MX2014008267A - Microorganismo capaz de producir l-aminoacido, y metodo para producir l-aminoacido usando el mismo. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un microorganismo que es capaz de producir L-treonina o L-triptofano, y a un método para producir L-treonina o L-triptofano usando el mismo; más específicamente, la presente invención se refiere a: Escherichia coli recombinante que es más eficiente para la producción de L-treonina o L-triptofano aumentando la capacidad de producir ATP que se usa como la fuente de energía más abundante en las células cuando se produce L-treonina o L-triptofano; y un método para producir L-treonina o L-triptofano utilizando el mismo.

Description

MICROORGANISMO CAPAZ DE PRODUCIR L-A INOÁCIDO. Y UN MÉTODO PARA PRODUCIR L-AMINOÁCIDO USANDO EL MISMO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un microorganismo capaz de producir L-treonina o L-triptófano y a un método para producir L-treonina o L-triptófano usando el mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Es sabido que microorganismos que producen productos útiles mediante la fermentación requieren cantidades muy grandes de energía tal como ATP cuando la vía biosintética se incrementa.

Como es conocido en la técnica, es muy importante el equilibrio intracelular entre nicotinamida adenina dinucleótido (NAD(H)) que es producido por las reacciones catabólicas y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NADP(H) que se utiliza en reacciones anabólicas en procedimientos metabólicos microbianos. NAD(H) es un intermedio en las reacciones catabólicas que generan ATP a través de la oxidación de los alimentos y las funciones como una fuente de energía. Y NADP(H) realiza funciones en proporcionar una energía reductora en el procedimiento metabólico in vivo, que se proporciona a los electrones de alta energía necesarios para sintetizar moléculas que reaccionan con la enzima que generalmente cataliza una reacción anabólica. El equilibrio entre estos está regulado por la fosforilación de NAD como se muestra en la siguiente ecuación 1 ) o por la desfosforilación de NADP como se muestra en la siguiente ecuación 2).

Ecuación 1) NAD+ + ATP <*NADP+ + ADP Ecuación 2) NADP+ »NAD+ + fosfato Por lo tanto, para producir efectivamente energía reductora tal como NADPH, una fuente de fosfato tal como ATP debe incrementarse conjutnamente.

ATP (adenosina-5'-trifosfato) tiene un enlace de fosfato de alta energía, y genera energía cuando se hidroliza a ADP y fosfato. ATP es producido principalmente por la fosforilación quimiosmótica mediante el sistema de transporte de electrones en microorganismos o por fosforilación de nivel sustrato. El ATP producido se degrada para suministrar la energía necesaria para las células y se reutiliza mediante la regeneración a través de la vía de glucólisis o fosforilación oxidativa.

Basado en este hecho, se han realizado estudios para aplicar el procedimiento de regeneración de energía de ATP de bacteria para la producción masiva de productos útiles para facilitar el suministro de energía (Biosci Biotechnol Biochem., (1997) 61: 840-845). En estudios sobre la regeneración de ATP en E. coli, se encontró que el nivel de ATP en un microorganismo es aproximadamente 150% superior que el de la cepa de origen cuando algunos genes, incluyendo genes ysaA (NCBI ID de Gen: 948085), ydaS (NCBI ID de Gen: 945923) y ybiX (NCBI ID de Gen: 947502) son deficientes, respectivamente, y este hallazgo se aplicó a la producción de glutationa (FEMS Microbiol Lett., (2009) 297:217-224). Sin embargo, no existe informe directo que explique directamente el aumento en la producción de aminoácidos causados por atenuación en las actividades de las proteínas que son codificadas por los genes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problema Técnico Los presentes inventores han encontrado que el aumento del nivel intracelular de ATP, que se utiliza como la fuente de energía más abundante en células que producen L-aminoácido, es efectivo para aumentar la producción de L-treonina o L-triptófano, completando así la presente invención.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una cepa de E. coli recombinante que tiene una productividad de L-treonina o L-triptófano incrementada mediante el aumento de la productividad del ATP.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir L-treonina o L-triptófano utilizando la cepa de E. coli recombinante.

Solución técnica Para cumplir con los objetivos anteriores, una modalidad de la presente invención proporciona una L-treonina o L-triptófano que produce la cepa de E. coli recombinante, en donde la cepa se modifica a la actividad atenuada (debilitada) de al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste de una proteína YsaA que tiene una secuencia de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2, una proteína YdaS que tiene una secuencia de aminoácido representada por SEQ ID NO: 4, y una proteína YbiX que tiene una secuencia de aminoácido representada por SEQ ID NO: 6.

Una modalidad de la presente invención también proporciona un método para producir L-treonina o L-triptófano, que comprende el cultivo de la cepa E. coli recombinante.

