CN111254132B

CN111254132B - 一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN111254132B
Application number: CN202010069633.3A
Authority: CN
Inventors: 刘森林; 钟雅芳; 陈伟钊
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2040-01-21
Also published as: CN111254132A

Abstract

本发明公开一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。该碱性木聚糖酶WMN1基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括1308个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。上述碱性木聚糖酶WMN1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No：7所示。本发明还公开了上述碱性木聚糖酶WMN1在造纸、洗涤等工业中的应用。

Description

一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用。

背景技术

国外对木聚糖酶的研究始于20世纪50年代，从菌种构建到产品研发和生产都比较完善，可运用工业化大批量的生产木聚糖酶。目前研究的热点主要集中在微生物木聚糖酶基因的克隆与表达，木聚糖酶的调控机理与诱导、提纯与鉴定，利用纳米技术制备固定化酶等方面。我国对木聚糖酶的研究较晚，目前的研究主要是产木聚糖酶优良菌株的筛选及驯化，产酶条件的优化，酶的纯化和理化性质的研究，木聚糖酶基因克隆、表达和重组等方面。对于适用于造纸业的碱性木聚糖酶，国际上仅有少数可用于工业化生产的碱性木聚糖酶，而在国内还没有一种同时具备嗜热嗜碱这两种性质的木聚糖酶在造纸工业批量使用。因此，急需利用各种技术筛选适合造纸工业生产的碱性木聚糖酶。

碱性木聚糖酶是指最适反应条件为碱性的木聚糖酶。1973年，Horikoshi等从嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.C-59-2中第一次分离得到嗜碱木聚糖酶。嗜碱木聚糖酶由于其独特的高pH耐受性，在造纸工业中，可以将蒸煮过程中再吸附和沉积在纤维表面上木聚糖降解成低聚木糖或木糖，使纤维表面和内部微观结构发生变化，增加漂白化学品对纸浆纤维的可及性，使后续漂白处理时漂白剂易于与残余木素作用，减少漂白过程的漂剂用量，其生物特性与造纸工艺合理衔接，具有广阔的应用前景。

虽然国内外对于木聚糖酶的研究已经有了一定的基础，但迄今为止能够进行大规模生产的高酶活的优良菌株依然不多。不同的行业需要不同特性的酶，为了得到性状优良的、适用于造纸工业的碱性木聚糖酶，方法之一是通过蛋白质工程和基因工程对现有的木聚糖酶进行改造，提高其耐热和耐碱性。二是从极端环境(盐碱地、盐碱沙漠、碱湖和造纸工业的废水)中发掘木聚糖酶资源。利用天然资源从自然界中筛选优良性能的菌株是一种相当有效的手段。因此，亟待筛选获得适合造纸、洗涤等工业生产的碱性木聚糖酶及菌株。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种碱性木聚糖酶WMN1基因的核苷酸序列及其氨基酸序列。本发明根据木聚糖酶保守序列设计简并引物，用PCR的方法成功克隆出碱性木聚糖酶的酶基因。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述WMN1基因的表达载体。

本发明的另一目的在于提供含有上述WMN1基因的大肠杆菌菌株。

本发明的再一目的在于提供上述重组碱性木聚糖酶WMN1的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种碱性木聚糖酶WMN1基因，所述WMN1基因的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。

所述碱性木聚糖酶WMN1基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括1308个核苷酸。

上述碱性木聚糖酶WMN1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No：7所示。

碱性木聚糖酶WMN1基因开放阅读框编码435个氨基酸。

一种含有本发明WMN1基因的表达载体。

所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。

本发明的WMN1基因被插入至pET-28a(+)载体中。

本发明的WMN1基因被插入至pET-28a(+)载体中的NdeI和Xho I酶切位点之间；

含有本发明的WMN1基因的大肠杆菌菌株。

所述的大肠杆菌菌株含有本发明的表达载体。

一株表达碱性木聚糖酶WMN1的菌株，是将上述核苷酸序列构建成载体后转染到大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21 Star(DE3)得到。

一株表达碱性木聚糖酶WMN1的菌株的制备方法，包括如下步骤：

用PCR方法从Bacillus sp.WMN1(CCTCC NO：M 2020007)的基因组DNA中克隆出酶基因全长，将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a-WMN1，并转化大肠杆菌E.coli(Escherichia coli)BL21 Star(DE3)菌株；经过筛选后得到表达所述的碱性木聚糖酶WMN1的重组大肠杆菌菌株E.coli BL21Star(DE3)-WMN1；

所述的PCR的所用的引物的序列：

上游引物F2：5′-CATATGGGGCACATTCATCCCCT-3′；(下划线的序列表示的是NdeI酶切位点)

下游引物R2：5′-CTCGAGTTACGCCAAGTTTGCACGC-3′；(下划线的序列表示的是Xho I酶切位点)

所述的碱性木聚糖酶WMN1在造纸、洗涤等工业中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶蛋白在分子量及酶学特性等方面与己知蛋白的差异判断，碱性木聚糖酶基因WMN1为新的木聚糖酶基因。

(2)利用阴离子交换层析分离到分子量约为42kDa的重组酶蛋白。重组碱性内切木聚糖酶WMN1蛋白在最适作用pH、最适作用温度及对金属离子的耐受性等方面与野生酶基本一致。但重组碱性木聚糖酶对SDS具有非常良好的耐受性，与SDS对野生酶活性有部分抑制作用不同。重组碱性内切木聚糖酶在终浓度为1.5％的市售立白洗衣粉中的稳定性显著优于其天然的酶蛋白，显示重组酶制剂在洗涤剂等工业中的良好应用价值。

附图说明

图1是1％琼脂糖凝胶电泳结果；其中，A：Bacillus sp.WMN1基因组；B：TouchdownPCR克隆WMN1木聚糖酶基因保守序列电泳图，M为DNA Ladder Marker，1为WMN1保守序列；C：WMN1保守序列的上游基因电泳图，M为DNA Ladder Marker，1为WMN1木聚糖酶基因保守序列上游基因；D：WMN1保守序列的下游基因电泳图，M为DNA Ladder Marker，1为WMN1木聚糖酶基因保守序列下游基因。

图2是重组质粒pET-28a-WMN1的酶切鉴定；其中，M：Marker1：NdeI和XhoI双酶切；2：NdeI单酶切；3：XhoI单酶切；4：重组质粒pET-28a-WMN1。

图3是重组质粒pET-28a-WMN1在E.coli BL21 Star(DE3)中诱导不同时间的表达电泳图谱；M：蛋白Marker；1：无IPTG诱导的沉淀；2：1mM IPTG诱导1h的沉淀；3：1mM IPTG诱导3h的沉淀；4：1mM IPTG诱导6h的沉淀；5：1mM IPTG诱导12h的沉淀；6：1mM IPTG诱导24h的沉淀。

图4是不同诱导温度对重组碱性木聚糖酶活性的影响。

图5是重组碱性木聚糖酶WMN1蛋白纯化电泳图；其中，M：Marker；1：重组碱性木聚糖酶液氮反复冻融破碎上清液；2：液氮破碎细胞上清液过DEAE Sepharose Fast Flow后的具有酶活性的峰液。

