CN107849094B - 葡糖酸阻抑物变体、包含其的产生l-赖氨酸的微生物和产生l-赖氨酸的方法 - Google Patents

葡糖酸阻抑物变体、包含其的产生l-赖氨酸的微生物和产生l-赖氨酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107849094B
CN107849094B CN201680035755.2A CN201680035755A CN107849094B CN 107849094 B CN107849094 B CN 107849094B CN 201680035755 A CN201680035755 A CN 201680035755A CN 107849094 B CN107849094 B CN 107849094B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lysine
ala
leu
microorganism
producing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680035755.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107849094A (zh
Inventor
朴相喜
金亨俊
金男贤
文准玉
吴政锡
柳松基
崔香
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=56616452&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN107849094(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by CJ CheilJedang Corp filed Critical CJ CheilJedang Corp
Publication of CN107849094A publication Critical patent/CN107849094A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107849094B publication Critical patent/CN107849094B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/26—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having more than one amino group bound to the carbon skeleton, e.g. lysine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及新型葡糖酸阻抑物变体、包含其的微生物和使用该微生物产生L‑赖氨酸的方法。

Description

葡糖酸阻抑物变体、包含其的产生L-赖氨酸的微生物和产生 L-赖氨酸的方法
[技术领域]
本发明涉及新型葡糖酸阻抑物变体、包含其的微生物和使用该微生物产生L-赖氨酸的方法。
[背景技术]
为了大量产生有用的产物比如氨基酸，在棒状杆菌属菌株中调节葡萄糖摄取和戊糖磷酸化途径是非常重要的(Handbook of Corynebacterium glutamicum.2005.215-240)。
葡糖酸阻抑物(GntR)是通过葡萄糖摄取和戊糖磷酸化途径调节碳流量的重要调节蛋白。已知的是两种葡糖酸阻抑物(GntR1和GntR2)在谷氨酸棒状杆菌菌株中发现。
GntR1和GntR2强力地抑制编码与葡糖酸代谢有关的葡糖酸通透酶(gntP)、葡糖酸激酶(gntK)和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(gnd)的基因的表达，并且起微弱地抑制tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子——其是戊糖磷酸化途径的主要基因——表达的作用。同时，编码磷酸转移酶系统(PTS)——其是棒状杆菌属菌株的主要糖输注(sugar-infusion)代谢途径——的葡萄糖特异性转运酶II(ptsG)和蔗糖特异性转运酶II(ptsS)的基因的表达被促进以显著地参与糖输注(Julia Frunzke,Verena Engels,Sonja Hasenbein,Cornelia Gatgens andMichael Bott,Molecular Microbiology(2008)67(2),305-322)。
[发明内容]
[技术问题]
本发明人已经尝试找到对L-赖氨酸生产力具有有效作用的基因并研发了新型变体葡糖酸阻抑物1(GntR1)，并且确认了包含其的产生L-赖氨酸的微生物与包括野生型葡糖酸阻抑物1的微生物相比增强了糖消耗速率和L-赖氨酸生产力，并且从而本发明人完成了本发明。
[技术方案]
本发明的目标是提供葡糖酸阻抑蛋白的新型变体。
本发明的另一个目标是提供编码该变体的多核苷酸和包括该多核苷酸的表达载体。
本发明的仍另一个目标是提供产生L-赖氨酸的微生物，其表达葡糖酸阻抑蛋白的变体。
本发明的又另一目标是提供用于产生L-赖氨酸的方法，其包括：(a)在培养基中培养产生L-赖氨酸的微生物；和(b)从步骤(a)中的培养的微生物或培养基回收L-赖氨酸。
[有益效果]
根据本发明的包含葡糖酸阻抑物变体的产生L-赖氨酸的微生物与不包含该变体的微生物相比展现了改善的糖消耗速率并且可以导致L-赖氨酸的有效产生。具体而言，L-赖氨酸是动物饲料的必需氨基酸和需要在工业上大量生产，并且当L-赖氨酸根据本发明以高效率生产时，其还可以降低生产饲料的成本。
[最佳模式]
本发明的实施方式提供了葡糖酸阻抑蛋白的新型变体。
如本文所使用，术语“葡糖酸阻抑蛋白”指的是参与葡糖酸代谢或糖摄取的调节蛋白。葡糖酸阻抑蛋白不被具体地限制，但是可以是属于棒状杆菌属的微生物，具体地，衍生自谷氨酸棒状杆菌的葡糖酸阻抑蛋白。更具体地，葡糖酸阻抑蛋白可以是衍生自谷氨酸棒状杆菌的GntR1蛋白，但是不限于此。葡糖酸阻抑蛋白可以是，但不限于，包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的GntR1。例如，葡糖酸阻抑蛋白可以是如此氨基酸序列：其包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列并具有至少80％、具体地至少90％、更具体地至少95％并且甚至更具体地至少99％的同源性。此外，包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的葡糖酸阻抑蛋白可以由包括SEQID NO:3的核苷酸序列的gntR1基因编码，但是不限于此。例如，其可以是SEQ ID NO:3的核苷酸序列或者可以是具有至少80％、具体地至少90％、更具体地至少95％并且甚至更具体地至少99％的同源性的核苷酸序列。