Efectos ventajosos La presente invención proporciona un microorganismo recombinante cuya productividad de L-treonina o L-triptófano es mejorada por el aumento del nivel intracelular de ATP en un microorganismo que tiene la productividad de L-treonina o L-triptófano. De acuerdo con la presente invención, proporciona un método para aumentar la producción de L-treonina o L-triptófano por recuperar el equilibrio del metabolismo de energía para incrementar la actividad celular y reducir el tiempo de cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra el nivel de ATP relativo (%) de una cepa de producción de L-treonina en relación con su cepa de origen.

La figura 2 muestra el nivel de ATP relativo (%) de una cepa de producción de L-triptófano en relación con su cepa de origen.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En lo siguiente, la presente invención se describirá en detalle.

Una modalidad de la presente invención proporciona una cepa de E. coli recombinante que produce L-treonina o L-triptófano, en donde la cepa es modificada para atenuar la actividad de al menos una seleccionada del grupo que consiste de una proteína YsaA que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, una proteína YdaS que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, y una proteína YbiX que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.

Un microorganismo que produce L-treonina o L-triptófano que puede ser utilizado en la presente invención puede ser cualquier microorganismo capaz de producir L-treonina o L-triptófano, tal como la bacteria Escherichia sp., E. coli, bacterias corineformes, Bacteria Serratia sp., Bacteria Providencia sp., o lo similar. En concreto, puede utilizarse un microorganismo que pertenece al género Escherichia.

En una modalidad específica de la presente invención, la cepa E. coli recombinante CJ600 (KCCM 10812P) (Patente coreana Registro No. 10-0792095) que tiene productividad de L-triptófano es utilizada, que se obtiene por diseño genéticamente de una cepa de E. coli recombinante (KFCC 10066) que tiene productividad de L-fenilalanina para desensibilizar el triptófano auxótrofo, bloquean la biosíntesis de L-fenilalanina y mejora los genes relacionados con la biosíntesis de triptófano.

En otra modalidad específica de la presente invención, cepa de E. coli recombinante FTR2533 (KCCM-10541) (Patente coreana registro No. 10-0576342) que tiene la productividad L-treonina se utiliza, que se obtiene por ingeniería genética de una cepa mutante de E. coli (KFCC 10718) que tiene la productividad de L-treonina con el fin de inactivar el gen gaIR tipo silvestre.

YsaA, una proteína que tiene una secuencia de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2, está predicha una hidrogenasa de componente tipo ferredoxina 4Fe-4S, pero su función exacta aún no ha sido encontrada.

YdaS, una proteína que tiene una secuencia de aminoácido representada por SEQ ID NO: 4, está predicho un regulador de transcripción de unión a ADN, pero su función exacta aún no ha sido encontrada.

YbiX, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, es una de la superfamilia de oxigenasa dependiente de Fe(ll), que funciona como una oxidorreductasa que oxida su substrato usando el oxígeno.

Los polipéptidos YsaA, YdaS y YbiX de la presente invención tienen las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 2, 4 y 6, respectivamente, pero no están limitadas a estas, porque las secuencias de aminoácidos de las proteínas pueden depender de las especies o cepas de microorganismos.

En otras palabras, las proteínas de la presente invención pueden ser mutantes o variantes artificiales que codifican una proteína que tiene una secuencia de aminoácido que incluye una sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos en una o más posiciones de la secuencia de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2, 4 o 6, siempre que los mutantes o variantes artificiales puedan ser útiles para aumentar la producción de aminoácido atenuando las actividades descritas en la presente invención. Aquí, el número de "varios" aminoácidos varía dependiendo de la posición o el tipo de residuos de aminoácido en la estructura tridimensional de la proteína, pero es particularmente 2-20, específicamente 2-10 y más específicamente 2-5. Además, esta sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de aminoácidos también incluyen aquellas alteraciones causadas por una mutación de origen natural o variación artificial basada en la diferencia de individuos o especies de microorganismos que tienen la actividad de los polipéptidos.

Como se usa aquí, el término "atenuación" significa que se debilita la actividad de una proteína mediante la deleción de todo o parte del gen que codifica la proteína, o por la modificación de una secuencia de regulación de expresión para reducir la expresión del gen, o mediante la modificación de la secuencia del gen cromosómico para debilitar la actividad de la proteína, o por sus combinaciones.

En la presente invención, atenuación de la actividad puede lograrse mediante un método seleccionado del grupo que consiste de: 1) suprimir todo o parte de un polinucleótido que codifica la proteína; 2) modificar una secuencia de regulación de expresión para reducir la expresión del polinucleótido; 3) modificar la secuencia de polinucleótido cromosómico para debilitar la actividad de la proteína; y 4) sus combinaciones.

El método para la deleción de todo o parte del polinucleótido que codifica la proteína puede realizarse mediante la sustitución de un polinucleótido que codifica una proteína objetivo endógena en el cromosoma, con un polinucleótido que deleta una parte de la secuencia de ácido nucleico o un gen marcador a través de vector de inserción del cromosoma.

Aquí, el término "una parte de" la secuencia de ácido nucleico difiere dependiendo del tipo de gen, pero es independientemente de su posición, y es específicamente 1-200, más específicamente 1-100, y aún más específicamente 1-50.

