KR20160000082A

KR20160000082A - L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법

Info

Publication number: KR20160000082A
Application number: KR1020140076698A
Authority: KR
Inventors: 정기용; 김경림; 이석명; 이광호; 이근철; 홍형표
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2014-06-23
Filing date: 2014-06-23
Publication date: 2016-01-04
Also published as: JP2017518759A; US10815510B2; RU2016152662A; WO2015199406A1; US20170137854A1; DK3159401T3; CN106574239B; CN106574239A; ES2918459T3; MY172369A; EP3159401A4; EP3159401A1; BR112016030467B1; JP2019013256A; EP3159401B1; RU2016152662A3; BR112016030467A2; JP6687549B2; KR101835173B1; RU2678139C2

Abstract

본 발명은 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 내재적 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 약화시키거나 불활성화시킴으로써, L-트립토판 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 에스케리키아속 미생물을 이용하여 L-트립토판을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판의 제조 방법{A MICROORGANISM OF ESCHERICHIA GENUS HAVING L-TRYPTOPHAN PRODUCING ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING L-TRYPTOPHAN USING THE SAME}

본 발명은 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-트립토판을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-트립토판(L-tryptophan)은 필수 아미노산의 하나로 사료 첨가제 등으로 널리 사용되어 왔으며, 또한 수액제 등의 의약품 원료 및 건강식품소재 등으로 널리 사용되어 왔다. 이와 같은, L-트립토판은 화학 합성법, 효소 반응법, 발효법 등을 통해 생산될 수 있으나, 현재에는 미생물을 이용한 직접 발효법이 주로 이용되고 있다.

L-트립토판 생산균주의 개발 방향은 초기에는 돌연변이 선별로 진행되거나(대한민국 등록특허 제1987-0001813호), 유전공학의 발달과 함께 생합성 경로 효소들의 트립토판 피드백 저해를 극복하는 방법, 혹은 트립토판 생합성 효소의 발현 강화와 같이 대사과정의 효소 합성 강화를 통해 트립토판 생산 균주의 개발이 진행되었다.

한편, L-아미노산의 생산을 향상시키고자 Entner-Doudoroff 경로를 이용하는 방법이 등장한 바 있다(US 등록특허 제7432085호). 상기 US 등록특허는 Entner-Doudoroff 경로에 관여하는 효소의 활성을 증강시켜 피루브산을 중간물질로 사용하는 생합성 경로에 의해 생산되는 L-아미노산의 생산을 향상시키는 방법에 대한 것으로, 구체적으로 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 또는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 증강시키는 것을 핵심 특징으로 하고 있다.

그러나 본 발명자들은 다른 L-아미노산들과 달리, L-트립토판의 경우에는 상기 Entner-Doudoroff 경로의 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 함께 약화시키거나 불활성화시키는 경우 L-트립토판 생산능이 현저히 향상된다는 것을 최초로 규명하였으며, 이를 이용하여 L-트립토판 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판 제조 방법에 대한 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 L-트립토판 생산능을 갖는 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 L-트립토판 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 L-트립토판을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 내재적 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성이 약화 또는 불활성화되어, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "L-트립토판(L-tryptophan)"은 α-아미노산의 하나로, 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이며 화학식이 C₁₁H₁₂N₂O₂인 방향족 L-아미노산을 말한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "Entner-Doudoroff 경로"는 에스케리키아속 미생물 내 존재하는 탄소 대사 경로의 하나로서, 상기 경로로 유입된 탄소원이 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제에 의한 2단계의 일련의 효소 반응을 통하여, 글리세르알데하이드-3-포스페이트(Glyceraldehyde-3-phosphate) 및 피루브산(pyruvate)으로 전환되는 것을 촉매하는 경로이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "6-포스포글루코네이트 탈수소효소(6-phosphogluconate dehydratase; Edd; EC 4.2.1.12)"는 Entner-Doudoroff 경로에 관여하는 효소로서, 6-포스포-D-글루코네이트를 2-디하이드로-3-데옥시-6-포스포-D-글루코네이트로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 효소는 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소의 활성을 갖는 서열이라면 제한없이 포함된다. 또한, 상기 6-포스포글루코네이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 구체적인 예로 서열번호 2의 염기서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제(2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase; Eda; EC 4.1.2.14)"는 Entner-Doudoroff 경로에 관여하는 효소로서, 2-디하이드로-3-데옥시-6-포스포-D-글루코네이트를 글리세르알데하이드-3-포스페이트 및 피루브산으로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 효소는 구체적으로 서열번호 3의 아미노산 서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소의 활성을 갖는 서열이라면 제한없이 포함된다. 또한, 상기 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제를 코딩하는 유전자는 구체적인 예로 서열번호 4의 염기서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함된다.

