JPWO2008120554A1 - 新規アミダーゼ、その遺伝子、ベクター、形質転換体、及びそれらを利用した光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列表配列番号1に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)配列表配列番号1に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有るポリペプチド、
(c)配列表配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド。
(a)ラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有する、
(b)SDS−PAGEにより測定した分子量が52kDa程度である、
(c)ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適pHが8〜9である、
(d)ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適温度が50℃である、
(e)pH7付近において50℃以下の温度で安定である。
(a)配列表配列番号2に示す塩基配列を含むDNA、
(b)配列表配列番号2に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(c)配列表配列番号2に示した塩基配列と70%以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
本発明は、以下の理化学的性質を有する新規アミダーゼに関するものである。
(a)ラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有する。
(b)SDS−PAGEにより測定した分子量が52kDa程度である。
(c)ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適pHが8〜9である。
(d)ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適温度が50℃である。
(e)pH7付近において50℃以下の温度で安定である。
(1)細胞形態 0.8〜1.0×1.5〜2.5μmの桿状。
(2)運動性はない。
(3)胞子はない。
(4)グラム染色:陰性
(5)コロニーの形態:円形、レンズ状、全縁滑らか、黄色
B.生理学的性質
(1)ゼラチンの加水分解:陰性
(2)デンプンの加水分解:陰性
(3)硝酸塩の還元:陽性
(4)カタラーゼ活性:陽性
(5)オキシダーゼ活性:陽性
(6)ウレアーゼ活性:陰性
(7)O−F試験:酸化、発酵共に陰性
(8)炭水化物の分解:Tween80は加水分解しない。アドニトール、サリシン、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、マンノース、ラフィノース、サッカロース、マルトース、セロビオース、ガラクトース、ラクトース、グリセロール、D−リボース、L−アラビノースからは酸を生成しない。フラクトースを酸化する。
1.分子量:52000(SDS−PAGEにより測定)
200000(ゲルろ過法により測定)
2.サブユニット構成:4量体
3.アミダーゼ反応至適pH:pH8.0〜9.0
4.アミダーゼ反応至適温度:50℃
5.熱安定性:50℃以下で安定である。
6.基質特異性:ニペコタミド、N−ベンジルニペコタミド、ピペコリン酸アミド、イソニペコタミド、インドリンカルボン酸アミドといった複素環化合物やプロピオン酸アミド、イソブチルアミド、マンデル酸アミド、フェニルプロピオン酸アミドといった脂肪族アミドに対して特に強い活性を示す。より好ましい基質としては、(S)−ニペコタミド、(R)−ピペコリン酸アミド、(R)−インドリンカルボン酸アミド、(S)−フェニルプロピオン酸アミドなどが挙げられる。
本発明のDNAは、ラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有し、光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸を生成する活性を有するポリペプチドをコードするDNAであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で本発明のDNAを取得できる。例えば、以下に示した方法で本発明のDNAを取得できる。
本発明のベクターは、適当な宿主細胞内で前記DNAがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
本明細書内に記載される宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。本発明のDNAを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のEscherichia coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。
本発明の形質転換体」は、本発明のポリペプチドをコードするDNAを、前記ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。なお、本発明の「形質転換体」は、培養菌体は言うまでもなく、その処理物も含まれる。ここで言う処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。ラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性が残存する限りにおいては、これら処理物を本発明の反応に使用しうる。本発明の形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。
