BR112016017592B1

BR112016017592B1 - Microrganismo recombinante e método de produção de laminoácidos

Info

Publication number: BR112016017592B1
Application number: BR112016017592-1A
Authority: BR
Inventors: Eun Sung Koh; Su Yon Kwon; Kwang Ho Lee; Ji Sun Lee; Juno JANG; Keun Cheol Lee; Hyeong Pyo Hong
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-17
Publication date: 2023-11-14
Also published as: HUE045306T2; EP3119874B1; TW201538725A; JP2017504349A; BR112016017592A2; KR20150109990A; AR099811A1; KR101599800B1; TW201734199A; TWI639698B; WO2015142021A1; CN105980545B; EP3119874A1; US20170002388A1; EP3119874A4; CN105980545A; JP6494643B2; UA118276C2; DK3119874T3; MY180267A

Abstract

MICRORGANISMOS QUE APRESENTAM PRODUTIVIDADE AUMENTADA DE LAMINOÁCIDOS E PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE L-AMINOÁCIDOS UTILIZANDO ESTES. A presente invenção descreve um microrganismo recombinante com produtividade aumentada do Laminoácido, em que o microrganismo recombinante é transformado para remover ou diminuir a atividade de no mínimo uma adenosina deaminase e AMP nucleosidase, e um método de produção de um L-aminoácido utilizando este microrganismo. O uso do microrganismo recombinante pode permitir a produção do L-aminoácido de uma forma mais eficiente.

Description

Campo técnico

[001] A presente invenção está relacionada a um microrganismo que apresenta produtividade aumentada do L- aminoácido e um método de produção de um L-aminoácido utilizando o microrganismo.

Antecedentes da invenção

[002] A adenosina-5’-trifosfato (ATP) apresenta ligações de fosfato de alta energia e produz energia quando é hidrolisado para adenosina difosfato (ADP) e um fosfato. ATP é a principal fonte de energia para todos os organismos vivos. O ATP é sintetizado pelo sistema de transporte de elétrons dentro de um microrganismo, por fosforilação a nível de substrato ou semelhante. O ATP fornece a energia necessária para as células quando estão sendo degradadas, e é continuamente reciclado através de um processo de glicólise ou fosforilação oxidativa. Além disso, microrganismos que produzem metabólitos úteis por fermentação são conhecidos por exigir mais energias tipo ATP de acordo com o aumento da biossíntese da ATP.

[003] Neste aspecto, os inventores da presente invenção aumentam a proporção do ATP, que é a fonte de energia mais utilizada para produzir um L-aminoácido dentro de uma célula, confirmando os efeitos do ATP na produção do L-aminoácido, desta forma concluindo a presente invenção.

Descrição da invenção Problema técnico

[004] A presente invenção oferece um microrganismo recombinante que apresenta produtividade aumentada de um L- aminoácido com aumento no nível de ATP.

[005] A presente invenção oferece um método de produção de um L-aminoácido utilizando o microrganismo recombinante.

Solução para o problema técnico

[006] De acordo com um aspecto da presente invenção, um microrganismo recombinante apresentando produtividade aumentada de um L-aminoácido é descrito, onde a atividade de no mínimo uma adenosina deaminase e AMP nucleosidase é removida ou reduzida.

[007] O termo “adenosina deaminase (Add)”, conforme utilizado na presente invenção, se refere a uma enzima que está presente no citosol e participa em parte do metabolismo da purina. A Add pode atuar na posição C-6 da adenosina para que um grupo amino ligado a esta posição seja desaminado, e neste aspecto, a Add pode apresentar um papel na catalisação de uma reação de conversão de adenosina+H2O ^ inosina+NH3, resultando na produção de inosina e amônio.