图6是Bacillus sp.WMN1木聚糖酶阴离子交换图谱。

图7是Bacillus sp.WMN1木聚糖酶分离纯化的电泳图谱，其中M：蛋白Marker；1：Bacillus sp.WMN1粗酶液；2：DEAE Sepharose Fast Flow阴离子层析的酶活峰液；3：superdex75凝胶过滤层析的酶活峰液。

图8是重组碱性木聚糖酶WMN1的最适反应温度。

图9是重组碱性木聚糖酶WMN1的温度稳定性。

图10是重组碱性木聚糖酶WMN1的最适反应pH。

图11是重组碱性木聚糖酶WMN1的pH稳定性。

图12是金属阳离子和表面活性剂对重组碱性木聚糖酶WMN1酶活力的影响。

图13是洗衣粉浓度对重组碱性木聚糖酶WMN1酶活的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1

(一)材料

(1)菌种：嗜碱芽孢杆菌，是从土壤中筛选得到的一株具有产碱性木聚糖酶活力的菌株Bacillus sp.WMN1。所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2020年1月3日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2020007。宿主菌E.coli DH5α购自Invitrogen公司。

(2)载体：

大肠杆菌克隆载体pMD19-T Vector，具有Amp^r抗性标志，购自Takara(大连)宝生物公司。

(3)培养基

LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，固体培养基中加入15～20g琼脂，定容至1L，121℃高压灭菌20min。

1％琼脂糖凝胶：1g琼脂糖溶解于100mL 1×TAE缓冲液中，再加入5μL Goldview。

Amp：溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10mL。过滤除菌后分装成小份于-20℃贮存。以50μg/mL的终浓度添加于培养基中。

Kan：溶解0.5g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10mL。过滤除菌后分装成小份于-20℃贮存。以50μg/mL的终浓度添加于培养基中。

(4)主要试剂：细菌基因组提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购于Generay公司；Gel Extraction Kit为Omega公司生产；M5 Plasmid Miniprep plus Kit为聚合美公司生产；所用的简并引物、特异性引物和随机引物均为广州Invitrogen公司合成。核酸染料GoldenView为BioTeke公司生产，LA Taq酶、Ex Taq酶、限制性内切酶购于Takara公司，DNAMarker购于生工生物工程(上海)有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

(5)仪器：Thermo高速冷冻离心机、Bio-Rad电泳仪、GE healthcare快速蛋白层析系统、Thermo超微量紫外分光光度计、Thermo低温培养箱、Eppendorf大容量高速冷冻离心机、Bio-Rad PCR仪、振荡摇床、压力蒸汽灭菌锅、Millipore超纯水机、凝胶成像系统、分光光度计、电子天平、水浴锅、电热恒温培养箱、搅拌器、微波炉、鼓风干燥箱、Eppendorf移液器、BioTek酶标仪。

(二)实验方法

1、目标菌株的筛选

(1)富集培养：称取1g采集的土样，充分混匀在100mL的无菌水中，制成菌悬液后，取1mL菌悬液加入到灭菌的5mL富集培养基中，37℃富集培养48h。

富集培养基：木聚糖8.0g，蛋白胨10g，NaCl 15g，KH₂PO₄ 1.5g，Na₂HPO₄·12H₂O9.0g，MgSO₄·7H₂O 2.0g，定容至1L ddH₂O，pH9.0。

(2)平板初筛：将富集培养后的菌液10倍逐级稀释，分别取稀释倍数为10^-3、10^-5、10^-7的菌悬液0.5mL涂布于含有木聚糖的碱性选择培养基平板上，37℃培养48h，筛选出透明圈较大的单菌落挑入碱性斜面培养基，经多次筛选后得到单一菌落，并保藏为原始菌种。

选择培养基：木聚糖8.0g，KNO₃ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 15g，KH₂PO₄ 1.5g，琼脂15～20g，溶于1L ddH₂O，pH9.0。

碱性斜面培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgCl₂0.2g/L，NaCl 50g/L，Na₂CO₃ 10g/L，琼脂15～20g/L，pH 9.0。

(3)本文使用其中一株菌株作为研究，利用通用引物(27F和1492R)PCR扩增该菌株的16S rDNA序列，到GENBANK上进行比对，比对结果显示，该菌株的16S rDNA序列与其它多株芽孢杆菌的16S rDNA序列有99％的相似性，初步确定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，将其命名为Bacillus sp.WMN1。

所述的Bacillus sp.WMN1菌株的16S rDNA序列如SEQ ID No：1所示，其长度为1456bp。

2、Bacillus sp.WMN1基因组DNA的提取

使用Genray细菌基因组DNA提取试剂盒进行Bacillus sp.WMN1基因组的提取，步骤如下：

柱子准备：在gDNA recovery Column中加入200μL Buffer CBS，10000rpm离心1min，弃透过液，备用。

(1)取1mL过夜培养菌液，8000rpm，离心1min，彻底弃净培养基。

(2)加入150μL TE(pH8.0)悬浮细菌，加入Lysozyme溶液8μL，用吸头混匀，室温酶解5～10min。

(3)加入300μL Digestion Solution，混匀；加入4μL RNase A混匀，55℃保温10min；再加入4μL Proteinase K，55℃保温10～30min。将混合液全部转移到套放2mL收集管内的gDNA recovery Column柱中(如获得的裂解液粘稠度较低，则直接添加300μL PBSolution，充分摇动混匀，12000rpm室温离心5min，将上清全部转移到套放2mL收集管内的gDNA recovery Column柱中。如获得的裂解液过于粘稠，则依次添加300μL Ext Solution以及300μL PB solution充分摇匀，12000rpm室温离心5min，上层溶液为蓝色，基因组DNA存在于下层溶液中，用1mL Tip头伸到下层，将下层溶液全部转移到套放于2mL收集管内的gDNA recovery Column柱中。)

(4)8000rpm室温离心1min。取下gDNA recovery Column柱，弃去收集管中的废液。

(5)将gDNA recovery Column柱放回收集管中，加入500μL Wash Solution，8000rpm，室温离心1min。取下gDNA recovery Column柱，弃去收集管中的废液。

(6)重复步骤5一次。

(7)将gDNA recovery Column柱放回收集管中，12000rpm，室温离心1min，以去除残留的Wash Solution。

(8)将gDNA recovery Column柱放入新的洁净的1.5mL离心管中，在gDNArecovery Column柱中央加入50～100μL Elution Buffer，室温或37℃放置2min。

(9)12000rpm，室温离心1min。离心管中的液体即为基因组DNA，-20℃保存。

3、Bacillus sp.WMN1木聚糖酶基因的保守序列及其侧翼序列

3.1、TouchDown PCR克隆木聚糖酶基因保守序列

(1)使用PrimerPremier 5.0软件设计上下游引物。根据已知的10家族木聚糖酶保守序列设计上游简并引物(5′-CTCTGGAAGCCNAYNCMRTSNA-3′)和下游简并引物(5′-GACTGGGAYGTNGTNAAYGA-3′)，送去合成。

