JP2000189159A - Ｓ―ヒドロキシニトリルリア―ゼの製造方法 - Google Patents
Ｓ―ヒドロキシニトリルリア―ゼの製造方法Info
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- JP2000189159A JP2000189159A JP10373246A JP37324698A JP2000189159A JP 2000189159 A JP2000189159 A JP 2000189159A JP 10373246 A JP10373246 A JP 10373246A JP 37324698 A JP37324698 A JP 37324698A JP 2000189159 A JP2000189159 A JP 2000189159A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 キャッサバ（Cassava, Manihot esculen
ta)由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼ(EC 4.1.2.37)
をコードする遺伝子を酵母エピソーム型発現ベクターへ
組込んだ組換え体ＤＮＡによって形質転換された酵母を
培地に培養し、培養物からS-ヒドロキシニトリルリアー
ゼを得ることを特徴とする、S-ヒドロキシニトリルリア
ーゼの製造方法。 【効果】 本発明によれば、遺伝子工学的手法によりS-
ヒドロキシニトリルリアーゼを効率よく大量に生産させ
ることができる。
ta)由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼ(EC 4.1.2.37)
をコードする遺伝子を酵母エピソーム型発現ベクターへ
組込んだ組換え体ＤＮＡによって形質転換された酵母を
培地に培養し、培養物からS-ヒドロキシニトリルリアー
ゼを得ることを特徴とする、S-ヒドロキシニトリルリア
ーゼの製造方法。 【効果】 本発明によれば、遺伝子工学的手法によりS-
ヒドロキシニトリルリアーゼを効率よく大量に生産させ
ることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、キャッサバ由来の
S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を組
込んだ組換え酵母菌によるS-ヒドロキシニトリルリアー
ゼの製造方法に関する。
S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を組
込んだ組換え酵母菌によるS-ヒドロキシニトリルリアー
ゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】キャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリル
リアーゼ(EC 4.1.2.37)は芳香族および／または脂肪族
のカルボニル化合物と青酸とから光学活性なS-シアノヒ
ドリンを合成するために有効な酵素である。本酵素を用
いた光学活性シアノヒドリンの合成は、種々の光学活性
中間体を合成する上で極めて有用である。しかしなが
ら、本酵素はキャッサバの組織に微量含まれるに過ぎ
ず、工業的に利用することは困難であった。これまで、
キャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼをコー
ドする遺伝子を組込んだ組換え体ＤＮＡを含む大腸菌を
培養することによって該酵素を製造した例が知られてい
る（Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35, 437-439, 1996 、Bio
technol. Bioeng. 53, 332-338, 1997）。しかし、大腸
菌を宿主とする方法では、生産性が高くないこと、酵素
生産のための培養に高価な抗生物質や誘導基質を培地に
添加することが必要であるなどの弊害があり、安価に効
率よく該酵素を生産することは困難であった。
リアーゼ(EC 4.1.2.37)は芳香族および／または脂肪族
のカルボニル化合物と青酸とから光学活性なS-シアノヒ
ドリンを合成するために有効な酵素である。本酵素を用
いた光学活性シアノヒドリンの合成は、種々の光学活性
中間体を合成する上で極めて有用である。しかしなが
ら、本酵素はキャッサバの組織に微量含まれるに過ぎ
ず、工業的に利用することは困難であった。これまで、
キャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼをコー
ドする遺伝子を組込んだ組換え体ＤＮＡを含む大腸菌を
培養することによって該酵素を製造した例が知られてい
る（Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35, 437-439, 1996 、Bio
technol. Bioeng. 53, 332-338, 1997）。しかし、大腸
菌を宿主とする方法では、生産性が高くないこと、酵素
生産のための培養に高価な抗生物質や誘導基質を培地に
添加することが必要であるなどの弊害があり、安価に効
率よく該酵素を生産することは困難であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、遺伝
子工学的手法によりS-ヒドロキシニトリルリアーゼを効
率よく大量に生産させることを目的とする。
子工学的手法によりS-ヒドロキシニトリルリアーゼを効
率よく大量に生産させることを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、キャッサバ由来の
S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を発
現する宿主として酵母を選択することにより、大腸菌よ
りも大量にS-ヒドロキシニトリルリアーゼを生産させる
ことに成功し、本発明を完成させるに至った。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、キャッサバ由来の
S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を発
現する宿主として酵母を選択することにより、大腸菌よ
りも大量にS-ヒドロキシニトリルリアーゼを生産させる
ことに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、キャッサバ(Cassav
a, Manihot esculenta)由来のS-ヒドロキシニトリルリ
アーゼ(EC 4.1.2.37)をコードする遺伝子を酵母エピソ
ーム型発現ベクターへ組込んだ組換え体ＤＮＡにより形
質転換した酵母を培地に培養し、培養物からS-ヒドロキ
シニトリルリアーゼを得ることを特徴とする、S-ヒドロ
キシニトリルリアーゼの製造方法である。以下、本発明
を詳細に説明する。
a, Manihot esculenta)由来のS-ヒドロキシニトリルリ
アーゼ(EC 4.1.2.37)をコードする遺伝子を酵母エピソ
ーム型発現ベクターへ組込んだ組換え体ＤＮＡにより形
質転換した酵母を培地に培養し、培養物からS-ヒドロキ
シニトリルリアーゼを得ることを特徴とする、S-ヒドロ
キシニトリルリアーゼの製造方法である。以下、本発明
を詳細に説明する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明においては、まず、高発現
を目的とするキャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリ
アーゼをコードする遺伝子のクローニングを行なう。該
酵素の遺伝子配列は公知であり、文献に公開されている
（Arch. Biochem. Biophys. 311, 496-502, 1994) 。キ
ャッサバの葉より該酵素遺伝子のmRNAを含む全mRNAを抽
出し、定法に従ってcDNAを合成する。公知のS-ヒドロキ
シニトリルリアーゼcDNA配列情報をもとに設計したプラ
イマーを使い、PCRによって該酵素をコードする遺伝子
を増幅する。
を目的とするキャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリ
アーゼをコードする遺伝子のクローニングを行なう。該
酵素の遺伝子配列は公知であり、文献に公開されている
（Arch. Biochem. Biophys. 311, 496-502, 1994) 。キ
ャッサバの葉より該酵素遺伝子のmRNAを含む全mRNAを抽
出し、定法に従ってcDNAを合成する。公知のS-ヒドロキ
シニトリルリアーゼcDNA配列情報をもとに設計したプラ
イマーを使い、PCRによって該酵素をコードする遺伝子
を増幅する。
【０００７】次に、上記操作によって得た該酵素遺伝子
を組換え酵母菌体で発現させるために、該酵素遺伝子の
上流に転写プロモーターを、下流にターミネーターを挿
入して発現カセットを構築し、これを発現ベクターに導
入する。あるいは、該酵素遺伝子を導入する発現ベクタ
ーに、転写プロモーターとターミネーターが既に存在す
る場合は、発現カセットを構築することなく、その転写
プロモーターとターミネーターを利用してその間に該酵
素酵素遺伝子のみを導入すればよい。いずれの場合であ