상기 각 효소들은 상기 서열번호 1 또는 3으로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더 구체적으로는 98% 이상, 더욱 더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 각 효소와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 효소라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖으며 각 효소에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 효소 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

또한, 상기 각 효소들을 코딩하는 유전자는 상기 서열번호 2 또는 4로 기재한 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 효소와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 효소를 코딩하는 유전자 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에서 용어, "내재적 활성"은 미생물이 천연의 상태 또는 해당 효소의 변형 전에 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미한다.

상기 "효소의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것"은 본래 미생물이 천연의 상태 또는 변형 전의 상태에서 가지고 있는 효소의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 감소된 것을 의미한다. 상기 약화는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다.

상기 "불활성화"는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다.

이러한 효소 활성의 약화 또는 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 효소의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 효소로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다.

상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 구체적으로는 1 내지 100개, 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기에서 "상동 재조합(homologous recombination)"이란, 서로 상동성을 지닌 유전자 사슬의 좌위에서 연결 교환을 통해 일어나는 유전자 재조합을 의미한다.

구체적으로, 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성이 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는, 상기 활성의 약화 또는 불활성화는 상기 6-포스포글루코네이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제를 코딩하는 유전자 내로, 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈 또는 상이 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition) 또는 전환(transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 방법을 통해 수행할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 상기 에스케리키아속(Escherichia) 미생물은 구체적으로 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

구체적으로 본 발명에서 상기 edd 및 eda의 활성의 약화 또는 불활성화에 의하여 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물의 모균주는 트립토판 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다. 트립토판 생산능을 가지는 미생물은, 그 예로, 트립토판 생합성 경로를 강화하기 위하여, 경쟁경로의 유전자, 트립토판 오페론의 방향성 경로의 조절자, 트립토판 유입유전자, 트립토판 유입 및 분해 유전자의 활성의 약화 또는 불활성화 시키거나, 및/또는 트립토판 오페론의 활성을 과발현시킨 미생물일 수 있다. 상기 활성의 약화 또는 불활성화 방법은 상기에서 설명한 바와 같으며, 공지의 방법은 제한 없이 포함된다. 또한, 트립토판 오페론 활성의 과발현은 공지의 방법은 제한없이 포함되나, 그 예로 오페론 유전자의 염기서열 일부 또는 전부 그 자체 혹은 외부로부터 도입된 발현조절부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 염색체에 삽입하는 방법, 벡터 시스템에 도입하는 방법에 의하여 카피수를 증가시키는 방법, 유전자의 발현을 조절하는 발현조절부위를 다른 조절서열로 치환, 발현조절부위의 염기서열 전체 혹은 일부 돌연변이가 유발된 변형, 유전자 자체의 변이도입에 의한 오페론 활성 강화 등에 의한 방법 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는 pheA, trpR, mtr 및 tnaAB 유전자의 전체 또는 일부가 결실, 및/또는 트립토판 오페론이 과발현된 대장균일 수 있다.

본 발명에서, edd, eda, pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자 및 트립토판 오페론 및 이들이 코딩하는 단백질 서열을 비롯하여, 본 발명에서 사용되는 유전자 및 단백질 서열들은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, pheA, trpR, mtr 및 tnaAB 유전자에 대한 구체적인 내용은 한국 특허등록 제10-0792095호에 기재되어 있는 내용을 참고할 수 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로서 포함될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예들에 비추어, 다양한 모균주에서 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 불활성화시킨 결과, Entner-Doudoroff 경로를 갖고 있는 에스케리키아속 미생물이라면 모균주의 종류에 상관없이 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 함께 약화시키거나 불활성화시키는 경우에는 L-트립토판의 생산능이 유의적으로 향상되는 것으로 확인되었다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 내재적 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성이 약화 또는 불활성화되어, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 미생물의 배양 단계에 따른 배양물 또는 상기 미생물로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 에스케리키아속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

본 발명에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알코올; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

본 발명에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.

배양물의 온도는 구체적으로는 27℃ 내지 40℃보다 구체적으로는 30℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 L-트립토판을 회수하는 단계는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-트립토판을 회수할 수 있다.

상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.

본 발명은 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 약화 또는 불활성화시킴으로써 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물을 제공하여, 이를 이용해 L-트립토판을 보다 고수율로 효율적이고 경제적으로 제조할 수 있는 효과를 나타낸다.

