BR112014016751A2

BR112014016751A2 - microrganismo capaz de produzir l-aminoácido, e um método para a produção de l-aminoácido, usando o mesmo

Info

Publication number: BR112014016751A2
Application number: BR112014016751-6A
Authority: BR
Inventors: Ki Yong Cheong; Seok Myung Lee; Young Bin Hwang; Keun Cheol LEE; Kwang Ho Lee
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2013-01-07
Publication date: 2020-11-03
Also published as: MY188383A; EP2801611B1; EP2801611A4; HUE049168T2; CN104185679A; ES2796799T3; US20150050703A1; BR112014016751B1; DK2801611T3; KR101327093B1; JP2017042167A; CN105695381B; CA2860616C; WO2013103268A2; PH12014501556B1; CN105695381A; CN105695382A; RU2600875C2; CA2860616A1; US20170198317A1

Abstract

MICRORGANISMO CAPAZ DE PRODUZIR L-AMINOÁCIDO, E UM MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE L-AMINOÁCIDO, USANDO O MESMO. A presente invenção refere-se a um microrganismo capaz de produzir a L-treonina ou L-triptofano, e a um método para a produção de L-treonina ou L-triptofano, usando o mesmo. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a: Escherichia coli recombinante que é mais eficiente na produção de L-treonina ou L-triptofano, aumentando a capacidade de produzir ATP que é utilizada como a fonte de energia mais abundante em células quando produzindo de L-treonina ou L-triptofano; e um método para a produção de L-treonina ou L-triptofano, usando o mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MI- CRORGANISMO CAPAZ DE PRODUZIR L-AMINOÁCIDO, E UM MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE L-AMINOÁCIDO, USANDO O MESMO". Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se a um microrganismo capaz de produzir a L-treonina ou L-triptofano e a um método para a produ- ção de L-treonina ou L-triptofano, usando o mesmo. Antecedentes da Técnica

[002] Sabe-se que os microrganismos que produzem produtos úteis por meio de fermentação requerem grandes quantidades de e- nergia, tais como ATP, quando a via biossintética é reforçada.

[003] Como é conhecido na técnica, é muito importante que o equilíbrio intracelular entre dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NAD (H)), que é produzido por meio das reações catabólicas e fosfato dinucleotídeo de nicotinamida adenina NADP (H) que é utilizado em reações anabólicas em processos metabólicos microbianos . NAD (H) é um intermediário nas reações catabólicas que geram ATP por meio da oxidação de alimentos e funciona como uma fonte de energia. E NADP (H) desempenha um papel no fornecimento de um poder redu- tor no processo metabólico in vivo, que está a fornecer os elétrons de alta energia, necessários para sintetizar as moléculas por meio da rea- ção com as enzimas que catalisam um modo geral as reações anabó- licas. O equilíbrio entre os mesmos é regulado quer por meio da fosfo- rilação de NAD como mostrado na seguinte equação 1) ou por meio da desfosforilação de NADP como mostrado na seguinte equação 2). Equação 1) NAD + + ATP ⇔ NADP + + ADP Equação 2) NADP + ⇔ NAD + + fosfato

[004] Dessa maneira, a fim de produzir de forma eficaz a redução da potência, tais como NADPH, uma fonte de fosfato, como o ATP de- ve ser aumentada em conjunto.

[005] ATP (adenosina-5'-trifosfato) tem uma ligação de fosfato de alta energia, e gera energia quando é hidrolisado em ADP e fosfato. ATP é produzido principalmente por meio da fosforilação quimiosmóti- ca através do sistema de transporte de elétrons em microrganismos ou por meio do nível de substrato de fosforilação. O ATP produzido é de- gradado para fornecer a energia necessária para as células e é reutili- zado por meio da regeneração pela via da glicólise ou da fosforilação oxidativa.

[006] Com base neste fato, os estudos têm sido realizados para aplicar processo de regeneração de energia ATP das bactérias para a produção em massa de produtos úteis a fim de facilitar o fornecimento de energia (Biosci Biotechnol Biochem, (1997) 61 : 840 a 845). Em es- tudos sobre a regeneração de ATP, em E. coli, doi observado que o nível de ATP em um microrganismo é de cerca de 150 % maior do que a da cepa-mãe quando alguns genes, incluindo os genes ysaA (NCBI Gene ID: 948085), ydaS (NCBI Gene ID: 945923) e ybiX (NCBI Gene ID: 947502) eram deficientes, respectivamente, e esta descoberta foi aplicada para a produção de glutationa (FEMS Microbiol Lett, (2009) 297 : 217 a 224.). No entanto, não houve relato direto que explica dire- tamente o aumento da produção de aminoácidos causado pelo efeito de atenuação das atividades das proteínas que são codificadas por meio dos genes. Descrição Problema Técnico

[007] Os presentes inventores descobriram que o aumento do nível intracelular de ATP, o que é utilizado como a fonte de energia mais abundante nas células produtoras de ácido L-amino, é eficaz pa-

ra aumentar a produção de L-treonina ou L-triptofano, completando dessa maneira a presente invenção .

[008] Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma cepa de E. coli recombinante, que tem um aumento de produtividade de L- treonina ou L-triptofano, aumentando a produtividade do ATP.

[009] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um mé- todo de produção de L-treonina ou L-triptofano usando a cepa de E. coli recombinante. Solução Técnica

[0010] A fim de alcançar os objetivos acima, uma modalidade da presente invenção proporciona uma cepa de E. coli recombinante, a produção de L-treonina ou L-triptofano, em que a cepa é modificada para atenuar (enfraquecer) a atividade de pelo menos uma proteína selecionada entre o grupo que consiste em uma proteína YsaA tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, um proteína YdaS possuindo uma sequência de aminoácidos repre- sentada por meio daSEQ ID NO: 4, e uma proteína YbiX tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 6 .

[0011] Uma modalidade da presente invenção também fornece um método para a produção de L-treonina ou L-triptofano, o qual compre- ende a cultura da cepa de E. coli recombinante. Efeitos vantajosos

[0012] A presente invenção fornece um microrganismo recombi- nante, cuja a produtividade de L-treonina ou L-triptofano é melhorada através do aumento do nível de ATP intracelular em um microrganismo tendo a produtividade de L-treonina ou L-triptofano. De acordo com a presente invenção, é proporcionado um método para aumentar a pro- dução de L-treonina ou L-triptofano, recuperando o equilíbrio do meta- bolismo de energia para aumentar a atividade celular e reduzir o tem- po de cultura.