っても、発現ベクター中に発現カセットを複数個存在さ
せてもよい。
を組換え酵母菌体で発現させるために、該酵素遺伝子の
上流に転写プロモーターを、下流にターミネーターを挿
入して発現カセットを構築し、これを発現ベクターに導
入する。あるいは、該酵素遺伝子を導入する発現ベクタ
ーに、転写プロモーターとターミネーターが既に存在す
る場合は、発現カセットを構築することなく、その転写
プロモーターとターミネーターを利用してその間に該酵
素酵素遺伝子のみを導入すればよい。いずれの場合であ
っても、発現ベクター中に発現カセットを複数個存在さ
せてもよい。
【０００８】発現カセット中のプロモーターは、酵素の
発現量に大差を生じるので、最適なプロモーターを選択
する必要がある。酵母菌内で導入遺伝子を効率的に発現
させるための酵母プロモーターとしては、例えば、天然
型としてはPGK 、GAP 、TPI、GAL1、GAL10 、ADH2、PHO
5、CUP1、MFα1 などが、組換え型としてはPGK/α2オペ
レーター、GAP/GAL 、PGK/GAL 、GAP/ADH2、CYC/GRE 、
PGK/ARE などが、変異型としてはLeu2-dなどがそれぞれ
挙げられる。これらの中では特にGAPプロモーターが好
ましい。上記の各プロモーターは、天然型プロモーター
の塩基配列からなるＤＮＡのほか、該塩基配列において
１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加した塩基配列
からなり、かつプロモーター活性を保持するＤＮＡであ
ってもよい。塩基の欠失、置換若しくは付加は、出願前
周知の常套的な技術、例えば部位特異的変異誘発法によ
り実施することができる。
発現量に大差を生じるので、最適なプロモーターを選択
する必要がある。酵母菌内で導入遺伝子を効率的に発現
させるための酵母プロモーターとしては、例えば、天然
型としてはPGK 、GAP 、TPI、GAL1、GAL10 、ADH2、PHO
5、CUP1、MFα1 などが、組換え型としてはPGK/α2オペ
レーター、GAP/GAL 、PGK/GAL 、GAP/ADH2、CYC/GRE 、
PGK/ARE などが、変異型としてはLeu2-dなどがそれぞれ
挙げられる。これらの中では特にGAPプロモーターが好
ましい。上記の各プロモーターは、天然型プロモーター
の塩基配列からなるＤＮＡのほか、該塩基配列において
１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加した塩基配列
からなり、かつプロモーター活性を保持するＤＮＡであ
ってもよい。塩基の欠失、置換若しくは付加は、出願前
周知の常套的な技術、例えば部位特異的変異誘発法によ
り実施することができる。
【０００９】一方、転写ターミネーターは、該酵素遺伝
子の下流に存在させて、最大限の遺伝子発現を得るため
に効率的な転写終結が可能とするものであればよく、例
えば、ADH1、TDH1、TFF 、TRP5などが挙げられる。
子の下流に存在させて、最大限の遺伝子発現を得るため
に効率的な転写終結が可能とするものであればよく、例
えば、ADH1、TDH1、TFF 、TRP5などが挙げられる。
【００１０】本発明においては、発現ベクターとして酵
母エピソーム型発現ベクターを使用する。酵母エピソー
ム型プラスミドベクター（yeast episome plasmid vect
or) は、酵母の本来もつ２μプラスミドの配列を含んで
おり、その複製起点を利用して宿主酵母細胞内で複製で
きるようにしたベクターである。
母エピソーム型発現ベクターを使用する。酵母エピソー
ム型プラスミドベクター（yeast episome plasmid vect
or) は、酵母の本来もつ２μプラスミドの配列を含んで
おり、その複製起点を利用して宿主酵母細胞内で複製で
きるようにしたベクターである。
【００１１】本発明において使用する酵母エピソーム型
発現ベクターは、酵母の２μプラスミド配列の少なくと
もORI 配列を含んでおり、かつ宿主酵母菌体内において
染色体外で増殖することができれば特に制限はない。か
かるベクターとしては、例えば、YEp51 、pYES2 、YEp3
51、YEp352などが挙げられるが、これらに限定はされな
い。
発現ベクターは、酵母の２μプラスミド配列の少なくと
もORI 配列を含んでおり、かつ宿主酵母菌体内において
染色体外で増殖することができれば特に制限はない。か
かるベクターとしては、例えば、YEp51 、pYES2 、YEp3
51、YEp352などが挙げられるが、これらに限定はされな
い。
【００１２】上記の酵母エピソーム型発現ベクターは、
組換え大腸菌でのサブクローニングを行なえる様、大腸