이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

비교예 1: Δ pheA Δ trpR Δ mtr Δ tnaAB / pCL1920 - Ptrc - trpO 인 모균주의 제작

(1) pheA , trpR , mtr 및 tnaAB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성화된 야생형 균주의 제작

모균주의 트립토판 생합성경로를 강화하기 위해 경쟁경로의 유전자인 pheA, 트립토판 오페론과 방향성 경로의 조절자인 trpR, 트립토판 유입유전자인 mtr, 트립토판 유입 및 분해유전자인 tnaA 및 tnaB 를 모두 불활성화시켜 본 발명의 트립토판 생산능을 더욱 더 잘 확인할 수 있도록 하였다. 대장균 W3110 (ATCC^®39936^TM)에서 pheA 유전자에 의해 코딩되는 chorismate mutase/prephenate hydratase; trpR 유전자에 의해 코딩되는 trpR transcriptional repressor; mtr 유전자에 의해 코딩되는 tryptophan/Indole:H+ symporter; tnaA 및 tnaB 유전자에 의해 코딩되는 오페론 형태의 tryptophanase 및 trpytpophan:H+symporter를 유전자 상동 재조합에 의하여 모두 불활성화시켰다. 이를 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합 효소(lambda Red recombinase)를 이용한 1단계 불활성화(one step inactivation) 방법을 사용하였으며(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA, 2000, Jun 6;97(12):6640-5), 대한민국등록특허 제10-0792095호에 기반하여 불활성화를 진행하였다. 본 비교예 1을 포함하여, 후술하는 비교예 2 및 실시예 1, 3에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 3에 나타내었다.

구체적으로, 서열번호 6의 서열을 갖는 pheA 유전자의 일부분과 pKD3 유전자의 클로람페니콜(Chloramphenicol) 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 프라이머 1 및 2를 이용하여 pKD3를 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 1,100 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 그 다음, 상기 PCR 증폭을 통하여 얻어진 DNA 단편을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 그 다음, 대장균 pheA 유전자의 5' 및 3' DNA 단편을 얻기 위하여, 프라이머 3과 4, 프라이머 5와 6을 이용하여 대장균 W3110의 염색체를 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 250 쌍의 유전자 단편을 각각 증폭하였다. 그 다음, 상기 PCR 증폭을 통하여 얻어진 DNA 단편을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다.

상기에서, 프라이머 1과 4의 18쌍의 염기서열이 상보적이며, 프라이머 2와 5의 20 쌍의 염기서열이 상보적이기 때문에, 프라이머 1과 2를 이용하여 얻어진 단편, 프라이머 3과 4로 얻어진 단편, 프라이머 5와 6으로 얻어진 단편들은 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 상기 얻어진 PCR 단편들을 프라이머 없이 5회 PCR법으로 증폭한 다음, 프라이머 3과 6를 첨가한 후 다시 25회 PCR법으로 증폭하였다. 그 결과 약 1,600 염기쌍 크기의 유전자 단편이 증폭되었다.

그 다음, Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46으로 형질 전환된 대장균 W3110을 컴피턴트 세포로 제작한 후, PCR로 얻어진 1,600 염기쌍 크기의 유전자 단편을 유입하여 클로람페니콜이 함유된(30 ㎎/L) LB 고체 배지에 도말하였다. 얻어진 균주는 다시 프라이머 3과 6을 이용한 PCR법으로 얻어진 크기가 1,600 염기쌍으로 pheA가 불활성화되었다는 것을 확인하고, W3110 ΔpheA 균주를 제작하였다.

위와 같은 방법으로 서열번호 8의 서열을 갖는 trpR, 서열번호 10의 서열을 갖는 mtr, 서열번호 12와 14의 서열을 갖는 tnaAB 유전자들에 의해 코딩되는 단백질들을 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 불활성화시켜, W3110 ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB 균주를 제작하였다.

(2) 트립토판 생산능을 나타내는 유전자들이 도입된 벡터의 제작

상기 제조된 W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB 야생형 균주에 트립토판 생산능을 부여하기 위하여 pCL1920 벡터에 Ptrc 프로모터 및 트립토판 오페론 유전자를 삽입하여 재조합 벡터 pCL1920-Ptrc-trpO를 제작하였다.

구체적으로는, Ptrc 프로모터를 pCL1920 벡터로 삽입하기 위하여 pCL1920의 플라스미드를 회수하여 제한효소 HindⅢ 및 PstI로 처리하여 준비하고, Ptrc 프로모터는 pTrcHis B (invitrogen, USA) 벡터를 주형으로 하고, 프라이머 23과 24를 이용해 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 중합하는 조건을 30회 반복하는 PCR법에 의해 준비하였다. 상기 준비된 Ptrc 프로모터 단편은 제한효소 HindⅢ 및 PstI로 절단한 후, pCL1920과 라이게이션하여 pCL1920-Ptrc 벡터를 제작하였다.