本発明の「光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造」は、適当な溶媒中に、基質となるラセミ体カルボン酸アミドと、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするDNAを含む形質転換体とを添加することにより実施できる。
以下に説明する各実施例では、アミダーゼ活性の測定は、100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に、N−ベンジルニペコタミド1%、及び酵素溶液を添加し、30℃で1時間反応後、高速液体クロマトグラフィー分析条件Aにより分析した。この条件において、1分間に1μmolのN−ベンジルニペコチン酸を生成する酵素活性を1unitと定義した。
カラム:YMC−A303(4.6mmφ×250mm、YMC社製)
溶離液:20mM リン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=9/1
流速:1.0ml/分
カラム温度:30℃
測定波長:210nm。
基質としてN−ベンジルニペコタミドを用いて、実施例1で取得した精製酵素のアミダーゼ反応の至適pH、至適温度、及び熱安定性を加水分解反応によって生じるN−ベンジルニペコチン酸をHPLCで定量することによって調べた。至適pH測定時には各pHで30℃で1時間反応を行い、アセトニトリルの添加により停止し、分析は実施例1に記載の高速液体クロマトグラフィー分析条件Aで行った。至適温度測定時には各温度で1時間反応を行い、アセトニトリルの添加により停止し、分析は実施例1に記載の高速液体クロマトグラフィー分析条件Aで行った。熱安定性測定時には各温度において30分インキュベーションを行った後1時間反応を行い、アセトニトリルの添加により停止し、分析は実施例1に記載の高速液体クロマトグラフィー分析条件Aで行った。
カラム:SUMICHIRAL OA−5000(4.6mmφ×150mm、住化分析センター社製)
溶離液:2mM CuSO4 水溶液
流速:1.0ml/分
カラム温度:30℃
測定波長:254nm。
実施例1で得られた精製HCSを用いて、ABI492型プロテインシーケンサー(Applied Biosystems社製)によりN末端アミノ酸配列を解析した。また、精製HCSを8M尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリジルエンドペプチダーゼ(和光純薬工業株式会社製)で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列を解析した。これらのアミノ酸配列から予想されるDNA配列を考慮し、プライマー1(配列表配列番号3)及びプライマー2(配列表配列番号4)を合成した。プライマー2種(プライマー1及びプライマー2)各40pmol、カプリアビダス エスピー(Cupriavidus sp.)KNK−J915株の染色体DNA100ng、dNTP各10nmol、ExTaq(宝酒造社製)2.5Uを含むExTaq用緩衝液50μlを調製し、熱変性(95℃、1分)、アニーリング(50℃、1分)、伸長反応(72℃、0.5分)を30サイクル行い、4℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅DNAを確認した。本反応に用いたカプリアビダス エスピー(Cupriavidus sp.)KNK−J915株の染色体DNAの調製は、分子生物学実験プロトコール1(丸善)P.36に記載されている細菌ゲノムDNAの少量調製法により行なった。
大腸菌においてHCSを発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作製した。まず、HCS遺伝子の開始コドン部分にNdeI部位を付加し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとEcoRI部位を付加した二本鎖DNAを以下の方法により取得した。
実施例4で構築した組換えベクターpNCSを用いて、E. coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、E. coli HB101 (pNCS)を得た。
実施例5で得た形質転換体、および、ベクタープラスミドpUCN18を含む形質転換体であるE. coli HB101 (pUCN18)(比較例)のそれぞれを、200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl0.5%、pH7.0)5mlに接種し、37℃で24時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、5mlの100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した。これを、UH−50型超音波ホモゲナイザー(SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のアミダーゼ活性を測定し、比活性として表したものを、表3に示した。