Descrição dos Desenhos

[0013] A FIG. 1 mostra o nível de ATP relativa (%) da cepa produ- zindo L-treonina em relação àquela da cepa-mãe.

[0014] A FIG. 2 mostra o nível de ATP relativa (%) da cepa produ- zindo L-triptofano em relação àquela da cepa-mãe. Melhor Modo

[0015] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em de- talhe.

[0016] Uma modalidade da presente invenção proporciona uma cepa de E. coli recombinante, a produção de L-treonina ou L- triptofano, em que a cepa é modificada para atenuar a atividade de, pelo menos, um selecionado do grupo que consiste em uma proteína YsaA tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, uma proteína YdaS possuindo uma sequência de ami- noácidos representada por meio da SEQ ID NO: 4, e uma proteína YbiX tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 6.

[0017] Um microrganismo que produz a L-treonina ou L-triptofano que pode ser utilizado na presente invenção pode ser qualquer micror- ganismo capaz de produzir a L-treonina ou L-triptofano, tais como Bac- téria Escherichia sp. , E. coli, bactéria Coryneform, bactéria Serratia sp., bactéria Providencia sp., ou similares. Especificamente, pode ser utilizado um microrganismo pertencente ao gênero Escherichia.

[0018] Em uma modalidade específica da presente invenção, a cepa de E. coli recombinante CJ600 (CCCM 10812P) (Registro de Pa- tente Coreana N ° 10-0.792.095) tendo a produtivida de de L-triptofano é usada, a qual é obtida por engenharia genética de uma cepa de E. coli recombinante (KFCC 10066) tendo a produtividade L-fenilalanina, de modo a dessensibilizar a auxotrofia de triptofano, bloqueio da bios- síntese de L-fenilalanina e aprimorar os genes relacionados com a bi-

ossíntese de triptofano.

[0019] Em uma outra modalidade específica da presente invenção, a cepa de E. coli recombinante FTR2533 (KCCM-10541) (Registro de Patente Coreana N ° 10-0.576.342) tendo produtivida de L-treonina é usada, a qual é obtida por engenharia genética de uma cepa de E. coli mutante (KFCC 10718) tendo a produtividade L-treonina, de modo a inativar o gene galR de tipo selvagem.

[0020] YsaA, uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, está prevista em uma hidro- genase de componente do tipo 4Fe-4S ferredoxina, mas a sua função exata ainda não foi encontrada.

[0021] YdaS, uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 4, está prevista em uma ligação do regulador da transcrição do DNA, mas a sua função exata ainda não foi encontrada.

[0022] YbiX, uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 6, é uma da superfamília oxi- genase dependente de Fe (II), que funciona como uma oxidorredutase que oxida o substrato usando oxigênio.

[0023] Os polipeptídeos YsaA, YdaS e YbiX da presente invenção têm as sequências de aminoácidos representadas por meio das SEQ ID NOS: 2, 4 e 6, respectivamente, mas não estão limitadas a eles, porque as sequências de aminoácidos das proteínas podem depen- derda espécie ou cepas de microrganismos.

[0024] Em outras palavras, as proteínas da presente invenção po- dem ser mutantes ou variantes artificiais que codificam uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos incluindo uma substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos em um ou mais posições das sequências de aminoácidos representa- das por meio da SEQ ID NO: 2, 4 ou 6, desde que os mutantes ou va-

riantes artificiais posam ser úteis para aumentar a produção de amino- ácidos por meio da atenuação das atividades descritas na presente invenção. Aqui, o número de "vários" aminoácidos difere dependendo da posição ou do tipo de resíduos de aminoácidos na estrutura tridi- mensional da proteína, mas é particularmente 2 a 20, especificamente 2 a 10, e mais especificamente 2 a 5. Além disso, esta substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de aminoácidos também inclui aquelas alterações provocadas por meio de uma mutação de ocorrên- cia natural ou variação artificial baseada na diferença de indivíduos ou de espécies de microrganismos tendo a atividade dos polipeptídeos.

[0025] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "atenua- ção" significa que a atividade de uma proteína é enfraquecida, quer por exclusão de parte ou a totalidade do gene que codifica para a pro- teína, ou através da modificação de uma sequência reguladora de ex- pressão para reduzir a expressão do gene, ou modificando a sequên- cia do gene cromossômico para enfraquecer a atividade da proteína, ou por meio das combinações dos mesmos.

[0026] Na presente invenção, a atenuação da atividade pode ser conseguida por meio de um método selecionado a partir do grupo que consiste em: 1) eliminação de uma parte ou totalidade de um polinu- cleotídeo que codifica a proteína; 2) modificação de uma sequência reguladora da expressão para reduzir a expressão do polinucleotídeo; 3) modificação da sequência cromossômica polinucleotídeo para en- fraquecer a atividade da proteína; e 4) as combinações dos mesmos.

[0027] O método para a supressão de todo ou parte do polinucleo- tídeo que codifica a proteína pode ser realizada por meio da substitui- ção de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo endógena no cromossoma, ou com um polinucleotídeo que uma parte da se- quência de ácido nucleico é suprimido ou um gene marcador, através do cromossoma vetor de inserção.

[0028] Na presente invenção, o termo "uma parte da" sequência de ácido nucleico difere dependendo do tipo de gene, mas é indepen- dente da posição do mesmo, e que é especificamente 1-200, mais es- pecificamente 1-100, e ainda mais especificamente 1-50.

[0029] Além disso, o método da modificação da sequência regula- dora de expressão para reduzir a expressão do polinucleotídeo pode ser realizado tanto através da indução de uma mutação na sequência reguladora da expressão da deleção, inserção, substituição não con- servativa ou conservative , ou combinações dos mesmos, de um ou mais nucleotídeos para atenuar a atividade da sequência reguladora de expressão, ou substituindo a sequência reguladora de expressão com uma atividade mais fraca. A sequência reguladora de expressão inclui um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica um local de ligação ao ribossoma, uma sequência de regula- ção da terminação da transcrição e tradução.