菌体内部で増殖できるシャトルベクターである方が好ま
しく、またアンピシリン耐性遺伝子など選択マーカー遺
伝子を含むものがさらに好ましい。また、該発現ベクタ
ーは、組換え酵母を作成した際に、栄養要求性や薬剤耐
性によって酵母クローンを選抜できる、マーカー遺伝子
を含む。マーカー遺伝子としては、例えば、HIS3、TRP
1、LEU2、URA3、LYS2、Tn903 kanr、Cmr 、Hygr 、CUP
1、DHFRなどが挙げられる。これらはあくまで例示であ
り、遺伝子導入の宿主とするサッカロマイセス株の遺伝
子型に応じて選択されるべきものである。
組換え大腸菌でのサブクローニングを行なえる様、大腸
菌体内部で増殖できるシャトルベクターである方が好ま
しく、またアンピシリン耐性遺伝子など選択マーカー遺
伝子を含むものがさらに好ましい。また、該発現ベクタ
ーは、組換え酵母を作成した際に、栄養要求性や薬剤耐
性によって酵母クローンを選抜できる、マーカー遺伝子
を含む。マーカー遺伝子としては、例えば、HIS3、TRP
1、LEU2、URA3、LYS2、Tn903 kanr、Cmr 、Hygr 、CUP
1、DHFRなどが挙げられる。これらはあくまで例示であ
り、遺伝子導入の宿主とするサッカロマイセス株の遺伝
子型に応じて選択されるべきものである。
【００１３】本発明において使用することのできる上記
酵母エピソーム型発現ベクターの具体例としては、酵母
発現ベクターYEp352のマルチクローニングサイトに、GA
P プロモーター、その下流にS-ヒドロキシニトリルリア
ーゼをコードする遺伝子、その下流にターミネーターを
組み込むことによって作成されるベクター（YEp352-GC
と命名）；酵母発現ベクターYEp51 のGAL10 プロモータ
ー下流にあるマルチクローニングサイトに、S-ヒドロキ
シニトリルリアーゼをコードする遺伝子を組みこむこと
によって作成されるベクター（YEp51-C と命名）；酵母
発現ベクターYEp351のマルチクローニングサイトに、GA
P プロモーター、その下流にS-ヒドロキシニトリルリア
ーゼをコードする遺伝子、その下流にターミネーターを
組み込むことによって作成されるベクター（YEp351-GC
と命名）；酵母発現ベクターpYES2 のGAL1プロモーター
下流にあるマルチクローニングサイトに、S-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼをコードする遺伝子を組み込むことに
よって作成されるベクター（pYES2-C と命名）などが挙
げられる。
酵母エピソーム型発現ベクターの具体例としては、酵母
発現ベクターYEp352のマルチクローニングサイトに、GA
P プロモーター、その下流にS-ヒドロキシニトリルリア
ーゼをコードする遺伝子、その下流にターミネーターを
組み込むことによって作成されるベクター（YEp352-GC
と命名）；酵母発現ベクターYEp51 のGAL10 プロモータ
ー下流にあるマルチクローニングサイトに、S-ヒドロキ
シニトリルリアーゼをコードする遺伝子を組みこむこと
によって作成されるベクター（YEp51-C と命名）；酵母
発現ベクターYEp351のマルチクローニングサイトに、GA
P プロモーター、その下流にS-ヒドロキシニトリルリア
ーゼをコードする遺伝子、その下流にターミネーターを
組み込むことによって作成されるベクター（YEp351-GC
と命名）；酵母発現ベクターpYES2 のGAL1プロモーター
下流にあるマルチクローニングサイトに、S-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼをコードする遺伝子を組み込むことに
よって作成されるベクター（pYES2-C と命名）などが挙
げられる。
【００１４】本発明において、宿主とする酵母は、サッ
カロマイセス属の酵母を用いるが、前記酵母エピソーム
型発現ベクターを導入した後、安定に該ベクターを保持
することができるものであれば、特に制限されない。サ
ッカロマイセス属の酵母としては、例えば、Saccharomy
ces cerevisiae KK4株、Y334株、Inv-Sc1株、W303株な
どを挙げることができる。さらに該宿主酵母は、半数体
(haploid) または２倍体（diploid)のいずれの株でも用
いることができる。
カロマイセス属の酵母を用いるが、前記酵母エピソーム
型発現ベクターを導入した後、安定に該ベクターを保持
することができるものであれば、特に制限されない。サ
ッカロマイセス属の酵母としては、例えば、Saccharomy
ces cerevisiae KK4株、Y334株、Inv-Sc1株、W303株な
