SK118594A3 - Delignifying preparation exhibiting alpha-l-arabinofuranosidase activity production and application thereof - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález se týka prípravku prejavujúceho se enzymatickou aktivitou obsahujúci ako hlavnú súčasť α-L-arabinofuranozidázovú aktivitu so schopnosťou delignifikácie drevnej buničiny pri pH 8-9 a teplote 65 θθ. Ďalej se týka spôsobu výroby tohto prípravku aeróbnou fermentáciou vybraného kmeňa Bacillus stearothermophi1us. Vynález sa tiež týka tohto vybraného kmeňa. Okrem toho sa týka spôsobu, zameraného na spracovanie drevnej buničiny prípravkom podľa vynálezu a taktiež buničiny spracovanej uvedeným prípravkom ako takej. Naviac sa týka použitia enzýmu produkovaného uloženým kmeňom Bacil lus stearothermophi1us NCIMB 40494 pri spracovaní buničiny. Rovnako sa týka α-L-arabínofuranozidázy so sekvenciou aminokyselín, ktorá obsahuje jednu alebo dve špecifické dielčie sekvencie aminokyselín alebo ich homológov.

Doterajší stav techniky

Vzhľadom na vplyv na životné prostredie sú predmetom záujmu priemyslu na spracovanie buničiny a papierenského priemyslu bieliace postupy vedúce k delignifikácii a bieleniu buničiny bez použitia zlúčenín obsahujúcich chlór.

S týmto účelom bol nedávno podaný celý rad patentových prihlášok opisujúcich enzýmy na deligni fikáciu drevnej buničiny. Jedna z týchto prihlášok je naša WO 91/10724 (švédska prioritná prihláška, na ktorú bol vydaný patent 19.decembra 1991), ktorá okrem iného nárokuje prípravok prejavujúci enzymatickú aktivitu so schopnosťou delignifikácie buničiny pri teplote najmenej 65 θθ a minimálnom pH 9. Tento prípravok možno získať aeróbnou fermentáciou kmeňa Baci11us stearothermophi1us so schopnosťou produkovať tento prípravok ako jeden z dvoch kmeňov uložených v zbierke mikroorganizmov pod číslami NCIMB 40221 alebo NCIMB 40222. Čistením enzymatickej aktivity sa získala xylanáza s MW /molekulovou hmotnosťou/ 41 000 - 42 000 Da.

Doteraz sa vynakladala snaha za účelom izolácie iného kmeňa Bacillus stearothermophi1us, ktorý by sa mohol použiť na čistenie iných delignifikačných aktivít, ako je aktivita xylanázy. Cieľom bolo, aby napríklad α-L-arabinofuranozidáza, ktorá má schopnosť del ignifi kovať drevnú buničinu pri vysokej teplote a pH bola zároveň užitočným nástrojom pri rozvinutí bieliacej operácie bez akýchkoľvek bieliacich chemikálii obsahujúcich chlór.

Nedávno bola publikovaná prihláška W0 91/18976 (podaná prihlasovateľom Novo Nordisk A/S). Jej nárok č.14 je zameraný na enzým arabinofuranozidázu produkovanú Baci 11 us stearothermophi 1 us. Na strane 9, riadok 11 a 12 se uvádza, že v literatúre nie je obsiahnutý žiadny odkaz na arabinofuranozidázu získanú z termofilného /teplomilného/ Baci11us. I keď W0 91/18976 nárokuje enzým arabinofuranozidázu produkovanú Bacillus stearothermophi1us, neopisuje spôsob jej z i s kani a.

Do zbierky mikroorganizmov sa uložili tri kmene, dva izolované a jeden mutant. Avšak žiaden z nich nebol v uvedenej prihláške opísaný ako kmeň produkujúci arabinofuranozidázu. .

Jediný kmeň opísaný ako kmeň produkujúci arabinofuranozidázu je neuložený mutantný kmeň označený ako BPS-3-H-17-4. Ďalej je treba uviesť, že pokusy s prípravkami opísané v prihláške (stred hore na str.17) boli uskutočňované s produktami fermentácie získanými z tohto neuloženého kmeňa. Na str.8 r.12-16 sa uvádza, že tento kmeň je odvodený od jedného z deponovaných kmeňov po uskutočnenej mutagenéze pomocou ety1metánsulfonátu. Tento mutagén je veľmi nešpecifický a nie sú opísané žiadne podmienky na získanie kmeňa produkujúceho arabinofuranozidázu. Takže v stave techniky nebol doteraz opísaný spôsob, ako získať arabinofuranozidázu z termofilného - teplomilného - kmeňa Baci11us.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týka prípravku prejavujúceho sa enzymatickou aktivitou, v ktorej zaberá podstatnú časť aktivita α-L-arabinofuranozidázy so schopnosťou delignifikácie drevnej buničiny pri pH 8-9 a teplote 60 θθ.

V tomto opise a pripojených nárokoch je treba vykladať výraz drevná buničina v širšom zmysle a to tak, že obsahuje všetky typy 1 ignocelulózových materiálov.

Jeden predmet vynálezu je zameraný na prípravok prejavujúci sa enzymatickou aktivitou, ktorý možno získať aeróbnou fermentáciou vo vhodnom prostredí kmeňa Baci11us stearotermophi1us vybraného z kmeňa NCIMB 40494 a jeho mutantov a variantov, ktoré majú v podstate tú istú schopnosť produkovať uvedený prípravok, ako kmeň NCIMB 40494, pričom v enzymatickej aktivite uvedeného prípravku zaberá podstatnú časť aktivita α-L-arabinofuranozidázy so schopnosťou del ignifikácie drevnej buničiny pri pH 8-9 a teplote 65 °C.

V jednom uskutočnení tohto predmetu vynálezu je prípravkom vyčistená kultúra živnej pôdy. V d'alšom uskutočnení tejto časti vynálezu je prípravkom koncentrovaná frakcia spomenutej vyčistenej kultúry živnej pôdy vykazujúca aktivitu α-L-arabinofuranozidázy v prostredí drevnej buničiny. V ešte ďalšom uskutočnení tohto predmetu vynálezu je aktivita α-L-arabinofuranozidázy odvodená z α-L-arabinofuranozidázy, ktorá je zložená z dvoch podjednotiek s približnou molekulárnou hmotnosťou 52 500 Da respektíve 57 500 Da.

