CN117757776A - 一种碱性木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents
一种碱性木聚糖酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程和蛋白质工程改造技术领域，具体涉及一种碱性木聚糖酶突变体及其在造纸中的应用。所述突变体是以野生型木聚糖酶Xyn为基础提供的包含G25A、G34A、S38H/T、Q40T、T44V/S、V91I、T100S、L173I单点突变的突变体，其比活力普遍提高了13.2%‑36.0%；其中，含T44S单点突变的木聚糖酶突变体的比活力最高，达329 U/mg，有利于降低该酶的生产成本，促进其在造纸等工业领域的广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程改造技术领域，具体涉及一种碱性木聚糖酶突变体及其应用。
背景技术
木聚糖是半纤维素的主要成分且分布广泛，其主链主要由木糖聚合而成、侧链含有多种取代基且结构复杂的异质多糖。降解木聚糖的水解酶主要包括作用主链的β-1，4-内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-木糖苷酶以及水解侧链基团的阿拉伯糖苷酶、葡萄糖醛酸苷酶、半乳糖苷酶等，从而提高木聚糖水解效率，其中最为重要的糖苷水解酶是β-1，4-内切木聚糖酶。它是一种O-糖苷水解酶，能够将木聚糖主链上的β-1，4糖苷键进行随机切割生成低聚木糖、阿拉伯木聚糖及木糖。
木聚糖酶(Xylanase,EC 3.2.1.8)以内切方式作用于木聚糖的主链，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。根据木聚糖酶对酸碱环境的耐受度，可以将其分为碱性、中性和酸性。目前研究表明除了动物和植物许多细菌和真菌都可以产生木聚糖酶。但是不同微生物生产的木聚糖酶性质有所差别。细菌生产的主要是酸性木聚糖酶，真菌生产的大都是碱性木聚糖酶，木聚糖酶在纸浆造纸、食品加工及能源开发等行业应用广泛，是现阶段生物研究的热点领域之一。酸性木聚糖酶的最适pH值低、酸稳定性好，是一种特殊的木聚糖酶。其在一些酸性环境下应用的行业，如酿酒、饲料、果汁加工等，具有突出的应用价值。
碱性木聚糖酶在造纸行业中的应用主要包括制浆、协助漂白、改纤维性质、废纸脱墨等方面。在工业生产中，制浆过程是在碱性的条件下，用高温蒸煮的方法除去木质素。为使溶解纸浆纤维素纯度达到98％，这就需要大量的氢氧化钠处理纸浆，造成了严重的环境污染，为此许多学者转而尝试生物法处理纸浆，而用于纸浆漂白的木聚糖酶应是耐热和耐碱的。冯建良等用木聚糖酶预处理麦草与常规化学法制浆进行了比较实验，木聚糖酶预处理提高了原料的脱木素程度，还可以降低了纸浆卡伯值。Khasin等得到了一个来源于碱性菌株Bacillus stearothermophilus T26的木聚糖酶，该木聚糖酶在pH 9.0及65℃时对纸浆有最好的漂白效果。
目前碱性木聚糖酶的活性和产量是其工业应用的制约因素。基因工程的方法被应用到菌种改良及木聚糖酶的改造中，以研制出符合不同应用领域要求的木聚糖酶产品。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种碱性木聚糖酶突变体及其应用。所述突变体的比活力比野生型得到显著提高，有利于其在造纸等工业领域中的广泛应用。
本发明一方面涉及一种木聚糖酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：25，34，38，40，44，91，100，173。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或至少99％的同一性。
在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，或至少99.9％的同一性。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：G25A，G34A，S38H/T，Q40T，T44V/S，V91I，T100S，L173I。
本发明还涉及编码上述木聚糖酶突变体的DNA分子。
本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的木聚糖酶突变体的比活力得到显著提升。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
本发明还提供了上述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。
本发明以野生型木聚糖酶Xyn11为基础，提供了包含G25A，G34A，S38H/T，Q40T，T44V/S，V91I，T100S，L173I中至少一个突变位点的突变体。与野生型木聚糖酶Xyn11相比，所述碱性木聚糖酶单点突变体的比活力普遍提高了13.2％-36.0％；其中，含T44S单点突变的碱性木聚糖酶突变体的比活力最高，达329U/mg，取得了意料不到的技术效果。
综上，本发明提供的木聚糖酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低木聚糖酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECΜLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS INMOLECΜLAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂：
菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
培养基配方：
大肠杆菌培养基(LB培养基)：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH7.0；
酵母培养基(YPD培养基)：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；
酵母筛选培养基(MD培养基)：2％蛋白胨，2％琼脂糖；
BMGY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油；