(2)使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：

然后按照以下条件进行Touchdown PCR反应：

采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

3.2、Touchdown PCR产物回收

PCR产物回收使用的是Omega公司生产的Gel Extraction Kit(100)D2500-01，主要步骤如下：

(1)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA回收率，之后放入EP管中。(注意切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤)

(2)切碎胶块。胶块切碎后可以加快胶块融化时间，提高DNA的回收率。称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μL进行计算，向胶块中加入等量的胶块融化液Binding Buffer。

(3)50℃溶解7～15分钟，保证溶胶要完全，否则会影响后续回收。

(4)将溶胶放入层析柱中(不超过700μL)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。

(5)加入300μL的Binding Buffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。

(6)加入700μL的SPW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。

(7)重复步骤(6)。

(8)将空柱13000rpm离心2min，以去掉残存的乙醇，否则会严重影响后续DNA的回收。

(9)弃掉收集管，换成干净的EP管，往吸附柱正中间的吸附膜小心加入15μLElution Buffer，室温静置3min，13000rpm离心2min，保存于-20℃冰箱中。

3.3、E.coli DH5α感受态细胞的制备

(1)蘸取菌种DH5α，在LB平板上划线，待长出单菌落将其接种于10mL LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养；

(2)取过夜摇床的菌液0.5mL，加入50mL LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养，待OD600nm在0.3～0.6时，将菌液收集起来，放置在冰上；

(3)4℃，5600rpm离心10min，去掉上清液，加入冰预冷的0.1mol/L CaCl₂ 10mL轻轻悬浮菌体，冰浴；

(4)重复步骤3；

(5)加入1.5mL 0.1mol/L CaCl₂和0.5mL 60％甘油轻轻悬浮菌体，分装在1.5mL离心管中，每管100μL，于-80℃保存备用。

3.4、Touchdown PCR产物的连接、转化和测序

(1)将4μL回收的PCR产物、1μL pMD-19T Simple Vector和5μL Solution I(TaKaRa公司生产)混匀，16℃水浴连接3h。

(2)从-80℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，冰中使其解冻。

(3)将连接好的产物加入感受态细胞中轻轻摇匀，冰上放置30min。(4)42℃水浴中放置90s，之后迅速置于冰上冷却15min。

(5)向管中加入1mL LB液体培养基，混匀后37℃、250rpm振荡培养1h。

(6)培养后的菌液于6000rpm离心5min，去除部分上清，剩下的混匀。取100μL涂布于含氨苄青霉素的筛选平板上，37℃培养16～24h。

(7)用接种环挑选长出的单菌落放于1mL LB培养基(含氨苄青霉素)中，37℃、250rpm过夜摇菌，每组选取1个送去测序。

3.5、TAIL-PCR克隆木聚糖酶基因保守序列的上下游基因

(1)TAIL-PCR是为了得到WMN1木聚糖酶基因保守序列上游和下游的基因，使用PrimerPremier 5.0软件设计特异性引物和随机引物。根据Touchdown PCR产物测序所得到的保守序列，分别设计2组20bp左右的上下游特异性引物，每组上游特异性引物(Upstreamprimer，简称USP)和下游特异性引物(Downstream primer，简称DSP)各有3个嵌套的引物用于TAIL-PCR的三轮反应。同时设计出7对随机引物(Arbitrary degenerate primer，简称AD)。保守序列和引物序列见表1。引物送去合成后，即可进行下一步实验。

表1 Bacillus sp.WMN1保守序列及用于TAIL-PCR的引物

名称	序列(5′-3′)
		保守序列	如SEQ ID No：2所示(243bp)
USP1	TCCAGTCCGTTGAGTAGTCG
		USP2	GTCAGCGGCACGGGCAGCA
USP3	ACCAAGCACCCGCTGGAAGA
		DSP1	GCCAGTCTGTCTTCCAGCGGGT
DSP2	AGGCTTTCCGTGCTGCCCGTG
		DSP3	TGCCCGTGCCGCTGACCC
AD1	AGTGNWGWANCAACG
		AD2	WGTGNAGAWNCAGASA
AD3	TNCSAGTWTGGWSTT
		AD4	CTWSNTACTNCTNTGC
AD5	TCWGNCTTANTANGT
		AD6	TGAGNAGWANSTNAGA
AD7	NGWCSAGWGANATGAA

(2)TAIL-PCR克隆上游基因

使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：

然后按照以下条件进行第一轮TAIL-PCR反应：

第二轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第一轮反应的PCR产物用ddH₂O稀释100倍后作为模板DNA，USP1换为USP2，反应条件如下：

第三轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第二轮反应的PCR产物用ddH2O稀释100倍后作为模板DNA，USP2换为USP3，反应条件同第二轮反应的一样。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮PCR产物进行检测。

(3)TAIL-PCR克隆下游基因

反应体系、反应条件同上游基因的克隆，相应的上游特异性引物换为下游特异性引物。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮PCR产物进行检测。

3.6、TAIL-PCR产物回收

方法同Touchdown PCR产物回收。

3.7、TAIL-PCR产物的连接、转化和测序

方法同Touchdown PCR产物的连接、转化和测序。

4、Bacillus sp.WMN1木聚糖酶基因全长序列

根据TAIL-PCR克隆得到的保守序列上下游基因的测序结果进行拼接，得到Bacillus sp.WMN1木聚糖酶基因全长序列。以Bacillus sp.WMN1的基因组为模板，使用上游引物F1：5′-ATGGGGCACATTCATCCCCT-3′和下游引物R1：5′-TTACGCCAAGTTTGCACGC-3′进行常规PCR，回收PCR产物，与pMD19-T连接，得到pMD19-T-WMN1，并转化E.coli DH5α感受态细胞中，得到含Bacillus sp.WMN1木聚糖酶基因全长的克隆菌株。

(三)实验结果

1、Bacillus sp.WMN1的基因组提取

使用Genray公司的细菌基因组提取试剂盒提取Bacillus sp.WMN1的基因组，之后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。由图1A可看出基因组的大小在10kb以上，可进行下一步实验。

2、Touchdown PCR克隆木聚糖酶基因保守序列结果

2.1、Touchdown PCR克隆保守序列的产物

根据已知保守序列设计本次PCR上下游引物，使用Touchdown PCR克隆WMN1木聚糖酶基因的保守序列，采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，结果如图1B所示。在泳道1中，大小约为240bp的条带符合已知的10家族木聚糖酶基因保守序列大小，所以对该条带进行回收。

2.2、木聚糖酶基因保守序列测序结果

通过PCR产物回收、连接、转化、测序等步骤，得到WMN1木聚糖酶基因保守序列的测序结果，其序列如下：

(1)基因序列(243bp)，如SEQ ID No：2所示。

(2)编码的氨基酸(81个)，如SEQ ID No：3所示。

2.3、NCBI氨基酸序列比对结果

将该氨基酸序列在NCBI数据库上进行比对(BLAST)，发现该保守序列与同为10家族的木聚糖酶Jonesia denitrificans具有83％的相似性，可推断克隆的保守序列所在的基因属于10家族木聚糖酶基因。