V ďalšom predmete vynálezu tvorí prípravok podľa už vyššie uvedeného predmetu vynálezu spojenie s prípravkom prejavujúcim enzymatickú aktivitu produkovanú iným mikrobiálnym kmeňom a so schopnosťou delignifikácie drevnej buničiny pri teplote najmenej 65 a hodnote pH najmenej 9. Pri špecifickom uskutočnení tohto predmetu vynálezu obsahuje prípravok α-L-arabinofuranozidázu produkovanú kmeňom NCIMB 40494 Bacillus stearothermophi1us a xylanázu produkovanú kmeňom NCIMB 40222 Bacillus stearothermophi1us .

Ďalší predmet	vynálezu je	zameraný	na
α-L-arabi nofuranozi dázu	so	sekvenci ou	amí nokyselí n,	ktorá
obsahuje N-koncovú dielči	u sekvenciu	arní nokysel i n	SEQ
Ident.č.1:
Met? Gin Pro Tyr Arg Pro?	Glu	Glu Leu
alebo jej homológ.
Ďalši predmet	vynálezu je	zameraný	na

α-L-arabinofuranozidázu so sekvenciou aminokyselín obsahujúci N-koncovú dielčiu sekvenciu aminokyselín SEQ Ident.č.2:

Ser Met Lys Lys Ala Thr Met íle íle Glu Lys Asp Phe Lys íle A1 a Glu íle Asp Lys Arg íle Tyr alebo jej homológ.

V súvislostí s α-L-arabinofuranozidázou so sekvenciou aminokyselín, ktorá obsahuje N-koncovú dielčiu sekvenciu aminokyselín SEQ Ident.č. 1:

Met? Gin Pro Tyr Arg Pro? Glu Glu Leu alebo jej homológom a/alebo s α-L-arabinofuranozidázou so sekvenciou aminokyselín obsahujúcou N-koncovú dielčiu sekvenciu aminokyselín SEQ Ident.č.: 2

Ser Met Lys Lys Ala Thr Met íle íle Glu Lys Asp Phe Lys íle Ala Glu íle Asp Lys Arg íle Tyr alebo jej homológom, takým homológom je zamýšľaný homológ so sekvenciou aminokyselín, ktorá vo vzťahu k sekvencii SEQ Ident.č.1 a/alebo SEQ Ident.č.2 má niektoré substituenty, rozšírené alebo odstránené časti aminokyselín, ktoré nespôsobujú elimináciu α-L-arabinofuranozidázovej aktivity celého enzýmu napríklad v prostredí drevnej buničiny a výhodne pri teplote 65 °C a pH 8-9. Ďalej môže mať takýto homológ napríklad sekvenciu, ktorá má 80 % alebo viac spoločných aminokyselín so sekvenciou SEQ Ident.č. 1 a/alebo SEQ Ident.č.2.

Príkladom homológu so sekvenciou SEQ Ident.č.2 je sekvencia SEQ Ident.č. 3:

Al a	Thr	Lys	Lys	Al a	Thr	Met	íle	íle	Glu	Lys	Asp
Phe	Lys	íle	Al a	Glu	íle	Asp	Lys	Arg	íle	Tyr	Gly
Ser	Phe	íle	Glu	Hi s	Leu	Gly	Arg	Al a	Val	Tyr	Gly
Gly	íle	Tyr	Glu	Pro	Gly	Hi s	Pro	Gin	Al a	Asp	Glu

Asn Gly čo je M-koncová sekvencia α-L-arabinofuranozidázy produkovanej kmeňom Bacil lus stearothermophi1us NCIMB 40222. Uvedená α-L-arabinofuranozidáza je zložená z dvoch identických podjednotiek, každá s približnou molekulovou hmotnosťou 64 000 Da (prírodný enzým, 128 000 Da, hodnotené podľa SDS gélu).

Takže, homológ sekvencie SEQ Ident.č.1 a/alebo sekvencie SEQ Ident.č.2 je akákoľvek sekvencia aminokyselín, ktorá je dostatočne homologická na úrovni nukleotidov, aby sa rozpoznala ktoroukoľvek sondou DNA alebo RNA odvodenou od uvedenej/ých sekvencie/i.

Iný predmet vynálezu prípravku, ktorý prejavuje Bacillus stearothermophi1us mutantov a variantov, v produkovať prípravok ako aeróbnej fermentáci i vo aktivita tohto prípra a-L-arabi nofuranozi dázovej delignifikácie drevnej buni je zameraný na spôsob výroby enzymatickú aktivitu, pričom kmeň vybraný z kmeňa NCIMB 40494 a jeho podstate s rovnakou schopnosťou kmeň NCIMB 40494, je podrobený vhodnom prostredí a enzymatická ku obsahuje podstatnú časť aktivity, so schopnosťou iny pri pH 8-9 a teplote 65 °C.

Ešte ďalší predmet vynálezu je zameraný na izolovaný kmeň NCIMB 44 Bacillus stearothermophi 1 us a jeho mutanty a varianty, kde tieto mutanty a varianty majú v podstate tú istú schopnosť produkovať prípravok prejavujúci enzymatickú aktivitu uvedeného kmeňa NCIMB 44, pričom v tejto enzymatickej aktivite zaberá podstatnú časť aktivita α-L-arabinofuranozidázy so schopnosťou delignifikácie drevnej buničiny pri pH 8-9 a teplote 65 ®C.

Ďalši predmet vynálezu je zameraný na použitie enzýmu produkovaného kmeňom Bacillus stearothermophi 1 us NCIMB 40494 na spracovanie drevnej buničiny. Ako je zrejmé z Tab.8 opisu prihlášky produkuje tento kmeň niekoľko typov enzimatických aktivít degradujúcich extra-celulárne uhlohydráty, ktoré sú odvodené od produkcie rôznych génov obsiahnutých v genóme tejto baktérie.

I keď tieto rôzne aktivity neboli ešte jednotlivo preskúmané, dá sa veriť, že rôzne aktivity, oddelene alebo v rôznych kombináciách, budú užitočné na spracovanie drevnej buni či ny.

