JP2732064B2 - 糖転移酵素検定用糖鎖及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、糖転移酵素検定用糖鎖及びその製造法に関
する。

（従来の技術） 本発明化合物は、文献未記載の新規化合物である。生
体内には様々な糖鎖構造を作り出す種々の糖転移酵素が
多数存在する。

本発明化合物は、特に、Ｎ−アセチルグルコサミン転
移酵素IVの基質となり得るものとしては、世界初の合成
例である。

（発明が解決しようとする課題） 最近、細胞機能発現因子としての種々の糖転移酵素を
臓器等から取り出す試みや、遺伝子組換えにより人工的
に糖転移酵素を作り出す試みが行なわれているが、天然
酵素の場合にはその完全精製が、又、人工酵素の場合に
は特異性の検定が課題となっている。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは上記課題の解決の一環として、特に、Ｎ
−アセチルグルコサミン転移酵素IVを対象として、アフ
ィニティークロマトグラフィーによる完全精製が可能と
なり、特異性の検定も可能となるように、糖鎖にスペー
サーを導入した形の糖転移酵素検定用糖鎖及びその製造
法を完成させた。

なお、本発明化合物は、ガラクトース転移酵素に関し
ても同様の目的で使用可能である。

本発明の新規な糖鎖は、下記の一般式（III）で表わ
される化合物である。

（式中、R¹は低級アルキル基を示し、R²はベンジル基又
は水素原子を示し、R³はアセチル基又は水素原子を示
し、Acはアセチル基を示す。）さらに本発明の新規な化
合物は、下記の一般式（Ｉ）及び（II）で表わされるも
のである。

（式中、R¹及びR²はベンジル基を示し、R³とR⁴は共同し
て一つのフタロイル基を示すか、又はR³はアセチル基を
示しかつR⁴は水素原子を示し、かつR⁵はアセチル基を示
すか、あるいはR¹はアセチル基、水素原子又は−Ｃ（＝
NH）CCl₃基を示し、R²，R³及びR⁵はアセチル基を示し、
かつR⁴は水素原子を示す。） （式中、R¹は水素原子又はアセチル基を示し、R²はアセ
チル基を示し、Bnはベンジル基を示し、Etはエチル基を
示す。） 以下、本発明を詳細に説明する。

（ａ）一般式（Ｉ）の化合物の合成 一般式（Ｉ）で表わされる化合物（12）は、スキーム
１に示すように、公知化合物であるベンジルトリ−Ｏ−
ベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド（10）〔T.オガワ
ら、カーボハイドレート・リサーチ（Carbohydrate Res
earch）、104（1982）271の方法により製造できる〕を
公知化合物であるＮ−フタロイルグルコサミニルブロミ
ド（11）〔R.U.レミュー（Lemieux）ら、アメリカン・
ケミカル・ソサイエティー・シンポジウム・シリーズ
（Am.Chem.Soc.Symp.Ser.）、39（1976）90の方法によ
り製造できる〕でグリコシル化することによって製造す
る。このグリコシル化は、例えばCl(CH₂)₂Clのような溶
媒中、AgOSO₂CF₃さらにはモレキュラーシーブ（以下MS
という）4Aの存在下で実施することが好ましい。また、
グリコシル化反応は、−20〜50℃の温度で、１分〜60時
間、例えば攪拌することによって実施することが好まし
い。

さらに、化合物（13）は、化合物（12）を脱アセチル
化後、脱フタロイル化し、次いでアセチル化することに
よって合成する。

上記化合物（12）の脱アセチル化は、例えばメタノー
ル等の溶媒中、NaOCH₃で処理することによって実施する
ことができる。

また、脱アセチル化後の脱フタロイル化は、脱アセチ
ル化した生成物をメタノール等の溶媒中、ｎ−BuNH₂で
処理することによって実施することができる。

次いで、脱フタロイル化後のアセチル化は、無水酢酸
／ピリジンで処理することによって実施することができ
る。

さらに、化合物（14）は、化合物（13）を脱ベンジル
化し、次いでアセチル化することによって合成する。

上記化合物（13）の脱ベンジル化は、例えば酢酸等の
溶媒中、Pd−Ｃのような触媒の存在下、水素還元するこ
とによって実施することができる。

また、脱ベンジル化後のアセチル化は、無水酢酸／ピ
リジンで処理することによって実施することができる。

さらに、化合物（15）は、化合物（14）を部分的に脱
アセチル化することによって合成する。この部分的な脱
アセチル化は、化合物（14）をN,N−ジメチルホルムア
ミド（以下DMFという）のような溶媒中、H₂NNH₂・CH₃CO
₂Hで処理することによって実施することが好ましい。