[008] Uma sequência de aminoácidos da Add pode ser fornecida por banco de dados conhecido, tal como GenBank da NCBI, mas sem estar limitado a este. A Add pode incluir, especificamente, uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, ou uma sequência de aminoácidos com cerca de 80% ou mais, 90% ou mais ou 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14. Além disso, tal sequência de aminoácidos, apresentando identidade de sequência, inclui uma sequência de aminoácidos na qual uma parte é deletada, modificada, substituída ou adicionada. A sequência da Add pode incluir uma sequência de polinucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14. A sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína da Add pode ser denominada como um gene add (Gene NCBI ID: 12931257). Por exemplo, uma sequência do gene Add que codifica a proteína Add pode incluir uma sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO:13, ou uma sequência de polinucleotídeos com cerca de 80% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO:13. Tal sequência de bases apresentando identidade de sequência inclui uma sequência de bases na qual parte é deletada, modificada, substituída ou adicionada.

[009] O termo “AMP nucleosidase (Amn)”, conforme utilizado na presente invenção, se refere a uma enzima que pertence à família das hidrolases, por exemplo, glicosilases que hidrolisam compostos de N-glicosila, e é também denominada adenilato nucleosidase. A Amn pode participar de uma parte do metabolismo da purina. Por exemplo, a Amn pode apresentar um papel na catalisação de uma reação de conversão da AMP+H2O ? D-ribose 5-fosfato + adenina. Além disso, quando um gene amn que codifica Amn é inativado, os níveis de ATP dentro da célula podem ser aumentados.

[010] Uma sequência de aminoácidos da Amn pode ser fornecida por um banco de dados conhecido, tal como GenBank de NCBI, mas sem estar limitado a este. A Amn pode incluir, em detalhes, uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, ou uma sequência de aminoácidos apresentando cerca de 80% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de identidade da sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16. Além disso, tal sequência de aminoácidos apresentando identidade de sequência inclui uma sequência de aminoácidos na qual uma parte é deletada, substituída ou adicionada. A sequência da Amn pode incluir uma sequência de polinucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16. A sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína Amn pode ser denominada como um gene amn (NCBI Gene ID: 12931407). Por exemplo, uma sequência do gene amn que codifica a proteína Amn pode incluir uma sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO:15, ou uma sequência de polinucleotídeos apresentando cerca de 80% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de identidade de sequência com a sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO:15. Tal sequência de bases com identidade inclui uma sequência na qual parte é deletada, modificada, substituída ou adicionada.

[011] Na presente invenção, a identidade de sequência se refere a um grau de similaridade nas sequências de bases de genes que codificam proteínas, ou nas sequências de aminoácidos. No caso de alta identidade genética, os produtos da expressão dos genes podem apresentar a mesma atividade ou similar.

[012] Na presente invenção, a atividade da Add ou da Amn pode ser removida ou reduzida em um microrganismo, e ele pode ser utilizado na produção do L-aminoácido. No microrganismo recombinante da presente invenção que apresenta produtividade aumentada do L-aminoácido, a atividade da Add ou da Amm conjunta ou separada pode ser removida ou reduzida. Por exemplo, no microrganismo recombinante, a atividade de ambas as proteínas pode ser removida ou reduzida. O microrganismo recombinante que apresenta atividade removida ou reduzida da Add ou da Amn ocasiona uma produtividade aumentada do L-aminoácido em comparação com um microrganismo onde a atividade das proteínas não é removida ou reduzida.

[013] O termo “L-aminoácido”, conforme utilizado na presente invenção, se refere a uma unidade estrutural básica de uma proteína que constitui o corpo de um organismo e apresenta tanto um grupo amino como um grupo de ácido carboxílico ligados ao mesmo átomo de carbono. Por exemplo, o L-aminoácido pode ser selecionado do grupo que consiste de L-leucina, L-fenilalanina, L-lisina, L-treonina, L-valina, L-isoleucina, L-triptofano e L-metionina. Por exemplo, o L- aminoácido pode ser L-triptofano ou L-treonina.

[014] O termo “microrganismo recombinante”, conforme utilizado na presente invenção, se refere a um microrganismo que é geneticamente modificado. Ele pode ser um microrganismo que é geneticamente modificado, e, por exemplo, um ácido nucléico exógeno pode ser introduzido no microrganismo de acordo com métodos de engenharia genética, ou uma sequência ou local de um gene endógeno em um microrganismo pode ser transformado.