Ďalši predmet vynálezu je zameraný na spôsob obsahujúci spracovanie drevnej buničiny, kde drevná buničina je spracovaná v najmenej jednej operácii prípravkom podľa vynálezu. V jednom uskutočnení tohto predmetu vynálezu spracovávaná drevná buničina je sulfátová buničina. V inom uskutočnení spracovávaná sulfátová buničina je čiastočne delignifi kovaná sulfátová buničina. Ešte v ďalšom uskutočnení tohto predmetu vynálezu je spracovávanou čiastočne deligni fi kovanou sulfátovou buničinou sulfátová buničina delignifi kovaná kyslíkom.

Ďalši predmet vynálezu je zameraný na drevnú buničinu, ktorá bola spracovaná aspoň v jednej operácii prípravkom podľa vynálezu.

Ešte ďalší predmet vynálezu je zameraný na sondu DNA alebo RNA, ktorá rozoznáva nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje sekvenciu aminokyselín SEQ Ident.č.l:

Met? Gin Pro Tyr Arg Pro? Glu G1u Leu a/alebo sekvenciu aminokyselín SEQ Ident.č.2:

Ser Met Lys Lys Ala Thr Met íle íle Glu Lys Asp Phe Lys íle Ala Glu íle Asp Lys Arg íle Tyr.

Posledný menovaný predmet vynálezu je užitočný na zistenie α-L-arabinofuranozidázy so schopnosťou delignifikácie drevnej buničiny pri teplote najmenej 65 ®C a pH najmenej 8-9.

Uloženie mikroorganizmov:

Kmeň Baci11us stearothermophi1us L1 bol uložený podľa Budapeštianskej zmluvy v National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd (NCIMB) /Národných zbierkach priemyslových a morských baktérií spol. s ručenim obmedzeným/ - (NCIMB) v Aberdeenu, dňa 24.marca 1992 a dostal evidenčné číslo NCIMB 40494.

Kmeň Bacillus stearothermophi1us T-6 dostal evidenčné číslo NCIMB 40222 v rovnakej zbierke mikroorganizmov a bol uložený skôr v súvislosti s podaním prioritnej prihlášky W0 91/10724.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Izolácia termostabi1 nej α-L-arabinofuranozidázy produkujúcej kmeň Bacillus stearothermophi1us Ll.

A. Príprava alkalický extrahovanej buničiny (AKP)

Suspenzia K15, kyslíkom čiastočne bielenej jemnej drevnej sulfátovej buničiny (6-10 % hmotnostných vlákien v sušine) v 0,02 N NaOH (pH 11,7) sa inkubovala pri 60-62 θθ počas 18-20 hod. Ešte v horúcom stave sa tekutina oddelila od vlákien odsatím pri

Výsledný roztok bol použití lievika zo sintrovaného skla.

neutrál izovaný na pH 7 a zahustený ultrafi 1tráci ou (odstránenie 10,000 jedn. molekulovej hmotnosti).

Zadržané množstvo (AKP-1) obsahovalo 5,2 mg/ml lignínu,

1,85 mg/ml uhlohydrátov (fenol sirovou kyselinou) a 0,83 mg/ml pentózy (orcinolom = 5-metyl-1.3-benzéndiol).

B. Obohatenie kultúry

K AKP-1 sa pridali soli (0,1 MgS04.7H20, 10 mM K2HPO4 0,1% močoviny a stopové prvky) a inokulovali sa vzorky kalu a vody odobranej z čistiarenských nádrží v Korsnäs. Banky sa inkubovali trepaním pri 65 θθ a pH 9,0 počas 48 hod. Zlomok kalnej kultúry sa potom inokuloval do skúmavky obsahujúcej ako médium 15 ml 0,2 % gal aktomanánu (živica z agátových zŕn. Sigma). Po inkubácii počas 24 hod. pri 65 °C a pH 9,0 sa kultúra naočkovala do LB agaru. Po inkubácii sa izolovalo a získalo v čistej kultúre približne 20 rôznych typov kolónií. Po predbežnom testovaní bol jeden z kmeňov podrobne preštudovaný: kmeň Ll, ktorý obsahoval termofilnú a-L-arabinofuranozidázu.

Kmeň Ll bola grampozit ívna, termofilná baktéria; rástla dobre pri 60-65 θθ, avšak nerástla pri teplote pod 40 θθ. Bola tyčkovitého tvaru s koncovými spórami, aeróbna a oxydázovo pozitívna. Kmeň Ll rástol na nasledujúcich uhlíkových zdrojoch: D-glukóza, D-xylóza, L-arabinóza, D-manóza a xylán. Nerástol na zdrojoch uhlíka ako je melobióza, a galaktóza. Na základe týchto vlastností bol kmeň Ll klasifikovaný ako kmeň heterogénnej skupiny, Bacillus stearothermophi 1 us .

Počiatočné pokusy (s buničinou K15)

C. Termofilná α-L-arabinofuranozidáza z kmeňa Ll vybraný pre tekutí na médiu bola ďalšie štúdium, pretože surová kultúry vypestovanej aktívna pri ďaleko sa dal na bol použitý absorbancie pri deli gni fi káci i i g n í n citlivý

350 nm ohodnotenie, ako enzymatickým prípravkom test. Hodnoty merané na supernatante (kvapalina nad usadeninou) percentá kmeňa Ll

Kmeň L1 bol extracelulárna galaktomanánovom buničiny KÍ5. Na extrahovať spektrofotometri cký (^Α35θ) ^bo1i vzoriek a uvoľneného pestovaného

Kmeň rástol a kasami nových a výťažkom pozorovaný galaktózy, akti vi ty.

namerané hodnoty sú prezentované ako lignínu. Rast a delignifikačná aktivita na rôznych zdrojoch uhlíka sú zhrnuté do určitej kyseli nách či stá 5,1% pri dani takti ež deli gni fi kačné kultúrach pestovaných na xylóze 7,6 %.

bol a extrakte pri ktorá

Naj 1 epši e miery na kvasnicovom bez prídavku iného zdroja uhlíka delignifikácia. Dodatočný rast bol všetkých možných cukrov s výnimkou brzďila tvorbu del i gni f i kačnej aktivity sa získali na a arabinóze, 7,1 % respektíve

Extracelulárne enzymatické aktivity kmeňa Ll pestovaného v prostredí xylózy a arabínózy sú zhrnuté v Tab.2. Aktivita xylanázy sa stanovila inkubáciou čerstvého roztoku xylánu s extracelulárnou supernatantnou tekutinou a testom na zvýšenie redukcie cukrov ferrikyanidovou metódou (Spiro, R.G. 1966 Methods of Enzymology 8: 7-9). Skúšobným tlmivým roztokom bolo 50 mM Tris.CL, pH 7.0 a 0,5% xylánu (nekultivovaný ovos. Sigma). Jednotky aktivity pre xylanázu sú umol redukovaného cukru vytvoreného pri 65 θθ.