También, el método de modificación de la secuencia de regulación de expresión para reducir la expresión del polinucleótido puede realizarse al inducir una mutación en la secuencia de regulación de expresión por la deleción, inserción, sustitución no conservadora o conservadora o combinaciones de las mismas, de uno o más nucleótidos para atenuar la actividad de la secuencia de regulación de expresión, o mediante la sustitución de la secuencia de regulación de expresión con actividad más débil. La secuencia de regulación de expresión incluye un promotor, una secuencia operadora, una secuencia que codifica un sitio de unión de ribosoma, una secuencia que regula la terminación de la transcripción y traducción.

Además, el método de modificación de la secuencia de polinucleótido cromosómico que codifica la proteína de la presente invención puede realizarse al inducir una mutación en la secuencia por la deleción, inserción, sustitución no conservadora o conservadora o sus combinaciones, de uno o más nucleótidos para atenuar la actividad de la secuencia, o mediante la sustitución de la secuencia con una secuencia de nucleótido modificada que tiene la actividad más débil.

El polinucleótido que codifica la proteína de la presente invención puede introducirse en una célula hospedera y puede sustituirse con un codón difícil de expresar en el hospedero. Además, su N-terminal o C-terminal puede ser extendida o deletada, y el codón de inicio puede ser modificado para regular el nivel de expresión.

Cada uno de los polinucleótidos de la presente invención puede tener un una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína que tiene una homología de al menos 80%, específicamente al menos 90%, más específicamente al menos 95%, y aún más específicamente al menos 97% de la secuencia de aminoácido de cada uno representado por SEQ ID NOS: 2, 4 y 6, siempre que el polinucleótído pueda atenuar la actividad de la proteína de la variante. Más específicamente, el polinucleótído tiene una secuencia de polinucleótído representada por SEQ ID NOs: 1 , 3 y 5, respectivamente.

Como se utiliza aquí, el término "homología" se refiere a la identidad entre dos secuencias de aminoácidos. La homología puede determinarse utilizando métodos bien conocidos, por ejemplo, el programa de computadora BLAST 2.0 que calcula los parámetros como puntuación, identidad y semejanza.

También, las secuencias de polinucleótído de la presente invención pueden ser hibridadas con las secuencias de polinucleótído representadas por SEQ ID NOS: 1 , 3 y 5 y sondas producidas a partir de las secuencias de nucleótido anteriormente descritas bajo condiciones estrictas, y pueden ser secuencias modificadas que codifican las proteínas de funcionamiento normalmente.

Como se utiliza aquí, el término "condiciones estrictas" se refiere a las condiciones que permiten la hibridación específica entre polinucleótidos. Alternativamente, el término se relaciona con polipéptidos o proteínas, incluyendo sus derivados (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al, editores, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989; o Current Protocolos in Molecular Biology, F.M.. Ausubel et al., Editores, John Wiley & Sons, Inc., New York).

Específicamente, las "condiciones estrictas" se refieren a hibridación a 65 °C en regulador de pH de hibridación (3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% de polivinilpirrolidona, 0.02% de albúmina de suero bovino, 2.5 mm de NaH2P04 (pH 7), 0.5% de SDS, 2 mM de EDTA). SSC es 0.15 M cloruro de sodio/0.15 M citrato de sodio a pH 7. Después de la hibridación, la membrana a la cual el ADN ha sido transferido se lava en 2 x SSC a temperatura ambiente y luego en 0.1-0.5*SSC/0.1 xSDS a 68 °C.

Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a un constructo de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos de un gen de codificación de la proteína objetivo operablemente enlazado a una secuencia de regulación adecuada con el fin de ser capaz de expresar el gen objetivo en una célula hospedera adecuada. La secuencia reguladora incluye un promotor capaz de iniciar la transcripción, cualquier operador para regular esta transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión de ribosoma de ARNm adecuado, y una secuencia para la regulación de la terminación de la transcripción y traducción. Una vez transformado en un hospedero adecuado, el vector puede replicar o funcionar independientemente del genoma hospedero, o puede, en algunos casos, integrar en el propio genoma.

El vector que se utiliza en la presente invención no está específicamente limitado y puede ser cualquier vector conocido en la técnica, tanto como pueda replicar en un hospedero. Ejemplos de los vectores utilizados comúnmente pueden incluir los plásmidos naturales o recombinantes, cósmidos, virus y bacteriófagos. Por ejemplo, el vector fago o vectores cósmidos incluyen pWE15, M13, ABL3, ABL4, ????, ASHII, ????, A10, A11 , Charon4A y Charon21A, y los vectores de plásmidos incluyen pBR, pUC, pBluescriptll, pGEM, pTZ, pCL1920 y plásmidos tipo pET. Los vectores que pueden ser utilizados no son particularmente limitados, y pueden utilizarse cualquiera de los vectores de expresión conocidos. Específicamente, se pueden utilizar vectores pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 o pCCI BAC. Más específicamente, se pueden utilizar vectores pACYC177, pCL1920 y pCCI BAC.