[015] O termo “atividade removida” de uma enzima ou de um polipeptídeo, conforme utilizado na presente invenção, se refere a uma condição onde a proteína descrita acima não é totalmente expressa em um microrganismo, ou onde a proteína descrita acima é expressa, mas não apresenta qualquer atividade. O termo “atividade reduzida” de uma enzima ou de um polipeptídeo, conforme utilizado na presente invenção, se refere a uma condição onde a proteína descrita acima é expressa, mas a sua atividade é reduzida em comparação com a atividade intrínseca. O termo “atividade removida” ou “atividade reduzida” pode ser substituído com “inativação” ou “atividade deficiente”. O termo “atividade intrínseca”, conforme utilizado na presente invenção, se refere à atividade de um microrganismo no seu estado natural, isto é, originalmente existente em um microrganismo, ou atividade de uma proteína que não foi geneticamente modificada.

[016] A remoção ou redução da atividade da Add ou da Amn pode ser causada pela deleção ou modificação de genes que codificam Add ou Amn. O termo “deleção ou modificação de genes”, conforme utilizado na presente invenção, se refere a uma condição onde uma parte ou todos os genes ou fatores regulatórios na região promotora ou terminadora dos genes sofrem mutação, são substituídos, deletados ou inseridos com no mínimo uma base, para que não sejam expressos ou pouco expressos, ou expressos sem atividade enzimática ou com atividade enzimática reduzida. A deleção ou ruptura dos genes pode ser obtida por manipulação genética, tal como recombinação homóloga, mutagênese ou evolução molecular. Quando uma célula inclui uma pluralidade dos mesmos genes ou no mínimo dois genes homólogos de polipeptídeos diferentes, um ou mais genes podem ser removidos ou rompidos na célula. Em uma modalidade, o gene add que codifica a Add, ou o gene amn que codifica a Amn pode ser removido do genoma do microrganismo por recombinação homóloga, ou pode apresentar um códon inicial modificado.

[017] O termo “microrganismo recombinante que apresenta produtividade aumentada do L-aminoácido”, conforme utilizado na presente invenção, se refere a um microrganismo capaz de produzir e acumular o L-aminoácido de uma fonte de carbono contida em um meio. O microrganismo recombinante com atividade reduzida ou removida da Add ou da Amn apresenta produtividade aumentada do L-aminoácido em comparação com um microrganismo onde a atividade das enzimas não é modificada. Em uma modalidade, foi confirmado que uma cepa produtora de treonina e uma cepa produtora de triptofano, que tiveram as enzimas inativadas conforme descrito acima, apresentaram produtividade aumentada de treonina e triptofano em comparação com as cepas mães da cepa produtora de treonina e da cepa produtora de triptofano.

[018] O microrganismo recombinante pode ser um microrganismo do gênero Escherichia, do gênero Enterbacter, do gênero Erwinia, do gênero Serratia, do gênero Providencia, do gênero Corynebacterium, e do gênero Brevibacterium. Por exemplo, o microrganismo recombinante pode pertencer ao gênero Escherichia. O microrganismo do gênero Escherichia pode ser a Escherichia coli (E. coli), por exemplo, KCCM11494P. A KCCM11494P é uma KCCM10910P?add?amn preparada pela utilização de uma cepa produtora de treonina (KCCM10910P) como uma cepa mãe, com a deleção dos genes add e amn. Na presente invenção, a produção de treonina na KCCM11494P é considerada como sendo maior do que a da cepa mãe (KCCM10910P).

[019] A KCCM11494P foi denominada ‘E. coli CA03-8254P’, e então, foi depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (a partir de agora, denominado como ‘KCCM’)em 9 de dezembro de 2013, de acordo com o Tratado de Budapeste.