Arabinofuranozidázový test je modifikáciou štandardného testu pre β-galaktozidázu (G.Tabold and Syguson, Appl.S Enviro. Microbiol. vol. 56 č. 11, 1960). Skúšobná rúrka obsahuje 40 mM Tris-tlmivého roztoku, pri pH 7,0. Množstvo 0,4 ml vzorky enzýmu a 0,1 ml 10 mM p-ni trofenyľa-L-arabi nofuranozi du (Sigma chemicals) sa inkubovalo pri 65°C počas 15 min. Reakcia bola ukončená vložením skúšobnej rúrky do ľadového vodného kúpeľa.

Uvoľnenie p-nitrofenolu sa určuje spektrofotometricky pri 401 nm. Množstvo 10 mikromolov p-nitrofenolu na ml má absorbanciu 18,4. Jednotka aktívneho enzýmu je definovaná ako množstvo mikromolov p-nitrofenylu uvoľnených za min.

V prostredí xylózy sa sledovali len dve aktivity.: 1,3 jednotiek na ml xylanázy a 0,004 jednotiek na ml α-L-arabinofuranozidázy. Nezistili sa aktivity α-L-arabinofuranozidázy, mananázy, α-D-galaktozidázy alebo α-L-manozidázy. Ukázalo se teda, že delignifikačná aktivita kmeňa L1 vznikla v dôsledku aktivity xylanázy počas rastu buniek v prostredí xylózy. Predsa len, akonáhle sa bunky pestovali v prostredí arabinózy, hlavnú aktivitu vykazovala α-L-arabinofuranozidáza (0,5 jednotiek na ml). Takže sa ukázalo, že α-L-arabinofuranozidáza je zodpovedná za delignifikáciu v A-prostredí.

Aktivita α-L-arabinofuranozidázy (AF) sa získala zahustením desať litrovej kultúry kmeňa L1 pestovanej v A-prostredí (Tab.3). Aktivita sa zrazila 80% síranom amónnym a výťažkom bol surový enzymatický prípravok s 11 jednotkami na ml AF a 0,96 jednotkami na ml xylanázy. Aktivita AF sa neviazala na karboxymetyl celulózu (CMC) avšak adsorbovala sa kompletne na DEAE celulózu alebo v DEAE-Sephacel .

Koncentrovaná AF preukázala významnú delignifikačnú aktivitu (Tab.4). Je treba zdôrazniť, že sa neskúmali optimálne podmienky pri použití AF na delignifikáciu buničiny. Potenciálne užitočná vlastnosť AF je tá, že by mala rozložiť väzbu blizku lignínu, čim by sa väčšina hemicelulózy ponechala pri vláknach celulózy. Tento krok by mal poskytnúť vyšší výťažok delignifi kovanej buničiny. Okrem toho je zrejmé, že delignifikačná aktivita AF spolu s aktivitou xylanázy T-6 je viac než len prídavná.

Tabuľky 5-7 ukazujú niektoré enzymatické vlastnosti vyčistenej AF pri použití ΡΝΡ-α-L-Ara ako substrátu. Enzým je najaktívnejší medzi pH 6,5 - 8,0, optimálne pri pH 7,0. Enzým má nízku aktivitu pri pH 9,0 a 70 θθ. Optimálna teplota bola 70 θθ ako pri pH 7,0 tak pri pH 8,0. Enzým bol najviac aktívny pri 20 mM Na2SO₄, v 10 mM vo fosfátovom tlmivom roztoku, pH

7,5 a teplote 70 θθ, avšak stratil asi 50% svojej aktivity pri 70 °C počas 75 min a bol úplne neaktívny pri 80 °C počas 15 mi n.

Rozšírené pokusy (s buničinou K20)

Extracelulárne enzymatické aktivity degradácie uhľohydrátov Bacillus stearothermophi 1us - Ľ1.

Špecifické extracelulárne enzymatické aktivity degradujúce uhľohydráty sa testovali sledovaním rastu v rôznych prostrediach (Tab.8). Bunky sa pestovali na rôznych zdrojoch uhlíka ako sú : p-nitrofenyl-p-D-manopyranozid, p-nitrofenyl-α-D-galaktopyranozid a p-nitrofenyl α-L-arabi nopyranozi d.

Xylanáza a dve a arabináza) sa testovali pri pH 8,0 rozri edená dal ši e v 10 mM fosfátového tlmivého celkového skúšobného objemu.

(0,1 ml) sa pridala do tlmivého roztoku a 0,55 a prenesením do kúpeľa s ľadovou vodou, cukor sa zisťoval metódou 3,5-dinitrosalicylovej endohemi celulázy (manáza roztoku a 60 °C vzorka v 1 ml

Vhodne substrátu, Reakcia sa

Redukovaný

0,1 ml ukonči 1 enzýmu

100 mM

0,25 ml ml vody.

kyseliny ako je opísaná Millerom ( Miller, GL, (1959) Anál. Chem 31:426-428). Substrátmi boli 4% xylán z nekultivovaného ovsa, 0,4% živice z agátových zŕn - galaktomanán, 4% arabinogal aktan zo smrekovcového dreva a 4% manán zo Saccharomyces cerevisiae.

Enzymatické uvoľňovanie lignínu z buničiny z mäkkého dreva sa zisťovalo pridaním 200 mg vlhkej buničiny K-20 (z Korsnäs papierne v Gävle, Švédsko) k 3 ml roztoku enzýmu, úpravou pH na 8,0 alebo 9,0 koncentrovaným roztokom NaOH a inkubáciou pri θε pri stálom trepaní. Po 2 hod. sa odobralo 1,5 ml tekutiny a odstredilo pri 10.000 x g počas 5 min. v minifúge za účelom odstránenia zvyšných buničinových vlákien. Čistá tekutina (0,5 ml) sa zriedila s 1,0 ml, 0,1 N NaOH na určenie absorbancie pri 350 nm. Kontrolou na každý test bola inkubácia buničiny za rovnakých podmienok bez enzýmu. Pretože 1 mg lignínu na ml vykazoval A35Q = 9,1 a buničina použitá v týchto pokusoch mala obsah lignínu 1,3% (Klason, zistené podľa Z.Zosima) je delta A35Q x 3 % obsah uvoľneného lignínu = --------------- x 100

P x 0,013 kde P je váha suchej buničiny a delta A35Q je absorbancia po inkubácii mínus absorbancia pred inkubáciou. Množstvo čistého uvoľneného lignínu je celková suma mínus množstvo zistené za podmienok bez prítomnosti enzýmu.