그 다음, pCL1920_Ptrc_trpO 벡터를 제작하기 위하여 pCL1920_Ptrc 벡터는 PstI 및 알칼리 포스파타아제(Alkaline phosphatase) 처리하여 준비하였고, 트립토판 오페론 유전자는 대장균 KCCM10812P(대한민국등록특허 제10-0792095호)의 염색체 DNA로부터 증폭하였다. 해당 오페론 유전자의 첫 번째 유전자인 trpE 유전자는 피드백 저항성 형태를 갖는다. 증폭을 위하여 대장균 KCCM10812P의 염색체 DNA를 주형으로 프라이머 25와 26을 이용해 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 5분간 중합하는 조건을 30회 반복하는 PCR법을 수행하였다. 상기 얻어진 DNA 단편은 PstI로 처리하여 준비된 pCL1920_Ptrc 벡터와 라이게이션하였고, 그 결과 얻어진 벡터를 pCL1920_Ptrc_trpO(서열번호 15)로 명명하였다.

(3) 트립토판 오페론을 포함하는 벡터가 삽입된 균주의 제작

비교예 1의 (1)에서 제작된 균주를 컴피턴트 세포로 제작한 후, 비교예1의 (2)에서 만든 벡터를 도입하여 트립토판 생산능을 가지는 W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO 야생형 균주를 제작하였다.

실시예 1: 비교예 1의 모균주로부터 Δ edd Δ eda 인 균주의 제작

상기 비교예 1에서 제작된 W3110 ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO 야생형 균주에 있어서, edd 및 eda 유전자군을 상동 재조합에 의하여 동시에 결실시킴으로써 edd(서열번호 2) 및 eda 유전자(서열번호 4)에 의해 코딩되는 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트가 모두 불활성화된 균주를 제작하였다.

구체적으로, 상기 균주를 제작하기 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합 효소를 이용한 돌연변이 제작 기법인 1단계 불활성화 방법을 사용하였다. 유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 마커로는 pUCprmfmloxC의 클로람페니콜 유전자를 사용하였다(대한민국공개특허 2009-007554). 상기 edd-eda 유전자군의 일부분과 pUCprmfmloxC 유전자의 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 프라이머 27과 프라이머 28을 이용하여 pUCprmfmloxC를 주형으로 하고 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 중합하는 조건을 30회 반복하는 PCR법에 의해 약 1,200쌍의 유전자 단편을 증폭하였다.

또한, PCR 증폭을 통하여 얻어진 DNA 단편은 0.8% agarose겔 전기영동 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 1차 DNA 단편의 5' 및 3' 영역의 20쌍의 상보적 염기서열을 갖도록 하였고, edd-eda 유전자군의 5' 및 3' 영역을 더한 프라이머 29과 프라이머 30을 이용하여 용리된 1차 PCR 산물을 주형으로 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 중합하는 조건을 30회 반복하는 PCR법에 의해 약 1,300쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 상기 과정을 거쳐 얻어진 DNA단편은 0.8% 아가로스 겔 전기영동 후 용리하여 재조합에 사용하였다.

Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46으로 형질 전환된 대상 대장균을 컴피턴트한 상태로 제조 후, PCR법으로 얻어진 1,300 염기쌍 크기의 유전자 단편을 유입하여 형질전환시켰다. 얻어진 균주는 클로람페니콜 내성을 갖는 LB에서 선별하였으며, 다시 프라이머 31과 프라이머 32를 이용한 PCR로 얻어진 크기가 1,626 염기쌍으로 edd-eda 유전자군이 결실되었다는 것을 확인하였다.

클로람페니콜 내성을 가진 1차 재조합 균주는 pKD46을 제거한 후, pJW168을 도입하여 클로람페니콜 마커 유전자를 균체로부터 제거하였다(Gene, (2000) 247, 255-64). 최종적으로 얻어진 균체는 프라이머 31과 32로 PCR을 통해 얻어진 580쌍의 증폭 산물로 의도한 대로 결실이 이루어졌음을 확인하였다. 그리고 이 균주를 컴피턴트한 상태로 제조 후, 비교예 1에서 제작된 벡터를 유입하여 형질전환시켜 트립토판 생산능을 가지는 균주 W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaABΔeddΔeda/pCL1920-Ptrc-trpO을 제작하였다.

