角质酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种嗜热真菌樟绒枝霉角质酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。

背景技术

角质酶(EC 3.1.1.74)是一种能够降解角质的水解酶，是α/β水解酶家族中分子量较小的成员。角质酶具有广泛的底物特异性，能够水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和天然聚酯等；此外，角质酶还可以催化酯化反应和转酯化反应。因此，角质酶在食品工业、纺织工业、生物降解、洗涤剂、合成生物柴油等诸多领域都有广泛的应用(张效宁等.角质酶的研究与应用进展,中国酿造,2013,32(11):11-17)。在食品工业中，角质酶可以催化酯化和转酯化反应合成风味酯(Dutta&Dasu,Synthesis of short chain alkyl esters usingcutinase from Burkholderia cepacia NRRL B2320.Journal of Molecular CatalysisB:Enzymatic,2011,72:150-156；Xu et al.,Characterization of an acidic cold-adapted cutinase from Thielavia terrestris and its application in flavorester synthesis.Food Chemistry,2015,188:439-445；Su et al.,Short-chainaliphatic ester synthesis using Thermobifida fusca cutinase.Food Chemistry,2016,206:131-136.)；也能够水解黄油制备奶味香精(Horii et al.,Fatty acidproduction from butter using novel cutinase-displaying yeast.Enzyme andMicrobial Technology,2010,46:194-199；Regado et al.,Flavour development vialipolysis of milkfats:changes in free fatty acid pool.International Journalof Food Science&Technology,2007,42:961-968)。在纺织工业中，角质酶可用于棉纤维的生物精炼过程，可改善织物的润湿性和白度(李江华等.角质酶的研究进展,生物工程学报,2009,12:1829-1837)。在生物降解方面，角质酶可以降解聚酯，如聚己内酯、聚丁二酸丁二醇酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯等；可以降解有毒物质，如真菌毒素玉米赤霉烯酮(维克索-尼尔森和索伦森.用于饲料产品的解毒的角质酶.中国专利,申请号200880122226.1)，杀虫剂马拉松(Kim et al.,Biodegradation and detoxification of organophosphateinsecticide,malathion by Fusarium oxysporum f.sp pisi cutinase.Chemosphere,2005,60:1349-1355)。

产角质酶的微生物主要有真菌、细菌和放线菌(Dutta et al.,Production,characterization and applications of microbial cutinases.ProcessBiochemistry,2009,44(2):127-134)。目前，对中温真菌角质酶的研究较多，而关于嗜热真菌角质酶的报道较少，仅见特异腐质霉(Humicola insolens)和太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)(Nielsen et al.,Thermal stability of Humicola insolenscutinase in aqueous SDS.Journal of Physical Chemistry,2007,111(11):2941-2947；Yang et al.,A low molecular mass cutinase of Thielavia terrestris efficientlyhydrolyzes poly(esters).Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2013,40(2):217-226)。

利用基因工程的手段可提高酶的产量，以满足大规模工业化应用的要求。迄今，已有不少角质酶在大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和镰孢霉(Fusariumvenenatum)中成功表达。围小丛壳菌(Glomerella cingulata)角质酶在毕赤酵母中表达，并在5L发酵罐中进行高密度发酵，酶活力最高达434U/mL，蛋白质含量3.8g/L(Seman etal.,High level expression of Glomerella cingulata cutinase in dense culturesof Pichia pastoris grown under fed-batch conditions.Journal of Biotechnology,2014,184:219-228)。来源于腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的角质酶基因成功表达在酿酒酵母中，5L发酵罐中分批补料发酵后，角质酶产量最高为546mg/L(Ferreira et al.,Towards a cost effective strategy for cutinase production by a recombinantSaccharomyces cerevisiae:strain physiological aspects.Applied Microbiologyand Biotechnology,2003,61(1):69-76)。吴敬等采用大肠杆菌外源重组蛋白分泌表达进行了嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)角质酶的克隆表达和高效分泌研究(吴敬等.一种高效分泌表达重组角质酶的基因工程菌及其构建方法.中国专利,申请号:200910260984.6；吴敬等.一种产角质酶基因工程菌及其应用.中国专利,申请号:201010578924.1)。经密码子优化的嗜热裂孢菌角质酶基因在大肠杆菌中成功表达后，经发酵条件优化，酶活力高达2258.5U/mL，蛋白浓度为5.1g/L(Su et al.,Enhancedextracellular expression of gene-optimized Thermobifida fusca cutinase inEscherichia coli by optimization of induction strategy.Process Biochemistry,2015,50:1039-1046)。虽然已有不少角质酶基因表达的报道，但是表达量仍不高，高产角质酶的菌株还有待挖掘。