3、TAIL-PCR克隆木聚糖酶基因保守序列上游基因结果

3.1、TAIL-PCR克隆保守序列上游基因的产物

通过3个嵌套的上游特异性引物和随机引物AD进行TAIL-PCR，克隆出WMN1木聚糖酶基因保守序列的上游基因，其PCR产物电泳图如图1C所示。从图中可以看出，经过3轮PCR，此时出现的明显条带只有一条，大小约为750bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列上游基因，将其回收用于测序。

3.2、保守序列上游基因测序结果

经过测序，WMN1木聚糖酶基因保守序列上游基因测序结果如SEQ ID No：4所示(711bp)，其中，1～20bp为USP3。

4、TAIL-PCR克隆木聚糖酶基因保守序列下游基因结果

4.1、TAIL-PCR克隆保守序列下游基因的产物

通过3个嵌套的下游特异性引物和随机引物AD进行TAIL-PCR，克隆出WMN1木聚糖酶基因保守序列的下游基因，其PCR产物电泳图如图1D所示。从图中可以看出，经过3轮PCR，此时出现的明显条带只有一条，大小约为600bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列下游基因，将其回收用于测序。

4.2、保守序列下游基因测序结果

经过测序，WMN1木聚糖酶基因保守序列下游基因测序结果如SEQ ID No：5所示(637bp)，其中，1～18bp为DSP3。

5、完整的酶基因序列及其编码的氨基酸序列

5.1、完整的酶基因序列

将上下游TAIL-PCR的产物测序结果参照保守序列进行拼接，得到WMN1木聚糖酶基因一个以ATG开始、以TAA结束的完整开放阅读框(ORF)，长度为1308bp。其核苷酸序列如SEQID No：6所示。

5.2、编码的氨基酸序列

该基因编码的氨基酸个数为435个，氨基酸序列如SEQ ID No：7所示。

5.3、NCBI氨基酸序列比对结果

将该氨基酸序列在NCBI数据库进行比对(BLAST)，发现该氨基酸序列与同为10家族的木聚糖酶Jonesia quinghaiensis具有83％的相似性，可初步推断编码该氨基酸序列的基因为新的木聚糖酶基因。

实施例2

(一)材料

1、菌种：嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.WMN1(CCTCC NO：M 2020007)。宿主菌E.coliDH5α，表达宿主菌E.coli BL21 Star(DE3)均购自Invitrogen公司。

2、载体：大肠杆菌克隆载体pMD19-T Vector，具有Amp^r抗性标志。大肠杆菌表达载体pET-28a(+)含有Kan^r抗性标记，均购自Takara(大连)宝生物公司。

3、培养基及缓冲液

LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，固体培养基中加入15-20g琼脂，定容至1L，121℃高压灭菌20min。

100mM IPTG：2.4g IPTG溶解在100mLddH₂O中，0.45μm滤膜除菌，分装，-20℃保存。

蛋白分离纯化缓冲液：

Tris-HCl缓冲液A(平衡缓冲液)：20mMTris，用HCl调节pH至8.0。

Tris-HCl缓冲液B(洗脱缓冲液)：20mMTris，1M NaCl,用HCl调节pH至8.0。

1％木聚糖溶液:1g木聚糖溶解于pH9.0的0.05M Gly-NaOH缓冲液中，定容至100mL，用前充分摇匀。

Gly-NaOH缓冲液(0.05M)：甘氨酸3.8g，氢氧化钠0.35g，溶于1L ddH₂O，pH9.0。

3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液：准确称取DNS 7.5g、氢氧化钠14.0g(缓慢加入)、酒石酸钾钠216g、偏重亚硫酸钠6.0g，搅拌均匀，加入5.6mL预先在60℃水浴中融化的苯酚(有毒，带口罩)，充分溶解，加去离子水定容至1L，贮于棕色瓶中，室温下避光放置一周后使用。

4、主要试剂：细菌基因组提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购于Generay公司；Gel Extraction Kit为Omega公司生产；M5 Plasmid Miniprep plus Kit为聚合美公司生产；所用的简并引物、特异性引物和随机引物均为广州Invitrogen公司合成。核酸染料GoldenView为BioTeke公司生产，LA Taq酶、Ex Taq酶、限制性内切酶购于Takara公司，DNAMarker、蛋白Marker、IPTG均购于生工生物工程(上海)有限公司。木聚糖生产于Megazyme。阴离子交换层析介质DEAESepharoseFastFlow为GE公司生产。10kDa蛋白超滤管购于Millipore公司。其他试剂均为国产分析纯。

5、仪器：Thermo高速冷冻离心机、Bio-Rad电泳仪、GE healthcare快速蛋白层析系统、Thermo超微量紫外分光光度计、Thermo低温培养箱、Eppendorf大容量高速冷冻离心机、Bio-Rad PCR仪、振荡摇床、压力蒸汽灭菌锅、Millipore超纯水机、凝胶成像系统、分光光度计、电子天平、水浴锅、电热恒温培养箱、搅拌器、微波炉、鼓风干燥箱、Eppendorf移液器、BioTek酶标仪。

(二)实验方法

1、Bacillus sp.WMN1木聚糖酶基因在大肠杆菌里的表达

1.1.重组质粒pET-28a-WMN1的构建

提取pMD19-T-WMN1质粒，以此为模板，使用上游引物F2：(5′-CATATGGGGCACATTCATCCCCT-3′，其中，下划线的序列表示的是NdeI酶切位点)和下游引物R2：(5′-CTCGAGTTACGCCAAGTTTGCACGC-3′，其中，下划线的序列表示的是Xho I酶切位点)进行常规PCR，回收PCR产物，得到WMN1木聚糖酶基因全长。使用NdeI、XhoI进行双酶切，与此同时将表达载体pET-28a(+)也进行NdeI、XhoI双酶切。酶切反应体系如下：

酶切反应在37℃进行，酶切时间为30min。酶切完成后使用PCR产物纯化试剂盒分别对酶切产物进行回收，之后将WMN1与表达载体pET-28a(+)连接起来，得到重组质粒pET-28a-WMN1。连接体系如下：

在22℃水浴4h，之后转化大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)感受态细胞中。

1.2.E.coli BL21 Star(DE3)感受态细胞的制备

E.coli BL21 Star(DE3)感受态细胞的制备与E.coli DH5α感受态细胞的制备相同。

1.3.转化E.coli BL21 Star(DE3)感受态细胞和培养

(1)1μL重组质粒pET-28a-WMN1与100μL感受态细胞混匀，冰浴30min；

(2)42℃热激90秒，冰浴10min；

(3)加入1mL LB液体培养基，37℃150r/min培养1h；

(4)6000r/min离心1min，去掉部分上清，将剩下的菌液吹打混匀，吸取200μL在含kan的平板上涂布均匀，37℃培养过夜。

(5)对照组以同体积的无菌水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。

(6)挑取平板的阳性单克隆于含kan的液体培养基过夜摇床培养，用于质粒的提取，并进行甘油保种。

1.4.使用M5 Plasmid Miniprep plus Kit进行重组质粒的小量提取

(1)柱平衡：向离心吸附柱中加入400μL Buffer BL，静止1min，室温下12000rpm离心1min，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新放回收集管中。