živica z

Xylanázová a dosiahla dôležité aktivity a to xylanázy Xylanáza sa našla pri nízkej uhlíka v kultivačnom médiu bola (LBG), D-glukóza a L-arabinóza. ako zdrojom uhlíka tvorbu akti vi ty.

bola významná v L-arabinózy, kde aktivita manázy, α-L-arabi nopyranozi dázy.

Zistili sa dve a α-L-arabinofuranozidázy. koncentrácii, kde zdrojom agátových zŕn aktivita sa zvýšila D-xylózou 1,23 U/ml. Manóza brzdila Aktivita α-L-arabinofuranozidázy bola a vysoká

Neži sti1 a prostredí D-xylózy dosi ahl a 1,5 U/ml . α-D-galaktozidázy.

xylanázovej nízka, avšak v prostredí sa žiadna β-D-mannozidázy, alebo

Čistenie α-L-arabinofuranózidázy od Bacillus stearothermophi1us

Po kultivácii Bacillus stearothermophi1us L1 počas 24 hod pri 60 θε v prostredí obsahujúcom L-arabinózu obsahovala voľná extracelulárna tekutina bez buniek 1,2 U/ml aktivity α-L-arabinofuranozidázy so špecifickou aktivitou 1,7 U/mg (Tab.9). Predbežné experimenty ukázali, že koncentrácia enzýmu mohla byť realizovaná zrážaním saturáciou 90% síranom amónnym. Predsa len sa získala iba 68% aktivita a žiadne podstatné zvýšenie špecifickej aktivity. Preto sa zrážanie síranom amónnym nepoužilo a surový enzým sa adsorboval priamo na DEAE Sephacel kolóne (Tab.9, aniónový menič). Po prepláchnuti kolóny 10 mM fosforečnano-drasel ným tlmivým roztokom pri pH 8,0 sa vypieranie uskutočnilo roztokom NaCl s lineárnym gradientom od 0,1 do 0,9 M. Aktivita α-Ľ-arabinofuranozidázy sa prejavila vo vypieraní ako ostrý hrot medzi 0,53 a 0,57 M NaCl . Po následnom zahustení a odsolení aktívnej frakcie pomocou dialýzy proti polyetylénglykol u sa špecifická aktivita zvýšila 38x so 100% obnovením aktivity. Tento materiál sa priamo preniesol na kolónu s náplňou Sephadex G-100. Aktívny materiál sa eluoval s jediným ostrým pi kom a zrejmou molekulovou hmotností 108.000. Celkové vyčištenie bolo 59-násobné pri výťažku 80%. Vyčištený enzým sa preskúšal gélovou filtráciou na FPLC Superóze v 100 mM fosforečnano-draselnom pufru pri pH 7,0 a 100 mM NaCl. Vyše 95% aktivity a proteínu sa eluovalo ako jediný ostrý vrchol s očividnou molekulovou hmotnosťou 114.800. U SDS PAGE se prejavil vyčistený enzým ako dva pásy s molekulovou hmotnosťou 57 500 a 52 500. Po odsatí na PVDF membráne a sekvenovaní na plynovom sekvetore Applied Biosystem model 475A ukázala analýza týchto pásov dve N-koncové sekvencie SEQ Ident.č.l a SEQ Ident.č.2.

Charakteristika α-L-arabinofuranozidázy Bacillus stearothermophi1us Ľ1

Pri pH 7,0 bol vyčištený enzým úplne stabilný pri 60 ®C po dobu nejmenej 80 min, zachoval si 50% svojej maximálnej aktivity po inkubácii pri 70 θθ po dobu 75 min a ztratil svoju všetku aktivitu po 15 min pri 80 θθ. Pri 70 ®C bolo pre aktivitu optimálne pH 7,0; pri pH 6,5 a pH 8,0 robili príslušné aktivity 55% a 50% optimálnej aktivity. Pri pH 7,0 a 8,0 bola optimálna teplota pre aktivitu 70 °C. Enzým preukázal maximálnu aktivitu v 20-50 mM NagSO^; pri 100 mM a 150 mM Nä2S0₄ sa aktivita znížila o 10 % resp. o 50 %.

Kinetické parametre enzýmu sa merali pri použití ρΝΡ-α-L-ara-f ako substrátu. Pri pH 7,0 a 65 θθ, K_m a ^v _max robili 2,2 x 10~⁴M a 101 gmol /min /mg. Enzým preukázal len nízku aktivitu na substráte s vysokou molekulovou hmotnosťou ako je arabinoxylán a arabinogalaktan.

Delignifikačná aktivita α-L-arabinofuranozidázy Bacillus stearothermophi1us L1

V priebehu čistenia enzýmu (Tab.9) sa eluenty z kolóny pravidelne skúmali na delignifikačnú aktivitu za použitia čiastočne bielenej buničiny ako substrátu. Del ignifikačná aktivita bola spojená a) s vrcholom aktivity α-L-arabi nofuranozi dázy,

b) s vrcholom aktivity endoxylanázy s nízkou molekulovou hmotnosťou, c) s frakciami, které obsahovali dolnú hodnotu obidvoch aktivít. Pretože sa najvyššia špecifická delignifikačná aktivita prejavovala za prítomnosti obidvoch enzýmov, rozhodlo sa preskúmať možnosť synergickej aktivity α-L-arabinofuranozidázy a predtým vyčistenej tepelne stabilizovanej xylanázy T6 opísanej v prihláške PCT WO 91/10724.