[020] De acordo com outro aspecto da presente invenção, uma composição para produção do L-aminoácido é descrita, incluindo o microrganismo recombinante. O termo “composição para produção do L-aminoácido”, conforme utilizado na presente invenção, se refere a uma composição capaz de produzir o L-aminoácido como um metabólito utilizando o microrganismo recombinante produtor do L-aminoácido ou um produto da cultura deste microrganismo. O microrganismo recombinante produtor do L-aminoácido é definido da mesma forma que descrito acima. O L-aminoácido pode ser selecionado do grupo que consiste, por exemplo, de L-leucina, L- fenilalanina, L-lisina, L-treonina, L-valina, L-isoleucina, L-triptofano e L-metionina. Por exemplo, o L-aminoácido pode ser L-treonina ou L-triptofano. O termo “produto da cultura”, conforme utilizado na presente invenção, se refere a um caldo de cultura contendo o microrganismo recombinante, um sobrenadante da cultura de onde uma célula microbiana é removida, ou uma solução diluída do produto da cultura. A composição pode também incluir um componente para aumentar a produtividade do L-aminoácido. Por exemplo, a composição pode também incluir fontes de carbono, fontes de nitrogênio ou componentes de elementos traço. As fontes de carbono podem incluir, por exemplo, carboidratos, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; gorduras, tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico, e ácido linoleico; álcool, tal como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ou uma combinação destes. A cultura do microrganismo recombinante pode ser realizada utilizando glicose como a fonte de carbono. As fontes de nitrogênio podem incluir, por exemplo, fontes orgânicas, tais como peptona, extrato de levedura, caldo de carne, extrato de malte, milhocina (CSL) e farinha de soja; e fontes inorgânicas de nitrogênio, tais como, uréia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, e nitrato de amônio; ou uma combinação destes. A composição pode incluir, como uma fonte de fósforo, diidrogênio fosfato de potássio ou hidrogênio fosfato de potássio. Além disso, a composição pode incluir sais contendo sódio correspondentes à fonte de fósforo e sais metálicos, tais como sulfato de magnésio ou sulfato de prata. Além disso, um meio de cultura pode incluir aminoácidos, vitaminas, e precursores apropriados.

[021] De acordo com outro aspecto da presente invenção, um método de produção do L-aminoácido é descrito, incluindo cultura do microrganismo recombinante produtor do L- aminoácido, e coleta do L-aminoácido do produto da cultura.

[022] O microrganismo recombinante produtor de L- aminoácido é definido conforme acima.

[023] O L-aminoácido pode ser selecionado do grupo que consiste de, por exemplo, L-leucina, L-fenilalanina, L- lisina, L-treonina, L-valina, L-isoleucina, L-triptofano e L-metionina. Por exemplo, o L-aminoácido pode ser L-treonina ou L-triptofano. A cultura do microrganismo recombinante pode ser obtida com um meio de cultura apropriado e condições da cultura que são bem conhecidas na área. Além disso, um especialista na área pode ajustar adequadamente um meio de cultura e suas condições de acordo com o microrganismo selecionado. O método da cultura pode incluir uma cultura em batelada, uma cultura contínua, uma cultura em batelada alimentada ou uma combinação destas.

[024] O meio de cultura pode incluir uma variedade de fontes de carbono, fontes de nitrogênio e componentes de elementos traço.

[025] As fontes de carbono podem incluir, por exemplo, carboidratos, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; gorduras, tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico, e ácido linoleico; álcool, tal como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ou uma combinação destes. A cultura do microrganismo recombinante pode ser realizada utilizando glicose como a fonte de carbono. As fontes de nitrogênio podem incluir, por exemplo, fontes orgânicas, tais como peptona, extrato de levedura, caldo de carne, extrato de malte, milhocina (CSL) e farinha de soja; e fontes inorgânicas de nitrogênio, tais como, uréia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, e nitrato de amônio; ou uma combinação destes. O meio de cultura pode incluir, como fonte de fósforo, diidrogênio fosfato de potássio ou hidrogênio fosfato de potássio. Além disso, o meio de cultura pode incluir sais contendo sódio correspondentes à fonte de fósforo e sais metálicos, tais como sulfato de magnésio ou sulfato de prata. Além disso, o meio de cultura pode incluir aminoácidos, vitaminas, e precursores apropriados. O meio ou componentes individuais podem ser adicionados ao meio de cultura de uma forma contínua ou em batelada.