どを挙げることができる。さらに該宿主酵母は、半数体
(haploid) または２倍体（diploid)のいずれの株でも用
いることができる。
【００１５】キャッサバ由来S-ヒドロキシニトリルリア
ーゼをコードする遺伝子を組込んだ酵母エピソーム型発
現ベクターを上記宿主に組込んで、目的とするS-ヒドロ
キシニトリルリアーゼ生産能を持つ組換え酵母を得るに
は、定法の形質転換法によって行えばよい。
ーゼをコードする遺伝子を組込んだ酵母エピソーム型発
現ベクターを上記宿主に組込んで、目的とするS-ヒドロ
キシニトリルリアーゼ生産能を持つ組換え酵母を得るに
は、定法の形質転換法によって行えばよい。
【００１６】得られた組換え酵母を培地に培養すれば、
S-ヒドロキシニトリルリアーゼを生産することができ
る。培地の組成としては、窒素源としてYeast nitrogen
base w/o amino acids (Difco製) 、必須アミノ酸、カ
ザミノ酸、炭素源してグルコース、ガラクトース、ラフ
ィノースなどの糖類、またはグリセリン、エタノールな
どのアルコール類を適宜添加したものを用いることがで
き、ｐＨは４〜７に調節するのが適当である。
S-ヒドロキシニトリルリアーゼを生産することができ
る。培地の組成としては、窒素源としてYeast nitrogen
base w/o amino acids (Difco製) 、必須アミノ酸、カ
ザミノ酸、炭素源してグルコース、ガラクトース、ラフ
ィノースなどの糖類、またはグリセリン、エタノールな
どのアルコール類を適宜添加したものを用いることがで
き、ｐＨは４〜７に調節するのが適当である。
【００１７】本発明における、酵母エピソーム型発現ベ
クターにて形質転換した酵母を培養する場合は、組換え
酵母菌体内に存在する該酵素遺伝子の脱落を防ぐため、
用いたベクター上の選択マーカー遺伝子に応じて培地成
分の変更をすることが好ましい。例えば、酵母エピソー
ム型発現ベクターYEp352-GC を組込んだ組換え酵母の場
合は、選択マーカー遺伝子がURA3であるから、実質的に
ウラシルを含まない培地を、また酵母エピソーム型発現
ベクターYEp351-GC を組込んだ組換え酵母の場合は、選
択マーカー遺伝子がLEU2であるから、実質的にL-ロイシ
ンを含まない培地を用いる。
クターにて形質転換した酵母を培養する場合は、組換え
酵母菌体内に存在する該酵素遺伝子の脱落を防ぐため、
用いたベクター上の選択マーカー遺伝子に応じて培地成
分の変更をすることが好ましい。例えば、酵母エピソー
ム型発現ベクターYEp352-GC を組込んだ組換え酵母の場
合は、選択マーカー遺伝子がURA3であるから、実質的に
ウラシルを含まない培地を、また酵母エピソーム型発現
ベクターYEp351-GC を組込んだ組換え酵母の場合は、選
択マーカー遺伝子がLEU2であるから、実質的にL-ロイシ
ンを含まない培地を用いる。
【００１８】また、プロモーターの種類により、酵素生
産を誘導させる必要がある場合には、それに応じた誘導
基質を培地に加えることが好ましい。例えば、プロモー
ターの発現が特定炭素源によって促進あるいは阻害され
る場合には、その場合に応じて適宜炭素源を選択する必
要がある。本発明に好適なプロモーターであるＧＡＰプ
ロモーターによって酵素遺伝子の発現が制御されている
場合には、本プロモーターは構成的に発現するので炭素
源の制限はなく、宿主酵母菌が資化することのできる炭
素源ならばいずれでも用いることができる。
産を誘導させる必要がある場合には、それに応じた誘導
基質を培地に加えることが好ましい。例えば、プロモー
ターの発現が特定炭素源によって促進あるいは阻害され
る場合には、その場合に応じて適宜炭素源を選択する必
要がある。本発明に好適なプロモーターであるＧＡＰプ
ロモーターによって酵素遺伝子の発現が制御されている
場合には、本プロモーターは構成的に発現するので炭素
源の制限はなく、宿主酵母菌が資化することのできる炭
素源ならばいずれでも用いることができる。
【００１９】培養は、例えば、25〜35℃で、数時間〜３
日間、増殖が定常期に達するまで行う。このようにして
培養した組換え酵母菌の菌体内には著量のS-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼが生産される。培養終了後、培養物よ
りS-ヒドロキシニトリルリアーゼを採取するには、通常
の酵素採取手段を用いることができる。すなわち細胞壁
溶解酵素（ザイモリアーゼなど）を作用させて溶菌させ
る方法、超音波破砕処理、ガラスビーズなどを共存させ
て破砕処理する方法、界面活性剤などで抽出する方法、
自己消化させる方法、凍結融解法などがある。次いで、
ろ過または遠心分離などにより不溶物を除去することに