如本文所使用，术语“同源性”指的是两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性百分比。来自一个部分与另一个部分的序列之间的同源性可以由已知的技术测定。例如，同源性可以通过比对序列信息和使用可容易得到的计算机程序直接地比对两个多核苷酸分子或两个多肽分子之间的序列信息来测定。计算机程序可以是BLAST(NCBI)、CLC MainWorkbench(CLC bio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc.)等。进一步，多核苷酸之间的同源性可以通过如下步骤测定：在同源区之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，然后解离单链特异性核酸酶来测定解离片段的大小。
葡糖酸阻抑蛋白的变体可以是如此多肽：在其中用除了精氨酸之外的氨基酸置换精氨酸(R)——其是SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的第102个氨基酸。具体地，葡糖酸阻抑蛋白的变体可以是包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，其中位置102处的氨基酸被半胱氨酸(C)置换。
葡糖酸阻抑蛋白的这样的变体不仅包括含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，还包括具有80％或更多、具体地90％或更多、更具体地95％或更多、甚至更具体地99％或更多的同源性的变体，并且实质上，显而易见的是在本发明的范围内包括具有如下生物学活性的氨基酸序列：其与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质相同或对应，即使在序列中的一些具有氨基酸序列的缺失、修饰、置换或添加的情况下。
本发明的另一个实施方式是编码葡糖酸阻抑蛋白的变体的多核苷酸和包括该多核苷酸的表达载体。
葡糖酸阻抑蛋白和其变体如上面所描述。
具体地，编码葡糖酸阻抑蛋白的变体的多核苷酸可以是编码包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，或者可以是具有至少80％、具体地至少90％、更具体地95％、甚至更具体地至少99％的同源性的多核苷酸。编码葡糖酸阻抑蛋白的变体的多核苷酸可以具有例如SEQ ID NO:2的核苷酸序列，但是不限于此。
如本文所使用，术语“多核苷酸”指的是核苷酸的聚合物，在其中核苷酸单元在长链中通过共价键连接。一般而言，其指的是长于某一长度的DNA或RNA链。由于遗传密码的遗传密码简并性，多核苷酸可以具有多个编码同一氨基酸序列的核苷酸序列。此外，根据宿主细胞的类型，可以采用密码子优化的序列以优化表达。
如本文所使用，术语“载体”指的是用于将多核苷酸克隆和/或转移入宿主细胞的任意核酸分子。载体可以是可以引起另一DNA片段的连接片段复制的复制子。“复制单元”指的是任何遗传单元(例如，质粒、噬菌体、黏粒、染色体和病毒)。在本发明中，载体不被具体地限制，只要其在宿主中是可复制的，并且可以使用本领域中已知的任何载体。用于构建重组载体的载体可以是天然或重组状态的质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、Charon4A、Charon21A等可以被用作噬菌体载体或黏粒载体，并且可以使用pDZ载体、pBR系统、pUC系统、pBluescriptII系统、pGEM系统、pTZ系统、pCL系统、pET系统等作为质粒载体。可利用的载体不被具体地限制，并且可以使用已知的表达系统。具体地，可以使用pDZ(韩国登记的专利号10-0924065；通过引用以其全部被并入本文)，但是不限于此。
如本文所使用，术语“转化”通过将编码葡糖酸阻抑蛋白的变体的多核苷酸引入宿主细胞使得该多核苷酸可以在宿主细胞中表达进行，并且被转化的多核苷酸——只要其可以在宿主细胞中表达——非限制性地包括被插入染色体中或者位于染色体外面的那些。
多核苷酸可以以表达盒的形式被引入宿主细胞，该表达盒是包含对于其自身表达必需的所有元件的构建体。该表达盒通常可以包括可操作地连接至基因的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。进一步，多核苷酸可以自身被引入宿主细胞或者以表达盒的形式被引入宿主细胞并且可操作地连接至对于在宿主细胞中表达必需的序列，但是不限于此。
本发明的另一个实施方式是表达葡糖酸阻抑蛋白的变体的产生L-赖氨酸的微生物。
葡糖酸阻抑蛋白和其变体已经在上面描述。
如本文所使用，术语“L-赖氨酸”是必需氨基酸，其在体内不合成为碱性的α-氨基酸，并且指的是具有化学式NH2(CH2)4CH(NH2)COOH的一类氨基酸。L-赖氨酸通过赖氨酸生物合成途径由草酰乙酸生物合成，并且NADPH依赖性还原酶催化赖氨酸生物合成的中间过程。在一个分子的L-赖氨酸生物合成的过程中，三个分子的NADPH直接地被糖酶消耗，并且间接地使用一个分子的NADPH。
微生物可以包括葡糖酸阻抑蛋白通过突变的变体，或者可以转化有包括编码葡糖酸阻抑蛋白的变体的多核苷酸的载体。
微生物包括具有葡糖酸阻抑蛋白的突变活性的蛋白质，或原核微生物和真核微生物——如果该微生物被转化使得糖基转移酶蛋白被表达的话。例如，可以包括微生物菌株比如埃希氏杆菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、肠道菌属、沙门氏菌属、链霉菌属、假单胞菌属、短杆菌属或棒状杆菌属等。具体地，它们可以是属于棒状杆菌属的微生物，并且更具体地可以是谷氨酸棒状杆菌，但是不限于此。
当本发明的葡糖酸阻抑蛋白的突变蛋白包含在产生L-赖氨酸的微生物中时，与包含野生型葡糖酸阻抑蛋白的微生物相比，L-赖氨酸生产能力可以通过有效地消耗糖类而增加。
如果产生L-赖氨酸的微生物具有L-赖氨酸生产能力，则其可以包括任何类型的微生物，并且包括所有形式的天然菌株和重组菌株。
能够具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属的微生物可以是对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变菌株。L-赖氨酸类似物抑制棒状杆菌(Coryne)微生物的生长，但是当L-赖氨酸共存于培养基中时，这种抑制被完全地或部分地清除。L-赖氨酸类似物的实例包括氧杂L-赖氨酸(oxa L-lysine)、L-赖氨酸异羟肟酸、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基L-赖氨酸、α-氯代己内酰胺等，但是不限于此。对这些L-赖氨酸类似物具有抗性的变体可以通过利用常规人工诱变处理来处理棒状杆菌属的微生物获得，但是不限于此。其非限制性实例包括谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(韩国登记的专利号10-0159812)、谷氨酸棒状杆菌KFCC 11001和谷氨酸棒状杆菌KCCM11347P(韩国登记的专利号10-0073610)，但是不限于此。