ラセミ体ニペコタミド10.1gを水に溶解し、pH8.0に調整した基質溶液200mlに実施例6と同様に培養したE. coli HB101 (pNCS)の培養液2mlに添加し、45℃にて25時間攪拌した。反応終了後、反応液を70℃、30分加熱処理し、遠心分離にて菌体等の固形物を除去した後、反応液中の基質及び生成物を、クロロギ酸ベンジルを用いて誘導化した。得られた誘導体を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率(%)及び光学純度(%e.e.)を求めた結果、変換率は50.2%、(R)−ニペコタミドの光学純度は98.3%e.e.、(S)−ニペコチン酸の光学純度は97.1%e.e.であった。
(P:生成物量(mol)、S1:残存基質量(mol))
光学純度(%e.e.)=(A−B)/(A+B)×100
(Aは対象とする鏡像異性体量でBは対応する鏡像異性体量)。
[変換率の分析]
カラム:YMC−A303(4.6mmφ×250mm、YMC社製)
溶離液:20mM リン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=7/3
流速:1.0ml/分
カラム温度:35℃
測定波長:210nm
[光学純度の分析]
カラム:CHIRALPAK AD−RH(4.6mmφ×150mm、ダイセル社製)
溶離液:20mM リン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=7/3
流速:0.5ml/分
カラム温度:室温
測定波長:210nm。
100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に、ラセミ体ピペコリン酸アミド1%、及び実施例1で得られた精製酵素溶液を添加し、30℃で反応後、高速液体クロマトグラフィーにより分析することにより、変換率(%)及び光学純度(%e.e.)を求めた結果、変換率は18.3%、(R)−ピペコリン酸の光学純度は80.1%e.e.であった。
(P:生成物量(mol)、S1:残存基質量(mol))
光学純度(%e.e.)=(A−B)/(A+B)×100
(Aは対象とする鏡像異性体量でBは対応する鏡像異性体量)。
[変換率・光学純度の分析]
カラム:SUMICHIRAL OA−5000(4.6mmφ×150mm、住化分析センター社製)
溶離液:2mM CuSO4 水溶液
流速:1.0ml/分
カラム温度:30℃
測定波長:254nm。
100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に、ラセミ体インドリンカルボン酸アミド1%、及び実施例1で得られた精製酵素溶液を添加し、30℃で反応後、無水酢酸を用いて誘導化した。得られた誘導体を高速液体クロマトグラフィーで分析することにより変換率(%)、光学純度(%e.e.)を求めた結果、変換率は39.2%、(R)−インドリンカルボン酸の光学純度は97.8%e.e.であった。
[変換率の分析]
カラム:YMC−A303(4.6mmφ×250mm、YMC社製)
溶離液:20mM リン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=9/1
流速:1.0ml/分
カラム温度:30℃
測定波長:210nm
[光学純度の分析]
カラム:SUMICHIRAL OA−5000(4.6mmφ×150mm、住化分析センター社製)
溶離液:2mM CuSO4 水溶液/メタノール=7/3
流速:2.0ml/分
カラム温度:35℃
測定波長:254nm。
100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に、ラセミ体フェニルプロピオン酸アミド1%、及び実施例1で得られた精製酵素溶液を添加し、30℃で反応後、高速液体クロマトグラフィーで分析することにより変換率(%)、光学純度(%e.e.)を求めた結果、変換率は36.0%、(S)−フェニルプロピオン酸の光学純度は89.1%e.e.であった。
[変換率の分析]
カラム:YMC−A303(4.6mmφ×250mm、YMC社製)
溶離液:20mM リン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=7/3
流速:1.0ml/分
カラム温度:35℃
測定波長:210nm
[光学純度の分析]
カラム:CHIRALPAK AD−H(4.6mmφ×250mm、ダイセル社製)
溶離液:ヘキサン/イソプロパノール/TFA=95/5/0.02
流速:1.0ml/分
カラム温度:30℃
測定波長:254nm。
実施例3で決定したカプリアビダス エスピー(Cupriavidus sp.)KNK−J915(FERM BP−10739)由来の本発明の塩基配列と高い配列同一性を示した、ラルストニア ユートロファ(Ralstonia eutropha)JMP134株由来putative amidaseの塩基配列(配列表配列番号9)に基づき、開始コドン部分にNdeI部位を付加したプライマー7(配列表配列番号10)、及び終始コドンの直後にSacI部位を付加したプライマー8(配列表配列番号11)を合成した。プライマー2種(プライマー7及びプライマー8)各50pmol、ラルストニア ユートロファ(Ralstonia eutropha)JMP134株の染色体DNA10ng、dNTP各10nmol、ExTaq(宝酒造社製)2.5Uを含む ExTaq用緩衝液50μlを調製し、熱変性(97℃、1分)、アニーリング(60℃、1分)、伸長反応(72℃、1.5分)を30サイクル行い、4℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅DNAを確認した。上記のPCRで得られたDNA断片をNdeI及びSacIで消化し、プラスミドpUCN18のlacプロモーターの下流のNdeI認識部位とSacI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNREを構築した。構築した組換えベクターpNREを用いて、E. coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、E. coli HB101 (pNRE)を得た。
