TW201538725A - 具有提高的ｌ－胺基酸生產力的微生物和使用其的ｌ－胺基酸的生產方法 - Google Patents

具有提高的ｌ－胺基酸生產力的微生物和使用其的ｌ－胺基酸的生產方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201538725A
TW201538725A TW104108792A TW104108792A TW201538725A TW 201538725 A TW201538725 A TW 201538725A TW 104108792 A TW104108792 A TW 104108792A TW 104108792 A TW104108792 A TW 104108792A TW 201538725 A TW201538725 A TW 201538725A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
amino acid
strain
gene
producing
recombinant microorganism
Prior art date
Application number
TW104108792A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI639698B (zh
Inventor
Eun-Sung Koh
Su-Yon Kwon
Kwang-Ho Lee
Ji-Sun Lee
Juno Jang
Keun-Cheol Lee
Hyeong-Pyo Hong
Original Assignee
Cj Cheiljedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cj Cheiljedang Corp filed Critical Cj Cheiljedang Corp
Publication of TW201538725A publication Critical patent/TW201538725A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI639698B publication Critical patent/TWI639698B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/26—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons
    • C12N1/28—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons aliphatic
    • C12N1/30—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons aliphatic having five or less carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
    • C12Y302/02004—AMP nucleosidase (3.2.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04004—Adenosine deaminase (3.5.4.4)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本發明揭露一種具有提高的L-胺基酸生產力之重組型微生物及使用所述重組型微生物之L-胺基酸生產方法，其中將所述重組型微生物轉型以使腺苷脫胺酶及AMP核苷酶中之至少一者的活性被消除或降低。使用所述重組型微生物能夠以高效方式生產所述L-胺基酸。

Description

具有增強L-胺基酸生產力的微生物和使用其的L-胺基酸的生產方法
本發明是關於一種具有提高的L-胺基酸可生產性之微生物和使用所述微生物之L-胺基酸生產方法。
腺苷-5'-三磷酸(Adenosine-5'-triphosphate；ATP)具有高能磷酸鍵且在ATP水解成腺苷二磷酸(adenosine diphosphate；ADP)及磷酸時產生能量。ATP為所有活生物體之主要能源。ATP藉由微生物內之電子傳輸系統、受質層次磷酸化或其類似物合成。ATP在細胞退化時供應其所需的能量，且隨後經由醣解或氧化磷酸化過程連續地進行再循環。另外，根據提高的ATP生物合成，已知藉由醱酵產生適用代謝物之微生物需要更多ATP類能量。
在這一方面，本發明之發明人在細胞內增加一定比例之ATP(其為生產L-胺基酸最常用的能源)以便確認ATP對生產L- 胺基酸之效應，進而完成本發明。
本發明提供一種根據其中ATP含量增加而具有提高的L-胺基酸可生產性的重組型微生物。
本發明提供一種使用所述重組型微生物之L-胺基酸生產方法。
根據本發明之一態樣，揭露一種具有提高的L-胺基酸可生產性之重組型微生物，其中腺苷脫胺酶及AMP核苷酶中之至少一者的活性被消除或降低。
如本文所使用，術語「腺苷脫胺酶(adenosine deaminase；Add)」是指存在於細胞溶質中且參與一部分嘌呤代謝之酶。Add可在腺苷之C-6位置上起作用，因此使結合至C-6位置之胺基進行脫胺基，且在這一方面，Add可具有催化腺苷+H2O→肌核苷+NH3之轉化反應的作用，導致產生肌核苷及銨。