此外，具有产L-赖氨酸能力的棒状杆菌属的微生物可以被修饰使得与未被修饰的菌株相比，L-赖氨酸生物合成相关蛋白的活性增强。即，增强了一种或多种类型的L-赖氨酸生物合成相关基因的表达。这样的表达增强可以包括但不限于基因扩增、序列比如启动子或起始密码子的替换或变更、引入修饰以改善表达等。其非限制性实例包括谷氨酸棒状杆菌CJ3P(Binder et al.Genome Biology 2012,13:R40)，但是不限于此。
此外，L-赖氨酸生物合成相关基因的实例包括位于L-赖氨酸生物合成途径上的基因，并且具体地，二氢吡啶二羧酸合成酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、天冬氨酸酶基因(aspA)和丙酮酸羧化酶(pyc)，但是不限于此。进一步，可以参照存在于戊糖磷酸途径等上的转酮醇酶，但是基因不限于此。
同时，棒状杆菌属的微生物可以通过包括在本领域中已知的与L-赖氨酸产生有关的修饰具有L-赖氨酸生产能力，但是不限于此。
本发明的另一个方面是用于产生L-赖氨酸的方法，其包括：(a)在培养基中培养产生L-赖氨酸的微生物；和(b)从步骤(a)中的培养的微生物或培养基中回收L-赖氨酸。
L-赖氨酸和产生其的微生物如上面所描述。
如本文所使用，术语“培养”指的是在适度地人工控制的环境条件下培养微生物。本发明的培养过程可以根据本领域中已知的适合培养基和培养条件进行。条件比如具体培养温度、培育时间和培养基的pH可以根据本领域技术人员的一般知识或根据常规已知的方法实施。具体地，这些已知的培养方法在[Chmiel；Bioprozesstechnik 1.Einfuhrungindie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991),and Storhas；Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994)]中描述。进一步，培养方法包括分批培养、连续培养和补料分批培养。具体地，分批过程或补料分批或重复补料分批过程可以连续地培养，并且培养过程不限于此。
用于培养的培养基应当以适合方式满足具体菌株的要求。可以被用于培养基的碳源包括糖类和碳水化合物比如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素等；油脂比如豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油等；脂肪酸比如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸等；甘油；醇类比如乙醇；和有机酸比如乙酸，但是不限于此。这些物质可以单独使用或作为混合物使用，但是不限于此。可以使用的氮源包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等，但是不限于此，并且氮源也可以单独使用或作为混合物使用。可利用的磷源包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或对应的含钠盐等，但是不限于此。进一步，培养基可以包含金属盐比如硫酸镁或硫酸铁，但是盐不限于此。最后，除了上述物质之外，可以使用必需生长物质比如氨基酸和维生素。进一步，适合的前体可以被用于培养基。上述原料可以在培育过程中被分批或连续添加至培养箱，但是不限于此。
此外，化合物比如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸可以在培养期间被适当地添加至培养箱以调节培养基的pH。在培育期间，泡沫的产生可以通过使用消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇来抑制。进一步，为了维持培养箱或培育的需氧条件，氧或含氧气体可以被加入至培养箱，或者为了维持厌氧条件，氮气、氢气或二氧化碳气体可以被注入或者可以不注入气体。培育的温度通常在20℃至40℃之间，具体地30℃至35℃之间，但是不限于此。培育周期可以继续直到取得期望量的有用物质，并且具体地可以是10小时至100小时。L-赖氨酸可以从培养基排出或者包含在微生物中。
此外，本发明的用于产生L-赖氨酸的方法或者从培养基中回收L-赖氨酸的方法在本领域中是众所周知的。对于回收L-赖氨酸的方法，可以使用过滤、阴离子交换色谱法、结晶和HPLC等，但是方法不限于这些实例。
[最佳模式]
在下文，将通过下列实施例更详细地描述本发明。但是，这些实施例意欲以示例性方式阐明本发明，并且本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1：制备重组谷氨酸棒状杆菌基因组DNA文库
在本实施例中，为了发现L-赖氨酸的生产能力和发现对生产力具有有益效果的基因和变体，在通过N-甲基-N-硝基-N-硝基胍(NTG)对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株诱导人工突变之后，通过在本领域中常规已知的提取方法提取基因组DNA。限制酶Sau3AI被应用至制备的DNA以获得具有1kb至3kb大小的部分片段。在将片段连接至大肠杆菌和棒状杆菌的转化体穿梭载体pECCG122的限制酶BamHI末端之后，它们被转化至大肠杆菌DH5α并且涂抹至包含卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基。在通过PCR(使用SEQ ID NO:5和6的引物)选择转化入载体——其插入有片段——的菌落(colony)之后，所有这些被混合在一起以通过通常已知的提取方法提取质粒。
SEQ ID NO 5:TCAGGGTGTAGCGGTTCGGTTTAT
SEQ ID NO 6:CCGCGCGTAATACGACTCACTATA
实施例2：引入人工变体文库和产L-赖氨酸能力增强
通过使KCCM11016P菌株作为亲本菌株(该微生物被公开为KFCC10881并且再保藏至布达佩斯条约下的国际保藏机构和分配登录号KCCM11016P，韩国专利登记号10-0159812)，制备的载体被转化并涂抹至下面的复合平板培养基。
<复合平板培养基>
葡萄糖20g、(NH4)2SO4 50g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 5g、K2HPO4 10g、MgSO4 7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸(chloride acid)硫胺素盐1,000μg、钙-泛酸2,000μg、烟酰胺2,000μg、琼脂20g和卡那霉素25mg(1L蒸馏水)。
大约10,000个菌落被接种至每个300μL的选择培养基并且在96深孔板中在32℃、1,000rpm下培养大约16小时。为了分析在培养期间产生的L-赖氨酸的产量，使用茚三酮方法(J.Biol.Chem.1948.176:367-388)。在完成培养之后，10μL的培养上清液和190μL的茚三酮反应溶液(63％甘油，27％茚三酮溶液)在65℃下反应30分钟，在570nm的波长下通过分光光度计测量吸光度，并且与对照组(KCCM11016P/pECCG122)的吸光度进行比较，选择展现类似或增加吸光度的248种变体菌株。在该条件下的培养期间，由于对照组菌株具有1g/L至2g/L的残留糖，每个对照组的糖消耗速率较快，并且可以选择具有增加的产赖氨酸能力的菌株。
