CN111100848A

CN111100848A - 碳-碳环合酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111100848A
Application number: CN202010002339.0A
Authority: CN
Inventors: 曾英; 冯克娜; 刘吉开
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-01-02
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2040-01-02
Also published as: CN111100848B

Abstract

本发明涉及一种来源于真菌的碳‑碳环合酶，其制备方法、基因克隆、表达及用于韧革菌素类化合物的制备。本发明的碳‑碳环合酶是将真菌褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans)的菌丝匀浆上清液经过硫酸铵沉淀、离子交换层析等步骤制备而得。该酶是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，和将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由1)衍生的蛋白质。将该蛋白的编码基因导入大肠杆菌后构成的重组大肠杆菌。利用碳‑碳环合酶及重组大肠杆菌所产蛋白作为生物催化剂，在温和条件下迅速催化氧杂环庚三烯‑2(3H)‑酮发生分子内碳‑碳环合形成具有4/5融合双环内酯骨架的韧革菌素类化合物，为这类活性分子的合成提供一种新途径。

Description

碳-碳环合酶及其编码基因与应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种来源于真菌的碳-碳环合酶及其编码基因与应用。

背景技术：

碳-碳环合是天然产物生物合成中非常重要的一类反应，不仅关系到天然产物的结构多样性，还可能赋予天然产物独特的生物活性。韧革菌素(Vibralactone,1)是韧革菌属(Stereum)真菌产生的活性小分子，其4/5融合双环内酯骨架结构在天然产物中十分罕见。韧革菌素不仅结构新颖，而且显著抑制与脂肪吸收相关的胰脂肪酶活性，作为新药先导化合物在化学生物学以及化学合成领域受到持续关注(Zhou,Q.&Snider,B.B.Synthesisof(±)-vibralactone.Org.Lett.2008，10：1401-1404；Zeiler,E.et al.Vibralactone asa tool to study the activity and structure of the ClpP1P2 complex fromListeria monocytogenes.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2011，50：11001-11004；List,A.etal.Omuralide and vibralactone:differences in the proteasome-β-lactone-γ-lactam binding scaffold alter target preferences.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2014，53：571-574；Nistanaki,S.K.et al.A concise total synthesis of(±)-vibralactone.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2019,58：1724-1726.)。前期本发明人证实了韧革菌素不同寻常的生物合成途径中存在新颖的碳-碳环合反应(Yan-Long Yang et al.A Monooxygenasefrom Boreostereum vibrans Catalyzes Oxidative Decarboxylation in a DivergentVibralactone Biosynthesis Pathway.Angewandte Chemie International Edition2016,55(18):5463–5466.)，但相应的催化酶尚属未知。系统深入地发掘新酶基因，将有助于通过合成生物学设计和创造新的生物合成途径以及新的活性分子。本发明所涉及的碳-碳环合酶及其制备以及利用重组菌高效表达碳-碳环合酶并将其应用于制备韧革菌素类化合物的研究均未见文献报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种碳-碳环合酶及其编码基因与应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

碳-碳环合酶VibC，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

碳-碳环合酶VibC，其由下述方法制备而得：由发酵培养得到的褐盖韧革菌菌丝在缓冲液中匀浆，匀浆液经离心得到上清液，再经过硫酸铵沉淀或进一步用离子交换层析纯化。

所述的碳-碳环合酶的制备方法，该方法包括由发酵培养得到的褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans)菌丝在缓冲液中匀浆，匀浆液经离心得到上清液，再经过硫酸铵沉淀或进一步用离子交换层析纯化。

所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因VibC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

根据所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因VibC基因，该编码基因为如下(a)-(b)中任一项所述的基因：

(a)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1032位；

(b)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1029位。

根据所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因为如下(a)-(d)中任一所述的基因：

(a)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1032位；

(b)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1029位；

(c)在严格条件下与(a)或(b)的基因杂交且编码所述蛋白的基因，所述严格条件为用0.1×SSPE或0.1×SSC，0.1％SDS的溶液，在DNA或RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜；

(d)与(a)或(b)的基因具有80％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

扩增上述所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因全长或其任一片段的引物。

本发明同时提供了含有所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因的表达载体。

含有所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因的细胞系。

含有所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因的宿主菌。

此外，本发明还提供了韧革菌素的制备方法，该方法应用所述的碳-碳环合酶VibC或VibC重组酶，催化结构式为

的化合物3生成结构式为

的韧革菌素1。

本发明此外还提供了韧革菌素类化合物的制备方法，应用所述的碳-碳环合酶VibC或VibC重组酶，催化结构式为

的化合物3a生成结构式为

的韧革菌素类化合物1a。

本发明进一步提供了碳-碳环合酶VibC或VibC重组酶在制备韧革菌素类化合物中的应用，应用所述的碳-碳环合酶VibC或VibC重组酶作为生物催化剂，以氧杂环庚三烯-2(3H)-酮3或3a为底物，经过分子内碳-碳环合生成化合物1或1a，不添加任何辅因子，常温下5-30min发生分子内碳-碳环合生成韧革菌素类化合物。化合物1、1a、3及3a的结构式为：

本发明首次提供了一种新的碳-碳环合酶，以及所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因VibC基因，同时还提供了它们的制备方法，以及利用重组菌高效表达该碳-碳环合酶并将其应用于制备韧革菌素类化合物的方法。本发明提供了一种新酶基因，并通过合成生物学设计和创造新的生物合成途径获取新的活性分子。本发明利用碳-碳环合酶及重组大肠杆菌所产蛋白作为生物催化剂，不添加任何辅因子，在温和条件下迅速催化氧杂环庚三烯-2(3H)-酮发生分子内碳-碳环合形成具有4/5融合双环内酯骨架的韧革菌素类化合物，为这类活性分子的合成提供了一种新途径。

与化学合成韧革菌素所需多步反应、催化条件剧烈以及产物大多为消旋体相比，本发明具备的优益性主要体现在：温和的反应条件、高度专一的产物立体结构、方便快捷的操作。

附图说明：

图1碳-碳环合酶VibC催化反应的结构式。

图2碳-碳环合酶催化底物3a生成1a的LC-MS检测图

图3左：重组表达的VibC及Sh112560粗酶蛋白SDS-PAGE，M：低分子量标准蛋白；1：全菌总蛋白；2：可溶的上清蛋白(粗酶)。右：亲和层析纯化重组VibC蛋白的SDS-PAGE，M：低分子量标准蛋白；1：全菌总蛋白；2：可溶的上清蛋白(纯化前)；3和4：洗脱的杂蛋白；5：纯化的重组VibC蛋白。

图4重组VibC及Sh112560粗酶分别催化底物3生成韧革菌素的LC-MS检测图。

图5重组表达的VibC纯酶催化底物3生成韧革菌素的LC-MS原图。

图6重组VibC纯酶在氘水中将底物3转化为氘代产物1的核磁共振氢谱。

具体实施方式：

下面结合附图，用以下具体实施例对本发明的实质性内容作进一步说明，但并不以此来限定本发明。

下述实施例中，无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

本发明所依赖的遗传资源是褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans，又名Stereumvibrans)，褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans)来源于中国科学院昆明植物研究所。

实施例1：

碳-碳环合酶的制备：

在50mL预冷的缓冲液(pH7.5Hepes,25mM)中加入30g真菌褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans)菌丝进行匀浆，匀浆液在4℃下9000rpm离心15分钟，取上清液，加入硫酸铵至饱和度60％，缓慢搅拌1h后4℃下9000rpm离心15分钟，收集沉淀，脱盐，上样阴离子交换层析介质DEAE-Sepharose FF，依次用含氯化钠(0M，0.1M，0.2M，0.3M，0.4M，0.7M，1.0M)的缓冲液(pH7.5Hepes,25mM)进行分步洗脱，收集0.4M NaCl洗脱峰，通过超滤离心在4℃下6000rpm进行脱盐和浓缩，得到部分纯化的碳-碳环合酶。

上述酶液0.2ml加入0.2mM底物3a，常温(16-37℃)反应5-30min之后用乙酸乙酯萃取，收集有机相进行LC-MS检测。如图2所示，酶反应的产物峰明显，产物的准分子离子峰及保留时间与标准品1a的一致，而失活酶对照反应中没有检测到相应的产物生成。

实施例2：

VibC基因的获取与高效表达：

根据本发明前期的酶蛋白分离纯化与蛋白组学鉴定研究结果，参照褐盖韧革菌基因组草图，使用正向引物(5′-AAATGGGTCGCGGATCCATGGCAATCACCCTGTTTCTCG-3′)和反向引物(5′-AAGCTTGTCGACGGAGCTCTTACTGGGGTGTCTTGCTGA-3′)以褐盖韧革菌的第一链cDNA为模板加入PrimeSTAR HS DNA Polymerase进行PCR扩增，扩增产物经磁珠法PCR产物纯化试剂盒纯化。此外，本发明还合成了VibC的直系同源基因Sh112560(GenBank登录号：XM_007306125.1，来源于毛韧革菌Stereum hirsutum)用于后续表达与酶活鉴定。

表达载体pET-28a(+)用BamHI和SacI双酶切之后用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化，得到的线性载体用NovoRec PCR一步定向克隆试剂盒分别与上述扩增产物及合成的Sh112560基因通过同源重组反应进行连接，得到的重组质粒经测序确认插入表达载体的VibC或Sh112560编码序列和插入方向都正确。重组质粒用热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)，提取质粒酶切鉴定阳性重组菌。挑取重组菌单克隆，接种到5ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，调pH至7.0)中，37℃的恒温摇床中震荡培养过夜(12-15h)，转速200rpm。过夜培养物按1:40(0.5ml:20ml)的比例转接入20ml LB培养基中，37℃,200rpm摇菌至OD₆₀₀达到0.4-0.6之间。加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalacctopyranoside)，并将培养温度设定为16℃,转速130rpm下诱导培养24h后4℃8000rpm离心5min，收集菌体沉淀。

实施例3：

重组VibC及Sh112560粗酶的酶活检测：

经上述诱导表达的重组菌用25mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)悬浮，冰浴条件下超声破碎细胞3min后4℃12000rpm离心5min，收集上清液得到粗酶液，粗酶蛋白的SDS-PAGE电泳结果见图3(左)。取粗酶液0.2ml加入0.2mM底物3，常温反应5-30min之后用乙酸乙酯萃取，收集有机相进行LC-MS检测。如图4所示，酶反应的产物峰(3.2min)明显，产物的准分子离子峰及保留时间与韧革菌素标准品1的一致，而失活酶对照反应中没有检测到相应的产物生成。

实施例4：

重组VibC纯酶应用于韧革菌素的制备：

1、重组蛋白的纯化

表达的重组蛋白在氨基端含有His标签，因此可采用Ni-NTA His-Bind树脂进行亲和层析纯化。具体步骤：先用含5mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(25mM pH7.5,300mM NaCl)平衡层析柱，同时将上述表达菌细胞沉淀用相同的缓冲液悬浮，冰浴条件下超声处理6min后4℃12000rpm离心收集上清液即粗酶液直接上样亲和层析柱；继续用3倍柱床体积的相同缓冲液洗柱，然后用3倍柱床体积含75mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(25mM pH7.5,500mM NaCl)洗柱，去除杂蛋白；接着用含200mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(25mM pH7.5,500mM NaCl)洗脱目标蛋白并用葡聚糖凝胶G-25脱盐，最后通过4℃离心浓缩得到纯化的酶液，保存于4℃。纯化过程的SDS-PAGE电泳结果见图3(右)。

2、VibC纯酶的酶活检测：

取上述VibC纯化酶50μl(2μM)加入0.1mM现时分离纯化的底物3，常温反应5min，对照为煮沸失活的VibC纯化酶。加100μl甲醇终止反应，12000rpm离心5min，取上清液进行LC-MS检测。如图5所示，酶反应的产物峰(3.2min)明显，产物的准分子离子峰及保留时间与韧革菌素标准品1的一致，而失活酶对照反应中没有检测到相应的产物生成。因化合物3与5存在互变异构，故采用现时分离纯化的3作为底物，用甲醇终止反应后立即进行LC-MS检测，由此消除了化合物5的干扰。

3、VibC纯酶合成韧革菌素产物的核磁共振谱鉴定：

经亲和纯化的重组VibC蛋白(2μM)与6mg底物3在5ml氘水(D₂O)中28℃反应0.5h，反应产物经HPLC分离纯化得到约4.5mg产物。通过产物的核磁共振氢谱(¹H NMRspectroscopy)分析发现，产物氢谱与天然来源的韧革菌素标准品1的相符，产物碳4位的氢存在明显的氘代(图6)，符合酶反应的化学机理。由此确定酶反应产物为韧革菌素。结果表明，碳-碳环合酶无需添加任何辅因子，即能催化化合物3生成韧革菌素1。

上述实施例的检测条件均为：仪器为美国Agilent Technologies公司1290/6530UPLC-Q-TOF液相色谱-质谱联用仪。质谱条件：电离方式为双源ESI；能量3500V；正模式；质量范围50-500。液相色谱条件：ZORBAX Eclips Plus C18Rapid Resolution HD柱(50mm×2.1mm×1.8μm)；柱流量为0.3mL/min；进样量1.0μL；化合物1a及标准品采用25％甲醇75％水进行层析洗脱；化合物1及标准品采用43％甲醇57％水进行层析洗脱；样品与标准品同时检测。

从上述试验可以得出结论：本发明的碳-碳环合酶，名称为VibC，来源于韧革菌科真菌褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans，又名Stereum vibrans)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由1)衍生的蛋白质。

为了使1)中的VibC便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签序列。

表1.标签的序列

上述2)中的VibC可人工合成，也可先合成其编码基因，再通过生物表达得到。

上述2)中的VibC的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第1-1032位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述2)的蛋白具体可以是在所述1)的蛋白质的C-端带上6个His标签的蛋白。

上述蛋白的编码基因(VibC基因)具体可以为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1032位；

2)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1029位；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)的基因具有80％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列1由1032个碱基组成，其开放阅读框(ORF)为自5′末端第1-1032位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的VibC蛋白。

在GenBank数据库中进行的序列比对分析表明，该VibC基因(序列1所示的基因)与同属的毛韧革菌(Stereum hirsutum)基因Sh112560(GenBank登录号：XM_007306125.1)的核苷酸及其编码氨基酸的序列同源性分别为87％和93％，都属于alpha/beta水解酶(alpha/beta-hydrolase)基因家族，但相应的催化功能未知。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

扩增上述VibC基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述VibC基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体具体可为在pET-28a(+)的BamHI和SacI酶切位点间插入上述基因得到的重组表达载体。所述重组菌是将上述的重组载体导入大肠杆菌得到的重组大肠杆菌。

本发明的一种表达上述VibC蛋白的方法，是将上述的重组菌进行液体培养，得到重组表达的蛋白。所述液体培养的条件是：0.1-1mM IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalacctopyranoside)诱导剂，培养温度15-30℃，培养时间12-24h。

上述蛋白在合成韧革菌素类化合物中的应用也属于本发明的保护范围之内。

实验证明：本发明提供的碳-碳环合酶以及重组大肠杆菌所产蛋白能够催化碳-碳键的形成，通过液相色谱与质谱联用(LC-MS)以及核磁共振谱鉴定产物证实，上述蛋白通过形成分子内碳-碳键将氧杂环庚三烯-2(3H)-酮转化为具有4/5融合双环内酯骨架的韧革菌素。反应结构式如图1所示。

序列表

<110> 中国科学院昆明植物研究所

中国科学院昆明植物研究所

<120> 碳-碳环合酶及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1032

<212> DNA

<213> 褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans)

<400> 1

atggcaatca ccctgtttct cgacgagggt ctctccaccg cccatccgga atttgcaccc 60

gtctgggctg cattcccaca gccgaccgac cccttccctc ctcttgaggc ccgtcgcgcc 120

ttctgggatg aggtcgtcat ccctaacctg aacaaattcc tcgagccaag cctaccgtcg 180

gaggaccgct accggctaga ggattattat atccccgtcg agggcaccaa catgcatgtt 240

cgaacctata tccctacatc cagccctgac aagaccaaga cttaccctct tttgtactgg 300

gtccactgtg ggggatgggc cattgggaac tacgaaatgg acgactatga cttaagaatt 360

atttgtgaca agctgcaagt ttgcgctgtc tccatagact ataggcttac accggaatct 420

tcctcgccta cgggtgcgaa agatgtatat gccggcctga aatgggctgc tgccaacgcg 480

ggttcgttca acgccgaccc taagaaaggc ttcgtcatcg ctggtcaatc cgcgggtggc 540

aatctctccc tcatcgccgc gcactgggcc cgagatgatc ctttcttcgc gaatacgcct 600

ttgactggac agctcgtcca gtaccctccg acctgtcatc cggaagctat gcctgaagag 660

tacaaatcgt gcatcaagtc gatggaggag tgcagggacg ctccgctcct gagcaagaag 720

gaagtgtact ggttcaacga actcgcgaac cctgcggatc cccacgaccc ttcttttagc 780

ccgctgctct tcccttcgca tgcgaacctt ccgcctttgt tctttatgtc ttgtggatgg 840

gatcctctcc gtgatgaagg cttgctttac cacgcgttgg tcaaggaggc gggtgtagag 900

accaggatga cgatgtaccc gggtgtacca catgcatttc atatgctttt ccggtccatg 960

aagttggcac aaaagttcca ggaggagacc atcgaaggga tgagctggct cttcagcaag 1020

acaccccagt aa 1032

<210> 2

<211> 343

<212> PRT

<213> 褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans)

<400> 2

Met Ala Ile Thr Leu Phe Leu Asp Glu Gly Leu Ser Thr Ala His Pro

1 5 10 15

Glu Phe Ala Pro Val Trp Ala Ala Phe Pro Gln Pro Thr Asp Pro Phe

20 25 30

Pro Pro Leu Glu Ala Arg Arg Ala Phe Trp Asp Glu Val Val Ile Pro

35 40 45

Asn Leu Asn Lys Phe Leu Glu Pro Ser Leu Pro Ser Glu Asp Arg Tyr

50 55 60

Arg Leu Glu Asp Tyr Tyr Ile Pro Val Glu Gly Thr Asn Met His Val

65 70 75 80

Arg Thr Tyr Ile Pro Thr Ser Ser Pro Asp Lys Thr Lys Thr Tyr Pro

85 90 95

Leu Leu Tyr Trp Val His Cys Gly Gly Trp Ala Ile Gly Asn Tyr Glu

100 105 110

Met Asp Asp Tyr Asp Leu Arg Ile Ile Cys Asp Lys Leu Gln Val Cys

115 120 125

Ala Val Ser Ile Asp Tyr Arg Leu Thr Pro Glu Ser Ser Ser Pro Thr

130 135 140

Gly Ala Lys Asp Val Tyr Ala Gly Leu Lys Trp Ala Ala Ala Asn Ala

145 150 155 160

Gly Ser Phe Asn Ala Asp Pro Lys Lys Gly Phe Val Ile Ala Gly Gln

165 170 175

Ser Ala Gly Gly Asn Leu Ser Leu Ile Ala Ala His Trp Ala Arg Asp

180 185 190

Asp Pro Phe Phe Ala Asn Thr Pro Leu Thr Gly Gln Leu Val Gln Tyr

195 200 205

Pro Pro Thr Cys His Pro Glu Ala Met Pro Glu Glu Tyr Lys Ser Cys

210 215 220

Ile Lys Ser Met Glu Glu Cys Arg Asp Ala Pro Leu Leu Ser Lys Lys

225 230 235 240

Glu Val Tyr Trp Phe Asn Glu Leu Ala Asn Pro Ala Asp Pro His Asp

245 250 255

Pro Ser Phe Ser Pro Leu Leu Phe Pro Ser His Ala Asn Leu Pro Pro

260 265 270

Leu Phe Phe Met Ser Cys Gly Trp Asp Pro Leu Arg Asp Glu Gly Leu

275 280 285

Leu Tyr His Ala Leu Val Lys Glu Ala Gly Val Glu Thr Arg Met Thr

290 295 300

Met Tyr Pro Gly Val Pro His Ala Phe His Met Leu Phe Arg Ser Met

305 310 315 320

Lys Leu Ala Gln Lys Phe Gln Glu Glu Thr Ile Glu Gly Met Ser Trp

325 330 335

Leu Phe Ser Lys Thr Pro Gln

340

Claims

1.碳-碳环合酶VibC，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.碳-碳环合酶VibC，其特征在于其由下述方法制备而得：由发酵培养得到的褐盖韧革菌菌丝在缓冲液中匀浆，匀浆液经离心得到上清液，再经过硫酸铵沉淀或进一步用离子交换层析纯化。

3.权利要求1或2所述的碳-碳环合酶的制备方法，其特征在于该方法包括由发酵培养得到的褐盖韧革菌菌丝在缓冲液中匀浆，匀浆液经离心得到上清液，再经过硫酸铵沉淀或进一步用离子交换层析纯化。

4.权利要求1或2所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因VibC基因，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

5.根据权利要求4所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因VibC基因，其特征在于：该编码基因为如下(a)-(b)中任一项所述的基因：

(a)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1032位；

(b)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1029位。

6.根据权利要求4所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因VibC基因，其特征在于：该编码基因为如下(a)-(d)中任一所述的基因：

(a)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1032位；

(b)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1029位；

(d)与(a)或(b)的基因具有80％以上的同源性且编码所述蛋白的基因，

7.含有权利要求4或5或6所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因的表达载体。

8.含有权利要求4或5或6所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因的细胞系。

9.含有权利要求4或5或6所述的碳-碳环合酶VibC的编码基因的宿主菌。

10.韧革菌素的制备方法，其特征在于应用权利要求1或4所述的碳-碳环合酶VibC或来源于VibC基因的VibC重组酶，催化结构式为

的化合物3生成结构式为

的韧革菌素1。

11.韧革菌素类化合物的制备方法，其特征在于应用权利要求1或4所述的碳-碳环合酶VibC或来源于VibC基因的VibC重组酶，催化结构式为

的化合物3a生成结构式为

的韧革菌素类化合物1a。

12.权利要求1或4所述的碳-碳环合酶VibC或或来源于VibC基因的VibC重组酶在制备韧革菌素类化合物中的应用，其特征在于应用权利要求1或4所述的碳-碳环合酶VibC或VibC重组酶作为生物催化剂，以氧杂环庚三烯-2(3H)-酮3或3a为底物，经过分子内碳-碳环合生成化合物1或1a，不添加任何辅因子，常温下5-30min发生分子内碳-碳环合生成韧革菌素类化合物。化合物1、1a、3及3a的结构式为：