100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に、ラセミ体N−ベンジルニペコタミド1%、及び実施例11で得られたE. coli HB101 (pNRE)の培養液を添加し、30℃で反応後、高速液体クロマトグラフィーで分析することにより変換率(%)、光学純度(%e.e.)を求めた結果、変換率は50.1%、残存する(R)−N−ベンジルニペコタミドの光学純度は99.4%e.e.であった。
(P:生成物量(mol)、S1:残存基質量(mol))
光学純度(%e.e.)=(A−B)/(A+B)×100
(Aは対象とする鏡像異性体量でBは対応する鏡像異性体量)。
[変換率の分析]
カラム:YMC−A303(4.6mmφ×250mm、YMC社製)
溶離液:20mM リン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=9/1
流速:1.0ml/分
カラム温度:35℃
測定波長:210nm
[光学純度の分析]
カラム:CHIRALPAK AD−RH(4.6mmφ×150mm、ダイセル社製)
溶離液:20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)/アセトニトリル=7/3
流速:0.5ml/分
カラム温度:室温
測定波長:210nm
Claims (13)
- 以下の(a)、(b)又は(c)のポリペプチド:
(a)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド、
(c)配列表配列番号1で示されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド。 - 配列表配列番号1で示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 以下の理化学的性質を有するポリペプチド:
(a)ラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有する、
(b)SDS−PAGEにより測定した分子量が52kDa程度である、
(c)ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適pHが8〜9である、
(d)ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適温度が50℃である、
(e)pH7付近において50℃以下の温度で安定である。 - カプリアビダス(Cupriavidus)属に属する微生物に由来する請求項1〜3のいずれかに記載のポリペプチド。
- カプリアビダス エスピー(Cupriavidus sp.)KNK−J915株(FERM BP−10739)に由来する請求項4に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリペプチドをコードするDNA。
- 以下の(a)、(b)又は(c)のDNA:
(a)配列表配列番号2に示される塩基配列からなるDNA、
(b)配列表配列番号2に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(c)配列表配列番号2に示した塩基配列と70%以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 配列表配列番号2に示した塩基配列と80%以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを(S)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードする、請求項7に記載のDNA。
- 請求項6〜8のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
- 請求項9に記載のベクターで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
- 宿主微生物が大腸菌である請求項10に記載の形質転換体。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリペプチド、または、請求項10および11のいずれかに記載の形質転換体をラセミ体カルボン酸アミドに作用させ、光学活性カルボン酸アミドを残存させ、光学活性カルボン酸を生成することを特徴とする光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法。
- ラセミ体カルボン酸アミドが、ラセミ体ニペコタミド、ラセミ体ピペコリン酸アミド、ラセミ体インドリンカルボン酸アミド、および、ラセミ体フェニルプロピオン酸アミドからなる群より選ばれるいずれか一つであり、光学活性カルボン酸アミドが、(R)−ニペコタミド、(S)−ピペコリン酸アミド、(S)−インドリンカルボン酸アミド、および、(R)−フェニルプロピオン酸アミドからなる群より選ばれるいずれか一つであり、光学活性カルボン酸が、(S)−ニペコチン酸、(R)−ピペコリン酸、(R)−インドリンカルボン酸、および、(S)−フェニルプロピオン酸からなる群より選ばれるいずれか一つである請求項12に記載の製造方法。
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