[026] Além disso, compostos, tais como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico podem ser adicionados ao meio durante a cultura do microrganismo recombinante de uma forma apropriada, para ajustar o pH do meio de cultura. Além disso, agentes antiespumantes, tais como poliglicol de éster de ácido graxo, podem ser utilizados durante a cultura do microrganismo recombinante, para evitar a produção de bolhas de ar. Para manter as condições aeróbicas do meio de cultura, oxigênio ou gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) pode ser injetado no meio de cultura. Na presente invenção, a temperatura do meio de cultura pode estar em uma faixa de cerca de 20°C a cerca de 45°C, por exemplo, cerca de 25°C a cerca de 40°C. Um período de cultura do microrganismo recombinante pode durar até que uma quantidade desejada do L-aminoácido seja obtida, e por exemplo, pode durar cerca de 10 horas a cerca de 160 horas.

[027] A coleta do L-aminoácido do produto da cultura pode ser realizada através de métodos de cultura apropriados conhecidos na área, tais como cultura em batelada, uma cultura contínua, ou uma cultura em batelada alimentada, para coletar ou recuperar o L-aminoácido produzido no produto da cultura.

Efeitos vantajosos da invenção

[028] De acordo com um aspecto, um microrganismo com atividade removida ou reduzida de no mínimo uma proteína selecionada da adenosina deaminase e AMP nucleosidase pode ser utilizado para produzir um L-aminoácido.

[029] De acordo com outro aspecto, uma composição ou um método para produção de um L-aminoácido pode ser utilizado de uma forma eficiente.

Breve descrição das figuras

[030] A figura 1 é um gráfico demonstrando níveis de ATP em uma cepa produtora de L-treonina com deleção do gene realizada de acordo com a presente invenção.

[031] A figura 2 é um gráfico demonstrando níveis de ATP em uma cepa produtora de L-triptofano com deleção do gene realizada de acordo com a presente invenção.

Forma da invenção

[032] A partir de agora, a presente invenção será descrita detalhadamente com referência aos seguintes exemplos. Estes exemplos são somente ilustrativos e não têm o objetivo de limitar o escopo da presente invenção.

Exemplo 1: Preparação da cepa produtora de L-treonina e da cepa produtora de L-triptofano, com cada uma apresentando atividade reduzida de uma proteína codificada pelo gene add ou gene amn.

[033] Nas cepas produtoras de L-treonina, isto é, KCCM10910P (Publicação Provisória da Patente Coreana No: 2009-0076389) e KCCM-10132 (Publicação Provisória da Patente Coreana No: 2000-0013853) e na cepa produtora de L- triptofano, isto é, KCCM10812P (Patente Coreana No:10- 0792095), os genes que codificam a Add e a Amn foram deletados por recombinação homóloga. Os genes add e amn a serem deletados incluem uma sequência de bases da SEQ ID NO:13 e uma sequência de bases da SEQ ID NO:13 e uma sequência de bases da SEQ ID NO:15.

[034] Especificamente, uma inativação de fase, que é uma técnica de construção de um mutante utilizando o sistema de lambda Red recombinase desenvolvido por Datsenko KA et al. (proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645), foi utilizada. Para confirmar a inserção do produto de amplificação no gene, um gene resistente ao cloranfenicol do pUCprmfmloxC foi utilizado como um marcador (Patente Coreana No:2009-007554). Então, a reação da cadeia de polimerase (a partir de agora, denominada como “PCR”) foi realizada utilizando pUCprmfmloxC como um modelo, um conjunto de primers das SEQ ID NOS: 1 e 2 contendo uma parte da sequência de bases desses dois genes e uma parte da sequência do gene resistente ao cloranfenicol do pUCprmfmloxC, e o conjunto de primeres das SEQ ID NOS: 7 e 8 com as seguintes condições: 30 ciclos de desnaturação à temperatura de 94°C por 30 segundos, anelamento’ à temperatura de 55°C por 30 segundos, e extensão à temperatura de 72°C por 1 minuto, resultando na amplificação de um fragmento do gene de aproximadamente 1.200 bp.