(2)取2mL过夜培养的菌液，室温12000rpm离心1min，尽量将上清去除干净。

(3)加入250μL Solution I，旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀。

(4)加入250μL Solution II，温和颠倒混匀6-8次，直到溶液变得清亮粘稠。

(5)加入350μL Solution III，立即温和颠倒混匀6-8次，可见白色沉淀物产生，室温静置2min，然后12000rpm离心5min。

(6)小心将上清液转移到离心吸附柱中，静置2min，让质粒DNA与吸附柱中的硅胶膜充分结合。12000rpm离心30sec，弃收集管中滤液。

(7)向吸附柱中加入500μL Buffer WB1，12000rpm离心30sec，弃收集管中滤液。

(8)加入500μL Buffer WB2，室温12000rpm离心30sec，弃收集管中滤液。

(9)重复步骤8一次。

(10)室温12000rpm离心2min，甩干残留液体。

(11)将离心吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，加入50-100μL的洗脱液BufferEB(60℃预热)，室温放置2min。12000rpm离心1min，离心管底溶液即质粒DNA。

1.5.酶切鉴定。按下面体系配制酶切体系，分别进行双酶切鉴定和单酶切鉴定：

1.6.重组大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)-WMN1的诱导表达

(1)将筛选得到的菌株E.coli BL21 Star(DE3)-WMN1接种到含有kan的20mL LB液体培养基的摇瓶中培养过夜。

(2)从上述菌液中取500μL接种到含kan抗性的50mL LB培养基中37℃摇床培养。

(3)待OD值达到0.6时加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导。

(4)分别在37℃诱导1h、3h、6h、12h、24h后取样，并分别对样品进行超声破碎，12000rpm高速离心，测上清液中酶活。

1.7.SDS-PAGE蛋白电泳分析

将37℃诱导1h、3h、6h、12h、24h后取样的菌液进行超声破碎，12000rpm高速离心，对破碎沉淀进行蛋白电泳。

2、重组碱性木聚糖酶蛋白诱导表达条件的研究

诱导温度对酶活的影响：在装有50mL LB培养基的250mL摇瓶中加入500μL过夜培养的菌液，培养至OD600为0.6时加入终浓度为1mM的IPTG，置于不同温度(28℃、33℃、37℃)培养，定时取样并用液氮反复冻融法破碎细胞后测其上清酶活力。

3、重组碱性木聚糖酶蛋白WMN1的分离纯化和酶学性质的研究

3.1.重组碱性木聚糖酶蛋白WMN1的阴离子交换层析

分离纯化使用的离子交换层析介质为DEAE Sepharose Fast Flow。缓冲液体系为pH8.0的Tris-HCl缓冲液，平衡液为pH8.0的Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含NaCl pH8.0的Tris-HCl缓冲液。取约60mL介质小心灌入规格为Φ1.6cm×40cm的层析柱中，使得凝胶均匀且无气泡。用3～5倍柱体积的平衡液进行平衡，待A280稳定后将经液氮反复冻融的破碎上清液上样，穿透峰出现之后进行盐浓度梯度洗脱，分别收集不同盐浓度梯度洗脱出来的峰，检测各个峰的木聚糖酶酶活。具有酶活性的峰即为重组的碱性木聚糖酶的纯酶液。后进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，剩下的纯酶液放4℃保存，用于后续的酶学性质研究。

3.2嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.WMN1产生的碱性木聚糖酶的分离纯化

1、粗酶液的制备

将菌株Bacillus sp.WMN1在发酵培养基中进行液体发酵，在37℃，200rpm的培养条件下发酵5d，于4℃，12000rpm高速冷冻离心25min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，即得粗酶液。测定其内切木聚糖酶活性后，用于离子交换层析。

2、碱性木聚糖酶的阴离子交换层析

分离纯化使用的离子交换层析介质为DEAE Sepharose Fast Flow。缓冲液体系为pH8.0的Tris-HCl缓冲液，平衡液为pH8.0的Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含NaCl pH8.0的Tris-HCl缓冲液。取约60mL介质小心灌入规格为Φ1.6cm×40cm的层析柱中，使得凝胶均匀且无气泡。用3～5倍柱体积的平衡液进行平衡，待A280稳定后上样(粗酶液)，穿透峰出现之后进行盐浓度梯度洗脱，分别收集不同盐浓度梯度洗脱出来的峰，检测各个峰的木聚糖酶酶活。使用10kDa的超滤管将洗脱的具有酶活性峰进行浓缩脱盐，得到碱性木聚糖酶的酶液，即浓缩酶液。后进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，剩下的浓缩酶液放4℃保存，用于后续的凝胶过滤。

3、碱性木聚糖酶的凝胶过滤

使用预装柱superdex75将进行过阴离子交换层析的浓缩酶液再次进行分离。缓冲液体系为pH8.0的Tris-HCl缓冲液，用3～5倍体积缓冲液将A280基线冲洗至稳定状态后，取适量浓缩酶液上样，再用1个体积将样品进行洗脱，并收集洗脱峰液，即纯酶液，记为WMN1，进行酶活检测和蛋白电泳分析之后，用于酶学性质的研究。

3.3.SDS-PAGE蛋白电泳分析

(1)试剂的准备与配制

10％过硫酸铵(W/V)：0.1g过硫酸铵溶解于1mL去离子水中，现配现用。

30％丙烯酰胺、10％SDS、pH8.8的分离胶缓冲液、pH6.8的浓缩胶缓冲液、10XTris-Glycine SDS电泳缓冲液(pH8.3)、5×蛋白质加样缓冲液；

染色液：将2.5g考马斯亮兰R-250溶解于500mL甲醇，加入100mL冰醋酸，混匀，去离子水补至1L。

脱色液：乙醇50mL，乙酸100mL，去离子水定容至1L。

(2)SDS-PAGE凝胶的配制：

a.按照下表配制10％的分离胶：

表2 SDS-PAGE凝胶分离胶配制

b.按照下表配制5％的浓缩胶：

表3 SDS-PAGE凝胶浓缩胶配制

c.待分离胶聚合之后，倒掉上层的水，加入浓缩胶，并插好梳子，直至完全聚合后开始SDS-PAGE凝胶电泳。

(3)电泳的步骤：

a.样品准备：在适量样品中加入5×Loading buffer，沸水浴5min，然后12000rpm离心10min，取上清备用。

b.向电泳槽的内外槽中加入现配的电泳缓冲液。

c.上样：取30μL上述样品上清加入到孔道中，后加入5μL的预染蛋白Marker。

d.电泳：接通电源，并正确连接正负极，电压为120V，约50min，即待溴酚兰指示剂下行至凝胶底部停止电泳。

e.染色：小心将凝胶从玻璃板上取下，加入适量考马斯亮兰染色液，在振荡摇床上染色20～30min。

f.脱色：将染色液倒掉，用去离子水漂洗一两遍，然后加入脱色液，多次更换脱色液直至蛋白条带清晰可见。

3.4.重组碱性木聚糖酶蛋白WMN1的酶学性质研究

木聚糖酶酶活测定方法：以pH＝9.0的Gly-NaOH缓冲液制备的1％木聚糖溶液为底物，取其1mL，加入100μL经适当稀释的上述酶液，混匀，于45℃下振荡反应20min后，迅速加入1mL DNS(3,5-二硝基水杨酸)溶液，沸水浴10min，冷却后于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每分钟由底物产生1μmol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，用U/mL表示。