发明内容

本发明的目的在于提供一种角质酶，来源于樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)S168。菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏日期：2012年4月19日，保藏号为CGMCC NO.6022。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

本发明提供的角质酶，命名为McCut，是如下1)或2)或3)所述的蛋白质：

1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)序列表中序列2自氨基末端第17至215位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将1)或2)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有角质酶活性的蛋白质。

其中，序列表中序列2由215个氨基酸残基组成。

为了使1)或2)或3)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签的序列。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成所述蛋白质的编码基因，再进行生物表达得到。

上述3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的核苷酸序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码所述蛋白质的核酸分子可为如下1)或2)或3)所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由648个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸序列编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明编码所述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述蛋白质的核苷酸序列具有75％或者更高同一性的核苷酸序列，只要编码所述蛋白质且具有角质酶活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的核苷酸序列。

所述同一性指与天然核苷酸序列的序列相似性。同一性包括与本发明编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件进行评价时，两个或多个核苷酸序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，数值可以用来评价相关核苷酸序列之间的同一性。

含有编码所述蛋白质的核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因植物也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为在载体pPIC9K的多克隆位点插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组质粒pPIC9K-McCut。

所述重组载体具体可为用序列表中序列1所示的核苷酸序列替换载体pPIC9K的EcoRI和NotI识别序列间的片段(载体pPIC9K被限制性核酸内切酶EcoRI和NotI切成一个大片段和一个小片段，替换该小片段)，得到的重组质粒pPIC9K-McCut。

所述重组菌可通过将所述重组载体导入宿主微生物中得到。

所述宿主微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述酵母为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。

将所述的重组载体导入巴斯德毕赤酵母中，得到重组巴斯德毕赤酵母。

所述转基因植物均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述蛋白质的编码基因导入受体植物得到的第一代转基因植物，也包括第一代转基因植物的子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该编码基因，也可用常规育种技术将该编码基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明的另一目的在于提供一种生产所述蛋白质的方法。

所述方法是将所述重组菌进行发酵培养，得到所述的蛋白质。

所述发酵培养依次经过如下步骤：

1)种子液培养：将重组菌接种到150mL BMGY培养基中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD₆₀₀为2-6，得到种子液；

2)基础培养：将步骤1)的种子液接种于含有1.5L基本培养基BSM的5L发酵罐中培养，所述培养温度为30℃，pH为4.0，转速600rpm，待甘油消耗完全，进行甘油流加培养；

3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％(w/v)的甘油，温度为30℃，pH为5.0，通过调整流加速度保持溶氧在20％-70％，流加时间4-6h；待菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油；

4)甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿半小时，流加100％甲醇诱导，转速800rpm，培养温度为30℃，pH为6.0，溶氧20％-70％。

上述蛋白质在水解黄油制备奶味香精和合成风味酯中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种来源于樟绒枝霉的角质酶及其编码基因。重组巴斯德毕赤酵母在5L发酵罐中高密度发酵，酶活力可达12536U/mL，蛋白质含量10.8mg/mL，实现了高效表达。该角质酶的最适反应pH为8.0，在pH 3.0-10.5保温30min，残余酶活力在85％以上；最适反应温度为45℃，在75℃下保持较好的稳定性。该角质酶能够水解黄油，具有制备奶味香精的潜力；且可催化短碳链酸和醇的酯化反应，合成风味酯。本发明所述的角质酶在工业生产和应用中具有很大的潜力。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为角质酶在5L发酵罐中的产酶历程图(■：蛋白浓度；▲：酶活力)。

图2为角质酶在5L发酵罐中高密度发酵过程的SDS-PAGE电泳图(列M：低分子量标准蛋白；列1-8：分别为诱导0、12、36、60、84、108、132、144h的发酵上清液)。

图3为角质酶的纯化电泳图(M：低分子量标准蛋白；1：粗酶液；2：纯酶液)

图4为角质酶的最适pH测定曲线图(◆：Citrate；□：PB；○：Tris-HCl；●：HEPES；◇：Tricine；▲：CHES；)。

图5为角质酶的pH稳定性测定曲线图(■：Glycine-HCl；◆：Citrate；□：PB；○：Tris-HCl；●：HEPES；◇：Tricine；▲：CHES；△：CAPS)。

图6为角质酶的最适温度测定曲线图。

图7为角质酶的温度稳定性测定曲线图。

图8为角质酶添加量对水解黄油的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、樟绒枝霉角质酶在重组巴斯德毕赤酵母中的表达