[0030] Além disso, o método da modificação da sequência cro- mossômica polinucleotídeo que codifica a proteína da presente inven- ção pode ser realizada tanto através da indução de uma mutação na sequência pela eliminação, inserção, substituição não conservativa ou conservador, ou combinações dos mesmos, de um ou mais nucleotí- deos para atenuar a atividade da sequência, ou através da substitui- ção da sequência com uma sequência de nucleotídeos modificada possuindo uma atividade mais fraca.

[0031] O polinucleotídeo que codifica a proteína da presente in- venção pode ser introduzido em uma célula hospedeira e pode ser substituído com um códon que dificulta a expressação no hospedeiro. Além disso, o N-terminal ou C-terminal dos mesmos, podem ser es- tendidos ou eliminados, e o códon de iniciação pode ser modificado para regular o nível de expressão.

[0032] Cada um dos polinucleotídeos da presente invenção podem ter uma sequência de polinucleotídeo que codifica para uma proteína com uma homologia de pelo menos 80 %, especialmente pelo menos 90 %, mais especificamente pelo menos 95 %, e ainda mais especifi- camente, pelo menos, 97 % para a sequência de aminoácido de cada uma representada por SEQ ID NOS: 2, 4 e 6, contanto que o polinu- cleotídeo possa atenuar a atividade de proteína da variante. Mais es- pecificamente, os polinucleotídeos têm uma sequência de polinucleotí- deo, representada por meio da SEQ ID NOs: 1, 3 e 5, respectivamen- te.

[0033] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "homolo- gia" refere-se a identidade entre duas sequências de aminoácidos. A homologia pode ser determinada utilizando s métodos bem conheci- dos, por exemplo, o programa de computador BLAST 2.0, que calcula os parâmetros como a pontuação, identidade e similaridade.

[0034] Além disso, as sequências de polinucleotídeos da presente invenção podem ser hibridadas com as sequências polinucleotídicas representadas por meio das SEQ ID NOS: 1, 3 e 5 e as sondas produ- zidas a partir das sequências de nucleotídeos acima descritas, sob condições rigorosas, e podem ser sequências de codificação de prote- ínas modificadas que funcionam normalmente .

[0035] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "condi- ções rigorosas" refere-se a condições que permitam a hibridação es- pecífica entre os polinucleotídeos. Alternativamente, o termo está rela- cionado com polipeptídeos ou proteínas, incluindo os seus derivados (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2ª edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989;. Ou Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque).

[0036] Especificamente, as "condições rigorosas" refere-se a hibri- dização a 65 em tampão de hibridação (3,5 × SSC, 0,02% Ficoll,

0,02 % de polivinilpirrolidona, 0,02% de albumina de soro bovino, NaH2PO42,5 a mM pH 7), 0,5% de SDS , EDTA a 2 mM). SSC é o cloret de sódio a 0.15 M / citrato de sódio a 0,15 M a pH 7. Após a hi- bridação, a membrana para a qual o DNA foi transferido é lavada em 2 x SSC à temperatura ambiente e, em seguida, em 0,1 a 0,5 × SSC /

0.1 × SDS a 68 °C.

[0037] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "vetor" refere-se a um constructo de DNA contendo a sequência de nucleotí- deos de um gene que codifica a proteína-alvo operativamente ligado a uma sequência reguladora adequada de modo a ser capaz de expres- sar o gene-alvo em uma célula hospedeira adequada. A sequência re- guladora inclui um promotor capaz de iniciar a transcrição, um opera- dor para regular esta transcrição, uma sequência que codifica para um local de ligação ao ribossoma mRNA adequado, e uma sequência de regulação da terminação da transcrição e tradução. Uma vez transfor- mado em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar e funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode, em alguns casos, integrar-se no próprio genoma.

[0038] O vetor, que é utilizado na presente invenção não está es- pecificamente limitado e pode ser qualquer vetor conhecido na técnica, desde que possa replicar em um hospedeiro. Exemplos dos vetores vulgarmente utilizados podem incluir os plasmídeos naturais ou re- combinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, os veto- res fago ou vetores de cosmídeo incluem pWE15, M13, λBL3, λBL4, λXII, λSHII, λPII, λ10, λ11, Charon4A e Charon21A, e os vetores de plasmídeos incluem pBR da PUC, pBluescriptII, pGEM, PTZ , p- CL1920 e plasmídeos do tipo pET. Os vetores que podem ser utiliza- dos não são particularmente limitados, e quaisquer vetores de expres- são conhecidos podem ser utilizados. Especificamente, podem ser uti- lizados os vetores pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117,

pUC19, pBR322, ou pMW118 pCC1BAC. Mais especificamente, po- dem ser usados os vetores pACYC177, pCL1920 e pCC1BAC.

[0039] Além disso, o vetor, que é utilizado na presente invenção é um vetor capaz de transformar as células hospedeiras, para inserir o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo no cromossoma da célula hospedeira. Os exemplos específicos do vetor incluem, mas não estão limitados a, o vetor de troca que pode pECCG112 autorreplicar em ambos os sentidos, em E. coli e bactérias do tipo Coryne (Kap-Soo, nô, Kor. Jour. Microbiol. Julho de 1991 P.149-154).

[0040] Além disso, o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo endógena no cromossoma pode ser substituído com um novo polinu- cleotídeo por meio de um vetor para a inserção no cromossoma bacte- riano. A inserção do polinucleotídeo no cromossoma pode ser realiza- da por meio de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, a recombinação homóloga. Uma vez que o vetor da presente invenção pode ser inserido no cromossoma por meio da recombinação homólo- ga, o mesmo pode compreender ainda um marcador de seleção para confirmar a sua inserção no cromossoma. O marcador de seleção é utilizado para selecionar uma célula transformada com o vetor, ou se- ja, confirmar a inserção do polinucleotídeo alvo. O marcador de sele- ção que é utilizado na presente invenção pode ser selecionado a partir de marcadores que proporcionam fenótipos selecionáveis, tais como resistência aos fármacos, auxotrofia, resistência a fármacos citotóxi- cos, ou a expressão da proteína de superfície. Apenas as células que expressam o marcador de seleção são capazes de sobreviver ou mos- trar diferentes fenótipos sob o meio ambiente tratado com o agente selctivo e, dessa maneira, as células transformadas podem ser sele- cionadas.

[0041] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "transfor- mação" significa introduzir um vetor que compreende o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo em uma célula hospedeira, de modo a ser capaz de expressar a proteína codificada por meio do polinucleotídeo na célula hospedeira. Os polinucleotídeos transformados incluem to- dos os genes inseridos no cromossoma da célula hospedeira ou locali- zados fora do cromossoma, desde que possam ser expressos na célu- la hospedeira. Além disso, os polinucleotídeos incluem DNA e RNA, que codificam a proteína alvo. Contanto que o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira e aí expresso, o gene pode ser introduzido em qualquer forma.

[0042] Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na cé- lula hospedeira sob a forma de um cassete de expressão, que é um constructo de polinucleotídeo, incluindo todos os elementos para ex- pressar o gene. O cassete de expressão inclui um promotor que está operativamente ligado ao gene, um sinal de terminação da transcrição, um local de ligação ao ribossoma, e um sinal de terminação da tradu- ção. O cassete de expressão pode ser na forma de um vetor de ex- pressão capaz de autorreplicação. O polinucleotídeo pode também ser introduzido na célula hospedeira, por si só, e estar operativamente li- gado à sequência necessária para a expressão na célula hospedeira.

[0043] Especificamente, a atenuação da atividade da proteína que é codificada pelo gene ysaA, ydaS ou ybiX pode ser alcançada através de deleção do gene. Especificamente, uma mutação no gene pode ser induzida usando os produtos químicos ou a luz, tal como luz UV, ob- tendo-se assim uma variante que tem o gene eliminado. Alternativa- mente, uma variante que falta a atividade da proteína pode ser obtida por meio da substituição do gene cromossômico para o nucleotídeo que falta a atividade de uma técnica de recombinação genética, por meio de um método de gene de substituição através da recombinação homóloga.

[0044] Além disso, uma modalidade da presente invenção também fornece um método para a produção de L-treonina ou L-triptofano, o método compreendendo a cultura de uma cepa produtora de E. coli L- treonina ou L-triptofano recombinante, em que a cepa é modificada para atenuar a atividade de pelo menos, um selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína YsaA tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, um proteína YdaS possuindo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 4, e uma proteína YbiX tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 6.

[0045] O processo de cultura da presente invenção pode ser reali- zado em meios adequados e condições de cultura conhecidos na téc- nica. Este processo de cultura pode ser facilmente modificado por qualquer pessoa que seja versada técnica, dependendo do tipo de ce- pa selecionada. Exemplos do processo de cultura incluem, mas não estão limitados a, cultura em batelada, cultura contínua, e cultura de batelada alimentada.

[0046] Os meios e condições de cultura que são utilizados na cul- tura do microrganismo da presente invenção podem ser tão longos quanto os que são utilizados na cultura de microrganismos pertencen- tes ao gênero Escherichia, mas estes devem satisfazer adequadamen- te os requisitos do microrganismo da presente invenção .

[0047] Em uma modalidade específica da presente invenção, o microrganismo pode ser cultivado em um meio convencional contendo fontes adequadas de carbono, fontes de nitrogênio, aminoácidos, vi- taminas e semelhantes, sob condições aeróbicas, enquanto o ajuste de temperatura, pH e semelhantes.

[0048] As fontes de carbono que podem ser utilizadas na presente invenção incluem os hidratos de carbono, tais como glicose, frutose, sacarose, maltose, manitol, sorbitol; álcoois tais como álcool de açú- car, glicerol, ácido pirúvico, ácido láctico e ácido cítrico; e aminoácidos tais como o ácido orgânico, ácido glutâmico, a metionina e lisina. Além disso, podem ser usadas fontes de nutrientes orgânicos naturais, tais como os hidrolisados de amido, melaços, melaço, farelo de arroz, mandioca, bagaço e maceração de milho. Especificamente, as fontes de nutrientes orgânicos incluem glicose e melaços pré-tratados esté- reis (isto é, melaços convertidos em açúcares reduzidos), e quantida- des adequadas de fontes de carbono podem ser usadas sem qualquer limitação.

[0049] As fontes de nitrogênio que podem ser usadas na presente invenção incluem fontes de nitrogênio inorgânicas, tais como amonía- co, sulfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio; aminoácidos tais como ácido glutâmico, a metionina e glutamina; e fontes orgânicas de nitrogênio, tais como peptona, NZ-amina, extrato de carne, extrato de levedura, extrato de malte, licor de milho, hidrolisado de caseína, fari- nha de peixe, ou o seu produto digerido, bolo de soja desengordurada ou o seu produto digerido, etc Estas fontes de nitrogênio podem ser utilizadas isoladamente ou em combinação. O meio pode conter fosfa- to de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico e sais corres- pondentes contendo sódio, como fonte de fósforo.

[0050] Os compostos inorgânicos que podem ser utilizados na presente invenção incluem cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de ferro, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de manganês e carbonato de cálcio. Além disso, o meio pode conter aminoácidos, vi- taminas e precursores adequados. Estes meios de comunicação ou de precursores podem ser adicionados ao meio de uma batelada ou de modo contínuo.

[0051] Os compostos tais como o hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amoníaco, ácido fosfórico e ácido sulfúrico podem ser a- dicionados ao meio de uma forma adequada durante a cultura para ajustar o pH do meio de cultura.

[0052] Além disso, durante a cultura, um agente anti-espuma tal como o éster poliglicólico de ácidos graxos pode ser utilizado para su- primir a formação de bolhas. Além disso, a fim de manter o meio de cultura em um estado aeróbio, o oxigênio ou gás contendo oxigênio pode ser injetado para o meio de cultura. Além disso, a fim de manter o meio de cultura em um estado anaeróbio ou não aeróbio, nenhum gás é injetado, ou nitrogênio, hidrogênio ou dióxido de carbono gasoso pode ser injetado no meio de cultura. O meio de cultura é normalmente mantido a uma temperatura que varia de 27 °C a 37 ° C e, especifica- mente, a partir de 30 °C a 35 °C. A cultura do mic rorganismo pode ser continuada até que o nível desejado de a substância útil seja obtido. Especificamente, o período de cultura é de 10 a 100 horas.