化合物（16）は、化合物（15）をクロルイミデート化
することによって合成する。このクロルイミデート化
は、化合物（15）を塩化メチレン等の溶媒中、NaHとCl₃
CCNで処理することによって実施することが好ましい。
さらにクロルイミデート化反応は、−50〜50℃の温度
で、１分〜16時間、例えば攪拌することによって実施す
ることが好ましい。

（ｂ）一般式（II）の化合物の合成 一般式（II）で表わされる化合物（18）及び化合物
（19）は、スキーム２に示すように、公知化合物である
化合物（17）〔T.オガワら、カーボハイドレート・リサ
ーチ（Carbohydrate Research）、152（1986）173の方
法により製造できる〕をアセチル化することによって合
成する。このアセチル化は、例えば塩化メチレン等の溶
媒中、ピリジンと塩化アセチルで処理することによって
実施することが好ましい。

（ｃ）一般式（III）の化合物の合成 一般式（III）で表わされる化合物（20）は、化合物
（18）を化合物（16）でグリコシル化することにより合
成する。このグリコシル化は、例えばジクロロエタン等
の溶媒中、BF₃・Et₂Oの存在下で実施することが好まし
い。さらにグリコシル化反応は、N₂等の雰囲気下、−50
〜50℃の温度で、１分〜24時間、反応系を攪拌しながら
行うことが好ましい。

さらに化合物（21）は、化合物（20）を脱ベンジル化
し、次いで脱アセチル化することよって合成する。

上記化合物（20）の脱ベンジル化は、Pd−Ｃの存在
下、水素ガス雰囲気中、酢酸等の溶媒中、５〜100℃の
温度で、１分〜24時間実施することが好ましい。

また、脱ベンジル化の次の脱アセチル化は、脱ベンジ
ル化した生成物をメタノール等の溶媒中、NaOCH₃で処理
することによって実施することが好ましい。

尚、前記工程において合成される化合物（12）、（1
3）、（14）、（15）、（16）、（18）、（19）、（2
0）、（21）は、いずれも新規化合物である。

（実施例） 以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
が、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

実施例１〔化合物（10）＋（11）→（12）〕 190℃で21時間真空乾燥したMS−4A粉末6gに、AgOSO₂C
F₃1.42g（5.5mモル）と1,2−ジクロロエタン25mlを加
え、系内を窒素置換した。次に、1,2−ジクロロエタン1
0mlに溶解した化合物（10）1.00g（1.8mモル）を加え
て、０℃まで冷却した。そして、1,2−ジクロロエタン1
5mlに溶解した化合物（11）1.21g（2.4mモル）を滴下し
た。反応は０℃→室温で18時間行なった。反応終了後、
CH₂Cl₂170mlを加えてセライト濾過し、水洗、重曹処理
をして有機層をMgSO₄で乾燥した。濾過後、減圧濃縮し
て、その残渣をシリカゲル180gのカラム（CH₂Cl₂−アセ
トン40:1）に通して精製し、化合物（12）を1.37g得た
（収率77.3％）。

〔化合物（12）の性質〕 TLC Rf＝0.58（トルエン−酢酸エチル2:1） 元素分析 C₅₄H₅₅NO₁₅として 計算値 C,67.70;H,5.79;N,1.46 測定値 C,67.53;H,5.79;N,1.42 比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼＋16.8°（C 1.00,CHCl₃）¹ H−NMR（CDCl₃）5.495（d,1H,J8.4Hz,H−１′）,4.710
（d,1H,J1,8Hz,H−１）¹³ C−NMR（CDCl₃）96.9（¹J_CH164.8Hz,C−１′）,96.6
（¹J_CH168.5Hz,C−１）,62.4（Ｃ−６′）,54.6（Ｃ−
２′） 実施例２〔化合物（12）→（13）〕 化合物（12）11.4gをメタノール220mlを溶解し、1N−
NaOHe3mlを加えて、室温で18時間攪拌した。この反応液
を減圧濃縮して、残渣をメタノール600mlに溶解し、ｎ
−ブチルアミン120mlを加えて、浴温100℃で42時間還流
した。この反応液を減圧濃縮して、残渣をピリジン110m
lに溶解し、無水酢酸110mlを加えて、室温で19時間攪拌
した。そして、反応液を減圧濃縮して、その残渣をシリ
カゲル900gのカラム（トルエン−酢酸エチル1:2）に通
して精製し、化合物（13）を9.7g得た（収率93.7％）。