一、重组菌的构建

以樟绒枝霉角质酶的cDNA为模板，根据已报道的真菌角质酶氨基酸序列，利用在线软件Block Maker(http://blocks.fhcrc.org/blocks/blockmkr/make_blocks.html)搜索保守区，再利用在线引物设计软件CODEHOP(http://blocks.fhcrc.org/codehop.html)设计简并引物，上游引物McCutEcoRIF：5’-tgcgaGAATTCTCCCCAGTTGCAGTGGAGA-3’(下划线示EcoRⅠ酶切位点，下划线后序列与序列表中序列1中的第49—67位相同)和下游引物McCutNotIR：tgcgaGCGGCCGCTTACGAGAGTCTATCCTCAAGCC(下划线示NotⅠ酶切位点，下划线后序列与序列表中序列1中的第626位至第648位相匹配)。PCR(聚合酶链式反应)扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，循环35次；最后72℃后延伸5min。PCR的产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以EcoRⅠ和NotⅠ双酶切。将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的酵母表达载体pPIC9K的载体骨架片段以T4DNA连接酶进行连接，转化至宿主大肠杆菌DH5α。挑选菌落PCR(PCR所用的引物和扩增条件与前述PCR的条件相同)验证为阳性的转化子测序。将得到的重组载体命名为pPIC9K-McCut。

将得到的重组载体pPIC9K-McCut以限制性内切酶SalI线性化后得电转化巴斯德毕赤酵母GS115，构成重组菌。

二、高拷贝筛选

将步骤一中得到的重组菌涂布MD平板(1.34％YNB，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖)，从MD平板得到的His⁺转化子经灭菌水刮取后取100μL涂布于不同浓度的YPD-G418平板(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖，G418浓度分别为1、2和4mg/mL)。30℃下培养3-5d后，挑取转化子于BMGY培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)摇瓶培养16-18h，3000rpm离心5min，收集菌体，用BMMY培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)重悬菌体至OD₆₀₀为1.0左右，诱导目标蛋白表达。以上培养条件为100mL三角瓶装量20mL培养基，温度30℃，转速200rpm。酶活力测定方法参照实施例2中步骤一。

三、重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵

将步骤二获得的产酶水平高的重组巴斯德毕赤酵母菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵。发酵方法及培养基(种子培养基BMGY、发酵基本培养基BSM、甘油分批补料培养基和100％甲醇诱导培养基)的配制参照Pichia Fermentation Process Guidelines(VersionB，053002，Invitrogen)。整个发酵过程采用种子液培养、基础培养、甘油流加培养和100％甲醇诱导培养四个阶段。

1)种子液培养：选择摇瓶发酵中产酶水平较高的重组菌株，接种到150mL BMGY培养基中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD₆₀₀为2-6。

2)基础培养：将种子液接种到5L发酵罐中(装有1.5L发酵基本培养基BSM)，发酵罐灭菌，28％浓氨水调pH 4.0，加入PTM₁ 4.35mL/L起始发酵液，接种量10％，转速600rpm，温度30℃。待甘油消耗完全(溶氧值迅速上升)，开始甘油流加培养阶段。

3)甘油流加培养：流加50％(w/v)的甘油，控制温度30℃，pH 5.0，始终监视溶氧，通过调整流加速度保持溶氧大于20％。流加时间4-6h，菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油。

4)100％甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿30min左右，流加100％甲醇诱导，转速800rpm，监控溶氧大于20％，控制温度30℃，pH 6.0。

发酵过程中取样测定菌体湿重、蛋白质含量和酶活力。结果显示，发酵132h酶活力达到最高，发酵上清液酶活力为12536U/mL，蛋白质浓度10.8mg/mL(图1)。由SDS-PAGE分析，目的蛋白分子量大小为21.85kDa(图2)，与预测分子量21.18kDa接近。

实施例2、角质酶的纯化及酶学性质

一、角质酶酶活力的定义及测定方法

角质酶酶活力测定参考Xu等的方法(Xu et al.,Characterization of anacidic cold-adapted cutinase from Thielavia terrestris and its application inflavor ester synthesis.Food Chemistry,2015,188:439-445)。将50μL适当稀释的角质酶液加入到400μL 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，在45℃水浴中预热2min，加入50μL20mM对硝基苯丁酸酯的异丙醇溶液后反应10min。反应完毕后加入500μL含有5％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)的300mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。最后在410nm处测量吸光值。酶活力单位(U)定义为：在以上条件下，每分钟反应生成1μmol对硝基苯酚所需要的角质酶量。比酶活力定义为1mg蛋白所具有的酶活力单位，表示为U/mg。