[035] O fragmento de DNA obtido por amplificação PCR foi submetido à eletroforese em um gel de agarose 0,8%, eluído e utilizado como modelo para PCR secundário. O PCR secundário foi realizado utilizando o produto do PCR primário eluído como um modelo, um conjunto de primers da SEQ ID NOS: 3 e 4 apresentando 20 bp de uma sequência complementar para as regiões 5’ e 3’ do fragmento do DNA primário, e também apresentando as regiões 5’ e 3’dos genes, um conjunto de primers da SEQ ID NOS: 9 e 10 sob as seguintes condições: 30 ciclos de desnaturação à temperatura de 94°C por 30 segundos, anelamento à temperatura de 55°C por 30 segundos, e extensão à temperatura de 72°C por 1 minuto, resultando na amplificação de 4 tipos de um fragmento do gene de aproximadamente 1.300 bp. Os fragmentos do DNA obtidos foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose 0,8%, eluído e utilizado na recombinação.

[036] E. coli, que foi transformada com um plasmídeo pKD46, de acordo com o método desenvolvido por Datsenko KA et al (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645), foi preparada como uma cepa competente, e a transformação foi realizada pela introdução do fragmento do gene de 1.300 bp que foi obtido por PRC. As cepas obtidas foram selecionadas em um meio LB suplementado com cloranfenicol. Desta forma, uma deleção de genes foi confirmada por um produto PCR de aproximadamente 1.440 bp e 2.104bp obtido por PCR utilizando um conjunto de primers de SEQ ID NOS: 5 e 6 e um conjunto de primers de SEQ ID NOS: 11 e 12.

[037] Após remoção do plasmídeo pKD46, a cepa de E. coli primária recombinante apresentando resistência ao cloranfenicol, foi introduzida com um plasmídeo pJW168 para remover o gene marcador do cloranfenicol da cepa (Gene, (2000), 247, 255-264). Nas células microbianas que foram finalmente obtidas, uma deleção de genes foi confirmada por um produto da PCR de aproximadamente 340 bp e 1.004 bp, obtido utilizando um conjunto de primers de SEQ ID NOS: 5 e 6 e um conjunto de primers de SEQ ID NOS: 11 e 12.

[038] Uma deleção do gene amn foi realizada da mesma forma acima utilizando uma cepa onde o gene add foi deletado, um conjunto de primers de SEQ ID NOS: 5 e 6 e um conjunto de primers de SEQ ID NOS: 11 e 12, e, desta forma, uma deleção dupla destes dois genes foi confirmada.

[039] De acordo com o método descrito acima, 6 tipos de cepas produtoras de L-treonina, isto é, uma cepa KCCM10910P?add,uma cepa KCCM10910P?amn, uma cepa KCCM10910P?add, uma cepa KCCM10132?add, uma cepa KCCM10132?amn, euma cepa KCCM10132?add?amn foram preparadas. Além disso, 3 tipos de cepas produtoras de L-triptofano, isto é, uma cepa KCCM10812P?add, uma cepa KCCM10812P?amn, e uma cepa KCCM10812P?add?amn foram preparadas.

Exemplo 2. Medição dos níveis de ATP na cepa produtora de L- treonina e na cepa produtora de L-triptofano

[040] Para quantificar os níveis reais de ATP encontrados nas cepas do exemplo 1, o “Efficient Method for Quantitative determination of Cellular ATP Synthetic Activity”, desenvolvido por KIYOTAKA Y et al (J Biom Scre, (2006) V11: No.3: PP310-17), de acordo com ou uso da luciferase, foi utilizado. Em um meio líquido LB contendo glicose, cada uma das cepas do exemplo 1, apresentando transformação genética diferente, foram cultivadas durante a noite. Após a remoção do sobrenadante por centrifugação, as células microbianas foram lavadas com uma solução de Tris-Cl 100 mM (pH 7,5), e então tratadas com uma solução tampão (PB) permeável (glicose 40% [v/v] Triton X-100) por 30 minutos, transportando desta forma o ATP intracelular para o lado de fora. Após a separação do sobrenadante por nova centrifugação, o material resultante foi misturado com luciferina, que é utilizada como um substrato da luciferase. Após 10 minutos de uma reação, o nível de desenvolvimento de cor da luciferase foi medido utilizando um luminômetro, para quantificar níveis de ATP. Os resultados estão apresentados nas FIGS. 1 e 2. Todos os valores resultantes foram valores médios obtidos por experimentos que foram repetidos 3 vezes.