Tab.10 zhŕňa typický pokus, pri ktorom bola del ignifikačná aktivita skúmaná s použitím čistej α-L-arabinofuranozidázy, čistej xylanázy a zmesi obidvoch enzýmov. Pri pH 8,0 a 65 po dobu 2 hod sa zo zmesi 38/ml a-L-arabinofuranozidázy a 5 U/ml xylanázy T6 uvoľnilo čistých 19,2% lignínu z buničiny, pričom výsledok u každého enzýmu pôsobiaceho samostatne bol len 16,5 %. Na získanie 16,5 % uvoľneného čistého lignínu za použitia len xylanázy T6 pri uvedených podmienkach bolo treba 50 U/ml enzýmu. Pri pH 9,0 a 65 °C po dobu 2 hod uvoľnila zmes enzýmov 18,4 % lignínu v porovnaní s len 13,3 % výsledkom ked' každá aktivita pôsobila oddelene. Je jasné, že obidva enzýmy pôsobili pri uvoľňovaní lignínu z buničiny synergicky.

Zjavným paradoxom je, že enzým α-L-arabinofuranozidáza prejavil menej ako 1% svojej optimálnej aktivity pri pH 9,0 za použitia modelového substrátu p-nitrofenol α-L-arabinofuranozidázy. Avšak pri biologickom procese bielenia bol enzým takmer rovnako účinný pri pH 9,0 ako pri pH 8,0. Možné je, že buničina určitým spôsobom chránila a konzervovala aktivitu enzýmu pri vyšších hodnotách pH. Tieto výsledky sú povzbudzujúce lebo priemyselný delignifikačný proces je ľahšie realizovateľný pri pH 9,0 a 65 °C ako pri nižších hodnotách teploty a pH.

Tab. 1

Rastová a delignifikačná aktivita kmeňa Ľ1 na rôznych médiách

Zdroj	uhlíka a	Rast (Α56θ)	Deli gni fi káci a Celková	(%) b Čistá
ži adny	0,73	7,1	5,1
0,2	LB	1,30	8,8	6,8
0,2	manóza	1,83	8,0	6,0
0,2	galaktóza	0,84	4,9	2,9
0,2	glukóza	2,62	8,9	6,9
0,2	xy1óza	2,04	9,1	7,1
0,2	arabi nóza	1,81	10,5	7,6

^Kultivačné médium sa skladalo zo zdroja uhlíka (0,2%), 0,1% kvasničného extraktu, 0,5% kasaminovej kyseliny, a E.soli (0,1% močoviny, 0,02% MgS0₄ . 7H₂0, 5mM KH₂PO₄, pH 9,0, 20 mM Tris HC1 , pH 9,0, 0,1% NaCl a štandardná zmes stopových prvkov) .

Všetky cukry mali D-konfiguráciu s výnimkou L-arabinózy; LB je živica z agátových zŕn.

^b)Delignifikácia buničiny K15 sa vykonala s extracelulárnym supernatantom (s úpravou pH na 9,0) pri 65 ®C, po dobu 2 hod.

Tab. 2

Extracelulárna enzymatická aktivita kmeňa L1

	X médi um a	A-médium &
Substrát	Akti v.(U/ml)	Akti v. (U/ml)
xyl án	1,3	0,05
PNP-a-L-AF	0,004	0,5
PNP-a-Gal	< 0,001
PNP-a-Man	< 0,001
PNP-a-AP	< 0,001
LB-GM	< 0,001

^a) Degradačné aktivity xylánu a LB-GM (galaktomanán z agátových zŕn) sa určili z produkcie redukčných cukrov a PNP-X aktivity sa merali podľa uvoľneného PNP (p-ni trofenol).

b^Bunky boli kultivované po dobu 24 hodin buď na X-médiu alebo A-médiu (prostredie xylózy alebo arabinózy opisané v Tab.l) a zmes sa odstredila za účelom odstránenia buniek.

Tab. 3

Predbežné čistenie	α-L-arabinofuranozidázy z	Ll vypestovaného
na	A-médi u
Frakcia	1 1 1 ! 1 . r- 1 -n E i 1 -Q * 1 1 O 1 1 1 1 1	Protei n	a AF (U/ml)	Xylanáza (U/ml)
Surový supernatant	8100	1,11	0,82	0,03
(NH4)S04 ppt	400	13,3	11,0	0,96
DEAE-Sephacel	20	41,1	46,6	0,09

^a Protein stanovený podľa BioRad

Tab 4

Delignifikácia K15 koncentrovanou α-L-arabinofuranozidázou

Enzým	% uvoľneného Celkom	lignínu a Či stý
(20 U/ml) b	8,6	3,0
Xylanáza T-6 c (5 U/ml)	11,3	5,7
AF + xylanáza T-6	16,1	11,5

^a) 10 mM fosfátového pufru, pH 8,0, 65 θθ 2 hod.

b) Zahustené pomocou DEAE-Sepharel chromatografi e; obsahuje <0,1 U/ml xylanázy.

^c) Xylanáza T-6 produkovaná kmeňom NCIMB 40222 opísaným v prihl.PCT W0 91/10724 a schopná delignifi kovať buničinu z dreva pri pH najmenej 9 a teplote najmenej 65 θθ.

Tab. 5

Vplyv teploty na aktivitu AF pri pH 7 a 8

Teplota °C	pH 7 AF (U/ml) a	pH 8 AF (U/ml) b
40	2,1	1,0
50	5,0	2,4
60	8,3	5,2
65	10,1	7,6
70	10,3	9,6
75	9,9	7,5
80	4,2	1,0
90	0,8	0,3
100	0	0

^a V 20 mM Tri s pufru

Tab. 6

Vplyv koncentrácie soli na aktivitu AF

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ^21 l 3 Q> 1 i 3 ro i 1 CO 1 1 O 1 1 -ŕ> 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1	AF (U/ml) a
0	3,1
20	3,6
50	3,4
100	3,0
150	1,0

^a) V 10 mM fosfátového pufru, pH 7,5, pri 70

Tab. 7

Stabilita aktivity α-L-arabinofuranozidázy (AF)

Reakčná doba (mi n)	60 °C AF a akti vi ta (U/ml)	70 °C AF a akti vi ta (U/ml)	80 °C AF a aktivita (U/ml)
2	7,7	6,7	5,0
5	7,5	7,0	-
15	8,4	7,0	0
30	8,4	6,7
45	7,5	5,5
60	7,7	4,2
75	8,0	2,7

a

V 20 mM Tris pufru, pri pH 7,0

Tab. 8

Extracelulárne enzymatické aktivity Bacillus stearothermophi1us

Ľ1 ^a pri degradáci i uhľohydrátov

Uhľohydrátové substráty použité pre:

Rast	Akti víta enzýmu b	Typ < enzýmu	Aktivi ta (U/ml)
LGB C	LBG	mananáza	<0,01
LGB	xyl án	xylanáza	0, 136
LGB	ρΝΡ-α-D-gal-p	α-D-galaktozi dáza	0,008
D-glukóza	LBG	mananáza	<0,01
D-glukóza	xyl án	xylanáza	0,319
D-xylóza	xyl án	xylanáza	1,25
D-xylóza	LBG	mananáza	<0,01
X-xylóza	arabi nogalaktan	galaktanáza/arabi nožidáza<0,01
D-xylóza	ρΝΡ-α-D-gal-p	α-D-galaktozi dáza	<0,001
D-xylóza	ρΝΡ-β-D-man-p	β-D-manozi dáza	<0,001
D-xylóza	pNP-a-L-ara-p	α-L-arabi no-pyranozi dáza	<0,001
D-xylóza	pNP-a-L-ara-f	α-L-arabino-furanozi dáza	0,01
D-manóza	manán	mananáza	<0,01
D-manóza	xyl án	xylanáz	<0,01
D-manóza	LBG	mannanáza/galaktozi dáza	<0,01
D-manóza	ρΝΡ-β-D-man-p	β-D-mannozi dáza	<0,001
L-arabi nóza	arabi nogalaktan	α-L-arabi nozdáza	<0,01
L-arabi nóza	xyl án	xylanáza	0.11
L-arabi nóza	pNP-a-L-ara-f	a-L-arabi no-furanozi dáza	1,5

^a) Bunky boli kultivované po dobu 24 hod pri 60 θθ a pH 8,0 v E-soliach obsahujúcich 0,1 % kvasničného extraktu, 0,1% kasaminových kyselín a 0,2% zdroja uhlíka.

Po inkubácii počas 24 hod, sa kultúra odstredila a extracelulárne enzýmy degradujúce karbohydráty sa testovali ako je uvedené v opisu prihlášky.

^c) LGB je živica z agátových zŕn - galaktomanán; pNP je p-ni trofenol

Tab. 9

Prehľad postupu čistenia ce-L-arabi nof uranozi dázy g-L-arabi nofuranozi dáza

Či sti ace operáci e	Obj em (ml)	Proteí n (mg/ml)	(U/ml)	Sp.akti v. (U/mg)	Výťažok
Surová a	1400	0,70	1,21	1,71
Aniónový menič	4,5	5,8	377	65	100
Gólová filtrácia0^	18	0,74	75,6	101	80

^a) 1,4 litra kultúry kmeňa Ľ1 sa pripravilo spôsobom opísaným v prihláške. Kultúra sa odstredila po dobu 30 min pri 10.000 x g. Supernatantná tekutina sa potom prefi 1troval a na 0,8 pm filtri za účelom odstránenia zvyškov buniek. Tento surový supernatant bol východiskovým materiálom pre čistiaci postup.

b) Po prechode kolónou s náplňou DEAE sephacel nasledovala dialýza proti polyetylénglykolu.

^c) Sephadex G-100

Tab. 10

Delignifikačná aktivita α-L-arabinofuranozidázy a xylanázy T6 na čiastočne bielenej buničine

Enzým a)	Deli gni fi káci a	(%) b Či stá
PH	Celkom
žiadny enzým	8,0	5,3
žiadny enzým	9,0	5,2
α-L-arabi nofuranozi dáza	8,0	7,6	2,3
α-L-arabi nofuranozi dáza	9,0	7,3	2,1
xylanáza	8,0	19,5	14,2
xylanáza	9,0	16,8	11,6
a-L-arabinofuranozidáza + xylanáza	8,0	24,5	19,2
α-L-arabinofuranozidáza + xylanáza	9,0	24,6	18,4

^a) Použila sa vyčistená α-L-arabinofuranozidáza (38 jednotiek/ml, špecifická aktivita 126 U/mg) a xylanáza T6 (5 U/ml , 192 U/mg). Enzýmy boli v 10 mM fosfátového pufru.

Použité podmienky boli tieto: 10 mM Na₂S0₄ a 10 nM (NH₄)₂S0₄, 65 °C pri pH 8.0 alebo 9.0.

Priemyselná využiteľnosť

Predmet vynálezu je možno s výhodou využiť v priemysle celulózy na delignifikáciu a bielenie všetkých typov drevnej buničiny obsahujúcej lignín najmä pri procesoch, v ktorých nie je žiadúca aplikácia chlóru..

ZOZNAM SEKVENCIÍ

(D	Všeobecná	i nformaci a:
(I)	Pri hlasovateľ:
(A)	Meno :	Korsnas AB
(B)	Ulica:	neuvedená
(C)	Mesto:	Gavl e
(E)	Kraj i na	Švédsko
(F)	PSČ:	S-801 81
(G)	Telefón:	026-151000
(H)	Telef ax:	026-195253
(A)	Meno:	The Technion Research and Development Foundation Ltd
(B)	U1i ca:	Technion City
(C)	Mesto:	Hai fa
(E)	Kraj i na:	Izrael
(F)	PSČ:	neuvedené
(A)	Meno:	Ramot - Univerši ty Authority for Applied Res.S Ind.Dev.Ltd
(B)	U1i ca:	32 H Levanon Street
(C)	Mesto:	Tel Aviv
(E)	Kraj i na:	Izrael
(F)	PSČ:	neuvedené
(II)	Názov vyn	álezu: Del ignifikačný prípravok prejavujúci alfa-L-arabi no-furanozidázovú aktivitu, spôsob jeho výroby a použitia
(III) Počet se	kvenci í: 3
(IV)	i Forma na	čítanie z počítača:
(A)	Typ nosiča	: F1 oppy disk
(R) (°C)	Poči tač:	IBM PC kompatibilný
l Operačný	systém: PC-DOS/MS-DOS
(D)	Software:	Patentln Release #1.0, Verše #1.25 (EPO)
(2)	INFORMÁCIE	PRE SEQ IDENT.Č.l
(I)	Sekvenčná	charakteri sti ka:
(A)	Dĺžka:	9 aminokyselín
(B)	Typ:	ami nokyseli na
(D)	Topológi a:	neznáma