二、角质酶的纯化

将发酵上清液用20mM磷酸盐缓冲液(缓冲液A)透析16h，过QSFF强阴离子柱，上样流速为0.5mL/min。上样后用缓冲液A洗脱6个柱体积，流速为1min/mL，之后用含有0-500mMNaCl的缓冲液A线性洗脱，将有角质酶活性的洗脱液进行SDS-PAGE分析检测纯度(图3)，角质酶的纯化结果见表2。

表2角质酶的纯化表

三、角质酶的酶学性质

1)最适反应pH及pH稳定性

在45℃，50mM不同缓冲液中测定角质酶酶活力以确定最适反应pH，所使用的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠(Citrate，pH 3.0-6.0)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(PB,pH 6.0-8.0)、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)(pH 7.0-8.0)、Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)(pH 7.5-8.5)、Tris-HCl(pH 7.0-9.0)和CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸)(pH 8.0-10.0)。用不同的pH值缓冲液分别稀释酶液，将稀释好的酶液置于50℃水浴中分别处理30min后，置于冰水中冷却30min，然后测定残余酶活力。按照实施例2步骤一的方法测定酶活力，以未经处理的酶液作为对照，计算残余酶活力占未处理对照酶活力的百分比。

结果表明，角质酶的最适反应pH为8.0(图4)；在pH 3.0-10.5处理30min，残余酶活力在85％以上(图5)。

2)最适反应温度及温度稳定性

将酶液用50mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液稀释适当倍数，分别在20-55℃下按照实施例2步骤一的方法测定酶活力以确定最适反应温度。温度稳定性的测定是将酶液分别在不同的温度下处理30min后，冰水浴中冷却30min，在45℃下测定残余酶活力，以未经处理的酶液作为对照。

结果表明，角质酶的最适反应温度为45℃(图6)，75℃以下保温30min后残余酶活力高于85％，有较好的温度稳定性(图7)。

实施例3、角质酶水解黄油

角质酶水解黄油：取1g黄油和1g 50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)混合，加入角质酶1500-4000U/g黄油，置于45℃，200rpm条件下水解。水解12h后加入15mL的乙醚：乙醇(2：1，v/v)混合溶剂，然后用0.1mol/L的KOH溶液滴定测定酸价。

气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测反应产物：水解后取上层油样，加入正己烷稀释，混匀，进行GC-MS检测。采用色谱柱DB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm)，进样量为1μL，分流比1：20，用He作为载气，流速为1.5mL/min；柱箱的升温程序为40℃保持2min，5℃/min升至210℃，保持5min；GC/MS接口温度250℃，EI离子源，离子源温度220℃，电子能量70eV，质谱扫描范围33-450aum。

当加入的角质酶量为3000U/g黄油时，水解效果最好，酸价为87.8mg/g(图8)。对角质酶水解黄油后的产物进行GC/MS分析，水解后的产物主要是脂肪酸类化合物，其中丁酸、己酸、辛酸、癸酸和月桂酸含量较高(表3)，该角质酶在水解黄油制备奶味香精方面有一定的应用潜力。

表3角质酶水解黄油后的产物

序号	保留时间(min)	化合物	峰面积百分比(％)
				1	21.463	丁酸	6.64
2	26.323	己酸	15.90
				3	30.677	辛酸	11.47
4	34.603	癸酸	24.00
				5	35.78	癸烯酸	1.94
6	36.604	十一烷酸	0.48
				7	38.323	月桂酸	34.41
8	40.882	十三烷酸	0.64

实施例4、角质酶合成风味酯

5mL异辛烷中加入0.1M的酸和0.2M的醇，加角质酶量200-600U/mL，40mg/mL分子筛，于55℃，200rpm条件下反应8h，取样200μL，进行气相检测。

气相色谱检测方法：色谱柱为HP-INNOWax(30m×0.32mm×0.25μm)，氮气为流动相；进样口和检测器(FID)温度250℃；柱温箱温度采用程序升温，50℃保持3min，15℃/min升至220℃，保持2min。

该角质酶能够催化合成风味酯，具体结果见表4。

表4角质酶合成风味酯

风味酯	转化率(％)
		丁酸乙酯	50-61
丁酸丁酯	90-98
		丁酸己酯	80-95
己酸乙酯	66-76
		己酸丁酯	89-98
己酸己酯	87-99