BMMY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇；
LB-AMP培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；
LB-AMP平板：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，1.5％琼脂，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；
上层培养基：0.1％MgSO4，1％KH2PO4，0.6％(NH4)2SO4，1％葡萄糖，18.3％山梨醇，0.35％琼脂糖；
下层培养基平板：2％葡萄糖，0.5％(NH4)2SO4，1.5％KH2PO4，0.06％MgSO4，0.06％CaCl2，1.5％琼脂。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1重组质粒的构建
将来源于放线杆菌(Actinobacteria bacterium)的木聚糖酶基因(GenBankPZN45477.1)根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，并在其起始密码子ATG前增加6个碱基GAATTC(EcoR I酶切位点)，在其终止密码子TAA后增加GCGGCCGC(Not I酶切位点)。优化后的核苷酸序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将该木聚糖酶命名Xyn11，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
用限制性内切酶EcoR I和Not I(Fermentas)对木聚糖酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进DH5α大肠杆菌(Invitrogen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。
使用质粒小量制备试剂盒(Omega)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，获得1个重组质粒，将其命名为pPIC9K-Xyn11。
实施例2高比活木聚糖酶突变体的筛选
为了进一步提高木聚糖酶Xyn11的酶活性，申请人对其进行蛋白结构分析。该蛋白是G11家族木聚糖酶，其结构为β-果冻卷的结构。申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
1.1设计PCR引物Xyn11-F1、Xyn11-R1：
Xyn11-F1：GGCGAATTCGATACTTGTATCACTCAAAACCAAAC(下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点)；
Xyn11-R1：ATAGCGGCCGCTTATCCAATGGTAACAGTTGATGATCC(下划线为限制性内切酶NotI识别位点)。
以Xyn11基因(SEQ ID NO：2)为模板，利用上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150μL含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出30μL裂解液至两块新的96孔板；将其中一块96孔板加入30μL底物，于37℃反应30min后，DNS法测定生成的还原糖，另一块板加入150μL考马斯亮蓝溶液，静置10min，考马斯亮蓝(Bradford)结合法测定蛋白质含量，分别计算不同突变子酶活水平及蛋白含量。最终，申请人从两万多个转化子中筛选出显著提高木聚糖酶比活力的单点突变位点：G25A，G34A，S38H，S38H T，Q40T，T44V，T44V S，V91I，T100S，L173I。
在上述野生型木聚糖酶Xyn11的基础上，本发明提供了分别含G25A，G34A，S38H，S38T，Q40T，T44V，T44S，V91I，T100S，L173I单个突变位点的突变体。
实施例3木聚糖酶在毕赤酵母中的表达
3.1表达载体的构建
依照毕赤酵母的密码偏爱性分别对木聚糖酶Xyn11及其突变体的基因序列进行优化，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上EcoRI和NotI两个酶切位点。
按照实施例1中所述方法，将合成的木聚糖酶Xyn11及其突变体的基因序列分别进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经同样酶切后的pPIC-9K载体16℃过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR(反应体系：模板挑取的单克隆，rTaqDNA聚合酶0.5μL，10×Buffer 2.0μL，dNTPs(2.5mM)2.0μL，5’AOX引物(10mM)：0.5μL，3’AOX引物：0.5μL，ddH2O 14.5μL，反应程序：95℃预变性5min，30个循环：94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，72℃10min)。验证阳性克隆子，经测序验证后获得了正确的重组表达质粒。
3.2毕赤酵母工程菌株的构建
3.2.1酵母感受态制备
将毕赤酵母GS115菌株进行YPD平板活化，30℃培养48h后接种活化的GS115单克隆于6mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm，培养约12h后转接菌液于装有30mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220rpm培养约5h，经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其OD600值在1.1-1.3范围后，4℃9000rpm离心2min分别收集4mL菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1mL灭菌水重悬菌体，4℃、9000rpm离心2min，轻轻弃上清，重复用1mL灭菌水洗一遍后，4℃、9000rpm离心2min，轻轻弃上清，预冷的1mL山梨醇(1mol/L)重悬菌体；4℃、9000rpm离心2min，轻轻弃上清，预冷的100-150μL山梨醇(1mol/L)轻柔重悬菌体。