<选择培养基(pH 8.0)>
葡萄糖10g、硫酸铵5.5g、MgSO4·7H2O 1.2g、KH2PO4 0.8g、K2HPO4 16.4g、生物素100μg、HCl硫胺素1,000μg、钙-泛酸2,000μg和烟酰胺2,000μg(1L蒸馏水标准品)。
此外，基于248种选择种类的菌株，重复进行该方法。结果，选择上面的29个种类的变体菌株，其与KCCM11016P/pECCG122菌株相比L-赖氨酸的生产能力增强超过10％。
实施例3：选择的人工变体菌株的产L-赖氨酸能力和糖消耗速率的分析
根据下面的方法培养实施例2的29种选择种类的菌株，并分析其产L-赖氨酸能力和糖消耗速率。
将每种菌株接种入250mL角挡板烧瓶(corner-baffle flask)并在200rpm下在30℃下振荡培养20小时。其后，将1mL的物种培养溶液接种入包含24mL生产培养基的250mL角挡板烧瓶。使用HPLC，分析L-赖氨酸的浓度，并且为了测量菌株的糖消耗速率和其生产力，测量培养溶液中剩余糖浓度/时间的浓度。
<物种培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO48g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、HCl硫胺素1,000μg、钙-泛酸2,000μg、烟酰胺2,000μg(1L蒸馏水标准品)。
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浆固体5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素盐1,000μg、钙-泛酸2,000μg、烟酰胺3,000μg和CaCO3 30g(1L蒸馏水标准品)。
在29种变体菌株中，与对照组相比，L-赖氨酸浓度高于等效水平(equivalentlevel)，并且具有增加的糖消耗速率和生产力的三种类型的菌株被选择用于重复地执行培养和分析，并且分析的结果在表1中示出。
[表1]
Figure GDA0001513623310000091
已经确认，三种菌株产生了高于对照组的等效水平的L-赖氨酸，并且每个单位小时的消耗速率通过改善发酵生产力而增强。在选择的变异菌株中，最终选择了具有最有价值地(meaningfully)增强的生产力的菌株KCCM11016P/1160，并且质粒被提取以在引起糖消耗速率和生产力增加的基本基因水平下探索核苷酸序列突变。其后，使用SEQ ID NO:5和6分析核苷酸序列。衍生自KCCM11016P/1160的质粒包含NCgl2440基因ORF起始密码子上游的大约450bp区至终止密码子下游的大约350bp附近。进一步，通过基于NationalInstitutes of Health(NIH)GenBank的基因的核苷酸序列分析，基因被确认为gntR1，其是葡糖酸阻抑物的一种，并且被引入至KCCM11016P/1160菌株的gntR1变异在第304个核苷酸序列处从C被置换为T，并且已经确认了第102个氨基酸从精氨酸突变为半胱氨酸。
即，已经确认了精氨酸——其为具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的gntR1的第102个氨基酸——被置换为半胱氨酸。
实施例4：用于将gntR1变异引入产L-赖氨酸菌株的染色体的载体制备
为了确认在实施例3中确认的gntR1变异的应用效果，制备了可以将其引入染色体的载体。
基于报告的核苷酸序列，合成引物(SEQ ID NO:7)，其中EcoRI限制酶区被插入5’端并且SalI限制酶区被插入3’端。使用这样的引物对，通过使KCCM11016P/1160的质粒作为模板进行PCR以扩增gntR1基因片段。PCR条件为在94℃下变性5分钟；重复如下周期30次：在94℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，和在72℃下聚合40秒；并且聚合反应在72℃下进行7分钟。
SEQ ID NO:7:AAGAATTCAGCAGATCGAAGAAGAAGC
SEQ ID NO:8:AAGTCGACGGGACTAAAAGCTGGCG
在利用限制酶EcoRI和SalI处理利用PCR扩增的基因片段之后，获得每个DNA片段，并且在将其连接至具有限制酶EcoRI和SalI端的pDZ载体(韩国专利登记号10-0924065)之后，其被转化至大肠杆菌DH5α并且涂抹(blot out)在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。在通过PCR选择了转化有载体——靶基因插入其中——的菌落之后，使用公知的质粒提取方法，获得质粒，并且根据被插入质粒的gntR1中的变异，其被命名为pDZ-gntR1(R102C)。
实施例5：制备菌株并比较生产力，在该菌株中gntR1变异被引入L-赖氨酸生产菌株KCCM11016P
根据两步同源染色体重组，将在实施例4中制备的新型变体引入载体转化入L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P。其后，其中引入染色体上的gntR1变异的菌株根据染色体序列分析进行选择，并且其中引入gntR1变异的菌株被命名为KCCM11016P::gntR1(R102C)。
通过利用与实施例3中相同的方法进行培养，L-赖氨酸的浓度和残留糖浓度从其测量。此外，为了确认来自原糖(raw sugar)的培养效果，原糖生产培养基代替葡萄糖生产培养基被用于使用相同的方法进行分析[表2]。
<原始糖生产培养基(pH 7.0)>
原糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浆固体5g、酶3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素盐1,000μg、钙-泛酸2,000μg、烟酰胺3,000μg、CaCO330g(1L水平的蒸馏水)。
[表2]
Figure GDA0001513623310000111
结果，确认了糖消耗速率增加而不影响L-赖氨酸生产能力——KCCM11016P::gntR1(R102C)多于KCCM11016，KCCM11016是葡萄糖和原始糖培养基中的对比组。进一步，作为确认所有葡萄糖和原始糖被消耗的时间点的结果，对比组在72小时和68小时之后被完全消耗，并且分别产生了43.5g/L和47.0g/L的L-赖氨酸，在60小时和58小时之后gntR1变异引入菌株产生了43.9g/L和47.4g/L的L-赖氨酸。即，在其中引入gntR1变异的菌株的情况下，确认了利用葡萄糖和原糖根据时间L-赖氨酸的生产能力分别增加21％和18％[表3]。
[表3]
菌株编号 生产能力(g/h) ％
葡萄糖 KCCM11016P 0.60 100
KCCM11016P::gntR1(R102C) 0.73 121
原糖 KCCM11016P 0.69 100
KCCM11016P::gntR1(R102C) 0.82 118