より、S-ヒドロキシニトリルリアーゼを含有する粗酵素
液を得ることができる。
日間、増殖が定常期に達するまで行う。このようにして
培養した組換え酵母菌の菌体内には著量のS-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼが生産される。培養終了後、培養物よ
りS-ヒドロキシニトリルリアーゼを採取するには、通常
の酵素採取手段を用いることができる。すなわち細胞壁
溶解酵素（ザイモリアーゼなど）を作用させて溶菌させ
る方法、超音波破砕処理、ガラスビーズなどを共存させ
て破砕処理する方法、界面活性剤などで抽出する方法、
自己消化させる方法、凍結融解法などがある。次いで、
ろ過または遠心分離などにより不溶物を除去することに
より、S-ヒドロキシニトリルリアーゼを含有する粗酵素
液を得ることができる。
【００２０】上記の粗酵素液から、S-ヒドロキシニトリ
ルリアーゼをさらに精製するには、通常のタンパク質精
製法を使用することができる。具体的には、硫安分画
法、有機溶媒沈澱法、イオン交換体などによる吸着処理
法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、電気泳動法などが、単独または適
宜組み合わせて用いられる。
ルリアーゼをさらに精製するには、通常のタンパク質精
製法を使用することができる。具体的には、硫安分画
法、有機溶媒沈澱法、イオン交換体などによる吸着処理
法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、電気泳動法などが、単独または適
宜組み合わせて用いられる。
【００２１】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 〔実施例１〕 キャッサバ組織からのcDNAの調製および
キャッサバ由来S-ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の
調製 キャッサバの葉を材料として、全mRNAの抽出を行なっ
た。回収したmRNAを鋳型として、cDNA合成を行ない、キ
ャッサバのcDNAライブラリーを作った。文献（Arch. Bi
ochem. Biophys. 311, 496-502, 1994) より入手した、
キャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子
の配列情報を参考にして、下記PCRプライマーを合成し
た。 センスプライマー：GGG GAA TTC ATG GTA ACT GCA CAT
TTT GTT CTG ATT C （配列番号１） アンチセンスプライマー：GGG GTC GAC CTC ACG GAT TA
G AAG CCG CCG （配列番号２）
が、本発明はこれに限定されるものではない。 〔実施例１〕 キャッサバ組織からのcDNAの調製および
キャッサバ由来S-ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の
調製 キャッサバの葉を材料として、全mRNAの抽出を行なっ
た。回収したmRNAを鋳型として、cDNA合成を行ない、キ
ャッサバのcDNAライブラリーを作った。文献（Arch. Bi
ochem. Biophys. 311, 496-502, 1994) より入手した、
キャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子
の配列情報を参考にして、下記PCRプライマーを合成し
た。 センスプライマー：GGG GAA TTC ATG GTA ACT GCA CAT
TTT GTT CTG ATT C （配列番号１） アンチセンスプライマー：GGG GTC GAC CTC ACG GAT TA
G AAG CCG CCG （配列番号２）
【００２２】これらのプライマーを使い、上記のcDNAを
鋳型としてPCR（95℃0.5 分、 55℃0.5 分、72℃1
分；計35サイクル）を行なったところ、S-ヒドロキシニ
トリルリアーゼをコードする遺伝子に相当する遺伝子を
獲得した。遺伝子配列の解析を行なったところ、文献に
示されている配列と一致した。
鋳型としてPCR（95℃0.5 分、 55℃0.5 分、72℃1
分；計35サイクル）を行なったところ、S-ヒドロキシニ
トリルリアーゼをコードする遺伝子に相当する遺伝子を
獲得した。遺伝子配列の解析を行なったところ、文献に
示されている配列と一致した。
【００２３】〔実施例２〕 酵素遺伝子組換え酵母菌に
よる発現 YEp352プラスミドベクターのマルチクローニングサイト
に、GAPプロモーター、ターミネーターが組込まれてい