[0053] O método da presente invenção pode compreender ainda a purificação ou a recuperação do ácido L-aminoácido produzido na eta- pa de cultura. O processo de purificação ou de recuperação pode ser realizado por meio de purificação, ou a recuperação do ácido L- aminoácido desejado a partir do meio de cultura utilizando um método adequado, selecionado de acordo com o método utilizado para a cultu- ra do microrganismo, por exemplo, uma batelada contínua ou método de cultura de batelada alimentada.

[0054] Daqui em diante, a presente invenção irá ser descrita em maior detalhe com referência a exemplos. É para ser entendido, no entanto, que estes exemplos são para fins ilustrativos e não se desti- nam a limitar o âmbito da presente invenção. Exemplos Exemplo 1: Construção de cepas produzindo L-treonina e L- triptofano possuindo a atividade atenuada de proteína que é codi- ficada por meio do gene ysaA, ydaS ou ybiX

[0055] Neste exemplo, cada um dos genes ysaA, ydaS e ybiX na cepa produtora de L-triptofano KCCM10812P (Registro de Patente Co- reana N ° 10-0.792.095) e a cepa L-treonina produzi ndo KCCM10541 (Registro de Patente Coreana N ° 10-0.576.342) fora m eliminados por meio da recombinação homóloga.

[0056] A cepa-mãe produtora de L-triptofano KCCM10812P é uma cepa derivada de uma variante de E. coli KFCC 10066 tendo a produ- tividade de L-fenilalanina. É uma cepa de E. coli recombinante com produtividade de L-triptofano, caracterizada pelo fato de a auxotrofia de triptofano cromossômico ter sido dessensibilizada, os genes PHE- A, trpR, mtr e tnaAB foram atenuados e os genes trpE e AROG foram modificados.

[0057] Além disso, a cepa-mãe produtora de L-triptofano KCCM10541 é uma cepa derivada de E. coli KFCC10718 (Patente Co- reana Aberta No. de publicação 1992-0008365). Ela tem uma resistên- cia à L-metionina análoga, um fenótipo metionina auxotrofo, a resis- tência ao análogo da L-treonina, um fenótipo mal vedado isoleucina auxotrofo, a resistência ao análogo de L-lisina, e a resistência ao ácido α-aminobutírico, e é capaz de produzir a L-treonina .

[0058] Os genes ysaA, ydaS e ybiX a serem eliminados têm as sequências polinucleotídicas representadas por meio das SEQ ID NOS: 1, 2 e 3, respectivamente.

[0059] Para esta finalidade, o método de inativação de uma etapa (. Desenvolvido por Datsenko KA et al.), que é uma técnica de muta- gênese usando lambda recombinase vermelha foi usado (Proc Natl Acad Sci EUA, (2000) 97:. 6640-6645). Como um marcador para con- firmar a inserção dos genes, o gene resistente a cloranfenicol de pUC- prmfmloxC foi usado (Patente Coreana de Publicação Aberta No. 2009-0075549).

[0060] Os fragmentos de genes de cerca de 1200 pb foram ampli- ficados por meio da reação em cadeia da polimerase (daqui em diante referido como PCR) usando pUCprmfmloxC como um molde e um par de iniciadores 1 e 2, um par de iniciadores 7 e 8 e um par de iniciado- res 13 e 14, que têm uma porção de cada um dos três genes e uma porção do gene resistente a cloranfenicol de pUCprmfmloxC. A PCR foi realizada durante 30 ciclos, cada um consistindo na desnaturação a 94 °C durante 30 seg, emparelhamento a 55 °C para 3 0 seg e exten- são a 72 °C durante 1 min. Tabela 1 Iniciado Sequência SEQ r No. ID NO 1 5'- 7

GTAGGGACGCGCTCTCTGGCACTCTGCTGTTTTAGTGCAA AGGAGTGATCAGGTGACACTATAGAACGCG-3' 2 5'- 8

GGCATAAACAAAGCGCACTGTTCCGGCGTTGAGAAACGC CGGAAAACGTTTAGTGGATCTGATGGGTACC-3' 3 5'- 9

GCTTTGGACAAGTGCCAAAACTTTAACATTTCCTTCGTTGG ATCAAAGCAGTAGGGACGCGCTCTCTGGC-3' 4 5'- 10

ATTGAATTTGGAAGAATTTGTAGGCCGGATAAGGCGTTTA CGCCGCATCTGGCATAAACAAAGCGCACTG-3' 5'- GAGAGAAAAATCTCCTGAAA -3' 11 6 5'- CCTACATGATTTCTGCAATA-3' 12 7 5'- 13

ATTGCGTTAGGCGTCGCCTAATATTTCTGTGTGTTTTTGGA GTTCATTCGAGGTGACACTATAGAACGCG-3' 8 5'- 14

ATTCGATGTGCTCATGCTTGATTTTCATGAATCATTTGCCT CTTGATGTTTAGTGGATCTGATGGGTACC-3' 9 5'- 15

TTACATTAGGCAATCCCTACCCTTACTGCATTAGGCACAG CCTATTGACAATTGCGTTAGGCGTCGCCTA-3' 5'- 16

ATTGGCTACCCATGCCTGCCCTTTTTCGGCTGCTAGGGCA AACAACACTGATTCGATGTGCTCATGCTTG-3' 11 5'- TATAGAGCCTTTCTTAATCC-3' 17 12 5'- CGCAGATATTCTTCAGTAAT-3' 18 13 5'- 19

CATTTCTGATTCAGATGTGGGGCGCAGGCCCCACTTTTTG GAGAAATTGTAGGTGACACTATAGAACGCG-3' 14 5'- 20

TGTACAGTTAAGTGTAGCTAATCCAGGGACGAACTCGGGC AGTTCAAGCATAGTGGATCTGATGGGTACC-3' 15 5'- 21

ACCGTTATCACCCGGGCGAGCCAAGAACCTTCTTGCTCAC AGCCAATATGCATTTCTGATTCAGATGTGG-3' 16 5'- 22

GTCATCGTTAGCCCAACCGGATGCCATATCGACCTCCCCA TATCAATACTTGTACAGTTAAGTGTAGCTA-3 17 5'- AAAGGTTCAGACGGCGCGGT -3' 23 18 5'- TAAGCGCACGCCAGGAATGG-3' 24