(1)最适反应温度与温度的稳定性

取适量稀释的纯酶液，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下反应20min，DNS法测定其酶活力，以此确定最适反应温度。研究温度的稳定性时，将适量稀释的纯酶液放置在不同的温度下保温1h，随后在45℃下反应20min测定其酶活力。

(2)最适反应pH与pH的稳定性

取适量稀释的纯酶液，分别在pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12下反应20min，DNS法测定其酶活力，以此确定最适反应pH。研究pH的稳定性时，将适量稀释的纯酶液放置在不同的pH下保温1h，随后在pH9.0下反应20min测定其酶活力。

(3)金属阳离子和表面活性剂对酶活力的影响

在适量纯酶液中分别加入一定体积的金属阳离子溶液，使其终浓度为10mM；加入的EDTA的浓度为0.1％；加入的SDS的浓度为0.05％和0.1％。均放置在37℃下保温30min后测定其酶活力。

(4)洗衣粉对酶活力的影响

在适量纯酶液中加入一定量的立白洗衣粉使其终浓度为0.5％、1％、1.5％、2％、5％，37℃保温30min，然后测定其酶活力。

(三)实验结果

1、重组质粒pET-28a-WMN1的构建

提取质粒pMD19-T-WMN1，并以此为模板，使用上游引物F2和下游引物R2进行常规PCR，回收PCR产物，得到WMN1木聚糖酶基因全长。使用NdeI、XhoI进行双酶切，与此同时将表达载体pET-28a(+)也进行NdeI、XhoI双酶切。酶切完成后对酶切产物进行回收，之后将WMN1与表达载体pET-28a(+)连接起来，得到重组质粒pET-28a-WMN1。将重组质粒pET-28a-WMN1转化E.coli BL21 Star(DE3)感受态细胞，在含50μg/mL的卡那霉素平板上涂布培养。挑取阳性单克隆过夜摇床培养之后提取重组质粒进行质粒提取。将提取的质粒进行NdeI、XhoI双酶切鉴定，NdeI单酶切和XhoI单酶切鉴定。如图2，酶切鉴定分析初步确定重组质粒pET-28a-WMN1构建成功。

2、碱性木聚糖酶在大肠杆菌中的诱导表达

将含重组质粒pET-28a-WMN1的E.coli BL21 Star(DE3)菌株涂布在含卡那霉素的平板上培养后，挑取转化子过夜摇床培养。接种1％过夜培养的菌液于50mL含kan的液体培养基中，待OD_600nm在0.6左右加入终浓度为1mM的IPTG，于常用培养条件37℃诱导培养，于1、3、6、12、24小时定时取样，并分别对样品进行超声破碎，12000rpm高速离心，发现各样品在上清液中几乎检测不到酶活，推测产物以无活性的包涵体存在。通过对其细胞破碎沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳分析(结果如图3)，发现随着诱导时间的增加，沉淀中包涵体的量也在增加，表明图3中42kDa左右条带为表达的目的蛋白条带。

鉴于在常用培养温度37℃下诱导表达培养的产物多以无活性包涵体形式存在，我们尝试在不同温度(28℃、33℃、37℃)诱导培养，定时取样并用液氮反复冻融法破碎细胞后测其酶活力。结果如图4，在37℃诱导培养时其酶活较低，但随着诱导培养温度的降低，重组酶活力逐渐升高。这可能由于低温诱导时表达速度较慢，不易形成包涵体，而高温诱导时表达速度过快,酶蛋白没有足够时间进行折叠以形成成熟的有活性的酶蛋白，易导致无活性包涵体的形成。考虑到诱导温度太低会影响到菌体的生长，因此，选择诱导温度以28℃为宜。

3、重组碱性木聚糖酶蛋白的分离纯化和酶学性质的研究

3.1、重组碱性木聚糖酶蛋白的分离纯化

在28℃下诱导表达24h后，将诱导表达的菌液收集起来，12000rpm离心20min，去上清。pH8.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体，液氮反复冻融进行细胞破碎，12000rpm离心20min，收集破碎上清液进行阴离子交换层析。将测得的酶活峰进行蛋白电泳。由图5泳道2中看出纯化的重组酶蛋白分子量大小约为42kDa，与理论值基本一致。利用分离纯化的重组酶进行后续酶学性质研究。

3.2、嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.WMN1产生的碱性木聚糖酶的分离纯化

(1)阴离子交换层析

pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡DEAE Sepharose Fast Flow柱子后，基线走平，取适量经0.45μm过滤的粗酶液上样。pH8.0的Tris-HCl缓冲液继续冲洗柱子，收集穿透峰；待基线再次走平，使用含NaCl的pH8.0的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集各个洗脱峰，并将收集到的所有峰液各自进行木聚糖酶活检测。离子交换图谱如图6。使用10kDa超滤管将检测到有酶活的峰液进行浓缩和脱盐，得到浓缩酶液。取适量浓缩酶液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，结果如图7，在泳道2能清楚地看到一条约为36kDa的条带。

(2)凝胶过滤层析

使用预装柱superdex75将进行过阴离子交换层析的浓缩酶液再次进行分离。缓冲液体系为pH8.0的Tris-HCl缓冲液，用3～5倍体积缓冲液将A280基线冲洗至稳定状态后，取适量浓缩酶液上样，再用1个体积将样品进行洗脱，并收集洗脱峰液，即纯酶液，进行酶活检测和蛋白电泳分析。凝胶过滤的蛋白电泳结果如图7的泳道3所示，可见一条明显的目的蛋白条带(分子量约为36kDa)，基本达到分离纯化的目的。之后用于酶学性质的研究。3.3、重组碱性木聚糖酶蛋白的酶学性质

(1)最适反应温度

取适量稀释的纯酶液，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下反应20min，DNS法测定其酶活力。由图8可见，重组酶的最适反应温度为50℃，与野生酶基本一致。

(2)温度的稳定性

研究温度的稳定性时，将适量稀释的纯酶液放置在不同的温度下保温1h，随后在45℃下反应20min测定其酶活力。图9可见，重组酶当温度在40℃以下时，此酶具有较好稳定性，与野生酶大致相似。

(3)最适反应pH

取适量稀释的纯酶液，分别在pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH11、pH12下反应20min，DNS法测定其酶活力，得到图10的结果。重组酶的最适反应pH为8.5，在偏酸和偏碱范围内酶活均得到了较大的提高。

(4)pH稳定性

研究pH的稳定性时，将适量稀释的纯酶液放置在不同的pH下保温1h，随后在pH9.0下反应20min测定其酶活力，结果如图11所示。由图11可见，与野生酶类似，重组酶在pH5-11范围内稳定，具有宽pH适应性，即具有既耐酸又耐碱的强抗逆特性。

(5)金属阳离子和表面活性剂对酶活力的影响

在适量纯酶液中分别加入一定体积的金属阳离子溶液，使其终浓度为10mM；加入的EDTA的浓度为0.1％；加入的SDS的浓度为0.05％和0.1％。均放置在37℃下保温30min后测定其酶活力。由图12可见，Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺对重组酶有一定的抑制作用，其他金属离子和EDTA对酶活的影响甚微。与SDS对野生酶活性有部分抑制作用不同，重组碱性木聚糖酶对SDS具有非常良好的耐受性。

(6)洗衣粉对酶活力的影响

在适量纯酶液中加入一定量的立白洗衣粉使其终浓度为0.5％、1％、1.5％、2％、5％，37℃保温30min，然后测定其酶活力。图13可见，重组酶WMN1在以上浓度中，残余酶活显著优于野生酶，显示重组酶制剂在洗涤剂等工业中的更好的应用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Bacillus sp. WMN1菌株的16S rDNA序列

<400> 1

cggcagtggc ggcgtgctat acatgcaagt cgagcggaca gaagggagct tgctcccgga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gagctaatac cggatagttc cttgaaccgc atggttcaag gatgaaagac 180

ggtttcggct gtcacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt ggggtaatgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgcgagagta actgctcgca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg 540

ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg 600

ggagggtcat tggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt 660

agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg 720

taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780

acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa 840

cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960

aggtcttgac atcctctgac aaccctagag atagggcttt cccttcgggg acagagtgac 1020

aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080

gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt tagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140

acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200

acacgtgcta caatggacag aacaaagggc tgcgagaccg caaggtttag ccaatcccat 1260

aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta 1320

gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380

cacaccacga gagtttgcaa cacccgaagt cggtgaggta acctttatgg agccagccgc 1440

cgaagtgaca gaggtg 1456

<211> 243

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN1木聚糖酶基因保守序列的核苷酸序列

<400> 2

tgggacgtcg taaacgaagc tttcgagggc gacgggactc gccgccagtc tgtcttccag 60

cgggtgcttg gtgacggata catcgaagag gctttccgtg ctgcccgtgc cgctgacccg 120

tcagctcagc tatgcattaa cgactactca acggactgga tcaacgcgaa gtccacggcc 180

atctacaact tggtgaagga cttcaaggaa cgcggtgtcc ccatgcactg tatcggcttc 240

cag 243

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN1木聚糖酶基因保守序列编码的氨基酸序列

<400> 3

Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Glu Gly Asp Gly Thr Arg Arg Gln

1 5 10 15

Ser Val Phe Gln Arg Val Leu Gly Asp Gly Tyr Ile Glu Glu Ala Phe

20 25 30

Arg Ala Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ser Ala Gln Leu Cys Ile Asn Asp

35 40 45

Tyr Ser Thr Asp Trp Ile Asn Ala Lys Ser Thr Ala Ile Tyr Asn Leu

50 55 60

Val Lys Asp Phe Lys Glu Arg Gly Val Pro Met His Cys Ile Gly Phe

65 70 75 80

Gln

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN1木聚糖酶基因保守序列上游基因的核苷酸序列

<400> 4

accaagcacc cgctggaaga cagactggcg gcgagtcccg tcgccctcga aagcttcatt 60

cacaacatcc catgctgcaa tgtcacctgc gtagcgtccg gcaacactgt tgatgtggtc 120

aaccatgacg gtccgcaatt cagctgggtc agtgattgac gccgcccact ggggaagctg 180

agagtgccac accagtgtgt ggccgtacac ctcagcgtca ttgtccttgg cgaactgaac 240

gaccgaatca gcccctgccc acgtgaactg cccacgttgt ggctgggttg catcccattt 300

catagcgttt tctgcagtga tcatggaaaa ttctcgttca acgatttgct tgtattgact 360

gtcgctgtcc gctaaatgtg gtgcataagc caccccaaag gtacggccag agcgctccgc 420

agcgtcgcgc agcggctcaa aatcatgccc aataccgggc gaagcttgtg gtgtggcatc 480

ttgcgcagcg ccgggggcgc caaaagccaa cattgcaggg gtgcacagcg ccgcagaaag 540

agctagcgcg cccgtcgcaa ggaacttctt catcacagat ttatccgttc tggcaggttg 600

tgccgttgag ggtgaaggag gtaggggatg aatgtgcccc attgtgggtc ccgttgaacc 660

cgatcgtgac gctggccccg ggggccaccg tccccattcc acgcagcatt c 711

<211> 637

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN1木聚糖酶基因保守序列下游基因的核苷酸序列

<400> 5

tgcccgtgcc gctgacccgt cagctcagct gtgcattaac gactactcaa cggactggat 60

caacgcgaag tccacggcca tctacaactt ggtgaaggac ttcaaggaac gcggtgtccc 120

catcgactgt gttggtttcc agtcgcactt aatcgttgga caggtcccaa ctaatttcca 180

acaaaacttg caacggtttg tggatctcgg ggttgatgtt cgcattaccg aactagatat 240

tcgtatggcg acaccaccaa ctgccgcgaa ccttgcaacg caggctgagg actaccgcaa 300

ggtattccag gcctgctgga acgttgatgg ctgcaccggg gtaactatat ggggcatcac 360

agatgcctac tcttggatac cgcaggtgtt cgcaggtgag ggtgctgctt tgccctggaa 420

cgatgactat tccacaaaag cggctctcac tgaacttgcg acagtgatgg gggcgcaacc 480

agcgtccaca actgacccaa cagatccgac cgatccaacc gacccaacag atccgaccga 540

tccaactgat ccaccaagcg atgcggtatg caccgttgta ccgcgggtca gcggcacggg 600

caaatcgtcg aacggcaggc gtgcaaactt ggcgtaa 637

<211> 1308

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN1木聚糖酶基因的核苷酸序列

<400> 6

atggggcaca ttcatcccct acctccttca ccctcaacgg cacaacctgc cagaacggat 60

aaatctgtga tgaagaagtt ccttgcgacg ggcgcgctag ctctttctgc ggcgctgtgc 120

acccctgcaa tgttggcttt tggcgccccc ggcgctgcgc aagatgccac accacaagct 180

tcgcccggta ttgggcatga ttttgagccg ctgcgcgacg ctgcggagcg ctctggccgt 240

acctttgggg tggcttatgc accacattta gcggacagcg acagtcaata caagcaaatc 300

gttgaacgag aattttccat gatcactgca gaaaacgcta tgaaatggga tgcaacccag 360

ccacaacgtg ggcagttcac gtgggcaggg gctgattcgg tcgttcagtt cgccaaggac 420

aatgacgctg aggtgtacgg ccacacactg gtgtggcact ctcagcttcc ccagtgggcg 480

gcgtcaatca ctgacccagc tgaattgcgg accgtcatgg ttgaccacat caacagtgtt 540

gccggacgct acgcaggtga cattgcagca tgggatgttg tgaatgaagc tttcgagggc 600

gacgggactc gccgccagtc tgtcttccag cgggtgcttg gtgacggata catcgaagag 660

gctttccgtg ctgcccgtgc cgctgacccg tcagctcagc tgtgcattaa cgactactca 720

acggactgga tcaacgcgaa gtccacggcc atctacaact tggtgaagga cttcaaggaa 780

cgcggtgtcc ccatcgactg tgttggtttc cagtcgcact taatcgttgg acaggtccca 840

actaatttcc aacaaaactt gcaacggttt gtggatctcg gggttgatgt tcgcattacc 900

gaactagata ttcgtatggc gacaccacca actgccgcga accttgcaac gcaggctgag 960

gactaccgca aggtattcca ggcctgctgg aacgttgatg gctgcaccgg ggtaactata 1020

tggggcatca cagatgccta ctcttggata ccgcaggtgt tcgcaggtga gggtgctgct 1080

ttgccctgga acgatgacta ttccacaaaa gcggctctca ctgaacttgc gacagtgatg 1140

ggggcgcaac cagcgtccac aactgaccca acagatccga ccgatccaac cgacccaaca 1200

gatccgaccg atccaactga tccaccaagc gatgcggtat gcaccgttgt accgcgggtc 1260

agcggcacgg gcaaatcgtc gaacggcagg cgtgcaaact tggcgtaa 1308

<211> 435

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN1木聚糖酶基因编码的氨基酸序列

<400> 7

Met Gly His Ile His Pro Leu Pro Pro Ser Pro Ser Thr Ala Gln Pro

1 5 10 15

Ala Arg Thr Asp Lys Ser Val Met Lys Lys Phe Leu Ala Thr Gly Ala

20 25 30

Leu Ala Leu Ser Ala Ala Leu Cys Thr Pro Ala Met Leu Ala Phe Gly

35 40 45

Ala Pro Gly Ala Ala Gln Asp Ala Thr Pro Gln Ala Ser Pro Gly Ile

50 55 60

Gly His Asp Phe Glu Pro Leu Arg Asp Ala Ala Glu Arg Ser Gly Arg

65 70 75 80

Thr Phe Gly Val Ala Tyr Ala Pro His Leu Ala Asp Ser Asp Ser Gln

85 90 95

Tyr Lys Gln Ile Val Glu Arg Glu Phe Ser Met Ile Thr Ala Glu Asn

100 105 110

Ala Met Lys Trp Asp Ala Thr Gln Pro Gln Arg Gly Gln Phe Thr Trp

115 120 125

Ala Gly Ala Asp Ser Val Val Gln Phe Ala Lys Asp Asn Asp Ala Glu

130 135 140

Val Tyr Gly His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Leu Pro Gln Trp Ala

145 150 155 160

Ala Ser Ile Thr Asp Pro Ala Glu Leu Arg Thr Val Met Val Asp His

165 170 175

Ile Asn Ser Val Ala Gly Arg Tyr Ala Gly Asp Ile Ala Ala Trp Asp

180 185 190

Val Val Asn Glu Ala Phe Glu Gly Asp Gly Thr Arg Arg Gln Ser Val

195 200 205

Phe Gln Arg Val Leu Gly Asp Gly Tyr Ile Glu Glu Ala Phe Arg Ala

210 215 220

Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ser Ala Gln Leu Cys Ile Asn Asp Tyr Ser

225 230 235 240

Thr Asp Trp Ile Asn Ala Lys Ser Thr Ala Ile Tyr Asn Leu Val Lys

245 250 255

Asp Phe Lys Glu Arg Gly Val Pro Ile Asp Cys Val Gly Phe Gln Ser

260 265 270

His Leu Ile Val Gly Gln Val Pro Thr Asn Phe Gln Gln Asn Leu Gln

275 280 285

Arg Phe Val Asp Leu Gly Val Asp Val Arg Ile Thr Glu Leu Asp Ile

290 295 300

Arg Met Ala Thr Pro Pro Thr Ala Ala Asn Leu Ala Thr Gln Ala Glu

305 310 315 320

Asp Tyr Arg Lys Val Phe Gln Ala Cys Trp Asn Val Asp Gly Cys Thr

325 330 335

Gly Val Thr Ile Trp Gly Ile Thr Asp Ala Tyr Ser Trp Ile Pro Gln

340 345 350

Val Phe Ala Gly Glu Gly Ala Ala Leu Pro Trp Asn Asp Asp Tyr Ser

355 360 365

Thr Lys Ala Ala Leu Thr Glu Leu Ala Thr Val Met Gly Ala Gln Pro

370 375 380

Ala Ser Thr Thr Asp Pro Thr Asp Pro Thr Asp Pro Thr Asp Pro Thr

385 390 395 400

Asp Pro Thr Asp Pro Thr Asp Pro Pro Ser Asp Ala Val Cys Thr Val

405 410 415

Val Pro Arg Val Ser Gly Thr Gly Lys Ser Ser Asn Gly Arg Arg Ala

420 425 430

Asn Leu Ala

435

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 上游简并引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 8

ctctggaagc cnayncmrts na 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 下游简并引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 9

gactgggayg tngtnaayga 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> USP1

<400> 10

tccagtccgt tgagtagtcg 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> USP2

<400> 11

gtcagcggca cgggcagca 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> USP3

<400> 12

accaagcacc cgctggaaga 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DSP1

<400> 13

gccagtctgt cttccagcgg gt 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DSP2

<400> 14

aggctttccg tgctgcccgt g 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DSP3

<400> 15

tgcccgtgcc gctgaccc 18

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD1

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 16

agtgnwgwan caacg 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD2

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 17

wgtgnagawn cagasa 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 18

tncsagtwtg gwstt 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD4

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 19

ctwsntactn ctntgc 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD5

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 20

tcwgncttan tangt 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD6

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 21

tgagnagwan stnaga 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD7

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 22

ngwcsagwga natgaa 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 上游引物F1

<400> 23

atggggcaca ttcatcccct 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 下游引物R1

<400> 24

ttacgccaag tttgcacgc 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 上游引物F2

<400> 25

catatggggc acattcatcc cct 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 下游引物R2

<400> 26

ctcgagttac gccaagtttg cacgc 25

Claims

1.一种碱性木聚糖酶WMN1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No：7所示。

2.编码权利要求1所述的碱性木聚糖酶WMN1的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。

4.一种含有权利要求2或3所述的基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：权利要求2或3所述的基因被插入至pET-28a(+)载体中。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：权利要求2或3所述的基因被插入至pET-28a(+)载体中的NdeI和Xho I酶切位点之间。

8.一种表达碱性木聚糖酶WMN1的菌株，其特征在于：是将权利要求2或3所述的基因的核苷酸序列构建成载体后转染至大肠杆菌E.coli BL21Star(DE3)得到。

9.根据权利要求8所述的表达碱性木聚糖酶WMN1的菌株，其特征在于：所述的载体为权利要求4～7任一项所述的表达载体。

10.权利要求1所述的碱性木聚糖酶WMN1在造纸、洗涤工业中的应用。