[041] Conforme demonstrado nas FIGS. 1 e 2, comparando as cepas mãe sem a deleção do gene (isto é, a cepa produtora de L-treonina e a cepa produtora de L-triptofano), com as cepas do exemplo 1, foi confirmado que os níveis de ATP nas cepas do exemplo 1 aumentaram. Além disso, foi confirmado que os níveis de ATP também aumentaram nas cepas que apresentam deleção dos genes add e amn em combinações, no lugar das cepas que apresentam deleção de um único gene.

Exemplo 3. Confirmação dos efeitos da cepa produtora de L- treonina apresentando atividade reduzida de proteínas codificadas por genes add e amn de E. coli em meio contendo glicose

[042] Na cepa produtora de L-treonina (KCCM10910P) do exemplo 1, os genes add e amn foram deletados juntos ou separados, para realizar um teste de potência com relação às cepas que apresentam níveis aumentados de ATP intracelular utilizando a da glicose como fonte de carbono.

[043] As cepas, com cada uma apresentando transformação genética diferente, foram cultivadas em meio LB sódio durante a noite em uma incubadora à temperatura de 33°C. Posteriormente, o material de cada célula microbiana contido em uma alça de platina foi inoculado em 25 mL do meio de titulação contendo glicose, conforme demonstrado na composição da tabela 1 abaixo, e então, foi cultivado em uma incubadora à temperatura de 33°C a 200 rpm por 50 h. Os resultados estão demonstrados na tabela 2 abaixo. Todos os valores resultantes foram valores médios obtidos de 3 frascos. Tabela 1 Tabela 2 *valor medido em 30 h ** valor medido em 50 h

[044] Conforme demonstrado na tabela 2 acima, foi confirmado que as cepas apresentando a deleção do gene de acordo com a presente invenção, apresentaram consumo de glicose aumentado em cerca de 18,8% em comparação com o consumo de glicose da cepa mãe. Foi também confirmado que as quantidades de treonina produzidas nas cepas foram aumentadas em torno de 6,6% em comparação com a quantidade de treonina produzida na cepa mãe. Estes resultados significam que, em relação aos níveis de ATP da figura 1, a atividade das cepas transformadas foi aumentada pelos níveis de ATP aumentados, e desta forma, as taxas de consumo da glicose ou a produtividade do aminoácido das cepas transformadas foram melhoradas.

[045] Neste aspecto, a cepa KCCM10910P?add?amn apresentando taxas de consumo de glicose e produtividade da treonina aumentadas, foi denominada ‘E. coli CA03-8254P’ (Acesso No. KCCM11494P, depositada no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM) em 9 de dezembro de 2013). Exemplo 4. Confirmação dos efeitos da cepa produtora de L- treonina apresentando atividade reduzida de proteínas codificadas por genes add e amn de E. coli em meio contendo glicose

[046] Na cepa produtora de L-treonina (KCCM10132) do exemplo 1, os genes add e amn foram deletados juntos ou separados, para realizar um teste de potência com relação às cepas que apresentam níveis aumentados de ATP intracelular pelo uso da glicose como fonte de carbono.

[047] As cepas, com cada uma apresentando transformação genética diferente, foram cultivadas no meio LB sódio durante a noite em uma incubadora à temperatura de 33°C. Posteriormente, o material de cada célula microbiana contido em uma alça de platina foi inoculado em 25 mL do meio de titulação contendo glicose, conforme demonstrado na composição da tabela 1 abaixo, e então, foi cultivado em uma incubadora à temperatura de 33°C a 200 rpm por 50 h. Os resultados estão demonstrados na tabela 3 abaixo. Todos os valores resultantes foram valores médios obtidos de 3 frascos. Tabela 3 *valor medido em 30 h ** valor medido em 50 h

[048] Conforme demonstrado na tabela 3 acima, foi confirmado que as cepas apresentando a deleção do gene de acordo com a presente invenção, apresentaram consumo de glicose aumentado em cerca de 13% em comparação com o consumo de glicose da cepa mãe. Foi também confirmado que as quantidades de treonina produzidas nas cepas foram aumentadas em torno de 6,4% em comparação com a quantidade de treonina produzida na cepa mãe.

