CN107779459A - 葡萄糖脱氢酶dna分子、载体和菌株及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及生产葡萄糖脱氢酶的DNA分子、蛋白或多肽序列，载体和菌株及应用。所述葡萄糖脱氢酶DNA分子，其碱基序列为SEQ ID NO.1所示；或者选自编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。本发明将突变体基因同质粒pBAD进行连接更加稳定，而且在阿拉伯糖的诱导下，发酵酶活更高，可达到2400U/mL以上，具有表达量高，发酵控制简单等特点，适宜规模化生产。

Description

葡萄糖脱氢酶DNA分子、载体和菌株及应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种生产葡萄糖脱氢酶的突变体和工程菌的构建方法，尤其涉及一种生产葡萄糖脱氢酶的DNA分子、蛋白或多肽序列，载体和菌株及应用。
背景技术
(1)高血脂作为现代社会危害人类健康的三大(三高：高血糖、高血脂、高血压)杀手之一，作为医疗诊治的重要对象。高脂血症常引起动脉粥样硬化进而导致冠心病、高血压和脑血管疾病。他汀类药物是降血脂的首选药物作用。目前已上市或正处于开发中的他汀类药物有罗素伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀、匹伐他汀等多种。他汀类药物全球产值可达到200亿美元。
目前他汀类药物的合成工艺路线存在可改进的地方，A6到A7以及C2到C3步骤，采用深冷条件下硼烷还原，对设备要求高且生产不安全。美国专利US5399722、US5286883、中国专利200610027347.0报道这类合成方法。
(2)度洛西汀是一种5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂，是一种抗抑郁药；孟鲁司特是一种对阿斯匹林敏感的哮喘患者以及预防运动诱发的支气管收缩进行治疗的药物。两种药物全球产值均可达到40亿美元。两个产品工艺均采用深冷条件下硼烷还原，对设备要求高且生产不安全。
(4)近年来，随着生物工程技术的迅猛发展，一些葡萄糖脱氢酶的基因工程菌相继出现，一方面酶活不断提高，另一方面应用工艺不断改进，使得利用葡萄糖脱氢酶和酮基还原酶偶联共催化合成他汀类药物和治疗抑郁症的度洛西汀(Duloxetine)和治疗哮喘孟鲁司特(Montelukast)中间体，简化了操作过程，降低了生产成本，具有广阔的应用前景。
(5)中国发明专利201510195643提供了一株葡萄糖脱氢酶重组大肠杆菌E.coliRIL/pET-R-SD-AS-G，将葡萄糖脱氢酶与(R)-羰基还原酶共表达方式，利用培养后的重组菌株，以2-羟基苯乙酮为底物，催化不对称转化反应。本发明没有对葡萄糖脱氢酶基因进行定点突变，所采用的表达系统也不同于本发明采用的pBAD+MC1061，所产生的酶催化的底物也不一样。
(6)中国发明专利201510098687同时具有羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌的方法产物光学纯度e.e％最高可达99.4％，相比现有技术均有了显著的提高。所采用的载体为pET-SsCR-GDH，与本发明采用的pBAD+MC1601不同，也没有采用定点突变方法改造脱氢酶，底物只针对4-氯-乙酰乙酸乙酯，应用工艺也不尽相同，未见规模化报道。
(7)中国发明专利201410758942提供了一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组菌E.coil BL21，并且公开了其构建方法。其SyS1酶活力为3.7U/g，SyGDH酶活力为44.1U/g。其方法是采用优化密码子在pETDuet-Sygdh-Sys1构建的，与本发明采用蛋白质结构比对筛选特殊氨基酸方法快速筛选突变体的方法不同。
(8)中国发明专利201410759167公开了一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌系统，在质粒pETDuet-Sygdh-Sys1共表达含有羰基还原酶(SyS1)基因和葡萄糖脱氢酶(SyGDH)基因。酮基还原酶的底物是针对2-氯-间氯苯乙酮。所用质粒和底物与本发明不一样，也未提及定点突变方法。
上述多项专利报道表明，利用基因工程方法可成功表达葡萄糖脱氢酶基因，但均没有通过蛋白质结构功能区域的分析，选择突变点构建突变体的方法报道。
发明内容
本发明所解决的现有技术的问题是：现有技术中葡萄糖脱氢酶的基因工程菌的比酶活低，表达不稳定，不易实现产业化的缺陷。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶的突变体及突变体的新型、高效构建方法，所发明的工程菌发酵操作简便、表达系统稳定，适合大规模生产。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；或者选自编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。