るYEp352-GAPベクターを使い、実施例１にて取得したS-
ヒドロキシニトリルリアーゼのcDNAについて、該YEp352
-GAPベクターのGAPプロモーターとターミネーターの間
に、該cDNA配列を挿入して、酵母エピソーム型発現ベク
ターYEp352-GC を作成した。このYEp352-GC は、アンピ
シリン耐性遺伝子、酵母 2μプラスミド由来の配列、組
換え酵母の選択マーカ遺伝子であるURA3の配列を含んで
いる、大腸菌−酵母シャトルベクターである。この発現
ベクターYEp352-GC を使い、宿主酵母菌Saccharomyces
cerevisiae Inv-Sc1株の形質転換を行なった。ウラシル
を含まない下記組成を有する最少選択培地で組換えクロ
ーンを選抜した。
よる発現 YEp352プラスミドベクターのマルチクローニングサイト
に、GAPプロモーター、ターミネーターが組込まれてい
るYEp352-GAPベクターを使い、実施例１にて取得したS-
ヒドロキシニトリルリアーゼのcDNAについて、該YEp352
-GAPベクターのGAPプロモーターとターミネーターの間
に、該cDNA配列を挿入して、酵母エピソーム型発現ベク
ターYEp352-GC を作成した。このYEp352-GC は、アンピ
シリン耐性遺伝子、酵母 2μプラスミド由来の配列、組
換え酵母の選択マーカ遺伝子であるURA3の配列を含んで
いる、大腸菌−酵母シャトルベクターである。この発現
ベクターYEp352-GC を使い、宿主酵母菌Saccharomyces
cerevisiae Inv-Sc1株の形質転換を行なった。ウラシル
を含まない下記組成を有する最少選択培地で組換えクロ
ーンを選抜した。
【００２４】
【表１】 Yeast nitrogen base without amino acids(Difco 製) 6.7 g/L グルコース 20 g/L アデニン 40 mg/ml Ｌ−アルギニン 20 mg/ml Ｌ−アスパラギン酸 100 mg/ml Ｌ−グルタミン酸 100 mg/ml Ｌ−ヒスチジン 20 mg/ml Ｌ−イソロイシン 30 mg/ml Ｌ−リジン 30 mg/ml Ｌ−メチオニン 20 mg/ml Ｌ−フェニルアラニン 50 mg/ml Ｌ−セリン 375 mg/ml Ｌ−トレオニン 200 mg/ml Ｌ−トリプトファン 40 mg/ml Ｌ−チロシン 30 mg/ml Ｌ−バリン 150 mg/ml Ｌ−ロイシン 60 mg/ml
【００２５】以上の操作によって取得した組換え酵母菌
株(YEp352-GC-S2 株) を、下記の組成を有するYNBDCas
液体培地で24時間培養し、その酵素活性を以下のように
して測定した。
株(YEp352-GC-S2 株) を、下記の組成を有するYNBDCas
液体培地で24時間培養し、その酵素活性を以下のように
して測定した。
【表２】 Yeast nitrogen base without amino acids(Difco 製) 6.7 g/L グルコース 20 g/L カザミノ酸 20 g/L Ｌ−トリプトファン 40 mg/ml
【００２６】まず、組換え菌培養液1ml を遠心分離し、
菌体を回収し、これに0.5mm径のガラスビーズを0.1ml
添加し、液体窒素で凍結した。次いで、0.15Mクエン酸
ナトリウム緩衝液（pH5）を0.2ml 添加し、攪拌によっ
て菌体破砕をした。菌体破砕液を遠心分離することによ
って上澄み液を得た。この上澄み液を酵素活性測定に用
いた。活性値は、DL-マンデロニトリルを基質として、
基質が酵素によって分解されてベンズアルデヒドを生成
する際の吸光度変化を249.6nmの波長で測定することに
よって算出し、１分間に基質１μmol を分解する活性を
1unit とした。本組換え菌株(YEp352-GC-S2 株) の培養
液1ml 当たりのS-ヒドロキシニトリルリアーゼ活性は1.
126unit/ml（比活性は1.33unit/mg protein)であった。
菌体を回収し、これに0.5mm径のガラスビーズを0.1ml
添加し、液体窒素で凍結した。次いで、0.15Mクエン酸
ナトリウム緩衝液（pH5）を0.2ml 添加し、攪拌によっ
て菌体破砕をした。菌体破砕液を遠心分離することによ
って上澄み液を得た。この上澄み液を酵素活性測定に用
いた。活性値は、DL-マンデロニトリルを基質として、
基質が酵素によって分解されてベンズアルデヒドを生成
する際の吸光度変化を249.6nmの波長で測定することに
よって算出し、１分間に基質１μmol を分解する活性を
1unit とした。本組換え菌株(YEp352-GC-S2 株) の培養
液1ml 当たりのS-ヒドロキシニトリルリアーゼ活性は1.