〔化合物（13）の性質〕 TLC Rf＝0.48（トルエン−酢酸エチル1:2） 元素分析 C₄₈H₅₅NO₁₄として 計算値 C,66.27;H,6.37;N,1.61 測定値 C,66.25;H,6.35;N,1.54 比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼＋7.3°（C 1.01,CHCl₃）¹ H−NMR（CDCl₃）2.018（s,3H,Ac）,2.014（s,3H,Ac）,
1.997（s,3H,Ac）,1.743（s,3H,NAc） 実施例３〔化合物（13）→（14）〕 化合物（13）1.99gを酢酸40mlに溶解し、10％Pd−C2.
00gを加えてH₂を封入し、80℃で30分間攪拌した。セラ
イト濾過後、減圧濃縮して、残渣をピリジン20mlに溶解
し、無水酢酸20mlを加えて、室温で17時間攪拌した。そ
して、反応液を減圧濃縮して、その残渣をシリカゲル19
0gのカラム（CHCl₃−アセトン3:1）に通して精製し、化
合物（14）を1.33g得た（収率85.8％）。

〔化合物（14）の性質〕 TLC Rf＝0.42（CHCl₃−アセトン2:1） 元素分析 C₂₈H₃₉NO₁₈として 計算値 C,49.63;H,5.80;N,2.08 測定値 C,49.64;H,5.82;N,2.11 比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼−10.0°（C 1.00,CHCl₃）¹ H−NMR（CDCl₃）5.994（d,1H,J2.2Hz,H−１） 実施例４〔化合物（14）→（15）〕 化合物（14）6.40g（9.4mモル）をDMF16mlに溶解し、
H₂NNH₂・AcOH932.7mg（10.1mモル）を加え、室温で1.5
時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチル600mlを加え、
水洗、重曹処理をして、有機層をMgSO₄で乾燥した。濾
過後、減圧濃縮して、その残渣をシリカゲル800gのカラ
ム（CHCl₃−メタノール15:1）に通して精製し、化合物
（15）を5.08g得た（収率84.6％）。

〔化合物（15）の性質〕 TLC Rf＝0.39（CHCl₃−メタノール10:1） 元素分析 C₂₆H₃₇NO₁₇・H₂Oとして 計算値 C,47.78;H,6.01;N,2.14 測定値 C,47.66;H,5.76;N,2.15 比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼−29.9°（C 1.01,CHCl₃）¹³ C−NMR（CDCl₃）99.1（¹J_CH158.7Hz,C−１′）,92.1
（¹J_CH171.1Hz,C−１）,55.4（Ｃ−２′） 実施例５〔化合物（15）→（16）〕 化合物（15）2.14g（3.4mモル）をCH₂Cl₂30mlに溶解
し、Cl₃CCN3.4mlを加え、０℃まで冷却した。そして、6
0％NaH128.4mg（3.2mモル）を加え、０℃で１時間攪拌
した。反応終了後、CH₂Cl₂80mlを加え、セライト濾過し
て、減圧濃縮し、残渣をシリカゲル150gのカラム（CHCl
₃−アセトン2:1）に通して精製し、化合物（16）を2.20
g得た（収率83.8％）。

〔化合物（16）の性質〕 TLC Rf＝0.42（CHCl₃−アセトン2:1） 元素分析 C₂₈H₃₇N₂O₁₇Cl₃,3/2H₂Oとして 計算値 C,41.67;H,5.00;N,3.47;Cl,13.18 測定値 C,41.94;H,4,70;N,3.49;Cl,13.45 比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼＋9.2°（C 1.01,CHCl₃）¹ H−NMR（CDCl₃）8.71（s,1H,C＝NH）,6.19（d,1H,J1.8
Hz,H−１） 実施例６〔化合物（17）→（18）＋（19）〕 化合物（17）3.09g（5.67mモル）をCH₂Cl₂90mlに溶解
し、ピリジン460μｌ（5.69mモル）と塩化アセチル400
μｌ（5.63mモル）を加え、−10℃で１時間攪拌後、さ
らに、ピリジン320μｌ（3.96mモル）と塩化アセチル28
0μｌ（3.94mモル）を加え、20分間攪拌した。反応終了
後、CH₂Cl₂200mlを加え、重曹処理をして、有機層をMgS
O₄で乾燥し、濾過後、減圧濃縮して、その残渣をシリカ
ゲル400gのカラム（トルエン−酢酸エチル7:1）に通し
て精製し、化合物（18）を2.73g（収率82.0％）、化合
物（19）を0.39g（収率10.9％）得た。