[0061] Além disso, os fragmentos de ADN, obtidos por meio da amplificação de PCR foram submetidos a eletroforese em 0,8% de gel de agarose, e em seguida, eluídos e utilizados como moldes em PCR secundário. PCR secundário foi realizada de modo a que os terminais 'e 3' dos fragmentos de DNA primário apresentam 20 pares de bases de nucleotídeos complementares. Os fragmentos de genes de cerca de 1300 pb foram amplificados por PCR utilizando os produtos de PCR primários eluidos como modelos e um par de iniciadores 3 e 4, um par de iniciadores 9 e 10 e um par de iniciadores 15 e 16, que têm incluem a 5 'e 3 'regiões dos genes. A PCR foi realizada durante 30 ciclos, ca- da um consistindo de desnaturação a 94 °C durante 3 0 seg, empare- lhamento a 55 °C para 30 seg e extensão a 72 °C du rante 1 min. Os fragmentos de DNA, obtidos por meio da amplificação de PCR foram submetidos a eletroforese em 0,8% de gel de agarose, e em seguida, eluidos e utilizados na recombinação.

[0062] De acordo com o método desenvolvido por Datsenko KA et al. (Proc Natl Acad Sci EUA., (2000) 97:6640 6645), uma cepa de E. coli transformada com um pKD46 foi tornada competente, e, em se- guida, transformada com os fragmentos do gene de 1300-pb obtidos por PCR. As cepas resultantes foram selecionadas em meio LB com resistência a cloranfenicol. A PCR foi realizada utilizando um par de iniciadores 5 e 6, um par de iniciadores de 11 e 12 e um par de inicia- dores 17 e 18, e os produtos de amplificação tinham tamanhos de 1450, 1530 e 1640 pb, respectivamente, e foi confirmado que os genes foram excluídos.

[0063] pKD46 foi removido a partir das cepas recombinantes pri- márias com resistência ao cloranfenicol, e em seguida, um vetor de pJW168 foi introduzido nas cepas, e o gene marcador de cloranfenicol foi removido a partir das células bacterianas (Gene, (2000) 247,255- 264). As células bacterianas resultantes eram de cerca de 400 pb, 500 pb e produtos de amplificação de 600 pb obtidos por um par de inicia- dores 5 e 6, um par de iniciadores 11 e 12 e um par de iniciadores 17 e 18, e foram confirmou que o deleção do gene desejado foi alcança- do.

[0064] De acordo com o método acima descrito, as cepas produto- ras de L-treonina KCCM10541 ∆ysaA, KCCM10541 ∆ydaS e KCCM10541 ∆ybiX foram construídos. Além disso, as cepas produto- ras de L-triptofano KCCM10812P ∆ysaA, KCCM10812P ∆ydaS e KCCM10812P ∆ybiX foram construídas. Exemplo 2: Construção de cepas recombinantes produtoras de L- treonina e L-triptofano com deleção de dois ou mais dos genes ysaA, ydaS e ybiX

[0065] De acordo com o método descrito no Exemplo, as cepas recombinantes que possuem uma deleção de dois ou mais dos genes foram construídas.

[0066] Um vetor pKD46 para utilização de lambda recombinase vermelha foi introduzdo nas cepas que têm uma deleção de qualquer um dos genes e, em seguida, as amostras foram tornadas competen- tes. Além disso, os fragmentos de genes amplificados por PCR para incluir uma porção de um dos três genes e o gene resistente a cloran- fenicol de pUCprmfmloxC foram transformados em diferentes cepas que têm uma deleção de um dos genes. As cepas resultantes foram rastreadas em meio LB com resistência ao cloranfenicol, e supressão de uma combinação dos genes foi confirmada através da utilização dos pares de iniciadores descritos no Exemplo 1.

[0067] De acordo com o método acima descrito, as cepas produto- ras de L-treonina KCCM10541 ∆ysaA ∆ydaS, KCCM10541 ∆ydaS ∆- ybiX, KCCM10541 ∆ybiX ∆ysaA e KCCM10541 ∆ysaA ∆ydaS ∆ybiX foram construídos. Além disso, as cepas produtoras de L-triptofano KCCM10812P ∆ysaA ∆ydaS, KCCM10812P ∆ydaS ∆ybiX, KCCM10812P ∆ybiX ∆ysaA e KCCM10812P ∆ysaA ∆ydaS ∆ybiX fo- ram construídas.

[0068] Entre as cepas recombinantes obtidas como descrito aci- ma, KCCM10541 ∆ysaA ∆ydaS ∆ybiX e KCCM10812P ∆ysaA ∆ydaS ∆ybiX foram denominados "E. coli CA03-4257P "e" E. coli CA04-2002 ", respectivamente, e depositado no Centro de Cultura Coreana de Mi- crorganismos (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seul, Coreia), uma autoridade internacional de depósito, em 29 de dezembro de 2011 sob os números de acesso KCCM11243P e KCCM11245P, res- pectivamente. Exemplo 3: A medição dos níveis de ATP em cepas produtoras de L-treonina e cepas produtoras de L-triptofano

[0069] Neste Exemplo, os níveis de ATP nas cepas construídas nos Exemplos 1 e 2 foram medidos quantitativamente.

[0070] Para esta finalidade, foi utilizado o método desenvolvido por

Kiyotaka Hara Y. et al., que utiliza a luciferase, ("um método eficiente para a determinação quantitativa da atividade celular de ATP Sintéti- co", J Biom Scre, (2006) V11:. No.3: PP310 a 17).