Add之胺基酸序列可由已知資料庫提供，諸如NCBI之Genbank，但資料庫不限於此。詳言之，Add可包含胺基酸序列SEQ ID NO：14，或與胺基酸序列SEQ ID NO：14具有約80%或大於80%、90%或大於90%、或大於95%的序列一致性之胺基酸序列。另外，具有序列一致性之所述胺基酸序列包含其中一部分序列缺失、經修飾、經取代或經添加之胺基酸序列。Add之序列可包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO：14之聚核苷酸序列。編碼Add蛋白質 之聚核苷酸序列稱為add基因(NCBI基因ID：12931257)。舉例而言，編碼Add蛋白質之add基因的序列可包含聚核苷酸序列SEQ ID NO：13，或與聚核苷酸序列SEQ ID NO：13具有約80%或大於80%、90%或大於90%、或95%或大於95%序列一致性之聚核苷酸序列。具有序列一致性之所述鹼基序列包含其中一部分序列缺失、經修飾、經取代或經添加之鹼基序列。
本文中所使用的術語「AMP核苷酶(AMP nucleosidase；Amn)」是指屬於水解酶家族之酶，例如水解N-糖基化合物之醣苷酶，且亦稱作腺苷酸核苷酶。Amn可參與一部分嘌呤代謝。舉例而言，Amn可具有催化AMP+H2OD-核糖5-磷酸+腺嘌呤之轉化反應的作用。另外，當編碼Amn之amn基因為不活化時，細胞內之ATP含量可能增加。
Amn之胺基酸序列可由已知資料庫提供，諸如NCBI之GenBank，但資料庫不限於此。詳言之，Amn可包含胺基酸序列SEQ ID NO：16，或與胺基酸序列SEQ ID NO：16具有約80%或大於80%、90%或大於90%、或大於95%的序列一致性之胺基酸序列。另外，具有序列一致性之所述胺基酸序列包含其中一部分序列缺失、經修飾、經取代或經添加之胺基酸序列。Amn之序列可包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO：16之聚核苷酸序列。編碼Amn蛋白質之聚核苷酸序列可稱為amn基因(NCBI基因ID：12931407)。舉例而言，編碼Amn蛋白質之amn基因的序列可包含聚核苷酸序列SEQ ID NO：15，或與聚核苷酸序列SEQ ID NO：15具有約80%或 大於80%、90%或大於90%、或95%或大於95%的序列一致性之聚核苷酸序列。具有序列一致性之所述鹼基序列包含其中一部分序列缺失、經修飾、經取代或經添加之鹼基序列。
在本發明中，序列一致性是指編碼蛋白質之基因之鹼基序列或胺基酸序列之相似程度。在高一致性基因之情況下，基因之表現產物可具有彼此相同或相似的活性。
在本發明中，在微生物中Add或Amn之活性可被消除或降低，且所述微生物可用於生產L-胺基酸之目的。在本發明之具有提高的L-胺基酸可生產性之重組型微生物中，Add及Amn之活性可分別或共同被消除或降低。舉例而言，在重組型微生物中，兩種蛋白質之活性均可被消除或降低。相比於其中蛋白質活性不被消除或不被降低之微生物，Add或Amn活性被消除或降低之重組型微生物導致提高的L-胺基酸可生產性。
如本文所使用，術語「L-胺基酸(L-amino acid)」是指構成生物體的主體且具有連接至同一碳原子之胺基及羧酸基之蛋白質的基礎結構單元。舉例而言，L-胺基酸可由L-白胺酸、L-苯丙胺酸、L-離胺酸、L-蘇胺酸、L-纈胺酸、L-異白胺酸、L-色胺酸以及L-甲硫胺酸所構成的族群中選出。舉例而言，L-胺基酸可為L-色胺酸或L-蘇胺酸。
如本文所使用，術語「重組型微生物(recombinant microorganism)」是指經基因修飾之微生物。重組型微生物可為經基因工程改造之微生物，且例如，可根據基因工程改造方法將外源性核酸引入微生物，或微生物中內源基因之序列或位置可經轉型。
如本文所使用，術語酶或多肽之「被消除的活性(removed activity)」是指上述蛋白質在微生物中完全不表現之情況，或上述蛋白質經表現但不具有任何活性之情況。如本文所使用，術語酶或多肽之「降低的活性(decreased activity)」是指上述蛋白質經表現，但其活性相比於固有活性較弱之情況。術語「被消除的活性」或「被降低的活性」可與術語「不活化(inactivation)」或「活性較弱(weakness of activity)」替換。如本文所使用，術語「固有活性(intrinsic activity)」是指微生物在天然狀態下之活性，亦即微生物中最初存在之活性，或不經基因修飾之蛋白質活性。
Add或Amn之活性被消除或降低可由各編碼Add或Amn之基因之缺失或修飾造成。本文中所使用之術語「基因之缺失或修飾(deletion or modification of gene)」是指基因之啟動子或終止子區域上之部分或所有基因或調節因子突變、經取代、缺失或插入至少一個鹼基，使得基因不表現或基因少量表現，或使得基因在不展示酵素活性之情況下表現或以減小的酵素活性表現。基因之缺失或破壞可藉由基因操作，諸如同源重組、突變誘發或分子進化達成。當細胞包含多個相同基因或具有不同多肽之至少兩個同源基因時，可移除或破壞細胞中之一或多個基因。在一例示性實施例中，編碼Add之add基因或編碼Amn之amn基因可藉由同源重組自微生物之基因組移除，或可具有經修飾之起始密碼子。