3.2.2转化和筛选
分别将3.1构建得到的重组表达质粒用Sac I进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株，然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板(0.5mg/mL-8mg/mL)上筛选多拷贝的转化子。
将获得的转化子分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMMY培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；9000rpm离心10min去除菌体，即得到分别含木聚糖酶Xyn11和木聚糖酶突变体的发酵上清液。
1、木聚糖酶酶活测定方法
(1)木聚糖酶酶活单位的定义
在温度为50℃、pH为8.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活性单位，以U表示。
(2)木聚糖酶酶活测定方法
吸取10.0mL木聚糖溶液，50℃平衡20min。
吸取10.0mL经过适当稀释的酶液，50℃平衡5min。
空白样品测定：吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过50℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试剂，电磁振荡3s。然后加入2.0mL木聚糖溶液，50℃平衡30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s～5s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。
样品测定：吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过50℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入2.0mL木聚糖溶液(已经过50℃平衡)，电磁振荡3s，50℃精确保温30min。加入5.0mL DNS试剂，电磁振荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。
式中：
XD—试样稀释液中木聚糖酶的活力，U/mL；
AE—酶反应液的吸光度；
AB—酶空白样的吸光度；
K—标准曲线的斜率；
C0—标准曲线的截距；
M—木糖的摩尔质量M(C5H10O5)＝150.2g/mol；
t—酶解反应时间，单位为分钟(min)；
N—酶液稀释倍数；
1000—转化因子，1mmol＝1000μmol。
(3)测定结果
按照上述方法进行酶活检测，结果显示：上述构建得到的重组表达木聚糖酶Xyn11及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液的酶活为274-329U/mL。
2、蛋白含量测定方法
考马斯亮蓝(Bradford)结合法测定蛋白质含量是比色法与色素法结合的复合方法。考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈棕红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。在3～5分钟即成大量吸收，至少稳定1小时。在10～1000μg/mL范围内，吸光值与蛋白质浓度成正比。
按照酶液和考马斯亮蓝溶液体积比1：5的比例进行混合，静置10mim，考马斯亮蓝(Bradford)结合法测定蛋白质含量。
按照上述方法进行蛋白含量的检测。结果显示：上述构建得到的重组表达木聚糖酶Xyn11及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液的蛋白含量为0.29-0.34mg/mL。
3、比活力计算
“比活力(Specific Activity)”是指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。
比活力计算公式：比活力(U/mg)＝酶活(U/mL)/蛋白含量(mg/mL)。
具体结果见表1。
表1碱性木聚糖酶突变体比活力比较
从表1的结果可以看出，与野生型木聚糖酶Xyn11相比，本发明提供的碱性木聚糖酶突变体的比活力普遍提高了13.2％-36.0％；其中，含T44S单点突变的碱性木聚糖酶突变体的比活力最高，达329U/mg，取得了意料不到的技术效果。
综上，本发明提供的碱性木聚糖酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域，尤其是造纸领域中的广泛应用。
Claims (9)
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：25，34，38，40，44，91，100，173。
2.如权利要求1所述的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
3.如权利要求2所述的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
4.如权利要求1所述的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：G25A，G34A，S38H/T，Q40T，T44V/S，V91I，T100S，L173I。
5.编码权利要求1-4任一所述木聚糖酶突变体的DNA分子。
6.包含权利要求5所述DNA分子的重组表达质粒。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求6所述的重组表达质粒；所述的宿主细胞为非植物细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）或毕赤酵母（Pichia pastoris）。
9.权利要求1-4任一所述木聚糖酶突变体在造纸中的应用。
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