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

<110>中国农业大学

<120>一种嗜热真菌角质酶及其编码基因与应用

<160> 2

<210> 1

<211> 648

<212> DNA

<213>樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）

<400> 1

atgaagatcc aatttgttat ttccgctctg gctggcattg ccgctgcctc cccagttgca 60

gtggagaagc gccagatctt cggccctggg gacaatgatc ttcgcgatgg accctgcaag 120

gacatcacct tcatcttcgc ccgcggctca accgagcccg gcctcatggg aataactgtt 180

ggccctgata cttgcgatga attgaatcgt gagttccgtg gtagagtggc atgtcaaggc 240

gttggccctc gctacgaagc aagccttgcg ggcaatttcc tcccacgagg cacgacgcag 300

gcggccatcg acgaagccgc tgagttgttc aacctcgccc acactaagtg ccccaacacc 360

caaatcgtgg gtggcggcta cagccagggc gcagctgtca tgcacggcgc cattcccggc 420

ctctccaacg cagtgaagga tcagatcaag ggagttgttc tctatggaga cactcgcaac 480

gagcaagatg gcggacggat tccaaacttc ccgaccgaca agaccaacat catctgcaat 540

cccggtgact tggtttgcga cggcactctc atcctgaccg ctgcgcactt cacctatggc 600

accagagtcc gcggcgccgt tgactggctt gaggatagac tctcgtaa 648

<210> 2

<211> 215

<212>PRT

<213>樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）

<400> 2

Met Lys Ile Gln Phe Val Ile Ser Ala Leu Ala Gly Ile Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ser Pro Val Ala Val Glu Lys Arg Gln Ile Phe Gly Pro Gly Asp Asn

20 25 30

Asp Leu Arg Asp Gly Pro Cys Lys Asp Ile Thr Phe Ile Phe Ala Arg

35 40 45

Gly Ser Thr Glu Pro Gly Leu Met Gly Ile Thr Val Gly Pro Asp Thr

50 55 60

Cys Asp Glu Leu Asn Arg Glu Phe Arg Gly Arg Val Ala Cys Gln Gly

65 70 75

Val Gly Pro Arg Tyr Glu Ala Ser Leu Ala Gly Asn Phe Leu Pro Arg

80 85 90 95

Gly Thr Thr Gln Ala Ala Ile Asp Glu Ala Ala Glu Leu Phe Asn Leu

100 105 110

Ala His Thr Lys Cys Pro Asn Thr Gln Ile Val Gly Gly Gly Tyr Ser

115 120 125

Gln Gly Ala Ala Val Met His Gly Ala Ile Pro Gly Leu Ser Asn Ala

130 135 140

Val Lys Asp Gln Ile Lys Gly Val Val Leu Tyr Gly Asp Thr Arg Asn

145 150 155 160

Glu Gln Asp Gly Gly Arg Ile Pro Asn Phe Pro Thr Asp Lys Thr Asn

165 170 175

Ile Ile Cys Asn Pro Gly Asp Leu Val Cys Asp Gly Thr Leu Ile Leu

180 185 190

Thr Ala Ala His Phe Thr Tyr Gly Thr Arg Val Arg Gly Ala Val Asp

195 200 205

Trp Leu Glu Asp Arg Leu Ser

210 215

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下1)或2)或3)所述的蛋白质：

1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)序列表中序列2自氨基末端第17至215位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将1)或2)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有角质酶活性的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为DNA分子或RNA分子；所述DNA为cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述RNA为mRNA或hnRNA。

4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1)或2)或3)所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

5.含有权利要求2或3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因植物。

6.如权利要求5所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因植物，其特征在于：

所述重组载体是在pPIC9K的多克隆位点插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组质粒pPIC9K-McCut；

所述重组菌通过将所述重组载体导入宿主微生物中得到；

所述转基因植物均不包括繁殖材料，所述转基因植物包括将所述蛋白质的编码基因导入受体植物得到的第一代转基因植物，也包括第一代转基因植物的子代。

7.权利要求1所述蛋白质的生产方法。

8.如权利要求7所述的蛋白质的生产方法，其特征在于：所述方法是将权利要求5所述重组菌进行发酵培养，得到所述的蛋白质。

9.如权利要求8所述的蛋白质的生产方法，其特征在于：所述发酵培养依次经过如下步骤：

1)种子液培养：将重组菌接种到150mL BMGY培养基中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD₆₀₀为2-6，得到种子液；

2)基础培养：将步骤1)的种子液接种于含有1.5L基本培养基BSM的5L发酵罐中培养，所述培养温度为30℃，pH为4.0，转速600rpm，待甘油消耗完全，进行甘油流加培养；

3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％的甘油，温度为30℃，pH为5.0，通过调整流加速度保持溶氧在20％-70％，流加时间4-6h；待菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油；

4)甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿半小时，流加100％甲醇诱导，转速800rpm，培养温度为30℃，pH为6.0，溶氧20％-70％。

10.权利要求1所述蛋白质在水解黄油制备奶味香精和合成风味酯中的应用。