〔化合物（18）の性質〕 TLC Rf＝0.57（トルエン−酢酸エチル3:1） 元素分析 C₃₃H₄₆O₉・1/2H₂Oとして 計算値 C,66.53;H,7.95 測定値 C,66.63;H,7,79 比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼−53.1°（C 1.01,CHCl₃）¹ H−NMR（CDCl₃）2.05（s,3H,6−OAc）¹³ C−NMR（CDCl₃）101.8（¹J_CH153.8Hz,C−１）,63.8
（Ｃ−６） 〔化合物（19）の性質〕 TLC Rf＝0.64（トルエン−酢酸エチル3:1） 元素分析 C₃₅H₄₈O₁₀・1/2H₂Oとして 計算値 C,65.91;H,7.74 測定値 C,66.06;H,7,62 比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼−72.6°（C 1.01,CHCl₃）¹ H−NMR（CDCl₃）2.06（s,3H,6−OAc）,1.87（s,3H,3−
OAc）¹³ C−NMR（CDCl₃）101.4（¹J_CH153.8Hz,C−１）,63.6
（Ｃ−６） 実施例７〔化合物（16）＋（18）→（20）〕 190℃で21時間真空乾燥したモレキュラーシーブAW300
粉末4.5gに1,2−ジクロロエタン20mlを加え、系内を窒
素置換した。次に1,2−ジクロロエタン17mlに溶解した
化合物（18）1103.0mg（1.88mモル）を加えて０℃まで
冷却した。そして、1,2−ジクロロエタン17mlに溶解し
た化合物（16）2624.3mg（3.36mモル）とBF₃・Et₂O500
μｌ（4.02mモル）を加え１時間攪拌した後、さらにBF₃
・Et₂Oを500μｌ加え１時間攪拌した。反応終了後、CH₂
Cl₂300mlを加え、セライト濾過し、重曹処理をして、有
機層をMgSO₄で乾燥した。濾過後、減圧濃縮して、その
残渣をシリカゲル450gのカラム（CHCl₃−アセトン4:1）
に通して精製し、化合物（20）を1585.0mg得た（収率7
0.0％）。

〔化合物（20）の性質〕 TLC Rf＝0.45（CHCl₃−アセトン3:1） 元素分析 C₅₉H₈₁NO₂₅・H₂Oとして 計算値 C,57.97;H,6.85;N,1.15 測定値 C,57.91;H,6.71;N,1.15 比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼−46.6°（C 1.01,CHCl₃）¹³ C−NMR（CDCl₃）101.9（¹J_CH153.8Hz,C−１）,100.0
（¹J_CH172.1Hz,C−１′）,99.6（¹J_CH163.6Hz,C−
１″）,54.3（Ｃ−２″） 実施例８〔化合物（20）→（21）〕 化合物（20）828.3mgを酢酸16mlに溶解し、10％Pd−C
0.4gを加えてH₂を封入し、60℃で1.5時間攪拌した。セ
ライト濾過後、減圧濃縮して、残渣をシリカゲル80gの
カラム（CHCl₃−アセトン3:2）に通して精製し、得られ
たシロップ663.6mgをメタノール13mlに溶解し、1N−NaO
Me0.5mlを加えて、室温で19時間攪拌した。この反応液
にAMBERLYST15を2ml加えて５分間攪拌して中和し、セラ
イト濾過後、減圧濃縮して、その残渣をゲル濾過（Seph
adex G−25 300ml、H₂O）により精製し、凍結乾燥し
て、化合物（21）を389.4mg得た（収率79.1％）。