126unit/ml（比活性は1.33unit/mg protein)であった。
【００２７】〔比較例１〕 酵素遺伝子組換え大腸菌に
よる発現 下記のプライマーを用いる以外は、実施例１と同様にし
て、S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子
に相当する遺伝子を獲得した。 センスプライマー：GGG GAA TTC ATG GTA ACT GCA CAT
TTT G （配列番号３） アンチセンスプライマー：TAG GAG CTG CAG GCT TCA AG
C ATA TGC ATC （配列番号４）
よる発現 下記のプライマーを用いる以外は、実施例１と同様にし
て、S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子
に相当する遺伝子を獲得した。 センスプライマー：GGG GAA TTC ATG GTA ACT GCA CAT
TTT G （配列番号３） アンチセンスプライマー：TAG GAG CTG CAG GCT TCA AG
C ATA TGC ATC （配列番号４）
【００２８】上記遺伝子を、大腸菌用ベクターpKK223-3
（ファルマシア製）のマルチクローニングサイトのBamH
I サイトとPstIサイトの間に導入して組換えベクターを
調製した。このベクタープラスミドを大腸菌へ組込むこ
とにより、組換え大腸菌を得た。この組換え菌を誘導基
質として1mM IPTG、抗生物質としてアンピシリン0.1ｇ/L
を含むＬＢ培地で培養して得た培養液の酵素活性は0.96
4unit/ml（比活性は 0.545unit/mg protein)であった。
（ファルマシア製）のマルチクローニングサイトのBamH
I サイトとPstIサイトの間に導入して組換えベクターを
調製した。このベクタープラスミドを大腸菌へ組込むこ
とにより、組換え大腸菌を得た。この組換え菌を誘導基
質として1mM IPTG、抗生物質としてアンピシリン0.1ｇ/L
を含むＬＢ培地で培養して得た培養液の酵素活性は0.96
4unit/ml（比活性は 0.545unit/mg protein)であった。
【００２９】
【発明の効果】本発明によれば、遺伝子工学的手法によ
りS-ヒドロキシニトリルリアーゼを効率よく大量に生産
させることができる。
りS-ヒドロキシニトリルリアーゼを効率よく大量に生産
させることができる。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NIPPON SHOKUBAI CO., LTD. <120> Method for producing S-hydroxynitryllyase <130> P98-0669 <160> 4 <170> Patent in Ver. 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 GGGGAATTCA TGGTAACTGC ACATTTTGTT CTGATTC 37 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 GGGGTCGACC TCACGGATTA GAAGCCGCCG 30 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 GGGGAATTCA TGGTAACTGC ACATTTTG 28 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 TAGGAGCTGC AGGCTTCAAG CATATGCATC 30
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】 キャッサバ(Cassava, Manihot esculent
a)由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼ(EC 4.1.2.37)
をコードする遺伝子を酵母エピソーム型発現ベクターへ
組込んだ組換え体ＤＮＡによって形質転換された酵母を
培地に培養し、培養物からS-ヒドロキシニトリルリアー
ゼを得ることを特徴とする、S-ヒドロキシニトリルリア
ーゼの製造方法。 - 【請求項２】 酵母エピソーム型発現ベクターが、サッ
カロマイセス (Saccharomyces) 属酵母由来のＧＡＰ
（グリセロールアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ）プ
ロモーターの塩基配列からなるＤＮＡ、または該塩基配
列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加し
た塩基配列からなり、かつプロモーター活性を保持する
ＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１に記載の製造
方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37324698A JP3544877B2 (ja) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | Ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法 |
| DE69928206T DE69928206T2 (de) | 1998-12-28 | 1999-12-22 | Verfahren zur Herstellung von S-Hydroxynitrillyasen |
| EP99310432A EP1016712B1 (en) | 1998-12-28 | 1999-12-22 | Process for producing S-Hydroxynitrile lyase |
| US09/472,146 US6387659B1 (en) | 1998-12-28 | 1999-12-27 | Process for producing S-hydroxynitrile lyase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37324698A JP3544877B2 (ja) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | Ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000189159A true JP2000189159A (ja) | 2000-07-11 |
| JP3544877B2 JP3544877B2 (ja) | 2004-07-21 |
Family
ID=18501840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP37324698A Expired - Fee Related JP3544877B2 (ja) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | Ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3544877B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006041226A1 (ja) | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | 改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ |
| US7214523B2 (en) | 2002-12-17 | 2007-05-08 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Method for production of S-hydroxynitrile lyase by use of Escherichia coli |
-
1998
- 1998-12-28 JP JP37324698A patent/JP3544877B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7214523B2 (en) | 2002-12-17 | 2007-05-08 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Method for production of S-hydroxynitrile lyase by use of Escherichia coli |
| WO2006041226A1 (ja) | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | 改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ |
| EP2243831A1 (en) | 2004-10-15 | 2010-10-27 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Improved hydroxynitrile lyase |
| EP2267124A1 (en) | 2004-10-15 | 2010-12-29 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Improved hydroxynitrile lyase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3544877B2 (ja) | 2004-07-21 |
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