실시예 2: Δ edd Δ eda 균주의 트립토판 생산능 확인

상기 비교예 1 및 실시예 1에서 제작된 균주를 이용하여 역가 평가를 진행하였다. 역가 평가를 위하여 균체를 백금이로 접종한 후, LB 고체 배지에서 밤새 배양하고, 하기 표 1의 조성을 갖는 25 ㎖의 플라스크 역가 배지에 한 백금이 씩 접종하였다. 균주 접종 후 37℃, 200 rpm에서 42시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 모든 결과는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

조성물	농도(리터당)
글루코스	30 g
K₂HPO₄	1 g
(NH₄)₂SO₄	10 g
NaCl	1 g
MgSO₄ㆍ7H₂O	1 g
구연산나트륨	5 g
효모액기스	2 g
탄산칼슘	40 g
구연산나트륨	5 g
페닐알라닌	0.15 g
타이로신	0.1 g
pH	6.8 g

균주	OD	소모당 (g/L)*	L-트립토판 (g/L)**
W3110ΔpheAΔtrpRΔmtr ΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO	30.1	24.7	0.78
실시예 1 (W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaABΔeddΔeda/pCL1920-Ptrc-trpO)	29.5	25.1	1.03

* 22시간 측정치

** 42시간 측정치

상기 실험 결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이 본 발명에서 제시한 edd-eda 유전자군의 결실시, 당 소모 속도는 모균주인 비교예 1과 유의차가 없었으나, 트립토판 생산량은 모균주 대비 약 32% 이상 향상된 것으로 확인되었다. 이 결과는 Enter Doudoroff 경로의 결실에 의해 기질인 6-포스포글루코네이트의 손실없이 루불로오스 5-포스페이트(Rubulose 5-phosphate)까지 반응이 이루어졌기 때문에 NADPH는 물론, PRPP (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate) 및 E4P (Erythrose 4-phosphate)의 양이 증가하여 결과적으로 트립토판 생산능력이 증가된 것으로 여겨진다.

실시예 3: 기탁된 모균주로부터 Δ edd Δ eda 인 균주의 제작

한국미생물보존센터에 기탁된 L-트립토판 생산 대장균 KCCM11166P(대한민국등록특허 제10-1261147호)를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하여, edd-eda 유전자군이 결실된 KCCM11166PΔeddΔeda 균주를 제작하였다.

유전자	프라이머 번호	서열 (5'→3')	서열번호
pheA	1	AGGCAACACTATGACATCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	16
	2	GGTCGCCATTAACAACGTGGCATATGAATATCCTCCTTAG	17
	3	TATTGAGTGTATCGCCAAC	18
	4	CGATGTCATAGTGTTGCC	19
	5	CCACGTTGTTAATGGCGACC	20
	6	TTCATTGAACGGGTGATTTC	21
trpR	7	TCCGCACGTTTATGATATGCTATCGTACTCTTTAGCGAGTACAACCGGGGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	22
	8	GCCACGTCTTATCAGGCCTACAAAATCAATCGCTTTTCAGCAACACCTCTCATATGAATATCCTCCTTAG	23
	9	GCGCCGGGCGTATCGACGCA	24
	10	GCATATCATAAACGTGCGGA	25
	11	TGTAGGCCTGATAAGACGTG	26
	12	AAGGGGCGATCGGCGTGTTT	27
mtr	13	ATGGCAACACTAACCACCACCCAAACGTCACCGTCGCTGCTTGGCGGCGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	28
	14	TTACTGATACACCGGCAGTAAATTAAAGCTCGATAAAATATGCACCAGTGCATATGAATATCCTCCTTAG	29
	15	GCAGCCGTTACATTGGTAAC	30
	16	GTGGTGGTTAGTGTTGCCAT	31
	17	TACTGCCGGTGTATCAGTAA	32
	18	TCAAACCGTCAGCACGGCTG	33
tnaAB	19	ATGAAGGATTATGTAATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAACCGTTCCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	34
	20	TTAGCCAAATTTAGGTAACACGTTAAAGACGTTGCCGAACCAGCACAAAACATATGAATATCCTCCTTAG	35
	21	TTAAGCGAAATCACCGGGGAA	36
	22	ATGTCCGAGCACTGGCGC	37
pCL1920-Ptrc-trpO	23	CCCAAGCTTGCTGTTGACAATTAATCAT	38
	24	AAAACTGCAGCTGTTTCCTGTGTGAAAT	39
	25	AAAACTGCAGATGCAAACACAAAAACCGACT	40
	26	AAAACTGCAGTTAACTGCGCGTCGCCGCTTTC	41
Edd-eda	27	AAACGCGTTGTGAATCATCCTGCTCTGACAACTCAATTTCAGGAGCCTTTGCCGCCAGCTGAAGCTTTAC	42
	28	ACAGCACGCTTTTCAGCGCCAGGTAGTCACGGTAGTTAGCCGGAGAAATATAGTGGATCTGATGGGTACC	43
	29	TGCCCTATGAGCTCCGGTTACAGGCGTTTCAGTCATAAATCCTCTGAATGAAACGCGTTGTGAATCATCC	44
	30	ATCGCCCGCTTCCAGCGCATCTGCCGGAACCAGCCAGGAACCACCGATGCACAGCACGCTTTTCAGCGCC	45
	31	CATGATCTTGCGCAGATTGTA	46
	32	CATGATCTTGCGCAGATTGTA	47

실시예 4: Δ edd Δ eda 균주의 트립토판 생산능 확인

상기 기탁균주 KCCM11166P 및 실시예 3에서 제작된 균주를 이용하여 역가 평가를 진행하였다.