(II)	Typ molekuly:	proteí n
(III)	Hypoteti cký:	n i e
(V)	Typ fragmentu:	N-koncový
(VI)	Pôvodný zdroj: (A) Organizmus:	Bacillus stearothermophi1us

(XI) Opis sekvencie: SEQ Ident.č.l:

Xaa Gin Pro Tyr Arg Xaa Glu Glu Leu 1 5 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ IDENT.Č.2 (I) Sekvenčná charakteristika:

(A) Dĺžka: 23 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: neznáma (II) Typ molekuly: proteín (III) Hypotetický: nie (V) Typ fragmentu: N-koncový (VI) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Bacillus stearothermophi1us (XI) Opis sekvencie: SEQ Ident.č.2:

Ser Met Lys Lys Ala Thr Met íle íle Glu Lys Asp Phe Lys íle Al a 1 10 15

Glu íle Asp Lys Arg íle Tyr (2) INFORMÁCIE PRE SEQ IDENT.Č.3 (I) Sekvenčná charakteristika:

(A) Dĺžka: 50 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: neznáma (II) Typ molekuly: proteín (III) Hypotetický: nie (V) Typ fragmentu: N-koncový (VI) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Bacillus stearothermophi1us (XI) Opis sekvencie: SEQ Ident.č.3:

Al a

Thr

Lys

Lys

Al a

Thr

Met

íle

íle

Glu

Lys

Asp

Phe

Lys

íle

Al a

1

5

10

15

G1 u

íle

Asp

Lys

Arg

íle

Tyr

Gly

Ser

Phe

íle

G1 u

H i s

Leu

Gly

Arg

20

25

30

Ala

Val

Tyr

Gly

Gly

íle

Tyr

G1 u

Pro

Gly

Hi s

Pro

Gin

Al a

Asp

G1 u

35

40

45

Asn Gly

Claims (17)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Prípravok prejavujúci sa enzymatickou aktivitou, vyznačujúci satým, že je pri praví teľný aeróbnou fermentáciou vo vhodnom médiu kmeňa Baci11us stearothermophilus získaného selekciou z kmeňa NCIMB 40494 a jeho mutantov a variantov, ktorý má v podstate rovnakú schopnosť produkcie uvedeného prípravku ako kmeň NCIMB 40494, pričom enzymatická aktivita prípravku obsahuje podstatnú časť aktivity a-L-arabinofuranozidázy so schopnosťou delignifikácie drevnej buničiny pri pH 8-9 a teplote 65 °C.
2. 2. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z vyčistenej kultúry kultivačnej pôdy.
3. 3. Pripravok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z koncentrovanej frakcie kultúry kultivačnej pôdy prejavujúcej aktivitu α-L-arabinofuranozidázy v prostredí drevnej buničiny.
4. 4. Pripravok podľa nároku 3, vyznačujúci satým, že aktivita α-L-arabinofuranozidázy je odvodená od α-L-arabinofuranozidázy, ktorá je zložená z dvoch podjednotiek s približnou molekulovou hmotnosťou 52 000 Da a 57 500 Da.
5. 5. Prípravok podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že je spojený s prípravkom vykazujúcim enzymatickú aktivitu produkovanú iným mikrobiálnym kmeňom a so schopnosťou delignifikácie drevnej buničiny pri teplote najmenej 65 a pH najmenej 9.
6. 6. Prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci sa, tým, že obsahuje α-L-arabinofuranozidázu produkovanú kmeňom NCIMB 40494 Bacillus stearothermophi 1us a xylanázu produkovanú kmeňom NCIMB 40222 Bacillus stearothermophi1us .
7. 7. Enzým α-L-arabinofuranozidáza vyznačujúci sa sekvenciou aminokyselín, ktorá obsahuje N-koncovú dielčiu sekvenciu aminokyselín (SEQ Ident.č.l)

   Met? Gin Pro Tyr Arg Pro? G1u Glu Leu alebo jej homológ.
8. 8) Enzým α-L-arabinofuranozidáza vyznačujúci sa sekvenciou aminokyselín, ktorá obsahuje N-koncovú dielčiu sekvenciu aminokyselín (SEQ Ident.č.2)

   Ser Met Lys Lys Al a Thr Met íle íle Glu Lys Asp Phe Lys íle Ala Glu íle Asp Lys Arg íle Tyr alebo jej homológ.
9. 9. Spôsob výroby prípravku prejavujúceho se enzymatickou aktivitou, vyznačujúci sa tým, že kmeň Bacillus stearothermophi1us vybraný selekciou z kmeňa NCIMB 40494 vvrátane jeho mutantov alebo variant, ktorý má v podstate rovnakú schopnosť produkovať prípravok, ako kmeň NCIMB 40494, sa podrobí aeróbnej fermentácii vo vhodnom médiu pričom v enzymatickej aktivite prípravku zaujíma podstatnú čásť aktivita α-L-arabinofuranozidázy so schopnosťou delignifikácie drevnej buničiny pri pH 8-9 a teplote 65 ®C.
10. 10. Izolovaný kmeň Bacillus stearothermophi 1 us NCIMB 040494 včítane jeho mutantov a variant, ktorý má v podstate rovnakú schopnosť produkcie prípravku prejavujúceho enzymatickú aktivitu, ako kmeň NCIMB 40494, pričom v tejto enzymatickej aktivite zaberá podstatnú čásť aktivita α-L-arabinofuranozidázy so schopnosťou delignifikácie drevnej buničiny pri pH 8-9 a teplote 65 ®C.
11. 11. Použitie enzýmu produkovaného kmeňom Baci11us stearothermophi1us NCIMB 040494 pri spracovaní drevnej buničiny.
12. 12. Spôsob obsahujúci spracovanie drevnej buničiny, vyznačujúci sa tým, že na drevnú buničinu sa pôsobí najmenej v jednej operácii prípravkom podľa jedného z nárokov 1 až 6.
13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že drevná buničina je sulfátová buničina.
14. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že drevná buničina je čiastočne delignifi kovaná sulfátová buni či na.
15. 15. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že delignifi kovaná sulfátová buničina je kyslíkom delignifi kovaná sulfátová buničina.
16. 16. Drevná buničina vyznačujúca sa tým, že sa spracuje najmenej v jednej operácii prípravkom podľa niektorého z nárokov 1 až 6.
17. 17. Sonda DNA alebo RNA rozoznávajúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje sekvenciu aminokyselín (SEQ Ident.č.l)