从上面的结果可以看出，gntR1变异的引入具有在相同水平下的L-赖氨酸生产能力并且在葡萄糖和原糖消耗速率方面是有效的。即，当本发明的gntR1变异被引入时，建议了在L-赖氨酸生产能力方面的效率的卓越性。因此，本发明人命名KCCM11016P::gntR1(R102C)为谷氨酸棒状杆菌“CA01-2293”，其具有增强的葡萄糖消耗速率和生产力，并且在2014年12月5日，其被给予登录号KCCM11628P，在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏。
实施例6：制备菌株并比较生产力，在该菌株中gntR1变异被引入L-赖氨酸生产菌株
为了确定在属于谷氨酸棒状杆菌的其它菌株的效果，制备菌株并命名为KCCM11347P::gntR1(R102C)，在该菌株中gntR1变异被引入谷氨酸棒状杆菌KCCM11347P(该微生物被公开为KFCC10750并且再保藏至布达佩斯条约下的国际保藏机构并分配登录号KCCM11347P，韩国专利登记号10-0073610)。使用与实施例5中相同的方法，培养制备的菌株，并比较赖氨酸生产能力和残留糖[表4]。
[表4]
Figure GDA0001513623310000121
Figure GDA0001513623310000131
结果，与实施例5中相同，确认了与对比组相比，在葡萄糖和原糖方面，所有葡萄糖消耗速率增加。进一步，作为确定葡萄糖和原糖全部被消耗的时间点的结果，在72小时和69小时下对比组完全消耗了糖，并产生了38.6g/L和41.3g/L的L-赖氨酸，并且gntR1变异在61小时和58小时下产生了38.7g/L和41.4g/L的L-赖氨酸。即，在其中引入gntR1变异的菌株的情况下，在葡萄糖和原糖方面根据时间L-赖氨酸的生产力被确认为分别增加18％和19％[表5]。
[表5]
菌株编号 生产力(g/h) ％
葡萄糖 KCCM11347P 0.54 100
KCCM11347P::gntR1(R102C) 0.63 118
原糖 KCCM11347P 0.60 100
KCCM11347P::gntR1(R102C) 0.71 119
实施例7：制备菌株并比较生产力，在该菌株中gntR1变异被引入L-赖氨酸生产菌株CJ3P
为了确认在属于谷氨酸棒状杆菌的其它菌株中的效果，制备菌株并将其命名为CJ3P::GntR1(R102C)，在该菌株中gntR1变异被引入谷氨酸棒状杆菌CJ3P(Binder etal.Genome Biology 2012,13:R40)。CJ3P菌株是具有产L-赖氨酸能力的谷氨酸棒状杆菌菌株，其中3种类型的变异(pyc(Pro458Ser)、hom(Val59Ala)、lysC(Thr311Ile))基于公开的技术被引入野生型菌株。制备使用与实施例5中相同的方法制备的菌株，并且测量培养溶液中每个时间的赖氨酸生产能力和残留糖的浓度[表6]。
[表6]
结果，与实施例5和6类似，确认了与对照组相比，gntR1变异插入菌株中的糖消耗速率增加。进一步，作为确认葡萄糖和原糖全部被消耗的时间点的结果，在对照组中在48小时和42小时下葡萄糖和原糖完全被消耗，并且分别产生8.2g/L和8.8g/L的L-赖氨酸，和gntR1(R102C)插入菌株分别在42小时和38小时下产生了8.4g/L和9.0g/L的赖氨酸。即，在其中引入gntR1变异的菌株的情况下，确认了根据时间L-赖氨酸的产生速率分别增加17％和13％[表7]。
[表7]
Figure GDA0001513623310000142
Figure GDA0001513623310000151
因此，从上面的结果，当gntR1变异被引入棒状杆菌属中的赖氨酸生产菌株中时，确认了由于在糖消耗速率方面的增加，赖氨酸生产速率被有效地增强。
从上文，本发明所属领域的技术人员将能够理解在不修改本发明的技术构思或基本特征的情况下，本发明可以以其它特定的形式体现。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅仅出于说明性目的并且不应当被解释为限制本发明的范围。相反，本发明意欲不仅覆盖示例性实施方式而且覆盖各种替代方案、修改、等价物和可以包含在本发明的精神和范围内的由所附权利要求书限定的其它实施方式。
Figure GDA0001513623310000161
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 葡糖酸阻抑物变体、包含其的产L-赖氨酸的微生物和使用该微生物产生L-赖氨酸的方法
<130> OPA15327-PCT
<150> KR 10-2015-0055495
<151> 2015-04-20
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GntR1 (R102C)
<400> 1
Met Thr Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly
20 25 30
Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu
35 40 45
Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu
50 55 60
Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg
65 70 75 80
Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys
85 90 95
Ser Ile Ile Arg Trp Cys Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala
115 120 125
Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg
130 135 140
Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala
145 150 155 160
Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu
165 170 175
Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser
180 185 190
Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro
195 200 205
Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu
210 215 220
Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn
225 230 235 240
Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn
245 250
<210> 2
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gntR1(R102C)
<400> 2
atgaccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60
aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120
gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggcat ttcccgcaca 180
gtggcacgcg aagcgatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240
attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300
tggtgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360
attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420
gagaaaatcc gcgcgctcgc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480
tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcact ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540
aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600
ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660
gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720
gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753
<210> 3
<211> 753
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 3
atgaccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60
aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120
gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggcat ttcccgcaca 180
gtggcacgcg aagcgatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240
attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300
tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360
attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420
gagaaaatcc gcgcgctcgc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480
tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcact ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540
aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600
ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660
gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720
gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753
<210> 4
<211> 250
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 4
Met Thr Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly
20 25 30
Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu
35 40 45
Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu
50 55 60
Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg
65 70 75 80
Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys
85 90 95
Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala
115 120 125
Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg
130 135 140
Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala
145 150 155 160
Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu
165 170 175
Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser
180 185 190
Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro
195 200 205
Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu
210 215 220
Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn
225 230 235 240
Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn
245 250
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
tcagggtgta gcggttcggt ttat 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
ccgcgcgtaa tacgactcac tata 24
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
aagaattcag cagatcgaag aagaagc 27
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
aagtcgacgg gactaaaagc tggcg 25

Claims (5)

1.由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽用于与野生型葡糖酸阻抑蛋白相比在产生L-赖氨酸的棒状杆菌属的微生物中增强L-赖氨酸生产力和增加糖消耗速率的用途。
2.编码由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸用于与野生型葡糖酸阻抑蛋白基因相比在产生L-赖氨酸的棒状杆菌属的微生物中增强L-赖氨酸生产力和增加糖消耗速率的用途。
3.权利要求2所述的用途，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成。
4.权利要求1所述的用途，其中所述棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌。
5.一种用于增强L-赖氨酸生产力和增加糖消耗速率的方法，其包括
(a)培养产生L-赖氨酸的表达具有葡糖酸阻抑物活性的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽的棒状杆菌属的微生物；和
(b)从步骤(a)中的培养的微生物或培养基中回收L-赖氨酸。
CN201680035755.2A 2015-04-20 2016-03-11 葡糖酸阻抑物变体、包含其的产生l-赖氨酸的微生物和产生l-赖氨酸的方法 Active CN107849094B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2015-0055495 2015-04-20
KR1020150055495A KR101640711B1 (ko) 2015-04-20 2015-04-20 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법
PCT/KR2016/002480 WO2016171392A1 (ko) 2015-04-20 2016-03-11 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107849094A CN107849094A (zh) 2018-03-27
CN107849094B true CN107849094B (zh) 2020-01-14

Family

ID=56616452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680035755.2A Active CN107849094B (zh) 2015-04-20 2016-03-11 葡糖酸阻抑物变体、包含其的产生l-赖氨酸的微生物和产生l-赖氨酸的方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US10253339B2 (zh)
EP (1) EP3287469B1 (zh)
JP (1) JP6465997B2 (zh)
KR (1) KR101640711B1 (zh)
CN (1) CN107849094B (zh)
BR (1) BR112017022528A2 (zh)
DK (1) DK3287469T3 (zh)
ES (1) ES2745561T3 (zh)
HU (1) HUE045394T2 (zh)
MY (1) MY176584A (zh)
PL (1) PL3287469T3 (zh)
RU (1) RU2681475C1 (zh)
WO (1) WO2016171392A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540261B (zh) * 2020-11-24 2024-02-02 北京化工大学 一种产氨基己二酸的基因工程菌
WO2023041425A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Evonik Operations Gmbh Method for the fermentative production of l-lysine using c. glutamicum strains expressing modified gluconate repressor proteins gntr1 and gntr2
KR20230053351A (ko) * 2021-10-14 2023-04-21 대상 주식회사 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
CN115490761B (zh) * 2021-11-01 2023-06-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 基于赖氨酸外排蛋白构建的重组微生物及生产赖氨酸的方法
KR20230161244A (ko) * 2022-05-18 2023-11-27 씨제이제일제당 (주) 신규한 글루타메이트 글루코네이트 리프레서 변이체 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법
KR20230161245A (ko) * 2022-05-18 2023-11-27 씨제이제일제당 (주) 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1108790A2 (en) * 1999-12-16 2001-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel polynucleotides
CN1596267A (zh) * 2001-11-05 2005-03-16 巴斯福股份公司 来自谷氨酸棒状杆菌的编码调节蛋白的基因
CN102741393A (zh) * 2010-07-15 2012-10-17 Cj第一制糖株式会社 L-赖氨酸生产率提高的微生物以及用其生产l-赖氨酸的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3008549B2 (ja) * 1991-03-06 2000-02-14 味の素株式会社 発酵法によるｌ−リジンの製造法
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
EP1362866A1 (en) * 2002-05-16 2003-11-19 Basf Aktiengesellschaft Use of the repressor glxR for the synthesis of lysine in Corynebacterium glutamicum
WO2008033001A1 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Cj Cheiljedang Corporation A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1108790A2 (en) * 1999-12-16 2001-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel polynucleotides