[0071] Especificamente, as cepas com diferentes características genéticas foram cultivadas durante a noite em meio LB contendo gli- cose líquida. O sobrenadante foi removido por meio a centrifugação, as células bacterianas foram lavadas com Tris-Cl a 100 mM (pH 7,5), e depois tratadas com tampão de PB (tampão permeável : 40 % [v / v] de glicose, 0,8% [v / v] Triton X-100) durante 30 minutos para libertar o ATP intracelular. Em seguida, o sobrenadante foi removido por meio da centrifugação, e a luciferina como um substrato para a luciferase foi adicionada às células. As células foram deixadas a repousar durante minutos, e, em seguida, a atividade de luciferase nas células foi medida com um luminômetro para determinar quantitativamente os níveis de ATP. Os resultados da medição são mostrados na Figuras 1 e 2. Todos os resultados foram registrados como a média de três ex- periências repetidas.

[0072] Como pode ser visto nas Figuras 1 e 2, os níveis de ATP nas cepas construídas a partir da cepa produtora de L-treonina e a ce- pa produtora de L-triptofano nos Exemplos 1 e 2, todos aumentaram. Além disso, o nível de ATP foi superior nas cepas que têm uma dele- ção de uma combinação de genes do que nas cepas que têm uma de- leção de um gene. Exemplo 4: Exame de titulação da cepa produtora de L-treonina, que tem atividade atenuada por si só ou uma combinação de en- zimas que são codificadas por ysaA, ydaS e gene ybiX, em um meio contendo glicose

[0073] De acordo com os métodos descritos nos Exemplos 1 e 2, por si só, ou uma combinação dos genes ysaA, ydaS e ybiX foi excluí- do da cepa L-treonina produzindo KCCM10541 (Registro de Patente

Coreana N ° 10-0576342) para aumentar o nível de AT P intracelular. Os títulos das cepas resultantes foram avaliados usando a glicose co- mo fonte de carbono.

[0074] Especificamente, as cepas tendo diferentes características genéticas foram cultivadas durante a noite em meio LB sólido em uma incubadora a 33 ºC e inoculadas por um loopde platina em 25 mL de meio contendo glicose com a composição mostrada na Tabela 2 abai- xo. Em seguida, as amostras foram incubadas em um incubador a 33 ºC e a 200 rpm durante 50 horas. Os resultados são mostrados na Ta- bela 3 abaixo. Todos os resultados foram registrados como a média de três resultados balão. Tabela 2 Composição Concentração (por litro) Glicose 70 g KH2PO4 2g (NH4)2SO4 25 g MgSO4·H2O 1g FeSO4·H2O 5 mg MnSO4·H2O 5 mg Extrato de levedura 2g Carbonato de cálcio 30 g pH 6,8 Tabela3 Cepa OD Consume de L-treonina glicose (g/L)* (g/L)** KCCM10541 23,7 30,3 31,8 KCCM10541 ∆ysaA 24,6 33,4 32,2 KCCM10541 ∆ydaS 23,5 34,7 33,0 KCCM10541 ∆ybiX 22,7 33,9 32,7 KCCM10541 ∆ysaA 24,9 35,1 32,9

∆ydaS KCCM10541 ∆ydsS 24,5 36 33,1 ∆ybiX KCCM10541 ∆ybiX 25,0 32,1 33,0 ∆ysaA KCCM10541 ∆ysaA 26,1 36,9 33,9 ∆ydaS ∆ ybiX Medido em 30 horas ** Medido em 50 horas

[0075] Como pode ser visto na Tabela 3 acima, foi demonstrado que a utilização de glicose da produção de cepas de E. coli recombi- nantes construídas de acordo com a presente invenção aumentou até cerca de 22 % em comparação com a da cepa-mãe de L-treonina, e a produção das cepas recombinantes de treonina aumentou até cerca de 7 % em relação à da cepa original. Tendo em vista o nível de ATP mostrado na FIG. 1, estes resultados indicam que a taxa de consumo de glicose ou produtividade de aminoácidos das cepas recombinantes foi aumentada por meio do aumento do nível de ATP. Exemplo 5: Análise de titulação da cepa produtora de L-treonina, a qual tem atividade atenuada por si só ou uma combinação de enzimas que são codificadas por ysaA, ydaS e gene ybiX, em um meio contendo sacarose

[0076] De acordo com os métodos descritos nos Exemplos 1 e 2, por si só, ou uma combinação dos genes ysaA, ydaS e ybiX foi exclu- ída da cepa L-treonina produzindo KCCM10541 (Registro de Patente Coreana N ° 10-0576342) para aumentar o nível de AT P intracelular. Os títulos das cepas resultantes foram avaliados utilizando sacarose como fonte de carbono.

[0077] Especificamente, as cepas tendo diferentes características genéticas foram cultivadas durante a noite em meio LB sólido em uma incubadora a 33 °C e inoculadas por um loopde plati na em 25 mL de meio contendo sacarose tendo a composição indicada na Tabela 4 abaixo.

Em seguida, as amostras foram incubadas em um incubador a 33 °C e a 200 rpm durante 48 horas.

Os resultados s ão mostrados na Tabela 5 abaixo.

Todos os resultados foram registrados como a média de três resultados em balão.

Tabela 4 Composição Concentração (por litro) Sacarose 70 g KH2PO4 2g (NH4)2SO4 25 g MgSO4·H2O 1g FeSO4·H2O 5 mg MnSO4·H2O 5 mg Extrato de levedura 2g Carbonato de cálcio 30 g pH 6,8 Tabela 5 Cepa OD Consume de L-treonina glicose (g/L)* (g/L)** KCCM10541 26,2 40,0 37,0 KCCM10541 ∆ysaA 27,1 40,9 37,5 KCCM10541 ∆daS 26,7 41,7 37,8 KCCM10541 ∆ybiX 25 41,1 38,1 KCCM10541 ∆ysaA ∆ydaS 27,5 42,1 38,0 KCCM10541 ∆dsS ∆ybiX 27,2 43,0 38,1 KCCM10541 ∆ybiX ∆ysaA 28,3 42,8 38,7 KCCM10541 ∆ysaA ∆ydaS 27,9 43,9 38,9 ∆ybiX Medido às 24 horas