역가 평가를 위하여 균체를 백금이로 접종한 후, LB 고체 배지에서 밤새 배양하고, 하기 표 4의 조성을 갖는 25 ㎖의 플라스크 역가 배지에 한 백금이 씩 접종하였다. 균주 접종 후 37℃, 200 rpm에서 42시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 모든 결과는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

조성물	농도(리터당)
글루코스	60 g
K₂HPO₄	1 g
(NH₄)₂SO₄	10 g
NaCl	1 g
MgSO₄ㆍ7H₂O	1 g
구연산나트륨	5 g
효모액기스	2 g
탄산칼슘	40 g
구연산나트륨	5 g
페닐알라닌	0.15 g
타이로신	0.1 g
pH	6.8 g

균주	OD	소모당 (g/L)*	L-트립토판 (g/L)**
KCCM11166P	22.9	31.0	5.7
KCCM11166PΔeddΔeda	23.6	30.7	6.9

* 33시간 측정치

** 48간 측정치

상기 실험 결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이 본 발명에서 제시한 edd-eda 유전자군의 결실시, 당 소모 속도는 모균주와 유의한 차이가 없었으나, 트립토판 생산량은 모균주 대비 약 21% 이상 향상된 것으로 확인되었다. 이 결과는 상기 실시예 2에서 언급한 것과 같은 이유로 트립토판 생산능력이 증가된 것이라고 할 수 있다.

본 발명자들은 KCCM11166P 균주 기반, edd-eda 유전자군의 불활성화 균주에서 트립토판 생산능력이 증가함을 확인하고, 상기 균주를 "CA04-2800"으로 명명한 후 부다페스트 조약 하에 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2013년 11월 15일에 기탁하여 수탁번호 KCCM11473P를 부여받았다.

상기와 같은 결과들은 Entner-Doudoroff 경로를 갖고 있는 에스케리키아속 미생물에 있어서, edd-eda 활성을 동시에 불활성화시킬 경우, 불활성화시키지 않은 미생물에 비해 트립토판 생산능이 증가되는 것을 시사하는 것이다.

본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11473P

20131115

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A MICROORGANISM OF ESCHERICHIA GENUS HAVING L-TRYPTOPHAN PRODUCING ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING L-TRYPTOPHAN USING THE SAME <130> PA131256/KR <160> 47 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 603 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(603) <223> edd <400> 1 Met Asn Pro Gln Leu Leu Arg Val Thr Asn Arg Ile Ile Glu Arg Ser 1 5 10 15 Arg Glu Thr Arg Ser Ala Tyr Leu Ala Arg Ile Glu Gln Ala Lys Thr 20 25 30 Ser Thr Val His Arg Ser Gln Leu Ala Cys Gly Asn Leu Ala His Gly 35 40 45 Phe Ala Ala Cys Gln Pro Glu Asp Lys Ala Ser Leu Lys Ser Met Leu 50 55 60 Arg Asn Asn Ile Ala Ile Ile Thr Ser Tyr Asn Asp Met Leu Ser Ala 65 70 75 80 His Gln Pro Tyr Glu His Tyr Pro Glu Ile Ile Arg Lys Ala Leu His 85 90 95 Glu Ala Asn Ala Val Gly Gln Val Ala Gly Gly Val Pro Ala Met Cys 100 105 110 Asp Gly Val Thr Gln Gly Gln Asp Gly Met Glu Leu Ser Leu Leu Ser 115 120 125 Arg Glu Val Ile Ala Met Ser Ala Ala Val Gly Leu Ser His Asn Met 130 135 140 Phe Asp Gly Ala Leu Phe Leu Gly Val Cys Asp Lys Ile Val Pro Gly 145 150 155 160 Leu Thr Met Ala Ala Leu Ser Phe Gly His Leu Pro Ala Val Phe Val 165 170 175 Pro Ser Gly Pro Met Ala Ser Gly Leu Pro Asn Lys Glu Lys Val Arg 180 185 190 Ile Arg Gln Leu Tyr Ala Glu Gly Lys Val Asp Arg Met Ala Leu Leu 195 200 205 Glu Ser Glu Ala Ala Ser Tyr His Ala Pro Gly Thr Cys Thr Phe Tyr 210 215 220 Gly Thr Ala Asn Thr Asn Gln Met Val Val Glu Phe Met Gly Met Gln 225 230 235 240 Leu Pro Gly Ser Ser Phe Val His Pro Asp Ser Pro Leu Arg Asp Ala 245 250 255 Leu Thr Ala Ala Ala Ala Arg Gln Val Thr Arg Met Thr Gly Asn Gly 260 265 270 Asn Glu Trp Met Pro Ile Gly Lys Met Ile Asp Glu Lys Val Val Val 275 280 285 Asn Gly Ile Val Ala Leu Leu Ala Thr Gly Gly Ser Thr Asn His Thr 290 295 300 Met His Leu Val Ala Met Ala Arg Ala Ala Gly Ile Gln Ile Asn Trp 305 310 315 320 Asp Asp Phe Ser Asp Leu Ser Asp Val Val Pro Leu Met Ala Arg Leu 325 330 335 Tyr Pro Asn Gly Pro Ala Asp Ile Asn His Phe Gln Ala Ala Gly Gly 340 345 350 Val Pro Val Leu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Leu Leu His Glu 355 360 365 Asp Val Asn Thr Val Ala Gly Phe Gly Leu Ser Arg Tyr Thr Leu Glu 370 375 380 Pro Trp Leu Asn Asn Gly Glu Leu Asp Trp Arg Glu Gly Ala Glu Lys 385 390 395 400 Ser Leu Asp Ser Asn Val Ile Ala Ser Phe Glu Gln Pro Phe Ser His 405 410 415 His Gly Gly Thr Lys Val Leu Ser Gly Asn Leu Gly Arg Ala Val Met 420 425 430 Lys Thr Ser Ala Val Pro Val Glu Asn Gln Val Ile Glu Ala Pro Ala 435 440 445 Val Val Phe Glu Ser Gln His Asp Val Met Pro Ala Phe Glu Ala Gly 450 455 460 Leu Leu Asp Arg Asp Cys Val Val Val Val Arg His Gln Gly Pro Lys 465 470 475 480 Ala Asn Gly Met Pro Glu Leu His Lys Leu Met Pro Pro Leu Gly Val 485 490 495 Leu Leu Asp Arg Cys Phe Lys Ile Ala Leu Val Thr Asp Gly Arg Leu 500 505 510 Ser Gly Ala Ser Gly Lys Val Pro Ser Ala Ile His Val Thr Pro Glu 515 520 525 Ala Tyr Asp Gly Gly Leu Leu Ala Lys Val Arg Asp Gly Asp Ile Ile 530 535 540 Arg Val Asn Gly Gln Thr Gly Glu Leu Thr Leu Leu Val Asp Glu Ala 545 550 555 560 Glu Leu Ala Ala Arg Glu Pro His Ile Pro Asp Leu Ser Ala Ser Arg 565 570 575 Val Gly Thr Gly Arg Glu Leu Phe Ser Ala Leu Arg Glu Lys Leu Ser 580 585 590 Gly Ala Glu Gln Gly Ala Thr Cys Ile Thr Phe 595 600 <210> 2 <211> 1812 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1812) <223> edd <400> 2 atgaatccac aattgttacg cgtaacaaat cgaatcattg aacgttcgcg cgagactcgc 60 tctgcttatc tcgcccggat agaacaagcg aaaacttcga ccgttcatcg ttcgcagttg 120 gcatgcggta acctggcaca cggtttcgct gcctgccagc cagaagacaa agcctctttg 180 aaaagcatgt tgcgtaacaa tatcgccatc atcacctcct ataacgacat gctctccgcg 240 caccagcctt atgaacacta tccagaaatc attcgtaaag ccctgcatga agcgaatgcg 300 gttggtcagg ttgcgggcgg tgttccggcg atgtgtgatg gtgtcaccca ggggcaggat 360 ggaatggaat tgtcgctgct aagccgcgaa gtgatagcga tgtctgcggc ggtggggctg 420 tcccataaca tgtttgatgg tgctctgttc ctcggtgtgt gcgacaagat tgtcccgggt 480 ctgacgatgg cagccctgtc gtttggtcat ttgcctgcgg tgtttgtgcc gtctggaccg 540 atggcaagcg gtttgccaaa taaagaaaaa gtgcgtattc gccagcttta tgccgaaggt 600 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tgtaaattcc gctagacctt tgtgtgtttt ttttgtttat attcaagtgg 10620 ttataattta tagaataaag aaagaataaa aaaagataaa aagaatagat cccagccctg 10680 tgtataactc actactttag tcagttccgc agtattacaa aaggatgtcg caaacgctgt 10740 ttgctcctct acaaaacaga ccttaaaacc ctaaaggctt aagtagcacc ctcgcaagct 10800 cgggcaaatc gctgaatatt ccttttgtct ccgaccatca ggcacctgag tcgctgtctt 10860 tttcgtgaca ttcagttcgc tgcgctcacg gctctggcag tgaatggggg taaatggcac 10920 tacaggcgcc ttttatggat tcatgcaagg aaactaccca