CN115704018A - 一种碱性木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents
一种碱性木聚糖酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及基因工程与蛋白质工程技术领域，具体涉及一种新型碱性木聚糖酶突变体。本发明以野生型木聚糖酶H1为基础，提供了包含T34C，D63F，D63Y，A102F，T177C，A186C，T189C中至少一个突变位点的突变体。所述突变体的对高温和碱性环境的耐受性得到显著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程与蛋白质工程技术领域，具体涉及一种碱性木聚糖酶突变体及其应用。
背景技术
木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素主要成分，是继纤维素之后的含量第二丰富的再生生物资源。木聚糖主链由D-木糖通过β-1,4-糖苷键连接而成，侧链上连着多种取代基，主要有O-乙酰基、4-O-甲基-D-葡糖醛酸残基、L-阿拉伯糖残基等，故木聚糖属杂合多聚分子。而且这些侧链与植物细胞细胞壁中其他几种多糖（如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等）以共价或非共价键连接故木聚糖的彻底降解需要多种酶参与。
广义的木聚糖酶指能将半纤维素木聚糖彻底降解一组酶的总称，包括多种内切酶和外切酶。通常说的木聚糖酶仅指内切-β-1,4-D-木聚糖酶（endo-β-1,4-D-xylanase）[EC3.2.1.8]，主要降解木聚糖主链骨架，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。木聚糖酶也是第一个成为工业用商品酶的半纤维素酶。自Viikari等首次发现使用木聚糖酶处理硫酸盐纸浆能增强制浆漂白度和降低在纸浆漂白等造纸过程中环境污染物的用量后，制浆造纸工业中对木聚糖酶的研究已全面展开，并取得了可喜的成果。将木聚糖酶融入到造纸生产工业中，不仅可以降低原料的黏度，分解多余的半纤维素，促进原料生成可溶性脂类成分，改善纸张性能，更重要的是可利用木聚糖酶对纸浆原料进行预处理，辅助氯气等化学漂白剂渗透到纸浆，大大减少化学漂白剂的使用，进而有效减少环境污染。
目前木聚糖酶的生产主要通过真菌、细菌等微生物获得，但由于天然木聚糖酶温度及酸碱性度耐受性差，活性差、表达水平低、生产成本高，严重限制了它的推广和应用，人工改造技术的出现使得天然木聚糖酶在保留其原有优势特性的同时向着更适合社会生产需要的方向转变，尤其是基因工程技术和蛋白质工程的快速发展成为解决这一缺陷的有效手段。
在纸浆和造纸工业中，造纸工艺多需较高的pH及高温蒸煮的方法除去原浆中的木质素，受这种严格的工艺条件限制，工业生产应用上需要具有耐高温、耐碱、催化活性高、成本低等特性的木聚糖酶。目前的木聚糖酶普遍存在活性不高、酶学性质不能满足工业生产应用的需求、发酵成本过高等问题，限制了木聚糖酶在造纸工业中的应用。大多数自然界中筛选获得的野生型木聚糖酶菌株往往产酶量、酶学性质等都达不到工业化应用的需要，故利用基因工程方法获得高活性且酶学性质优良的木聚糖酶编码基因和构建高效的表达菌株是研究的趋势。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型碱性木聚糖酶突变体。所述突变体的耐热性得到显著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明涉及一种木聚糖酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：34，63，102，177，186，189。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：T34C，D63F，D63Y，A102F，T177C，A186C，T189C。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：T34C；D63F；D63Y；A102F；T177C；A186C；T189C；
T34C/D63F；
T34C/A102F；
T34C/T177C；
T34C/A186C；
T34C/T189C；
D63F/A102F；
D63Y/A102F；
A102F/T177C；
A102F/A186C；
A102F/T189C；
T177C/A186C；
T177C/T189C；
A186C/T189C；
T34C/D63F/A102F；
T34C/D63Y/A102F；
T34C/A102F/T177C；
T34C/A102F/A186C；
T34C/A102F/T189C；
T34C/D63F/T177C；
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T34C/D63F/A102F/T177C/A186C；
T34C/D63F/A102F/T177C/T189C；
T34C/D63F/A102F/A186C/T189C；
T34C/ D63F/T177C/A186C/T189C；
T34C/D63Y/A102F/T177C/A186C；
T34C/D63Y/A102F/T177C/T189C；
T34C/D63Y/A102F/A186C/T189C；
T34C/ D63Y/T177C/A186C/T189C；
T34C/A102F/T177C/A186C/T189C；
T34C/D63F/A102F/T177C/A186C/T189C；
T34C/D63Y/A102F/T177C/A186C/T189C。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示。
本发明还涉及编码上述木聚糖酶突变体的DNA分子。
本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的木聚糖酶突变体的耐热性和耐碱性得到显著提升。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