如本文所使用，術語「具有提高的L-胺基酸可生產性之重組型微生物(recombinant microorganism having enhanced producibility of the L-amino acid)」是指能夠自含於培養基中之碳源生產並積聚L-胺基酸之微生物。相比於其中酶活性未經修飾之 微生物，Add或Amn活性被消除或降低之重組型微生物導致提高的L-胺基酸可生產性。在一例示性實施例中，已確認，相比於蘇胺酸產生菌株及色胺酸產生菌株之母菌株，具有上文所描述之不活化酶的蘇胺酸產生菌株及色胺酸產生菌株各具有提高的蘇胺酸及色胺酸可生產性。
重組型微生物可為艾氏菌屬(Escherichia)、腸細菌屬(Enterbacter)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、沙雷菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)以及短桿菌屬(Brevibacterium)之微生物。舉例而言，重組型微生物可為艾氏菌屬之微生物。艾氏菌屬之微生物可為大腸桿菌(E.coli)，例如KCCM11494P。KCCM11494P為藉由使用作為母菌株之蘇胺酸產生菌株(KCCM10910P)且執行add及amn基因的缺失而製備的KCCM10910P△add△amn菌株。此處，發現蘇胺酸在KCCM11494P中之產量大於在母菌株(KCCM10910P)中之產量。
KCCM11494P命名為『大腸桿菌CA03-8254P』，且隨後根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)在2013年12月9日寄存於韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms)(在下文中稱為『KCCM』)。
根據本發明之另一態樣，揭露一種用於生產L-胺基酸之組成物，其中所述組成物包含重組型微生物。如本文所使用，術語「用於生產L-胺基酸之組成物(composition for producing the L-amino acid)」是指使用生產L-胺基酸之重組型微生物或重組型微生物之培養產物能夠生產呈代謝物形式之L-胺基酸的組成物。生產L-胺基酸之重組型微生物與上文所描述之定義相同。L-胺基 酸可由例如L-白胺酸、L-苯丙胺酸、L-離胺酸、L-蘇胺酸、L-纈胺酸、L-異白胺酸、L-色胺酸以及L-甲硫胺酸所構成的族群中選出。舉例而言，L-胺基酸可為L-蘇胺酸或L-色胺酸。如本文所使用，術語「培養產物(culture product)」是指含有重組型微生物之液體(broth)培養物、移除微生物細胞之培養上清液或所述培養產物之經稀釋溶液。組成物可更包含用於增加L-胺基酸生產力之成分。舉例而言，組成物可更包含碳源、氮源或微量元素成分。碳源可包含例如碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉以及纖維素；脂肪，諸如大豆油、葵花油、蓖麻油以及椰子油；脂肪酸，諸如棕櫚酸、硬脂酸以及亞麻油酸；醇，諸如丙三醇及乙醇；以及有機酸，諸如乙酸，或其組合。重組型微生物之培養可藉由使用葡萄糖作為碳源執行。氮源可包含例如有機氮源，諸如蛋白腖、酵母萃取物、肉汁(gravy)、麥芽萃取物、玉米漿(corn steep liquor；CSL)以及大豆粉；及無機氮源，諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨以及硝酸銨；或其組合。組成物可包含磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀作為磷源。另外，組成物可包含對應於磷源之含鈉鹽，及諸如硫酸鎂或硫酸鐵等金屬鹽。另外，培養基可包含胺基酸、維生素以及適當前驅物。
根據本發明之另一態樣，揭露一種L-胺基酸之生產方法，所述方法包含：培養生產L-胺基酸之重組型微生物；及自培養產物收集L-胺基酸。
生產L-胺基酸之重組型微生物與上文所描述之定義相同。
L-胺基酸可由例如L-白胺酸、L-苯丙胺酸、L-離胺酸、 L-蘇胺酸、L-纈胺酸、L-異白胺酸、L-色胺酸以及L-甲硫胺酸所構成的族群中選出。舉例而言，L-胺基酸可為L-蘇胺酸或L-色胺酸。重組型微生物之培養可根據所屬領域中熟知之適當培養基及培養條件達成。另外，本領域中具有通常知識者可根據所選擇的微生物適當調節培養基及培養條件。培養方法可包含分批培養、連續培養、分批補料培養或其組合。
培養基可包含多種碳源、氮源以及微量元素成分。
碳源可包含例如碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉以及纖維素；脂肪，諸如大豆油、葵花油、蓖麻油以及椰子油；脂肪酸，諸如棕櫚酸、硬脂酸以及亞麻油酸；醇，諸如丙三醇及乙醇；以及有機酸，諸如乙酸，或其組合。重組型微生物之培養可藉由使用葡萄糖作為碳源執行。氮源可包含例如有機氮源，諸如蛋白腖、酵母萃取物、肉汁、麥芽萃取物、玉米漿(CSL)以及大豆粉；及無機氮源，諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨以及硝酸銨；或其組合。培養基可包含磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀作為磷源。另外，培養基可包含對應於磷源之含鈉鹽及諸如硫酸鎂或硫酸鐵等金屬鹽。另外，培養基可包含胺基酸、維生素以及適當前驅物。培養基或培養基之個別成分可以分批或連續方式添加至培養基中。
另外，在以適當方式培養重組型微生物期間，可將諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸以及硫酸之化合物添加至培養基中以便調節培養基之pH。另外，在培養重組型微生物期間可使用諸如脂肪酸聚乙二醇酯之消泡劑以便抑制氣泡產生。為了維持培養基之有氧條件，可將氧氣或含氧氣體(例如空氣)注入培養基中。 此處，培養基之溫度可典型在約20℃至約45℃，例如約25℃至約40℃範圍內。培養重組型微生物之時間可持續直至獲得所需量之L-胺基酸，且舉例而言，重組型微生物之培養可持續約10小時至約160小時。
自培養產物收集L-胺基酸可藉由所屬領域中已知之適當培養方法，諸如分批培養、連續培養或分批補料培養執行以便收集或回收培養產物中產生之L-胺基酸。
根據一態樣，具有被消除或降低之選自腺苷脫胺酶及AMP核苷酶之至少一種蛋白質之活性的微生物可用於生產L-胺基酸。
根據另一態樣，用於生產L-胺基酸之組成物或生產L-胺基酸之方法可用於以有效方式生產L-胺基酸。
圖1為展示在根據本發明執行基因缺失後L-蘇胺酸產生菌株中之ATP含量的曲線圖。
圖2為展示在根據本發明執行基因缺失後L-色胺酸產生菌株中之ATP含量的曲線圖。
在下文中，將參考以下實例進一步詳細地描述本發明。這些實例僅為達成說明之目的，且不意欲限制本發明之範疇。
實例1：製備L-蘇胺酸產生菌株及L-色胺酸產生菌株，各菌株具有由add基因或amn基因編碼之蛋白質之減弱活性
在L-蘇胺酸產生菌株(亦即KCCM10910P(韓國專利特許公開公開案第2009-0076389號)及KCCM-10132(韓國專利特許公開公開案第2000-0013853號))以及L-色胺酸產生菌株(亦即KCCM10812P(韓國專利第10-0792095號))中，各編碼Add及Amn之基因藉由同源重組缺失。待缺失之add基因及amn基因各包含鹼基序列SEQ ID NO：13及鹼基序列SEQ ID NO：15。
詳言之，使用一步不活化(one step inactivation)，其為使用由達特森科KA(Datsenko KA)等人(美國國家科學院院刊(Proc Natl Acad Sci USA),(2000)97：6640-6645)開發之λ Red重組酶構築突變體之技術。為了確認擴增產物插入基因中，使用pUCprmfmloxC之耐氯黴素基因作為標記物(韓國專利第2009-007554號)。隨後，藉由在以下條件下使用作為模板之pUCprmfmloxC、具有這兩種基因之一部分鹼基序列及pUCprmfmloxC之耐氯黴素基因之一部分鹼基序列的引子組SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2以及引子組SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8來執行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction)(在下文中稱為「PCR」)：30個循環，每個循環包括在94℃下變性持續30秒，在55℃下退火持續30秒，以及在72℃下伸長持續1分鐘，以產生大致1,200bp的基因片段之擴增。
在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳藉由PCR擴增獲得之DNA片段，溶離且將其用作二次PCR之模板。藉由在以下條件下使用作為模板之經溶離之原始PCR產物、具有原始DNA片段之5'及3' 區域的20bp互補序列且進一步具有基因之5'及3'區域的引子組SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4、引子組SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10來執行二次PCR：30個循環，每個循環包括在94℃下變性持續30秒，在55℃下退火持續30秒，以及在72℃下伸長持續1分鐘，以產生大致1,300bp的4種類型基因片段之擴增。在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳自其獲得之DNA片段、溶離且用於重組。
將根據由達特森科KA(Datsenko KA)等人(美國國家科學院院刊，(2000)97：6640-6645)開發之方法用pKD46質體轉型之大腸桿菌製備成勝任菌株，且藉由引入藉由PCR獲得之1,300bp基因片段執行轉型。在補充有氯黴素之LB培養基上選擇所得菌株。因此，基因之缺失藉由使用引子組SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6以及引子組SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12利用PCR獲得的大致1,440bp及2,104bp之PCR產物來確認。
在移除pKD46質體之後，將pJW168質體引入具有氯黴素抗性之原始重組型大腸桿菌菌株，以便自所述菌株移除氯黴素標記基因(基因(Gene),(2000)247,255-264)。在最後獲得的微生物細胞中，基因之缺失藉由使用引子組SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6以及引子組SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12利用PCR獲得的大致340bp及1,004bp之PCR產物來確認。
amm基因之缺失以與上文所描述相同之方式，藉由使用add基因缺失之菌株、引子組SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6以及引子組SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12執行，且因此確認這兩種基因之雙重缺失。
根據上文所描述之方法，製備6種類型之L-蘇胺酸產生 菌株，亦即KCCM10910P△add菌株、KCCM10910P△amn菌株、KCCM10910P△add△amn菌株、KCCM-10132△add菌株、KCCM-10132△amn菌株以及KCCM-10132△add△amn菌株。另外，製備3種類型之L-色胺酸產生菌株，亦即KCCM10812P△add菌株、KCCM10812P△amn菌株以及KCCM10812P△add△amn菌株。
實例2.量測L-蘇胺酸產生菌株及L-色胺酸產生菌株中之ATP含量
為了定量發現於實例1之菌株中之實際ATP含量，根據螢光素酶之用途，使用由青隆Y(KIYOTAKA Y)等人開發之『用於定量測定細胞ATP合成活性之有效方法(Efficient Method for Quantitative determination of Cellular ATP Synthetic Activity)』(J Biom Scre,(2006)V11：第3期：PP310-17)。在含葡萄糖之LB液體培養基中，隔夜培養各具有不同基因轉型之實例1之菌株。在藉由離心移除上清液之後，用100mM Tris-Cl(pH 7.5)溶液洗滌微生物細胞，且隨後用可滲透(PB)緩衝溶液(40%[v/v]葡萄糖、0.8%[v/v]曲拉通X-100(Triton X-100))處理30分鐘，進而將細胞內ATP傳輸至外部。在再次藉由離心分離上清液之後，使所得物與螢光素混合，所述螢光素用作螢光素酶之受質。在反應10分鐘之後，藉由使用光度計量測螢光素酶之顯色度，以便定量ATP含量。結果展示於圖1及圖2中。所有所得值均為藉由重複3次實驗獲得之平均值。
如圖1及圖2中所示，比較不具有基因缺失之母菌株(亦即，L-蘇胺酸產生菌株及L-色胺酸產生菌株)與實例1之菌株，已確認發現實例1之菌株中之ATP含量增加。另外，已確認，相 比於具有單個基因的缺失之菌株，具有add基因及amn基因組合缺失之菌株中之ATP含量進一步增加。
實例3.於含葡萄糖培養基中具有大腸桿菌add基因及amn基因編碼之蛋白質的減弱活性之L-蘇胺酸產生菌株之效應確認
在實例1之L-蘇胺酸產生菌株(KCCM10910P)中，add基因及amn基因分別或組合缺失，以便藉由使用葡萄糖作為碳源進行關於具有增加細胞內ATP含量之菌株的效能測試。
在33℃培育下，在LB固體培養基中隔夜培養各具有不同基因轉型之菌株。然後，將1個鉑環之各微生物細胞接種於含有如下表1之組成所示之葡萄糖之25毫升效價培養基(titer medium)中，且隨後在33℃下且以200轉/分在培育箱中培養50小時。結果展示於下表2中。所有所得值均為自3個燒瓶獲得之平均值。
如上表2中所示，已確認，與母菌株之葡萄糖消耗相比，根據本發明之具有基因缺失之菌株導致葡萄糖消耗增加約18.8%。亦確認，與母菌株中產生之蘇胺酸量相比，所述菌株中產生之蘇胺酸量增加約6.6%。這些結果表明，考慮到如圖1中所示之ATP含量，轉型菌株之活性藉由其增加之ATP含量增加，且因此，轉型菌株之葡萄糖消耗速率或胺基酸可生產性有所改良。
在這一方面，具有提高的葡萄糖消耗速率及蘇胺酸可生產性之KCCM10910P△add△amn菌株命名為『大腸桿菌CA03-8254P』(寄存編號：KCCM11494P，於2013年12月9日寄存於韓國微生物培養中心(KCCM))。
實例4.於含葡萄糖培養基中具有大腸桿菌add基因及amn基因編碼之蛋白質的減弱活性之L-蘇胺酸產生菌株之效應確認
在實例1之L-蘇胺酸產生菌株(KCCM-10132)中，add基因及amn基因分別或一起缺失，以便藉由使用葡萄糖作為碳源進行關於具有增加的細胞內ATP含量之菌株的效能測試。
在33℃培育下，在LB固體培養基中隔夜培養各具有不同基因轉型之菌株。然後，將1個鉑環之各微生物細胞接種於含有如下表1之組成所示之葡萄糖之25毫升效價培養基中，且隨後在33℃下且以200轉/分在培育箱中培養50小時。結果展示於下表3中。所有所得值均為自3個燒瓶獲得之平均值。
如上表3中所示，已確認，與母菌株之葡萄糖消耗相比，根據本發明之具有基因缺失之菌株導致葡萄糖消耗增加約13%。亦確認，與母菌株中產生之蘇胺酸量相比，所述菌株中產生之蘇胺酸量增加約6.4%。
實例5.於含葡萄糖培養基中之大腸桿菌add基因及amn基因編碼之蛋白質的減弱活性之L-色胺酸產生菌株之效應確認
在實例1之L-色胺酸產生菌株(KCCM10812P)中，add基因及amn基因分別或組合缺失，以便藉由使用葡萄糖作為碳源進行關於具有增加細胞內ATP含量之菌株的效能測試。
為了進行效能測試，將1個鉑環之各微生物細胞接種於含有如下表4之組成所示之葡萄糖之25毫升效價培養基中，且隨後在37℃下且以200轉/分在培育箱中培養48小時。結果展示於下表5中。所有所得值均為自3個燒瓶獲得之平均值。
如上表5中所示，已確認，與母菌株之葡萄糖消耗相比，根據本發明之具有基因缺失之菌株導致葡萄糖消耗增加約10%。亦確認，與母菌株中產生之色胺酸量相比，所述菌株中產生之色胺酸量增加約26.6%。這些結果表明，考慮到如圖2中所示之ATP含量，轉型菌株之活性藉由其增加之ATP含量增加，且因此，轉型菌株之葡萄糖消耗速率或胺基酸可生產性有所改良。
應理解，本文中描述之例示性實施例應僅視為描述意義，且非出於限制之目的。各實施例內之特徵或態樣描述應典型地被認為可用於其他實施例中之其他類似特徵或態樣。儘管已參考圖式描述了本發明之一或多個實施例，本領域中具有通常知識者應理解，在不背離如以下申請專利範圍所界定的本發明之精神及範圍的情況下，可以在其中進行形式及細節上的各種改變。
【生物材料寄存】
[國外寄存資訊]
寄存機構：韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms)(國際)
寄存日期：2013年12月9日
寄存編號：KCCM11494P
<110> CJ第一製糖
<120> 具有提高的L-胺基酸生產力的微生物和使用其的L-胺基酸生產方法
<130> PX048448
<150> KR 2014/033698
<151> 2014-03-21
<160> 16
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 1
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 2
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 3
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 4
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 5
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 6
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 7
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 8
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 9
<210> 10
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 10
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 11
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 12
<210> 13
<211> 1002
<212> DNA
<213> 大腸桿菌
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1002)
<223> add
<400> 13
<210> 14
<211> 333
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<400> 14
<210> 15
<211> 1455
<212> DNA
<213> 大腸桿菌
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1455)
<223> amn
<400> 15
<210> 16
<211> 484
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<400> 16

Claims (6)

  1. 一種具有提高的L-胺基酸可生產性之重組型微生物，其中包括胺基酸序列SEQ ID NO：14之腺苷脫胺酶及包括胺基酸序列SEQ ID NO：16之AMP核苷酶中之至少一者之活性經消除或減小。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之重組型微生物，其中所述L-胺基酸為L-蘇胺酸或L-色胺酸。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之重組型微生物，所述重組型微生物屬於艾氏菌屬(Escherichia)。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之重組型微生物，其中所述重組型微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)。
  5. 一種L-胺基酸生產方法，所述方法包括：培養如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之重組型微生物；以及自培養物收集L-胺基酸。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之L-胺基酸生產方法，其中所述L-胺基酸為L-蘇胺酸或L-色胺酸。
TW104108792A 2014-03-21 2015-03-19 具有提高的ｌ－胺基酸生產力的微生物和使用其的ｌ－胺基酸的生產方法 TWI639698B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
??10-2014-0033698 2014-03-21
KR1020140033698A KR101599800B1 (ko) 2014-03-21 2014-03-21 Ｌ-아미노산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201538725A true TW201538725A (zh) 2015-10-16
TWI639698B TWI639698B (zh) 2018-11-01

Family

ID=54144919

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104108792A TWI639698B (zh) 2014-03-21 2015-03-19 具有提高的ｌ－胺基酸生產力的微生物和使用其的ｌ－胺基酸的生產方法
TW106123387A TW201734199A (zh) 2014-03-21 2015-03-19 具有提高的l-胺基酸生產力的微生物和使用其的l-胺基酸的生產方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106123387A TW201734199A (zh) 2014-03-21 2015-03-19 具有提高的l-胺基酸生產力的微生物和使用其的l-胺基酸的生產方法

Country Status (16)

Country Link
US (1) US10113191B2 (zh)
EP (1) EP3119874B1 (zh)
JP (1) JP6494643B2 (zh)
KR (1) KR101599800B1 (zh)
CN (1) CN105980545B (zh)
AR (1) AR099811A1 (zh)
BR (1) BR112016017592B1 (zh)
DK (1) DK3119874T3 (zh)
ES (1) ES2728970T3 (zh)
HU (1) HUE045306T2 (zh)
MY (1) MY180267A (zh)
PL (1) PL3119874T3 (zh)
TR (1) TR201907655T4 (zh)
TW (2) TWI639698B (zh)
UA (1) UA118276C2 (zh)
WO (1) WO2015142021A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116254242B (zh) * 2022-12-21 2024-01-30 江南大学 一种atp磷酸核苷转移酶突变体及产l-组氨酸的谷氨酸棒杆菌

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1004663B1 (en) 1997-07-18 2007-02-07 Ajinomoto Co., Inc. Process and microorganism for producing purine nucleosides via fermentation
KR100270510B1 (ko) * 1998-08-14 2000-11-01 고두모 신규 미생물 및 이를 이용한 엘- 쓰레오닌의 제조방법
RU2175351C2 (ru) * 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
JPWO2002097086A1 (ja) * 2001-05-29 2005-04-07 協和醗酵工業株式会社 工業的生産に有用な微生物
KR100792095B1 (ko) 2006-12-29 2008-01-04 씨제이 주식회사 Ｌ-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주로부터유전자조작된 ｌ-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균균주 및 이를 이용한 트립토판 제조방법
KR100966324B1 (ko) 2008-01-08 2010-06-28 씨제이제일제당 (주) 향상된 ｌ－쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균 및 이를 이용한ｌ－쓰레오닌의 생산 방법
BRPI0907542A2 (pt) 2008-02-25 2015-07-28 Ajinomoto Kk Método para produzir ácido 5'-guanílico, e, microrganismo com uma capacidade de converter ácido inosínico em ácido 5'-guanílico
US8231664B2 (en) * 2009-02-26 2012-07-31 Advanced Cooling Therapy, Llc Devices and methods for controlling patient temperature
KR101261147B1 (ko) 2011-01-18 2013-05-06 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR101327093B1 (ko) 2012-01-06 2013-11-07 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산을 생산할 수 있는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
ES2728970T3 (es) 2019-10-29
HUE045306T2 (hu) 2019-12-30
WO2015142021A1 (en) 2015-09-24
KR20150109990A (ko) 2015-10-02
US10113191B2 (en) 2018-10-30
UA118276C2 (uk) 2018-12-26
EP3119874B1 (en) 2019-05-08
EP3119874A1 (en) 2017-01-25
AR099811A1 (es) 2016-08-17
US20170002388A1 (en) 2017-01-05
DK3119874T3 (da) 2019-07-22
BR112016017592B1 (pt) 2023-11-14
MY180267A (en) 2020-11-26
KR101599800B1 (ko) 2016-03-04
EP3119874A4 (en) 2017-11-15
BR112016017592A2 (pt) 2017-10-03
JP6494643B2 (ja) 2019-04-03
CN105980545A (zh) 2016-09-28
CN105980545B (zh) 2019-12-24
PL3119874T3 (pl) 2019-10-31
JP2017504349A (ja) 2017-02-09
TW201734199A (zh) 2017-10-01
TWI639698B (zh) 2018-11-01
TR201907655T4 (tr) 2019-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI694151B (zh) Ａｔｐ磷酸核糖基轉移酶變體及使用該變體製造ｌ-組胺酸之方法
JP2019047790A (ja) Ｌ−アミノ酸を生産する微生物、及びそれを利用してｌ−アミノ酸を生産する方法
CN107075454B (zh) 细胞内能量水平提高的微生物和用其生产l-氨基酸的方法
TWI639698B (zh) 具有提高的ｌ－胺基酸生產力的微生物和使用其的ｌ－胺基酸的生產方法
KR102433200B1 (ko) 히스티딘에 의한 피드백 억제가 감소된 atp-prt 변이체 및 이를 발현하는 히스티딘 생산 균주
US20240060103A1 (en) Atp-prt variant with reduced feedback inhibition by histidine, and histidine-producing strain expressing same
EP4269574A1 (en) Atp-prt variant with reduced feedback inhibition by histidine, and histidine-producing strain expressing same
US20240060104A1 (en) Atp-prt variant with reduced feedback inhibition by histidine, and histidine-producing strain expressing same
KR20220094257A (ko) 히스티딘에 의한 피드백 억제가 감소된 atp-prt 변이체 및 이를 발현하는 히스티딘 생산 균주
KR101821401B1 (ko) 비산화 펜토오스 인산 경로 관련 효소의 불활성화에 의한 히스티딘 생산능 변이 균주
WO2022210308A1 (ja) 環状リポペプチド産生微生物株、及び環状リポペプチドの製造方法
KR20230108789A (ko) L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아 속 변이주 및 이를 이용한 l-히스티딘의 생산 방법
KR20230108790A (ko) L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아 속 변이주 및 이를 이용한 l-히스티딘의 생산 방법
OA20586A (en) An improved method for high level production of CRM
KR20120033807A (ko) 박테리아 변이 균주를 이용한 이소루신 생산