Además, el vector que se utiliza en la presente invención es un vector capaz de transformar las células hospederas, para insertar el polinucleótido que codifica la proteína objetivo en el cromosoma de la célula hospedera. Ejemplos específicos del vector incluyen, pero no se limitan a, vector transportador pECCG112 que puede auto-replicarse en ambas direcciones en las bacterias E. coli y tipo Coryne (Kap-Soo, Noh, Kor. Jour. Microbiol. July 1991 , p149-154).

También, el polinucleótido que codifica la proteína objetivo endógena en el cromosoma puede reemplazarse con un nuevo polinucleótido por un vector para la inserción en el cromosoma bacteriano. La inserción del polinucleótido en el cromosoma puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, la recombinación homologa. Debido a que el vector de la presente invención puede insertarse en el cromosoma por recombinación homóloga, además puede comprender un marcador de selección para confirmar su inserción en el cromosoma. El marcador de selección se utiliza para seleccionar una célula transformada con el vector, es decir, confirmar la inserción del polinucleótido objetivo. El marcador de selección que se utiliza en la presente invención puede seleccionarse de los marcadores que proporcionan los fenotipos seleccionares, tales como resistencia al fármaco, auxótrofo, resistencia a agentes citotóxicos, o la expresión de la proteína superficial. Sólo las células que expresan el marcador de selección son capaces de sobrevivir o mostrar diferentes fenotipos bajo el ambiente tratado con el agente selectivo, y por lo tanto se pueden seleccionar las células transformadas.

Como se usa aquí, el término "transformación" significa introducir un vector que comprende el polinucleótido que codifica la proteína objetivo en una célula hospedera para ser capaz de expresar la proteína codificada por el polinucleótido en la célula hospedera. Los polinucleótidos transformados incluyen todos los genes insertados en el cromosoma de la célula hospedera o ubicado fuera del cromosoma, mientras se pueden expresar en la célula hospedera. Además, los polinucleótidos incluyen ADN y ARN, que codifican la proteína objetivo. Siempre que el polinucleótido pueda ser introducido en la célula hospedera y expresada en ésta, el gen puede introducirse en cualquier forma.

Por ejemplo, el polinucleótido puede introducirse en la célula hospedera en la forma de un cartucho de expresión que es un constructo de polinucleótido que incluye todos los elementos para expresar el gen. El cartucho de expresión incluye un promotor que está enlazado operablemente con el gen, una señal de terminación de transcripción, un sitio de unión al ribosoma y una señal de terminación de traducción. El cartucho de expresión puede estar en la forma de un vector de expresión capaz de auto-replicarse. El polinucleótido también puede introducirse en la propia célula hospedera, y estar enlazado operablemente con la secuencia necesaria para la expresión en la célula hospedera.

Específicamente, la atenuación de la actividad de la proteína que es codificada por el gen ysaA, ydaS o ybiX puede lograrse por la deleción del gen. Específicamente, una mutación en el gen puede ser inducida utilizando químicos o luz tal como luz UV, obteniendo así una variante que tiene el gen deletado. Alternativamente, una variante que carece de la actividad de la proteína puede obtenerse sustituyendo el gen cromosómico al nucleótido que carece la actividad mediante una técnica de recombinación genética, por un método del reemplazo del gen a través de la recombinación homóloga.

También, una modalidad de la presente invención también proporciona un método para producir L-treonina o L-triptófano, el método que comprende el cultivo de una cepa E. coli recombinante que produce L-treonina o L-triptófano, en donde la cepa es modificada para atenuar la actividad de al menos una seleccionado del grupo que consiste de una proteína YsaA que tiene una secuencia de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2, una proteína YdaS que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, y una proteína YbiX que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.

El procedimiento de cultivo de la presente invención puede realizarse en medios adecuados y condiciones de cultivo conocidos en la técnica. Este procedimiento de cultivo puede ser modificado fácilmente por cualquier persona con experiencia en la técnica dependiendo del tipo de cepa seleccionada. Ejemplos del procedimiento de cultivo incluyen, pero no se limitan a, cultivo de lote, cultivo continuo y cultivo alimentación por lote.

Las condiciones del medio y cultivo que se utilizan en el cultivo del microorganismo de la presente invención pueden ser aquellos que mientras se utilizan en el cultivo de microorganismos que pertenecen al género Escherichia, pero aquellos deben satisfacer apropiadamente los requerimientos del microorganismo de la presente invención.

En una modalidad específica de la presente invención, el microorganismo puede ser cultivado en un medio convencional que contiene fuentes de carbono adecuados, fuentes de nitrógeno, aminoácidos, vitaminas y similares bajo condiciones aerobias mientras se ajusta la temperatura, pH y similares.