〔化合物（21）の性質〕 TLC Rf＝0.47（酢酸エチル−エタノール−水8:4:2） 元素分析 C₃₀H₅₃NO₁₈・５H₂Oとして 計算値 C,44.71;H,7.88;N,1.74 測定値 C,44.86;H,7,65;N,1.70 比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼−18.1°（C 1.01,H₂O）¹ H−NMR（D₂O）5.143（s,1H,H−１′）,4.647（s,1H,H
−１）,4.555（d,1H,J8.5Hz,H−１″）,3.698（s,3H,OM
e）,2.395（t,2H,J7.3Hz,CH₂CO）,2.060（s,3H,NAc） （発明の効果） 本発明の３糖（III）は、Ｎ−アセチルグルコサミン
転移酵素IVの特異性の検定用基質として、また、アフィ
ニティークロマトグラフィーにる酵素精製のリガンドと
して用いることが可能な糖鎖である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 和昭 埼玉県北葛飾郡吉川町中曽根477

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次式（Ｉ）で表わされる化合物。 （式中、R¹及びR²はベンジル基を示し、R³とR⁴は共同し
   て一つのフタロイル基を示すか、又はR³はアセチル基を
   示しかつR⁴は水素原子を示し、かつR⁵はアセチル基を示
   すか、あるいはR¹はアセチル基、水素原子又は−Ｃ（＝
   NH）CCl₃基を示し、R²，R³及びR⁵はアセチル基を示し、
   かつR⁴は水素原子を示す。）
2. 【請求項２】次式（II）で表わされる化合物。 （式中、R¹は水素原子を示し、R²はアセチル基を示し、
   Bnはベンジル基を示し、Etはエチル基を示す。）
3. 【請求項３】次式（III）で表わされる化合物。 （式中、R¹は低級アルキル基を示し、R²はベンジル基又
   は水素原子を示し、R³はアセチル基又は水素原子を示
   し、Acはアセチル基を示す。）
4. 【請求項４】（ａ）次式 （式中、Bnはベンジル基を示す。）の化合物（10）を次
   式 （式中、Acはアセチル基を示し、Phthはフタロイル基を
   示す。）の化合物（11）でグリコシル化し、一般式 で表わされる化合物（12）［一般式（Ｉ）中、R¹及びR²
   はベンジル基を示し、R³及びR⁴は共同して一つのフタロ
   イル基を示し、R⁵はアセチル基を示す。］を製造する工
   程、 （ｂ）化合物（12）を脱アセチル化及び脱フタロイル化
   後、アセチル化し、一般式（Ｉ）で表わされる化合物
   （13）［一般式（Ｉ）中、R¹及びR²はベンジル基を示
   し、R³及びR⁵はアセチル基を示し、R⁴は水素原子を示
   す。］を製造する工程、 （ｃ）化合物（13）を脱ベンジル化後、アセチル化し、
   一般式（Ｉ）で表わされは水素原子を示す。］を製造す
   る工程、 （ｄ）化合物（14）を部分的に脱アセチル化し、一般式
   （Ｉ）で表わされる化合物（15）［一般式（Ｉ）中、R¹
   及びR⁴は水素原子を示し、R²，R³及びR⁵はアセチル基を
   示す。］を製造する工程、 （ｅ）化合物（15）をクロルイミデート化し、一般式
   （Ｉ）で表わされる化合物（16）［一般式（Ｉ）中、R¹
   は−Ｃ（＝NH）CCl₃基を示し、R²，R³及びR⁵はアセチル
   基を示し、R⁴は水素原子を示す。］を製造する工程、 （ｆ）次式 （式中、Bnはベンジル基を示し、Etはエチル基を示
   す。）の化合物（17）をアセチル化し、次式 （式中、Acはアセチル基を示し、Bnはベンジル基を示
   し、Etはエチル基を示す。）で表わされる化合物（18）
   及び次式 （式中、Acはアセチル基を示し、Bnはベンジル基を示
   し、Etはエチル基を示す。）で表わされる化合物（19）
   を製造する工程、 （ｇ）化合物（18）を化合物（16）でグリコシル化し、
   一般式 で表わされる化合物（20）［一般式（III）中、R¹はエ
   チル基を示し、R²はベンジル基を示し、R³はアセチル基
   を示す。］を製造する工程、および （ｈ）化合物（20）を脱ベンジル化及び脱アセチル化
   し、一般式（III）で表わされる化合物（21）［一般式
   （III）中、R¹はメチル基を示し、R²及びR³は水素原子
   を示す。］を製造する工程、 の諸工程からなる、糖転移酵素検定用糖鎖の製造法。