本发明还提供了上述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。
本发明以野生型木聚糖酶H1为基础，提供了包含T34C，D63F，D63Y，A102F，T177C，A186C，T189C中至少一个突变位点的突变体。在80℃和85℃条件下处理30min后，所述突变体的酶活残留率比野生型分别提高了11.3-52.8%和18.4-74.8%；其中，突变体H1-4、H1-6、H1-9、H1-10、H1-11在80℃条件下处理30min后，酶活残留率均超过60%；突变体H1-9、H1-10、H1-11在85℃条件下处理30min后，酶活残留率均超过50%，取得了意料不到的技术效果。
在pH12.0条件下处理2h后，所述突变体的酶活残留率高达60.41-96.59%，比野生型提高了43.6-129.6%；尤其是突变体H1-3、H1-4、 H1-6、H1-7、H1-8、H1-9、H1-10、H1-11的酶活残留率分别高达90.6%、96.59%、92.33%、92.11%、93.11%，90.64%、91.16%、93.04%和91.18%，取得了意料不到的技术效果。
综上，本发明提供的木聚糖酶突变体对高温和碱性环境的耐受性得到显著提高，从而有利于木聚糖酶在造纸领域中的广泛应用。
具体实施方式
本发明公开了一种木聚糖酶突变体、其制备方法及应用、编码该木聚糖酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂：
菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418均购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
培养基配方：
大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；
酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；
酵母筛选培养基（MD培养基）：2%蛋白胨，2%琼脂糖；
BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 %生物素，1%甘油；
BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 %生物素，0.5%甲醇；
LB-AMP培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；
LB-AMP平板：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，1.5%琼脂，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；
上层培养基：0.1%MgSO4，1%KH2PO4，0.6%(NH4)2SO4，1%葡萄糖，18.3%山梨醇，0.35%琼脂糖；
下层培养基平板：2%葡萄糖，0.5%(NH4)2SO4，1.5%KH2PO4，0.06%MgSO4，0.06%CaCl2，1.5%琼脂。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 重组质粒的构建
将来源于拟青霉（Paecilomyces. sp）的木聚糖酶基因（GeneBank ACS26244. 1）根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化，并在其起始密码子ATG前增加6个碱基GAATTC（EcoRI酶切位点），在其终止密码子TAA后增加GCGGCCGC（Not I酶切位点）。优化后的核苷酸序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将该木聚糖酶命名H1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
用限制性内切酶EcoR I和Not I（Fermentas）对木聚糖酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶（Fermentas）将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进DH5α大肠杆菌（Invitrogen），用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序。
使用质粒小量制备试剂盒（Omega）从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，获得1个重组质粒，将其命名为pPIC9K-H1。
实施例2 耐高温和耐碱突变体的筛选
为了进一步提高木聚糖酶H1对高温和碱性条件的耐受性，申请人对其进行蛋白结构分析。该蛋白是GH11家族木聚糖酶，其结构为β-果冻卷的结构，蛋白质表面和蛋白质的活性中心都是暴露在外界环境中，所以认为外界环境的改变特别是高温或强的酸碱环境既可以直接影响到酶的表面结构的稳定性也可以直接影响酶的活性中心的稳定性，所以要提高酶在环境中的耐受性，就要提高蛋白整体的刚性，稳定酶的整体结构。在不破坏蛋白二级结构与活性中心的前提下，进一步对该基因进行突变。
1.1设计PCR引物H1-F1、H1-R1：
H1-F1：GGCGAATTCATGATGATTGGTATCACTTCTTTTGC（下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点）；
H1-R1：ATAGCGGCCGC TTAACCGACGTCTGCAACGGTAATTC（下划线为限制性内切酶NotI识别位点）。
以H1基因（SEQ ID NO：1）为模板，利用上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（博迈斯）进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃、220rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出三份裂解液做如下处理：第一份裂解液用pH8.0的缓冲液稀释，第二份裂解液用pH8.0的缓冲液稀释后于75℃处理30min，第三份裂解液用预热的pH10.0的0.05M硼砂-0.2M氢氧化钠的缓冲液37℃处理2h后用缓冲液稀释。取上述处理好的裂解液各30 ul，分别置于三块新的96孔板，三块96孔板都加入30 ul用相应缓冲液配置的底物，于50℃反应30 min后，DNS法测定生成的还原糖。分别计算不同突变子的酶活水平。
实验结果显示，不同的突变子在高温和碱性条件下处理后保持的活性不同。从而说明有些突变对木聚糖酶的耐温性和耐碱性没有影响，有些突变甚至使其耐受性变得更差了；另外还有些突变，虽然能提高木聚糖酶的耐温性和耐碱性，但突变后其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终，申请人筛选获得既能显著提高木聚糖酶耐温性和耐碱性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点：T34C，D63F/Y，A102F，T177C，A186C，T189C。
在上述野生型木聚糖酶H1的基础上，本发明提供了分别含T34C，D63F，D63Y，A102F，T177C，A186C，T189C单个突变位点的突变体。
本发明还提供了包含T34C，D63F/Y，A102F，T177C，A186C，T189C中至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个突变位点的木聚糖酶突变体。
其中，将含D63F单点突变的木聚糖酶突变体命名为H1-1，其氨基酸序列为SEQ IDNO：3；
含D63Y单点突变的木聚糖酶突变体命名为H1-2，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
含A102F单点突变的木聚糖酶突变体命名为H1-3，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
含T34C/T189C两点突变的木聚糖酶突变体命名为H1-4，其氨基酸序列为SEQ IDNO：6；
含T177C/A186C两点突变的木聚糖酶突变体命名为H1-5，其氨基酸序列为SEQ IDNO：7；
含D63F/A102F两点突变的木聚糖酶突变体命名为H1-6，其氨基酸序列为SEQ IDNO：8；
含D63Y/A102F两点突变的木聚糖酶突变体命名为H1-7，其氨基酸序列为SEQ IDNO：9；
含T34C/T177C/A186C/T189C四点突变的木聚糖酶突变体命名为H1-8，其氨基酸序列为SEQ ID NO：10；
含T34C/A102F/T177C/A186C/T189C五点突变的木聚糖酶突变体命名为H1-9，其氨基酸序列为SEQ ID NO：11；
含T34C/D63F/A102F/T177C/A186C/T189C六点突变的木聚糖酶突变体命名为H1-10，其氨基酸序列为SEQ ID NO：12；
含T34C/D63Y/A102F/T177C/A186C/T189C六点突变的木聚糖酶突变体命名为H1-11，其氨基酸序列为SEQ ID NO：13。
参照上述氨基酸序列，分别得到所述木聚糖酶突变体的编码核苷酸序列。
实施例3 木聚糖酶在毕赤酵母中的表达
3.1表达载体的构建
依照毕赤酵母的密码偏爱性分别对木聚糖酶H1及其突变体的基因序列进行优化，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上EcoRI和NotI两个酶切位点。
按照实施例1中所述方法，将合成的木聚糖酶H1及其突变体的基因序列分别进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经同样酶切后的pPIC-9K载体16℃过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR（反应体系：模板挑取的单克隆，rTaqDNA聚合酶 0.5ul，10×Buffer 2.0μL，dNTPs(2.5mM) 2.0μL，5’AOX引物（10mM）：0.5μL，3’AOX引物：0.5μL，ddH2O 14.5μL，反应程序：95℃预变性5min，30个循环：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，72℃ 10min）。验证阳性克隆子，经测序验证后获得了正确的重组表达质粒。
3.2毕赤酵母工程菌株的构建
3.2.1酵母感受态制备
将毕赤酵母GS115菌株进行YPD平板活化，30℃培养48 h后接种活化的GS115单克隆于6 mL YPD液体培养基中，30℃、220 rpm，培养约12 h后转接菌液于装有30mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220 rpm培养约5h，经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其OD600值在1.1–1.3范围后，4℃ 9000 rpm离心2 min分别收集4mL菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1 mL灭菌水重悬菌体，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，重复用1mL灭菌水洗一遍后，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的1mL山梨醇(1 mol/L)重悬菌体；4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的100-150μl山梨醇(1 mol/L)轻柔重悬菌体。
3.2.2转化和筛选
分别将3.1构建得到的重组表达质粒用Sac I进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株，然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板（0.5mg/mL-8mg/mL）上筛选多拷贝的转化子。
将获得的转化子分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMMY培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；9000rpm离心10min去除菌体，即得到分别含木聚糖酶H1和木聚糖酶突变体的发酵上清液。
（1）木聚糖酶酶活单位的定义
在温度为50℃、pH为8.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活性单位，以U表示。
（2）木聚糖酶酶活测定方法
吸取10.0 ml木聚糖溶液，50℃平衡20 min。
吸取10.0 ml经过适当稀释的酶液，50℃平衡5 min。
空白样品测定：吸取2.00 ml经过适当稀释的酶液（已经过50℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5ml DNS试剂，电磁振荡3 s。然后加入2.0 ml木聚糖溶液，50℃平衡30 min，沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温，加水定容至25 ml，电磁振荡3 s～5s。以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光度AB。
样品测定：吸取2.00 ml经过适当稀释的酶液（已经过50℃平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0 ml木聚糖溶液（已经过50℃平衡），电磁振荡3 s，50℃精确保温30 min。加入5.0 ml DNS试剂，电磁振荡3 s，以终止酶解反应。沸水浴加热5 min，用自来水冷却至室温，加水定容至25 ml，电磁振荡3 s。以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光度AE。
XD=
。
式中：
XD—试样稀释液中木聚糖酶的活力，U/ml；
AE—酶反应液的吸光度；
AB—酶空白样的吸光度；
K—标准曲线的斜率；
CO—标准曲线的截距；
M—木糖的摩尔质量M（C5XYN110O5）= 150.2 g/mol；
t—酶解反应时间，min；
1000—转化因子，1 mmol = 1000 μmol；
XD值应在0.04—0.10 U/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
X = XD·Df （2）
X—试样中木聚糖酶的活力，U/ml；
Df—试样的稀释倍数。
（3）测定结果
按照上述方法进行酶活检测，结果显示：上述构建得到的重组表达木聚糖酶H1及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液的酶活为320-550 U/mL。
实施例4 木聚糖酶在里氏木霉中的表达
首先依照木霉的密码子偏爱性，分别对木聚糖酶H1以及其突变体的基因序列进行优化。优化后的基因序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上KpnI和MluI两个酶切位点。
4.1表达载体的构建
将合成后的木聚糖酶基因片段与pSC1G载体分别用限制性内切酶KpnI和MluI（Fermentas）进行酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶（Fermentas）分别将上述木聚糖酶基因与pSC1G载体的酶切产物连接并转化大肠杆菌Trans5α (Transgen)，用氨苄青霉素进行选择，并对克隆进行测序(Invitrogen)验证。测序正确后，即得到含有木聚糖酶基因的重组质粒。
4.2 里氏木霉重组菌株的构建
（1）原生质体制备
取宿主菌里氏木霉（Trichoderma reesei）UE孢子悬液，接种于PDA平板上，30℃培养6 天；待其产孢丰富后，切取约1cm×1cm的菌落置于含120 mL YEG+U（0.5%酵母粉、1%葡萄糖、0.1%尿苷）的液体培养基中，30℃，220 rpm振荡培养14~16 h；
用无菌纱布过滤收集菌丝体，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20 mL10mg/mL裂解酶液（Sigma L1412）的三角瓶中，30℃，90 rpm作用1-2 h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；
将预冷的20 mL 1.2 M山梨醇（1.2 M山梨醇，50 mM Tris-Cl，50 mM CaCl2）加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入预冷的5 mL 1.2 M山梨醇溶液悬浮菌体，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入适量预冷的1.2 M山梨醇悬浮分装（200 μL/管，原生质体浓度为108个/mL）。
（2）表达载体转化
以下操作均在冰上进行，分别取10 μg上述构建的到的重组质粒加入到含有200 μL原生质体溶液的7 mL无菌离心管中，然后加入50 μL 25% PEG（25% PEG，50 mM Tris-Cl，50 mM CaCl2），轻弹管底混匀，冰上放置20 min；加入2 mL 25% PEG，混匀后室温放置5min；加入4 mL 1.2 M山梨醇，轻轻混匀后倒入熔化并保持在55℃的上层培养基中；轻轻混匀后铺在制备好的下层培养基平板上，30℃培养5~7 d至有转化子长出，将生长出的转化子挑至下层培养基平板进行复筛，菌落边缘形态较光滑的菌株为阳性转化子。
按照上述方法，申请人分别构建得到重组表达木聚糖酶H1及其突变体的里氏木霉工程菌株。
（3）发酵验证和酶活测定
将上述构建得到的里氏木霉工程菌株分别接种至PDA固体平板，在30℃恒温培养箱倒置培养6-7天，待孢子丰富后，分别取两块直径1cm的菌丝块接种于含有50mL发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH4)2SO4，0.09%MgSO4，2%KH2PO4，0.04%CaCl2，0.018%吐温-80，0.018%微量元素）的250mL三角瓶中，30℃培养48小时，然后25℃培养48小时。将发酵液离心，即得到分别含木聚糖酶H1及其突变体的发酵上清液。
按照上述方法进行酶活检测，结果显示：上述构建得到的重组表达木聚糖酶H1及其突变体的里氏木霉重组菌株发酵上清液的酶活为350-500 U/mL。
实施例5木聚糖酶酶学性质测定
1、最适作用pH
分别采用pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.1M磷酸氢二钠-0.05M柠檬酸，pH 8.0、8.5、9.0的0.2M硼酸-0.05M硼砂，pH9.5、10.0、11.0、12.0的0.05M硼砂-0.2M氢氧化钠的缓冲液将上述重组菌株发酵上清液进行稀释，木聚糖底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在50℃条件下测定其木聚糖酶酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活。
结果显示，木聚糖酶突变体的最适作用pH均为6.5，与野生型木聚糖酶H1一致。
2、最适作用温度
分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，80℃，pH8.0条件下，对上述重组菌株发酵上清液进行木聚糖酶酶活测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活。
结果显示，野生型木聚糖酶H1的最适作用温度为65℃；
木聚糖酶突变体H1-1、H1-2、H1-3和H1-5的最适温度也是65℃，但是其在70℃下的相对酶活分别高达94.9%、71.19%、81.23%、77.54%，而野生型木聚糖酶H1在70℃下的相对酶活仅为52.86%；
木聚糖酶突变体H1-4、H1-6、H1-7、H1-8的最适作用温度是70℃，其在75℃下的相对酶分别高达87.33%、62.13%、57.49%和93.43%，而野生型木聚糖酶H1在75℃下的相对酶活仅为15.37%；
木聚糖酶突变体H1-9，H1-10和H1-11的最适作用温度是75℃，其在80℃下的相对酶活分别高达76.11%，69.93%和63.87%，而野生型木聚糖酶H1在80℃下的相对酶活仅为6.98%。
综上，本发明提供的木聚糖酶突变体在高温条件下的相对酶活水平均显著高于野生型木聚糖酶，取得了意料不到的技术效果。
实施例6 木聚糖酶对高温和碱性环境的耐受性分析
1、耐碱性分析
用去离子水将上述重组菌株发酵上清液稀释至50U/ml；取1ml上清液分别加入到已预热10min的9ml相应pH（pH9.0，10.0，11.0，12.0）缓冲液中，37℃处理2h；反应结束迅速加入5ml补充液，摇匀；然后用缓冲液稀释，测定残留酶活。以未处理发酵上清液酶活为100%，计算酶活残留率。具体结果见表1。
酶活残留率（%）=处理后样品的酶活/未处理样品的酶活×100%。
表1 木聚糖酶H1及其突变体在pH9.0-12.0条件下的耐受性
从表1的结果可知，在pH9.0-11.0条件下处理2h后，野生型木聚糖酶H1及其突变体的酶活残留率普遍高于91%，几乎没有酶活损失；
在pH12.0条件下处理2h后，野生型木聚糖酶H1的酶活残留率仅为42.06%，而木聚糖酶突变体的酶活残留率高达60.41-96.59%，尤其是突变体H1-3、H1-4、 H1-6、H1-7、H1-8、H1-9、H1-10、H1-11的酶活残留率分别高达90.6%、96.59%、92.33%、92.11%、93.11%，90.64%、91.16%、93.04%和91.18%。从而说明，本发明提供的突变体对碱性环境的耐受性得到显著提高，取得了意料不到的技术效果。
2、耐热性分析
将上述重组菌株发酵上清液用0.1M磷酸氢二钠-0.05M柠檬酸稀释至200U/ml，再用预热10min的缓冲液稀释10倍，混合均匀，分别在80℃、85℃条件下处理30min，结束时取样并冷却至室温，测定稀释后的酶活，并计算残留酶活。以未处理发酵上清液的酶活计100%，计算酶活残留率。具体结果见表2。
酶活残留率（%）=处理后样品的酶活/未处理样品的酶活×100%。
表2木聚糖酶H1及其突变体的耐热性分析
从表2的结果可知，与野生型木聚糖酶H1相比，本发明提供的木聚糖酶突变体在80℃和85℃条件下处理30min后，酶活残留率分别提高了11.3-52.8%和18.4-74.8%，耐热性得到显著提高。其中，突变体H1-4、H1-6、H1-9、H1-10、H1-11在80℃条件下处理30min后，酶活残留率均超过60%；突变体H1-9、H1-10、H1-11在85℃条件下处理30min后，酶活残留率均超过50%，取得了意料不到的技术效果。
综上所述，本发明提供的木聚糖酶突变体在高温和碱性环境中的耐受性得到显著提高，从而有利于其在造纸行业中的广泛应用。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一种碱性木聚糖酶突变体及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 194
<212> PRT
<213> 拟青霉(Paecilomyces. sp)
<400> 1
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<210> 2
<211> 585
<212> DNA
<213> 拟青霉(Paecilomyces. sp)
<400> 2
caaaccactc caaactctga aggttggcat gacggttatt actactcttg gtggtctgac 60