优选的，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代的一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质的第149位为亮氨酸，第170位为赖氨酸。
优选的，碱基序列SEQ ID NO.1利用SEQ ID NO.3序列的149位氨基酸和170位氨基酸突变得到。
优选的，用于149位氨基酸突变的引物序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
优选的，用于170位氨基酸突变的引物序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。
第二方面，本发明提供了一种蛋白质或者多肽序列，选自以下多肽或蛋白质中的一种：
(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。
优选的，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质的第149位为亮氨酸，第170位为赖氨酸。
第三方面，本发明还提供了一种载体，其将如下所述的DNA分子作为目的基因，通过同质粒结合得到；
所述DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；或者选自编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。
优选的，所述质粒含有阿拉伯糖操纵子作为启动子。
更优选的，所述质粒为pBAD质粒。
第四方面，本发明还提供了一种生产葡萄糖脱氢酶的菌株，所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli.A149-170，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2016102。
第五方面，本发明还提供了以上所述的生产葡萄糖脱氢酶的菌株在葡萄糖脱氢酶发酵领域中的应用。
优选的，所述菌株发酵时添加外源诱导剂阿拉伯糖。本发明所取得的有益效果是：
(1)本发明将突变体基因同质粒pBAD进行连接更加稳定，而且在阿拉伯糖的诱导下，发酵酶活更高，可达到2400U/mL以上，本发明选取的以阿拉伯糖为诱导剂的大肠杆菌表达系统(pBAD+MC1061)具有表达量高，发酵控制简单等特点，而且由于以阿拉伯糖作为诱导剂，避免了进口乳糖的使用，将生产成本降低了10-20％，操作简便，更适宜规模化生产。
(2)本发明提供了一种生产葡萄糖脱氢酶的菌株，其发酵酶活高，催化活性高，同时提供了一种突变体的新型、高效构建方法。
(3)本发明所提供的葡萄糖脱氢酶可以同酮基还原酶连用，既可以用于他汀类脂肪烃酮基中间体底物的生物催化合成，也可适用于治疗抑郁症类药物芳基酮和治疗哮喘类药物噻吩类酮基中间体的生物催化合成，催化效率高，底物适应性强。
保藏信息
本发明所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli.A 149-170，保藏编号为CCTCCNO:M2016102，保藏日期为2016年3月10日，保藏中心为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编：430072，电话：(027)-68752319。
具体实施方式
如上所述，本发明的目的在于：提供一种生产葡萄糖脱氢酶的DNA分子、蛋白或多肽序列，重组质粒和菌株，及其构建方法和应用。
本发明首次报道了以枯草芽孢杆菌中获得的葡萄糖脱氢酶(GlcDH)基因为已知序列，通过在NCBI基因库中筛选出同源性较高的16个葡萄糖脱氢酶基因对应的氨基酸序列，通过对氨基酸中氢键、辅酶与葡萄糖氢酶的结合位点、亚基相互作用分析，选取149，170和252的3个突变位点，设计单突变体、双突变体、三突变体共7个突变体，进行基因突变，获得比酶活高的基因片段。
本发明找到一个表达效果好的大肠杆菌表达系统(pBAD+MC1061)，可以将葡萄糖脱氢酶突变基因连接，并以阿拉伯糖为诱导剂，进行表达。
本发明筛选出比酶活高的突变体(A 149-170)，获得了发酵稳定，酶活高的基因工程菌。
其中，所述生产葡萄糖脱氢酶的菌株的构建方法，通过将目的基因片段同载体连接，得到重组载体，然后转化到大肠杆菌中，得到生产葡萄糖脱氢酶的菌株。
其中，本发明筛选出的目的基因序列为SEQ ID NO.1所示：
其中，SEQ ID NO.1基因对应的编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示：
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。但是这些实施例仅为本发明的代表举例而已，不应理解为本发明实施的限定范围。此外，凡是对本发明实施例的简单替换或变化，均属于本发明的保护范围。本发明实施例中所用的材料以及仪器均为本领域技术人员常用的材料和仪器。例如，质粒载体pBAD Myc-HisA质粒，MC1061感受态细胞等可以通过市售购买，例如北京华越洋生物科技有限公司等多家生物公司均有销售。本发明实施例中所用的pBAD Myc-HisA质粒，MC1061感受态细胞具体来说，是电子科技大学生命科学与技术学院的汤丽霞女士赠送的。
本发明实施例中所用的试剂和仪器信息如下：
表1本发明实施例中所用的材料及厂家名称
表2本发明所用设备的信息
名称 型号 厂家
PCR扩增仪 T100 Bio-rad
蛋白电泳仪器 Mini-protean tetra Bio-rad
磁力搅拌器 79-1 常州国华
气象色谱仪(GC) 9790 浙江福立
旋转蒸发仪 RE-3000B 巩义宇翔
实施例一
实施例一提供了一种构建本发明突变体基因的路线，如下所示：
(1)突变体基因的筛选
利用关键字“glucose dehydrogenase”在NCBI上进行搜索，比对分析后，选择枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis str.AG1839)中的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因序列作为研究模板，其中Bacillus subtilis subsp.Subtilis str.AG1839的葡萄糖脱氢酶的序列为SEQ ID NO.3，
其中，SEQ ID NO.3序列如下：
利用SEQ ID NO.3序列转换的氨基酸序列在NCBI蛋白质数据库(PDB)中搜索同源性高的蛋白质结构序列，与已知原始序列(SEQ ID NO.3)经CLUSTALW比对，将GlcDH已知序列在NCBI中BLAST后，同时通过分析蛋白质功能区域中的氢键、辅酶与葡萄糖氢酶的结合位点、亚基相互作用，选取三个氨基酸突变点，分别为V149L(gtg-cta)、R170K(cga-aag)和L252V(cta-gta)。即将149位氨基酸由缬氨酸(Val)替换为亮氨酸(Leu)，将170位氨基酸由精氨酸(Arg)替换为赖氨酸(Lys)，将252位氨基酸由亮氨酸(Leu)替换为缬氨酸(Val)。
(2)突变体的设计与构建：
对149、170和252位点的氨基酸进行7种组合方式的突变，分别为3个单突变；149-170、170-252、149-252两两组合的3个双突变和1个149-170-252结合的三突变，通过定点突变的方法，获得7种突变体目的片段。
其中，通过定点突变试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，直接通过引物设计以及PCR的方法获得突变片段。
其中定点突变时所用到的引物序列如表3所示，按照突变位点，先进行单个位点的突变，然后再进行另一位点的突变(得到双突变突变)，然后再进行第三个位点的突变(得到三位点突变)。
表3引物序列
反应体系：
PCR反应条件如下：
1)94℃，5min；
2)94℃，30sec；
3)60℃，30sec；
4)72℃，8min；
5)2)-4)循环30次
6)72℃，10min。
Taq酶，pfu酶，北京全式金生物技术有限公司
(3)工程菌的构建与筛选
第一步：分别将突变体的目的片段(即149突变片段，170突变片段，252突变片段，149-170突变片段，170-252突变片段，149-252突变片段，149-170-252突变片段)与质粒pBAD大片段混匀后，进行连接。
第二步：连接产物转化大肠杆菌
取10μL连接反应物加入到100μL感受态细菌(MC1061)中，在EP管中轻轻混匀，冰浴30min后，42℃下热击90s，取出后快速冰浴2min，使细菌冷却。加入lmL不含抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡1h。取100μL 均匀涂布于含AMP(100μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养。经电泳检测连接成功。
第三步：葡萄糖脱氢酶的摇瓶发酵及优势菌株筛选
从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含30uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在30℃、240rpm条件下，完成18-20小时的一级培养过程。接下来，将一级培养种子接种到1L含10mL阿拉伯糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养24小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为菌体：缓冲液＝1：10(m:v)的浓度超声破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得葡萄糖脱氢酶粗酶液。粗酶液经絮凝后得到葡萄糖脱氢酶酶液。通过比较酶活大小和发酵稳定性，筛选出突变体A149-170具有最高酶活。
表4不同突变片段的发酵酶活
菌株 发酵酶活(U/ml)
原始基因 550
A149突变片段 1200
A170突变片段 950
A252突变片段 430
A149-170突变片段 2500
A149-252突变片段 440
A170-252突变片段 600
A149-170-252突变片段 870
从表4可以看出，采用原始基因即未突变的片段合成的重组质粒转化到大肠杆菌之后，发酵酶活为550u/ml，而采用定点突变后的A149片段，A170片段，A149-170片段，A170-252片段，A149-170-252片段合成的重组质粒转化到大肠杆菌之后，发酵酶活均有不同程度的提高，尤其是A149片段，更重要的是A149-170片段，发酵后的酶活提高了3倍，为2500U/ml。从以上结果不 难看出，采用本实施例的方法构建的特异位点的突变片段，特定位点氨基酸的突变对发酵酶活带来了巨大的改变，显著提高了发酵酶活。
其中，酶活的测定方法如下：
A.1酶活定义
在反应温度为30℃，pH值为7.0的条件下，每分钟催化还原1mmolNAD+所需的酶量，定义为一个单位(U)。
A.2原理
经磷酸戊糖途径，葡萄糖脱氢酶特异性的氧化分解葡萄糖分子生成葡萄糖酸，同时伴随氢负离子的产生。电子受体NAD+迅速与氢负离子结合，生成还原型辅酶NADH，后者在λ＝340nm处有特征吸收。通过紫外-可见分观光度法，以时间为横坐标，OD340值为纵坐标，作线性回归曲线，求得曲线斜率。将曲线斜率代入下面的计算公式，测得葡萄糖脱氢酶的酶活大小。
A.3溶液的配置
A.3.1葡萄糖水溶液的制备：称取9.9g葡萄糖溶于50mL纯净水中得1M葡萄糖水溶液。
A.3.2磷酸钠缓冲液的制备：称取3.12g磷酸二氢钠溶于100mL纯净水中得磷酸二氢钠溶液，称取7.17g磷酸氢二钠溶于100mL纯净水中得磷酸氢二钠溶液。量取39mL磷酸二氢钠溶液和61mL磷酸二氢钠溶液混匀，加水稀释至200mL得100mmol的磷酸钠缓冲液。
A.3.3 NAD+水溶液的制备：称取6.64mgNAD+溶液1mL水溶液中得0.01mol/L的NAD+水溶液。
A.3.4酶液的制备：量取一定量的酶液(按4.1方法融化，并搅拌均匀)于25mL容量瓶中，用纯净水定溶至刻度，得稀释X倍的稀释酶液。
A.4实验操作
A.4.1向4mL体系石英比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液，2mL磷酸缓冲液，100uL葡萄糖脱氢酶液，300uL水作空白对照组。
A.4.2向4mL体系石英比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液，2mL磷酸缓冲液，100uL葡萄糖脱氢酶液，300uLNAD+水溶液作实验组。340nm波长处测OD值，每2s记一次读数，记录2min。
A.4.3平行测定三次，以时间为横坐标，OD340值为纵坐标作线性回归曲线，求得曲线斜率k1、k2、k3。
A.5酶活计算
酶活计算公式：E(U/mL)＝[ΔA/min]*[1/S]*[1/d]*[Vt/Vs]*X
ΔA/min：每分钟吸光度的变化值(曲线斜率)，ΔA/min＝(k1+k2+k3)/3
S：摩尔消光系数，S＝1
d：比色皿光径，d＝1
Vt：反应液总体积，Vt＝2.8mL
Vs：酶液体积，Vs＝0.1mL
X：酶液稀释倍数，X倍
A.6检测要求
A.6.1调节稀释倍数，吸光度值必须控制在0.2-1.2之间，且读数必须从0.200-0.220开始。
A.6.2测量完毕后，每隔30s取一个读数，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，作线性回归曲线，根据相关系数验证曲线的相关性，要求r≥0.999。
A.6.3检测同一个样品，对照组只须配一次，检测不同样品时，对照组要求重新配制。
A.6.4每次量取酶液之前，务必先将酶液融化，混合均匀后再取样，取样务必准确。
A.6.5氧化型辅酶NAD+要求现配现用，其他溶液配制后放置时间不超过1个月。
A.7结果的允许误差
平行试验相对误差为±5％。每个样品检测三次，检测结果记为En(n＝1,2,3)，其算数平均值记为则需满足要求式(Ⅰ)：
实施例二
实施例二提供了本发明实施例一制备得到的菌株所产的葡萄糖脱氢酶同原始菌株所产葡萄糖脱氢酶的比酶活比较实验。
其中，比酶活为每毫克每蛋白所含的酶活力单位数，也就是用酶活力单位除以酶蛋白的质量。
将已知序列的目的片段基因和葡萄糖脱氢酶与经过149-170双突变的突变体的基因片段，分别连接到质粒pBAD大片段，取10μL连接反应物加入到100μL感受态细菌中，在EP管中轻轻混匀，冰浴30min后，42℃下热击90s，取出后快速冰浴2min，使细菌冷却。加入lmL不含抗生素的LB液体培养基(含10μL阿拉伯糖诱导剂)，37℃，200rpm振荡1h。取100μL均匀涂布于含AMP(100μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养，得到未突变和突变的大肠杆菌基因工程菌，采用实施例一第三步葡萄糖脱氢酶的摇瓶培养中所述的方法，进行发酵，提取酶液，然后分别测定每毫升酶液中酶蛋白的质量(采用凯氏定氮法)以及每毫升酶液中酶活力单位数，，得到经过149-170双突变的菌株所产葡萄糖脱氢酶的比酶活是原始菌株产酶的比酶活的四倍(见表5)。