Las fuentes de carbono que pueden ser utilizadas en la presente invención incluyen carbohidratos tal como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, sorbitol; alcoholes tal como el alcohol de azúcar, glicerol, ácido pirúvico, ácido láctico y ácido cítrico; y aminoácidos tal como ácido orgánico, ácido glutámico, metionina y lisina. Además, fuentes de nutrientes orgánicas naturales tal como hidrolizados de almidón, melaza, melazas residuales, arroz salvado, yuca, bagazo y licor de maceración de maíz puede usarse. Específicamente, las fuentes de nutrientes orgánicas incluyen glucosa y melaza pre-tratada estéril (es decir, melazas convertidas a azúcares reducidas), y las cantidades adecuadas de fuentes de carbono pueden utilizarse sin limitación.

Fuentes de nitrógeno que pueden ser utilizadas en la presente invención incluyen fuentes de nitrógeno inorgánico tal como amoníaco, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio; aminoácidos tal como ácido glutámico, metlonina y glutamina; y fuentes de nitrógeno orgánico tal como peptona, NZ-amina, extracto de carne, extracto de levadura, extracto de malta, y licor de maceracion de maíz, hidrolisado de caseína, harina de pescado o su producto digerido, torta de soya desgrasada o su producto digerido, etc. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse solas o en combinación. El medio puede contener fosfato de potasio monobásico, fosfato de potasio dibásico y sales que contienen sodio, como fuentes de fósforo.

Los compuestos inorgánicos que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de hierro, sulfato de magnesio, sulfato de hierro, sulfato de manganeso y carbonato de calcio. Además, el medio puede contener los aminoácidos, vitaminas y precursores adecuados. Estos medios o precursores pueden añadirse al medio en lotes o de manera continua.

Los compuestos tales como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoníaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico pueden añadirse al medio de manera adecuada durante el cultivo para ajustar el pH del medio de cultivo.

Además, durante el cultivo, un agente desespumante tal como poliglicol éster del ácido graso puede utilizarse para suprimir la formación de burbujas. Además, con el fin de mantener el medio de cultivo en un estado aerobio, oxígeno o gas que contiene oxígeno se puede inyectar en el medio de cultivo. Además, con el fin de mantener el medio de cultivo en un estado no-aerobio o anaerobio, no se inyecta gas, o nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono se puede inyectar en el medio de cultivo. El medio de cultivo normalmente se mantiene a una temperatura que varía de 27 °C a 37 °C, y específicamente de 30 °C a 35 °C. El cultivo del microorganismo puede ser continuado hasta que se obtenga el nivel deseado de la sustancia útil. Específicamente, el período de cultivo es de 10 a 100 horas.

El método de la presente invención puede además comprender la purificación o recuperación el L-aminoácido producido en el paso de cultivo. La purificación o procedimiento de recuperación se puede realizar por la purificación o recuperando del L-aminoácido deseado del medio de cultivo utilizando un método adecuado seleccionado dependiendo del método utilizado para el cultivo del microorganismo, por ejemplo, un lote, método de cultivo alimentación en lotes o continuo.

Posteriormente, la presente invención se describirá con mayor detalle con referencia a los ejemplos. Se entenderá, sin embargo, que estos ejemplos son para propósitos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de cepas que producen L-treonina v L-triptófano que tienen actividad atenuada de la proteína que es codificada por el gen vsaA. vdaS o vbiX En este ejemplo, cada uno de los genes ysaA, ydaS y ybiX en la cepa que produce L-triptófano KCC 10812P (Patente Coreana registro No. 10-0792095) y la cepa que produce L-treonina KCCM 10541 (Patente Coreana registro No. 10-0576342) se deletó por recombinación homóloga.

La cepa de origen que produce L-triptófano KCCM10812P es una cepa derivada de una variante de E. coli KFCC 10066 que tiene la productividad de L-fenilalanina. Es una cepa de E. coli recombinante que tiene productividad de L-triptófano, caracterizada en que el auxótrofo de triptófano cromosómico es desensibilizado, los genes pheA, trpR, mtr y tnaAB se atenuaron y se modificaron los genes aroG y trpE.

También, la cepa de origen que produce L-treonina KCCM10541 es una cepa derivada de E. coli KFCC10718 (Publicación de Patente Coreana abierta a consulta al publico No. 1992-0008365). Tiene resistencia al análogo de L-metionina, un fenotipo de auxótrofo de metionina, resistencia al análogo de L-treonina, un fenotipo auxótrofo de isoleucina parcial, resistencia al análogo de L-lisina y resistencia al ácido a-aminobutírico y es capaz de producir L-treonina.

Los genes ysaA, ydaS y ybiX que se deletan tienen las secuencias de polinucleótido representadas por SEQ ID NOS: 1 , 2 y 3, respectivamente.

Para este propósito, el método de inactivación de un solo paso (desarrollado por Datsenko KA et al) es una técnica de mutagénesis que usa recombinasa lambda roja (Proc Nati Acad Sci USA., (2000) 97: 6640-6645). Como un marcador para confirmar la inserción en los genes, se utilizó el gen resistente acloranfenicol de pUCprmfmIoxC (Publicación de patente coreana abierta a consulta para el público No. 2009-0075549).