taatacaaga aaagcccgtc 10980 acgggcttct cagggcgttt tatggcgggt ctgctatgtg gtgctatctg actttttgct 11040 gttcagcagt tcctgccctc tgattttcca gtctgaccac ttcggattat cccgtgacag 11100 gtcattcaga ctggctaatg cacccagtaa ggcagcggta tcatcaacag gctta 11155 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 16 aggcaacact atgacatcgt gtaggctgga gctgcttc 38 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 17 ggtcgccatt aacaacgtgg catatgaata tcctccttag 40 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 <400> 18 tattgagtgt atcgccaac 19 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 <400> 19 cgatgtcata gtgttgcc 18 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 <400> 20 ccacgttgtt aatggcgacc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 <400> 21 ttcattgaac gggtgatttc 20 <210> 22 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7 <400> 22 tccgcacgtt tatgatatgc tatcgtactc tttagcgagt acaaccgggg gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 23 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 8 <400> 23 gccacgtctt atcaggccta caaaatcaat cgcttttcag caacacctct catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 9 <400> 24 gcgccgggcg tatcgacgca 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 10 <400> 25 gcatatcata aacgtgcgga 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 11 <400> 26 tgtaggcctg ataagacgtg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 12 <400> 27 aaggggcgat cggcgtgttt 20 <210> 28 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 13 <400> 28 atggcaacac taaccaccac ccaaacgtca ccgtcgctgc ttggcggcgt gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 29 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 14 <400> 29 ttactgatac accggcagta aattaaagct cgataaaata tgcaccagtg catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 15 <400> 30 gcagccgtta cattggtaac 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 16 <400> 31 gtggtggtta gtgttgccat 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 17 <400> 32 tactgccggt gtatcagtaa 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 18 <400> 33 tcaaaccgtc agcacggctg 20 <210> 34 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 19 <400> 34 atgaaggatt atgtaatgga aaactttaaa catctccctg aaccgttccg gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 35 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 20 <400> 35 ttagccaaat ttaggtaaca cgttaaagac gttgccgaac cagcacaaaa catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 21 <400> 36 ttaagcgaaa tcaccgggga a 21 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 22 <400> 37 atgtccgagc actggcgc 18 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 23 <400> 38 cccaagcttg ctgttgacaa ttaatcat 28 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 24 <400> 39 aaaactgcag ctgtttcctg tgtgaaat 28 <210> 40 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 25 <400> 40 aaaactgcag atgcaaacac aaaaaccgac t 31 <210> 41 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 26 <400> 41 aaaactgcag ttaactgcgc gtcgccgctt tc 32 <210> 42 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 27 <400> 42 aaacgcgttg tgaatcatcc tgctctgaca actcaatttc aggagccttt gccgccagct 60 gaagctttac 70 <210> 43 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 28 <400> 43 acagcacgct tttcagcgcc aggtagtcac ggtagttagc cggagaaata tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 44 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 29 <400> 44 tgccctatga gctccggtta caggcgtttc agtcataaat cctctgaatg aaacgcgttg 60 tgaatcatcc 70 <210> 45 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 30 <400> 45 atcgcccgct tccagcgcat ctgccggaac cagccaggaa ccaccgatgc acagcacgct 60 tttcagcgcc 70 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 31 <400> 46 catgatcttg cgcagattgt a 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 32 <400> 47 catgatcttg cgcagattgt a 21

Claims

내재적 6-포스포글루코네이트 탈수소효소(6-phosphogluconate dehydratase; edd) 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제(2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase; eda)의 활성이 약화 또는 불활성화되는, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물.
제1항에 있어서, 상기 6-포스포글루코네이트 탈수소효소는 서열번호 1의 아미노산 서열인, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제는 서열번호 3의 아미노산 서열인, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 에스케리키아속 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것인, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물.
제1항에 있어서, 추가로 pheA, trpR, mtr 및 tnaAB 유전자의 전체 또는 일부가 결실된, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 에스케리키아속 미생물을 배양하는 단계, 및
상기 배양에 따른 배양물 또는 상기 미생물로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 제조 방법.