ggtggagccc aggctacata caccaatttg gagggtggaa catacgaaat ctcttggggt 120
gacggaggaa acttggtcgg tggtaaggga tggaacccag gattgaatgc aagagccatt 180
cactttgatg gtgtctatca accaaacgga aactcttact tggcagttta cggttggaca 240
agaaacccat tggtcgagta ttacatcgtc gagaattttg gtacttatga cccttcttct 300
gatgctacag acttgggtac agtcgagtgc gatggatcta catatagatt gggaaagtct 360
accagataca acgcaccttc tatcgacgga atccaaacat tcgatcagta ttggtctgtt 420
agacaaaata agagatcctc tggaaccgtt caaacaggat gccacttcga cgcttgggcc 480
agagctggat tgaacgtcaa cggtgaccac tattatcaaa ttgttgccac tgagggttat 540
ttctcttctg gttatgccag aattaccgtt gcagacgtcg gttaa 585
<210> 3
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Cys Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Tyr Cys Arg Ile Cys Val Ala Asp
180 185 190
Val Gly
Claims (10)
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：34，63，102，177，186，189。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
4.如权利要求1-3任一所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：T34C，D63F，D63Y，A102F，T177C，A186C，T189C。
5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：T34C；D63F；D63Y；A102F；T177C；A186C；T189C；
T34C/D63F；
T34C/A102F；
T34C/T177C；
T34C/A186C；
T34C/T189C；
D63F/A102F；
D63Y/A102F；
A102F/T177C；
A102F/A186C；
A102F/T189C；
T177C/A186C；
T177C/T189C；
A186C/T189C；
T34C/D63F/A102F；
T34C/D63Y/A102F；
T34C/A102F/T177C；
T34C/A102F/A186C；
T34C/A102F/T189C；
T34C/D63F/T177C；
T34C/D63F/A186C；
T34C/D63F/T189C；
T34C/D63Y/T177C；
T34C/D63Y/A186C；
T34C/D63Y/T189C；
D63Y/T177C/A186C；
D63Y/A186C/T189C；
A102F/T177C/T189C；
A102F/A186C/T189C；
A102F/T177C/A186C；
T177C/A186C/T189C；
T34C/D63F/A102F/T177C；
T34C/D63F/A102F/T189C；
T34C/D63F/T177C/A186C；
T34C/D63F/T177C/T189C；
T34C/D63F/A186C/T189C；
T34C/D63Y/A102F/T177C；
T34C/D63Y/A102F/T189C；
T34C/D63Y/T177C/A186C；
T34C/D63Y/T177C/T189C；
T34C/D63Y/A186C/T189C；
T34C/A102F/T177C/A186C；
T34C/A102F/T177C/T189C；
T34C/A102F/A186C/T189C；
T34C/T177C/A186C/T189C；
D63Y/A102F/T177C/A186C；
D63Y/A102F/T177C/T189C；
D63Y/A102F/A186C/T189C；
A102F/T177C/A186C/T189C；
T34C/D63F/A102F/T177C/A186C；
T34C/D63F/A102F/T177C/T189C；
T34C/D63F/A102F/A186C/T189C；
T34C/ D63F/T177C/A186C/T189C；
T34C/D63Y/A102F/T177C/A186C；
T34C/D63Y/A102F/T177C/T189C；
T34C/D63Y/A102F/A186C/T189C；
T34C/ D63Y/T177C/A186C/T189C；
T34C/A102F/T177C/A186C/T189C；
T34C/D63F/A102F/T177C/A186C/T189C；
T34C/D63Y/A102F/T177C/A186C/T189C。
6.如权利要求5所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示。
7.编码权利要求6所述木聚糖酶突变体的DNA分子。
8.包含权利要求7所述DNA分子的重组表达质粒。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求8所述的重组表达质粒。
10.权利要求1-6任一所述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。
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