Unos fragmentos del gen 200-bp se amplificaron por la reacción en cadena de polimerasa (en lo sucesivo, referido como PCR) utilizando pUCprmfmIoxC como una plantilla y un par de iniciadores 1 y 2, un par de iniciadores 7 y 8 y un par de iniciadores 13 y 14, que tienen una porción de cada uno de los tres genes y una porción del gen resistente a cloranfenicol de pUCprmfmIoxC. La PCR se realizó durante 30 ciclos, cada uno que consiste de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, recocido a 55 °C por 30 segundos y extensión a 72 °C durante 1 minuto.

CUADRO 1 También, los fragmentos de ADN obtenidos por la amplificación de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, y luego se eluyeron y utilizaron como plantillas en PCR secundaria. La PCR secundaria se realizó para que las regiones 5' y 3' terminales de los fragmentos de ADN primarios tengan 20 pares de bases de nucleótido complementarios. Unos fragmentos de gen de 1300-bp se amplificaron por PCR utilizando los productos de PCR primarios eluidos como plantillas y un par de iniciadores 3 y 4, un par de iniciadores 9 y 10 y un par de iniciadores 15 y 16, que han incluido las regiones 5' y 3' de los genes. La PCR se realizó por 30 ciclos, cada uno que consiste de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, recocido a 55 °C por 30 segundos y extensión a 72 °C durante 1 minuto. Los fragmentos de ADN obtenidos por la amplificación por PCR son sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 0.8% y luego eluidos y utilizados en la recombinación.

De acuerdo con el método desarrollado por Datsenko KA et al. (Proc Nati Acad Sci USA., (2000) 97:6640 6645), una cepa de E. coli transformada con un pKD46 se hizo competente, y luego se transformó con los fragmentos de gen de 1300-bp obtenidos por PCR. Las cepas resultantes son seleccionadas en medio LB que tiene resistencia a cloranfenicol. PCR se realizó usando un par de iniciadores 5 y 6, un par de iniciadores 1 1 y 12 y un par de iniciadores 17 y 18, y los productos de amplificación tienen tamaños de 1450, 1530 y 1640 bp, respectivamente y se confirmó que los genes son suprimidos.

Se removió pKD46 de las cepas recombinantes primarias que tienen resistencia a cloranfenicol, y luego un vector pJW168 se introdujo en las cepas, y el gen marcador de cloranfenicol se removió de las células bacterianas (Gene, (2000) 247,255-264). Las células bacterianas resultantes son los productos de amplificación de 400-bp, 500-bp y 600-bp obtenidos por un par de iniciadores 5 y 6, un par de iniciadores 11 y 12 y un par de iniciadores 17 y 18, y se confirmó que se logró la deleción del gen deseado.

De acuerdo con el método descrito anteriormente, las cepas que producen L-treonina KCCM10541 AysaA, KCCM10541 AydaS y KCCM10541 AybiX se construyeron. También, las cepas que producen L-triptófano KCCM10812P AysaA, KCCM10812P AydaS y KCCM10812P AybiX se construyeron.

EJEMPLO 2 Construcción de cepas que producen L-treonina y L-triptófano recombinantes que tienen deleción de dos o más genes vsaA. vdaS y vbiX De acuerdo con el método descrito en el ejemplo, se construyeron cepas recombinantes que tienen una deleción de dos o más de los genes.

Un vector pKD46 para usar recombinasa lambda roja se introdujo en las cepas que tienen una deleción de alguno de los genes, y luego las cepas se hacen competentes. También, fragmentos de gen amplificados por PCR para incluir una porción de los tres genes y el gen resistente a cloranfenicol de pUCprmfmloxC se transformaron en diferentes cepas que tienen una deleción de uno de los genes. Las cepas resultantes se clasificaron en medio LB que tiene resistencia a cloranfenicol, y deleción de una combinación de los genes se confirmó por el uso de los pares de iniciadores descritos en el ejemplo 1.

De acuerdo con el método descrito anteriormente, las cepas que producen L-treonina KCCM10541 AysaA AydaS KCCM10541 AydaS AybiX, KCCM10541 AybiX AysaA y KCCM10541 AysaA AydaS AybiX se construyeron. También, las cepas que producen L-triptófano KCCM10812P AysaA AydaS KCCM10812P AydaS AybiX, KCCM10812P AybiX AysaA y KCCM10812P AysaA AydaS AybiX se construyeron.

Entre las cepas recombinantes obtenidas como se describió anteriormente, KCCM10541 AysaA AydaS AybiX KCCM10812P AysaA AydaS AybiX se llamaron "E. coli CA03-4257P" y "E. coli CA04-2002", respectivamente y se depositaron en el centro de cultivo Coreano de microorganismos (361-221 , Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seúl, Corea), una autoridad internacional de depósito, el 29 de diciembre de 2011 , bajo los números de acceso KCCM11243P y KCC 11245P, respectivamente.