** Medido às 48 horas

[0078] Como pode ser visto na Tabela 5 acima, os presentes in- ventores demonstraram que a utilização de sacarose da cepa produto- ra recombinante de E.coli construída de acordo com a presente in- venção aumentou até cerca de 10 % em comparação com a da cepa- mãe de L-treonina, e a produção das cepas recombinantes de treonina aumentada até cerca de 5 % em relação à da cepa original. Tendo em vista o nível de ATP mostrado na FIG. 1, estes resultados indicam que a atividade e a taxa de consumo de sacarose ou a produtividade de aminoácidos das cepas recombinantes foram aumentadas por meio do aumento do nível de ATP. Exemplo 6: Análise de titulação da cepa produtora de L-triptofano, que tem atividade atenuada por si só ou uma combinação de en- zimas que são codificadas por ysaA, ydaS e gene ybiX, em um meio contendo glicose

[0079] De acordo com os métodos descritos nos Exemplos 1 e 2, por si só, ou uma combinação dos genes ysaA, ydaS e ybiX foi excluí- da da cepa produtora de L-triptofano KCCM10812P (Registro de Pa- tente Coreana N ° 10-0792095) para aumentar o nível de ATP intrace- lular. Os títulos das cepas resultantes foram avaliados usando a glico- se como fonte de carbono.

[0080] A fim de examinar o título, as amostras foram inoculadas com um loop de platina em um meio LB sólido e, em seguida, cultiva- das durante a noite em uma incubadora. E, foi inoculada por um loop de platina em 25 ml de meio de titulação balão que possui a composi- ção indicada na Tabela 6 abaixo. Em seguida, as amostras foram in- cubadas em um incubador a 37 °C e a 200 rpm durante 48 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo. Todos os resultados foram registrados como a média de três resultados balão.

Tabela 6 Composição Concentração (por litro) Glicose 60 g K2HPO4 1g (NH4)2SO4 10 g NaCl 1g MgSO4·H2O 1g Citrato de sódio 5g Extrato de levedura 2g Carbonato de cálcio 40 g Citrato de sódio 5g Fenilalanina 0,15 g Tirosina 0,1 g PH 6,8 Tabela 7 Cepa OD Consume L-treonina de glicose (g/L)** (g/L)* KCCM10812P 18.2 47.2 5.7 KCCM10812P ∆ysaA 18.3 48.3 6.9 KCCM10812P ∆ydaS 18 49.1 6.6 KCCM10812P ∆ybiX 17.7 50 6.0 KCCM10812P

17.9 48.4 7.5 ∆ysaA∆ydaS KCCM10812P ∆ydaS∆ybiX 18.7 49.3 7.6 KCCM10812P ∆ybiX∆ysaA 19.9 49 7.3 KCCM10812P

18.9 51.9 7.9 ∆ysaA∆ydaS∆ybiX Medido em 33 horas ** Medido às 48 horas

[0081] Como pode ser visto na Tabela 7, acima, os presentes in- ventores demonstraram que a utilização de sacarose da cepa produto- ra recombinante de E.coli construída de acordo com a presente in- venção aumentou até cerca de 10 % em comparação com a da cepa- mãe de L-treonina, e a produção das cepas recombinantes de treonina aumentada até cerca de 38 % comparada com a da cepa-mãe. Tendo em vista o nível de ATP mostrado na FIG. 2, estes resultados indicam que a atividade e a taxa de consumo de glicose ou produtividade de aminoácidos das cepas recombinantes foram aumentadas por meio do aumento do nível de ATP.

[0082] Embora a presente invenção tenha sido descrita com refe- rência às modalidades ilustrativas em particular, as pessoas as quais são versadas na técnica à qual pertence a presente invenção podem compreender que a presente invenção pode ser concretizada em ou- tras formas específicas sem se afastar do espírito ou das característi- cas essenciais técnica da presente invenção. Portanto, as modalida- des descritas acima são consideradas como ilustrativas em todos os aspectos e não restritivas. Além disso, o âmbito da presente invenção é definido por meio das reivindicações anexas em vez da descrição detalhada, e deve ser entendido que todas as modificações ou varia- ções decorrentes dos significados e escopo da presente invenção e os seus equivalentes sejam incluídos no âmbito das reivindicações ane- xas. Número de Acesso Autoridade Depositária : Centro de Cultura Coreano de Microrganis- mos (Internacional) Número de acesso: KCCM11243P Data da Deposição: 29 de dezembro de 2011 Autoridade Depositária : Centro de Cultura Coreano de Microrganis- mos (Internacional)

Número de acesso: KCCM11245P Data da Deposição: 29 de dezembro de 2011

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa de E. coli produtora de L-treonina ou L-triptofano recombinante, caracterizada pelo fato de que a cepa é modificada para atenuar a atividade de, pelo menos, um selecionado do grupo que consiste em uma proteína YsaA tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2 , uma proteína YdaS possu- indo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 4, e uma proteína YbiX tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 6.

2. Cepa de E. coli produtora de L-treonina ou L-triptofano recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína YsaA é codificada por meio de uma sequência poli- nucleotídica, representada por meio da SEQ ID NO: 1, a proteína YdaS é codificada por meio de uma sequência de polinucleotídeos representada por meio da SEQ ID NO: 3, e a proteína YbiX é codifica- da por meio de uma sequência polinucleotídica, representada por meio da SEQ ID NO: 5.

3. Cepa de E. coli produtora de L-treonina ou L-triptofano recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de E. coli recombinante é Escherichia coli produtora de L-treonina CA03-4257P (KCCM11243P).

4. Cepa de E. coli produtora de L-treonina ou L-triptofano recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de E. coli recombinante é Escherichia coli produtora de L-triptofano CA04-2002 (KCCM11245P).

5. Método para a produção de L-treonina ou L-triptofano, caracterizado pelo fato de que o método compreende a cultura de uma cepa de E. coli produtora de L-treonina ou L-triptofano recombinante, em que a cepa é modificada para atenuar a atividade de, pelo menos, um selecionado do grupo consistindo em uma proteína (YsaA) possu-

indo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, uma proteína (YdaS) possuindo uma sequência de aminoá- cidos representada por meio da SEQ ID NO: 4, e uma proteína (YbiX) possuindo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 6.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cepa de E. coli recombinante é Escherichia coli pro- dutora de L-treonina CA03-4257P (KCCM11243P).

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cepa de E. coli recombinante é Escherichia coli pro- dutora de L-triptofano CA04-2002 (KCCM11245P).