Exemplo 5. Confirmação dos efeitos da cepa produtora de L- triptofano apresentando atividade reduzida de proteínas codificadas por genes add e amn de E. coli em meio contendo glicose

[049] Na cepa produtora de L-triptofano (KCCM10812P) do exemplo 1, os genes add e amn foram deletados juntos ou separados, para realizar um teste de potência com relação às cepas que apresentam níveis aumentados de ATP intracelular pelo uso da glicose como fonte de carbono.

[050] Para realizar o teste de potência, o material de cada célula microbiana contido em uma alça de platina foi inoculado em 25 mL do meio de titulação contendo glicose, conforme demonstrado na composição da tabela 4 abaixo, e então, foi cultivado em uma incubadora à temperatura de 37°C a 200 rpm por 48 h. Os resultados estão demonstrados na tabela 5 abaixo. Todos os valores resultantes foram valores médios obtidos de 3 frascos. Tabela 4 Tabela 5 *valor medido em 33 h ** valor medido em 48 h

[051] Conforme demonstrado na tabela 5 acima, foi confirmado que as cepas apresentando a deleção do gene de acordo com a presente invenção, apresentaram consumo de glicose aumentado em cerca de 10% em comparação com o consumo de glicose da cepa mãe. Foi também confirmado que as quantidades de triptofano produzidas nas cepas foram aumentadas em torno de 26,6% em comparação com a quantidade de triptofano produzida na cepa mãe. Estes resultados significam que, em relação aos níveis de ATP da figura 2, a atividade das cepas transformadas foi aumentada pelos níveis de ATP aumentados, e desta forma, as taxas de consumo da glicose ou a produtividade do aminoácido das cepas transformadas foram melhoradas.

[052] Deve ser compreendido que as modalidades descritas na presente invenção devem ser consideradas somente de uma forma ilustrativa e não limitante. As descrições das características ou aspectos de cada modalidade devem ser consideradas como disponíveis para outras características ou aspectos em outras modalidades. Embora uma ou mais modalidades da presente invenção tenham sido descritas com referência às figuras, deve ser compreendido pelos especialistas na área que várias modificações na forma e detalhes podem ser realizadas sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção, conforme definido pelas reivindicações abaixo. [Número de acesso] Instituição depositária: Centro de Cultura Coreana de Microrganismos (internacional) Número de acesso: KCCM11494P Data do depósito: 9 de dezembro de 2013

Claims

1. Microrganismo recombinante CARACTERIZADOpelo fato de que apresenta produtividade aumentada de um L-aminoácido, em que a atividade de adenosina deaminase de SEQ ID NO: 14 é removida pela deleção de SEQ ID NO: 13 e a atividade da AMP nucleosidase de SEQ ID NO: 16 é removida pela deleção de SEQ ID NO: 15 em comparação com uma cepa mãe, em que o microrganismo recombinante pertence ao gênero Escherichia e o L-aminoácido é L-treonina ou L-triptofano, em que o microrganismo tem produtividade aumentada de L-aminoácido em comparação com uma cepa mãe, em que a cepa mãe é um microrganismo no qual a atividade da adenosina deaminase de SEQ ID NO: 14 e a atividade da AMP nucleosidase de SEQ ID NO: 16 não são removidas.

2. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOpelo fato do microrganismo recombinante ser Escherichia coli.

3. Método de produção do L-aminoácido CARACTERIZADO pelo fato do método compreender: o cultivo do microrganismo recombinante, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, e a coleta de um L-aminoácido da cultura, em que o L- aminoácido é L-treonina ou L-triptofano.