表5突变菌株和原始菌株的发酵比酶活
菌株 比酶活
原始菌株 210U/mg
突变菌株 850U/mg
实施例三
实施例三提供了将实施例一制备得到的葡萄糖脱氢酶在生物合成领域中的应用。
在100L发酵罐中加入2.4kg底物(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯(其浓度为67％)、25kg磷酸钠缓冲液、2kg葡萄糖固体、2kg葡萄糖脱氢酶液(2500U/ml)、9kg酮基还原酶(80U/ml)和500mg辅酶NADP+，磁力搅拌，反应温度30℃、pH＝7.0条件下进行反应。其中，气相检测条件为：色谱柱型号，HP-5，进样量1μL；进样器温度，270℃；柱箱温度，程序升温100℃保持3min，然后10℃/min升温至220℃；FID检测器温度，270℃。采用该气相检测条件检测反应完全。
然后向反应体系加入300g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次经40L、20L乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基乙酸叔丁酯粗品1850g(其浓度为80％)，计算得到化学收率(即质量收率)为92％，光学纯度99.5％以上。
(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯是一种重要的药物中间体，可以用于合成他汀类药物的中间体。从以上反应结果可以看出，本发明获得的葡萄糖脱氢酶同酮基还原酶一起可以用于他汀类脂肪烃酮基中间体底物的生物催化合成。催化效率高，底物适应性强。同时也可以用于治疗抑郁症类药物芳基酮和治疗哮喘类药物噻吩类酮基中间体的生物催化合成。本发明的菌株制得的葡萄糖脱氢酶表现出良好的生物学活性。
以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用于局限本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在发明的保护范围之内。
。

Claims (12)

1.一种葡萄糖脱氢酶DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；或者选自编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代的一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质的第149位为亮氨酸，第170位为赖氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于，碱基序列SEQ ID NO.1利用SEQ IDNO.3序列的149位氨基酸和170位氨基酸突变得到。
4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，用于149位氨基酸突变的引物序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，用于170位氨基酸突变的引物序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。
6.一种蛋白质或者多肽序列，选自以下多肽或蛋白质中的一种：
(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。
7.根据权利要求6所述的蛋白质或者多肽序列，其特征在于，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质的第149位为亮氨酸，第170位为赖氨酸。
8.一种载体，其将如下所述的DNA分子作为目的基因，通过同质粒结合得到；
所述DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；或者选自编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。
9.根据权利要求8所述的载体，所述质粒含有阿拉伯糖操纵子作为启动子，优选为pBAD质粒。
10.一种生产葡萄糖脱氢酶的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌Escherichiacoli.A149-170，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016102。
11.权利要求10所述的生产葡萄糖脱氢酶的菌株在葡萄糖脱氢酶发酵领域中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述菌株发酵时添加外源诱导剂阿拉伯糖。
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