EJEMPLO 3 Medición de los niveles de ATP en cepas construidas que producen L- treonina y cepas que producen L-triptófano En este ejemplo, se midieron cuantitativamente los niveles de ATP en cepas construidas en los ejemplos 1 y 2.

Para este propósito, el método desarrollado por Kiyotaka Y. Hará et al., que utiliza la luciferasa, se utilizó ("An Efficient Method for Quantitative determination of Cellular ATP Synthetic Activity", J Biom Scre, (2006) V11 :No.3:PP310-17).

Específicamente, las cepas que tienen diferentes caracteres genéticos se cultivaron durante la noche en medio líquido LB que contienen glucosa. El sobrenadante se removió por centrifugación, las células bacterianas se lavaron con 100 mM de Tris-CI (pH 7.5), y luego se trataron con regulador de pH PB (regulador de pH permeable: 40% [v/v] de glucosa, 0.8% [v/v] Tritón X-100) durante 30 minutos liberar ATP intracelular. Después, el sobrenadante se eliminó por centrifugación, y luciferina como un sustrato para la luciferasa se añadió a las células. Las células se dejaron reposar durante 10 minutos, y entonces se midió la actividad de luciferasa en las células con un luminómetro para determinar cuantitativamente el nivel de ATP. Los resultados de la medición se muestran en las figuras 1 y 2. Todos los resultados se registraron como el promedio de tres experimentos repetidos.

Como puede observarse en las figuras 1 y 2, los niveles de ATP en las cepas construidas a partir de la cepa que produce L-treonina y la cepa que produce L-triptófano en los ejemplos 1 y 2 todos aumentaron. Además, el nivel de ATP fue mayor en las cepas que tienen una deleción de una combinación de los genes que en las cepas que tienen una deleción de uno del gen.

EJEMPLO 4 Examen de la titulación de la cepa que produce L-treonina, que tiene actividad atenuada de enzima sola o una combinación de enzimas que están codificadas por el gen vsaA. vdaS v vbiX, en medio que contiene glucosa De acuerdo con los métodos descritos en los ejemplos 1 y 2, solo o una combinación de los genes ysaA, ydaS y ybiX se deletó de la cepa que produce L-treonina KCC 10541 (Patente Coreana registro No. 10-0576342) para aumentar el nivel de ATP intracelular. Las titulaciones de las cepas resultantes se evaluaron usando glucosa como una fuente de carbono.

Específicamente, las cepas que tienen diferentes caracteres genéticos se cultivaron durante la noche en el medio sólido LB en una incubadora a 33 °C y se inocularon por un bucle de platino en 25 mi de medio que contiene glucosa que tiene la composición que se muestra en el cuadro 2 posterior. Entonces, las cepas se incubaron en una incubadora a 33 °C y a 200 rpm durante 50 horas. Los resultados se muestran en el cuadro 3 siguiente. Todos los resultados se registraron como el promedio de los tres resultados del matraz.

CUADRO 2 CUADRO 3 * medido a 30 horas * medido a 50 horas Como puede observarse en el cuadro 3 anterior, hemos demostrado que la utilización de glucosa de las cepas de E. coli que producen L-treonina recombinante construida de acuerdo con la presente invención incrementa hasta aproximadamente 22% en comparación con la de la cepa de origen, y la producción de treonina de las cepas recombinantes aumentó hasta aproximadamente 7% en comparación con la de la cepa de origen. En vista del nivel de ATP que se muestra en la figura 1 , estos resultados indican que la tasa de consumo de glucosa de la productividad de aminoácido de las cepas recombinantes se aumentó por el nivel de ATP incrementado.

EJEMPLO 5 Examen de la titulación de la cepa que produce L-treonina, que tiene actividad atenuada de alolna o una combinación de enzimas que están codificadas por el gen vsaA, vdaS v vbiX, en medio que contiene sacarosa De acuerdo con los métodos descritos en los ejemplos 1 y 2, solo o una combinación de los genes ysaA, ydaS y ybiX se deletó de la cepa que produce L-treonina KCCM 10541 (Patente Coreana registro No. 10-0576342) para aumentar el nivel de ATP intracelular. Las titulaciones de las cepas resultantes se evaluaron usando sacarosa como una fuente de carbono.

Específicamente, las cepas que tienen diferentes caracteres genéticos se cultivaron durante la noche en el medio sólido LB en una incubadora a 33 °C y se inocularon por un bucle de platino en 25 mi de medio que contiene sacarosa que tiene la composición que se muestra en el cuadro 4 posterior. Entonces, las cepas se incubaron en una incubadora a 33 °C y a 200 rpm durante 48 horas. Los resultados se muestran en el cuadro 5 siguiente. Todos los resultados se registraron como el promedio de los tres resultados del matraz.

CUADRO 4 demostrado que la utilización de sacarosa de las cepas de E. coli que producen L-treonina recombinante construidas de acuerdo con la presente invención incrementan hasta aproximadamente un 10% en comparación con aquella de la cepa de origen, y la producción de treonina de las cepas recombinantes aumentó hasta aproximadamente 5% en comparación con aquella de la cepa de origen. En vista del nivel de ATP que se muestra en la figura 1, estos resultados indican que la actividad y tasa de consumo de sacarosa o productividad del aminoácido de las cepas recombinantes se aumentaron por el nivel de ATP incrementado.

EJEMPLO 6 Examen de la titulación de cepa que produce L-triptófano, que tiene actividad atenuada de enzima sola o una combinación de enzimas que están codificadas por el gen ysaA, ydaS y ybiX, en medio que contiene glucosa De acuerdo con los métodos descritos en los ejemplos 1 y 2, solo o una combinación de genes ysaA, ydaS y ybiX se deletó de la cepa que produce L-triptófano KCCM10812P (Patente Coreana registro No. 10-0792095) para incrementar el nivel de ATP intracelular. Las titulaciones de las cepas resultantes se evaluaron usando glucosa como una fuente de carbono.

Para examinar la titulación, las cepas se inocularon con un bucle de platino en el medio sólido LB y luego se cultivaron durante la noche en una incubadora. Y se inoculó por un bucle de platino en 25 mi de medio de titulación del matraz que tienen la composición que se muestra en el cuadro 6 posterior. Entonces, las cepas se incubaron en una incubadora a 37 °C y a 200 rpm durante 48 horas. Los resultados se muestran en el cuadro 7 siguiente. Todos los resultados se registraron como el promedio de los tres resultados del matraz.

CUADRO 6 CUADRO 7 * medido a 33 horas * medido a 48 horas Como puede observarse en el cuadro 7 anterior, hemos demostrado que el consumo de glucosa de las cepas de E. coli que producen L-treonina recombinante construidas de acuerdo con la presente invención incrementan hasta aproximadamente un 10% en comparación con aquella de la cepa de origen, y la producción de triptófano de las cepas recombinantes aumentó hasta aproximadamente 38% en comparación con aquella de la cepa de origen. En vista del nivel de ATP que se muestra en la figura 2, estos resultados indican que la actividad y tasa de consumo de glucosa o productividad del aminoácido de las cepas recombinantes se aumentaron por el nivel de ATP incrementado.

Mientras que la presente invención se ha descrito con referencia a las modalidades ilustrativas particulares, los expertos en la técnica a los que se refiere la presente invención pueden entender que la presente invención puede ser incorporada en otras formas específicas sin apartarse de la esencia técnica o las características esenciales de la presente invención. Por lo tanto, las modalidades descritas anteriormente se considera que son ilustrativas en todos los aspectos y no restrictiva. Además, el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones anexadas en vez de la descripción detallada, y debe ser entendido que todas las modificaciones o variaciones derivadas del significado y el alcance de la presente invención y sus equivalentes están incluidas en el alcance de las reivindicaciones anexadas.

Número de acceso Autoridad Depositaría: Centro Coreano de cultivo de microorganismos (internacional) Número de acceso: KCCM11243P Fecha de depósito: 29 de diciembre de 2011 Autoridad Depositaría: Centro Coreano de cultivo de microorganismos (internacional) Número de acceso: KCC 11245P Fecha de depósito: jueves, 29 de diciembre de 2011

Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una cepa de E. coli recombinante que produce L-treonina o L-triptófano, en donde la cepa es modificada para atenuar la actividad de al menos una seleccionada del grupo que consiste de una proteína YsaA que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, una proteína YdaS que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, y una proteína YbiX que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.

2. La cepa E. coli recombinante que produce L-treonina o L-triptófano de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteína YsaA es codificada por una secuencia de polinucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 , la proteína YdaS es codificada por una secuencia de polinucleótidos representada por SEQ ID NO: 3, y la proteína YbiX es codificada por una secuencia de polinucleótidos representada por SEQ ID NO: 5.

3. La cepa E. coli recombinante que produce L-treonina o L-triptófano de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la cepa E. coli es Escheríchia coli CA03-4257P que produce L-treonina (KCCM11243P).

4. La cepa E. coli recombinante que produce L-treonina o L- triptófano de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la cepa E. coli es Escherichia coli CA04-2002 que produce L-triptófano (KCCM11245P).

5. Un método para producir L-treonina o L-triptófano, el método que comprende el cultivo de una cepa E. coli recombinante que produce L-treonina o L-triptófano, en donde la cepa es modificada para atenuar la actividad de al menos una seleccionado del grupo que consiste de una proteína (YsaA) que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, una proteína (YdaS) que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, y una proteína (YbiX) que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la cepa E. coli recombinante es Escherichia coli CA03-4257P que produce L-treonina (KCCM11243P).

7. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la cepa E. coli recombinante es Escherichia coli CA04-2002 que produce L-triptófano (KCCM1 1245P).