US7332310B2 (en) * 1999-12-16 2008-02-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Mutant of homoserine dehydrogenase from Corynebacterium and DNA encoding thereof
CN1596267A (zh) * 2001-11-05 2005-03-16 巴斯福股份公司 来自谷氨酸棒状杆菌的编码调节蛋白的基因
CN102741393A (zh) * 2010-07-15 2012-10-17 Cj第一制糖株式会社 L-赖氨酸生产率提高的微生物以及用其生产l-赖氨酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Co-ordinated regulation of gluconate catabolism and glucose uptake in Corynebacterium glutamicum by two functionally equivalent transcriptional regulators, GntR1 and GntR2;Julia Frunzke等;《Molecular Microbiology》;20071106;第62卷(第2期);305–322 *
transcriptional regulator [Corynebacterium glutamicum];NCBI Reference Sequence: WP_011015190.1;《GenBank：WP_011015190.1》;20130515;序列 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL3287469T3 (pl) 2020-06-15
US20180100173A1 (en) 2018-04-12
KR101640711B1 (ko) 2016-07-19
CN107849094A (zh) 2018-03-27
HUE045394T2 (hu) 2019-12-30
JP2018512877A (ja) 2018-05-24
WO2016171392A1 (ko) 2016-10-27
DK3287469T3 (da) 2019-11-04
JP6465997B2 (ja) 2019-02-06
EP3287469A1 (en) 2018-02-28
BR112017022528A2 (pt) 2019-02-19
EP3287469A4 (en) 2018-10-03
RU2681475C1 (ru) 2019-03-06
MY176584A (en) 2020-08-17
ES2745561T3 (es) 2020-03-02
EP3287469B1 (en) 2019-08-07
US10253339B2 (en) 2019-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107849094B (zh) 葡糖酸阻抑物变体、包含其的产生l-赖氨酸的微生物和产生l-赖氨酸的方法
JP6998466B2 (ja) クエン酸シンターゼの活性が弱化された変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－アミノ酸生産方法
CN105483145B (zh) 利用具有产生l-赖氨酸能力的微生物产生l-赖氨酸的方法
JP6625133B2 (ja) ピルビン酸デヒドロゲナーゼ変異体、それを含む微生物及びそれを用いるｌ−アミノ酸生産方法
AU2016284767B2 (en) Microorganisms for producing putrescine or ornithine and process for producing putrescine or ornithine using them
KR20130082124A (ko) 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법
CN114729012A (zh) L-苏氨酸输出蛋白变体和使用其生产l-苏氨酸的方法
JP2019030316A (ja) Ｌ−リシン生産能を有する微生物及びそれを用いたｌ−リシンの生産方法
CN114729338B (zh) 变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽和使用其生产l-苏氨酸的方法
KR101564753B1 (ko) 코리네형 세균 유래의 치환된 개시코돈을 포함하는 재조합 벡터, 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용한 아미노산의 생산방법
JP7308296B2 (ja) メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－トレオニン生産方法
JP2023506053A (ja) クエン酸シンターゼの活性が弱化した新規な変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－アミノ酸生産方法
RU2819442C1 (ru) Микроорганизм, обладающий усиленной способностью продуцировать L-аминокислоту с разветвленной цепью, и способ получения L-аминокислоты с разветвленной цепью с его использованием
RU2817768C2 (ru) Микроорганизм, обладающий усиленной способностью продуцировать L-аминокислоту с разветвленной цепью, и способ получения L-аминокислоты с разветвленной цепью с его использованием
KR102673796B1 (ko) 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
CN115175993B (zh) 柠檬酸合酶活性减弱的新型修饰多肽及使用其生产l-氨基酸的方法
CN115702244A (zh) L-支链氨基酸生产能力增强的微生物和利用其生产l-支链氨基酸的方法
BR112019009942B1 (pt) Micro-organismo do gênero corynebacterium que produz l-lisina e método para produzir l-lisina

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant