WO2010123067A1 - (ｓ)-１-置換プロパン-１-オール誘導体の製造方法 - Google Patents

(ｓ)-１-置換プロパン-１-オール誘導体の製造方法 Download PDF

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WO2010123067A1
WO2010123067A1 PCT/JP2010/057152 JP2010057152W WO2010123067A1 WO 2010123067 A1 WO2010123067 A1 WO 2010123067A1 JP 2010057152 W JP2010057152 W JP 2010057152W WO 2010123067 A1 WO2010123067 A1 WO 2010123067A1
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WO
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propan
thienyl
chloro
polypeptide
seq
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Application number
PCT/JP2010/057152
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Inventor
川野茂
八十原良彦
小野寺慶子
Original Assignee
株式会社カネカ
国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing (S) -1-substituted propan-1-ol derivatives.
  • 1-Substituted propan-1-ol derivatives are useful compounds as synthetic raw materials and intermediates for pharmaceuticals, agricultural chemicals and the like.
  • (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol is an important intermediate for the synthesis of the drug duloxetine.
  • Geotrichum genus Pichia genus, Candida genus, Hansenula genus, Saccharomyces genus, Pseudomonas genus, Burkholderia (Burkhorderia) Asymmetric reduction of 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one using cells of microorganisms belonging to the genera), Rhodococcus, and Lactobacillus (patent) Reference 1).
  • Patent Document 1 the enzyme derived from Lactobacillus brevis (Patent Document 1) and the enzyme derived from a microorganism belonging to the genus Azoarcus (Patent Document 2) have been obtained as structural genes of the enzyme. Furthermore, only an enzyme derived from a microorganism belonging to the genus Azoarcus (Patent Document 2) has been bred for recombinant organisms that mass-produce the enzyme by introducing the structural gene.
  • JP2007-533628A JP2007-535956A International Publication Pamphlet WO2007 / 077400
  • the object of the present invention is to efficiently produce (S) -1-substituted propan-1-ol derivatives, particularly (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol, which are useful as intermediates for pharmaceuticals.
  • the purpose is to manufacture it industrially and industrially.
  • the present invention has the following one or more features.
  • the present invention provides the following formula (2):
  • A is a carbocyclic or heterocyclic ring
  • R 1 is a halogen atom, a thiol group, a hydroxyl group, a nitro group, or a substituted or unsubstituted amino group represented by —NR 2 R 3 ( R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group), and a method for producing (S) -1-substituted propan-1-ol derivatives
  • R 1 is a halogen atom, a thiol group, a hydroxyl group, a nitro group, or a substituted or unsubstituted amino group represented by —NR 2 R 3 ( R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group), and a method for producing (S) -1-substituted propan-1-ol derivatives
  • R 1 is a halogen atom,
  • a and R 1 are as defined above, the following (a1), (a2), (a3), (b1), (b2), and (B3): (A1) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing; (A2) consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and 3-chloro-1- (2-thienyl) A polypeptide having an activity of acting on propan-1-one and NADPH to produce (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol and NADP; (A3) having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and acting on 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one and NADPH ( S) a polypeptide having an activity to produce NADP with 3-chloro-1- (2-thi
  • A is preferably a 2-thienyl group or a phenyl group
  • R 1 is preferably a halogen atom or a methylamino group.
  • A1 DNA described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (A2) DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing (A3) Hybridizes under stringent conditions with a DNA complementary to the DNA shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing and acts on 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one and NADPH
  • a DNA encoding a polypeptide having an activity to produce (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol and NADP (A4) has a sequence identity of 85% or more with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and acts on 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one and NADPH
  • S) DNA encoding a polypeptide having an activity to produce NADP with 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol (B1) DNA described in SEQ
  • the recombinant organism is preferably Escherichia coli.
  • the polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme is preferably produced by a recombinant organism that has been given the ability to produce a polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme.
  • regeneration ability is glucose dehydrogenase.
  • the present invention also provides the following formula (2):
  • A is a carbocyclic or heterocyclic ring
  • R 1 is a halogen atom, a thiol group, a hydroxyl group, a nitro group, or a substituted or unsubstituted amino group represented by —NR 2 R 3 ( R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group), and a method for producing (S) -1-substituted propan-1-ol derivatives
  • R 1 is a halogen atom, a thiol group, a hydroxyl group, a nitro group, or a substituted or unsubstituted amino group represented by —NR 2 R 3 ( R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group), and a method for producing (S) -1-substituted propan-1-ol derivatives
  • R 1 is a halogen atom,
  • a and R 1 are as defined above, the following (a1), (a2), (a3), (b1), (b2), and (B3): (A1) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing; (A2) consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and 3-chloro-1- (2-thienyl) A polypeptide having an activity of acting on propan-1-one and NADPH to produce (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol and NADP; (A3) having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and acting on 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one and NADPH ( S) a polypeptide having an activity to produce NADP with 3-chloro-1- (2-thi
  • the (S) -1-substituted propan-1-ol derivative is preferably (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol, and the active pharmaceutical ingredient is duloxetine. preferable.
  • Polypeptide used in the present invention examples include polypeptides having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 in the Sequence Listing ((a1) and (b1) ) Polypeptide).
  • polypeptide used in the present invention is a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 in the sequence listing. It may be present (polypeptides (a2) and (b2)).
  • polypeptides can be prepared according to a known method described in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1989), etc., and 3-chloro-1- (2-thienyl) propane As long as they have the activity of acting on -1-one and NADPH to produce (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol and NADP, they are included in the above-mentioned polypeptides.
  • the “plural amino acids” are, for example, 35, preferably 20, more preferably 15, more preferably 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 Means 3 or less amino acids.
  • the place where amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added is not particularly limited, but it is preferable to avoid a highly conserved region.
  • the highly conserved region represents a position where amino acids are matched between a plurality of sequences when amino acid sequences are optimally aligned and compared for a plurality of enzymes having different origins.
  • the highly conserved region can be confirmed by comparing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 with the amino acid sequence of a known microorganism-derived alcohol dehydrogenase using a tool such as GENETYX.
  • amino acid sequence modified by substitution, insertion, deletion and / or addition may include only one type (for example, substitution) of modification, or two or more types of modification (for example, substitution and substitution). Insertion).
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having a property similar to that of the amino acid before substitution (cognate amino acid).
  • amino acids in the same group of the following groups are regarded as homologous amino acids.
  • Group 1 neutral nonpolar amino acids
  • Group 2 neutral polar amino acids
  • Ser, Thr, Gln, Asn, Trp, Tyr Group 3: acidic amino acids
  • Glu Asp
  • Group 4 basic amino acids
  • polypeptide used in the present invention has 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 in the sequence listing, and has 3-chloro-1- (2-thienyl) propane- It may be a polypeptide having an activity of acting on 1-one and NADPH to produce (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol and NADP ((a3) and ( polypeptide of b3).
  • sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 in the sequence listing is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • sequence identity between the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is 89.4%.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 in the sequence listing is compared with the amino acid sequence to be evaluated, and the number of amino acid matches in both sequences is divided by the total number of amino acids compared. Further, it is expressed by a value obtained by multiplying by 100.
  • substantially equivalent activity means, for example, 50 to 100%, usually 70 to 100%, preferably 80 to 100%, more preferably 90% or 95 to 100% of the original activity. Say activity. The activity can be measured by the method described later.
  • polypeptide used in the present invention is obtained by reducing (S) -3-chloro-1 by reducing 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one. It can be obtained from microorganisms that have the ability to produce-(2-thienyl) propan-1-ol.
  • a microorganism having the polypeptide can be found, for example, by the following method.
  • the microorganism is cultured in an appropriate medium, and after collection, the microorganism is reacted with 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one in a buffer solution in the presence of nutrients such as glucose. After the reaction, extraction with a solvent or the like is performed, and analysis by high performance liquid chromatography or the like confirms the amount of 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol produced and its optical purity. Good.
  • a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients and the like can be used as long as the microorganism grows.
  • the culture can be performed, for example, by shaking or aeration at a temperature of 25 ° C. to 37 ° C. and a pH of 4 to 8.
  • Isolation of the polypeptide used in the present invention from a microorganism can be carried out by using an appropriate combination of known protein purification methods. For example, it can be implemented as follows. First, microorganisms are cultured in an appropriate medium, and the cells are collected from the culture solution by centrifugation or filtration. The obtained bacterial cells are crushed by an ultrasonic crusher or a physical method using glass beads or the like, and then the cell residue is removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • the polypeptide used in the present invention is isolated from the cell-free extract by using a technique such as external filtration alone or in combination.
  • the reducing activity and stereoselectivity of the isolated polypeptide against 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one are determined by comparing the polypeptide to be evaluated with 3-chloro-1- (2-thienyl) propane-1 It can be evaluated by analyzing with high performance liquid chromatography after acting on. Further, the 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one reducing activity can be evaluated by the following simple method.
  • the reduction activity for 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one is 10 mM 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one in 100 mM phosphate buffer (pH 6.5).
  • the coenzyme NADPH 0.25 mM and the crude enzyme solution were added and reacted at 30 ° C. for 1 minute, and calculated from the rate of decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm. Under these reaction conditions, the enzyme activity that oxidizes 1 ⁇ mol of NADPH to NADP per minute was defined as 1 U.
  • the origin of the polypeptide used in the present invention is not limited, but is preferably a microorganism belonging to the genus Burkholderia.
  • bacteria belonging to the genus Burkholderia include Burkholderia ambifaria, Burkholderia andropogonis, Burkholderia indharadol Caledonica (Burkholderia caledonica), Burkholderia caryophylli, Burkholderia caribensis, Burkholderia caripenia cercephorice (Burkholderia caripenis) Burkholderia cepacia, Burkholderia dolosa, Burkholderia endofungorum, Burkholderia ferrariah Delia Ginsengori (Burkholderia ginsengolii), Burkholderia gladioli (Burkholderia gladioli), Burkholderia glaseii (Burkholderia glathei), Burkholderia Gurmae (
  • Burkholderia sp new species of bacteria belonging to the genus Burkholderia newly isolated from the natural world, such as Burkholderia sp.
  • Burkholderia ambifaria Burkholderia anthina, Burkholderia cenocepacia, Burkoldia urceia Borans (Burkholderia multivorans), Burkholderia pyrrocinia (Burkholderia stabilis), Burkholderia Stabilis, Burkholderia (Burmburgers) Delia sp (Burkholderia sp.) And the like.
  • the above-mentioned bacteria belonging to the genus Burkholderia can be obtained from the following culture collection.
  • Biological Genetic Resource Department (NBRC), National Institute of Technology and Evaluation Biotechnology Headquarters (NBRC) (2-5-8 Kazusa Kamashizu, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818).
  • RIKEN BioResource Center Microbial Materials Development Office JCM (2-1 Hirosawa, Wako City, Saitama Prefecture 351-0198) German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) (Marschuder Weg 1b, D-38124 Brunswick, Germany)
  • the Burkholderia sp. YT strain was issued on August 18, 2008, under the accession number NITE P-613. It is deposited in 2-5-8) Kazusa Kamashishi, Kisarazu City.
  • DNA encoding the polypeptide used in the present invention may be any DNA that can express the polypeptide in a host cell introduced according to the method described below, and may contain any untranslated region. .
  • DNA obtained by synthesis is also included.
  • polypeptide can be obtained, such DNA can be obtained by a person skilled in the art from a microorganism that is the origin of the polypeptide by a known method. For example, it can be acquired by the method shown below.
  • polypeptide used in the present invention isolated by the method described above in “Method for obtaining the polypeptide used in the present invention” is digested with an appropriate endopeptidase, and the resulting peptide fragment is reversed-phased. Preparative by HPLC. Then, for example, part or all of the amino acid sequences of these peptide fragments are determined by an ABI492 type protein sequencer (Applied Biosystems).
  • a PCR (Polymerase Chain Reaction) primer for amplifying a part of the DNA encoding the polypeptide is synthesized.
  • chromosomal DNA of the microorganism that is the origin of the polypeptide is prepared by a conventional DNA isolation method, for example, the method of Visser et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)).
  • PCR is carried out using the PCR primers described above, a part of the DNA encoding the polypeptide is amplified, and the base sequence is determined.
  • the base sequence can be determined using, for example, Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • the entire sequence is determined by, for example, the inverse PCR method (Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)). be able to.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention for example, DNA encoding the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (DNA of (A2)), or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing DNA encoding the polypeptide shown (DNA of (B2)).
  • Specific examples include DNA shown in SEQ ID NO: 2 (DNA of (A1)) and DNA shown in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing (DNA of (B1)).
  • the DNA used in the present invention is hybridized under stringent conditions with DNA complementary to the DNA shown in SEQ ID NO: 2 or 4 in the sequence listing, and 3-chloro-1- (2-thienyl). It may be a DNA encoding a polypeptide having an activity of acting on propan-1-one and NADPH to produce (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol and NADP (DNA of (A3) and (B3)).
  • the DNA used in the present invention has 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4 in the sequence listing, and 3-chloro-1- (2-thienyl) propane-1 It may be DNA encoding a polypeptide having an activity of acting on (ON) and NADPH to produce (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol and NADP ((A4 ) And (B4) DNA).
  • DNA encoding a polypeptide having an activity of acting on NADPH to produce (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol and NADP means SEQ ID NO: 2 in the sequence listing or DNA obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like under stringent conditions using a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in 4 as a probe And acting on 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one and NADPH (S) It means 3-chloro-1- (2-thienyl) DNA encoding a polypeptide having the activity to form 1-ol and NADP.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions means, for example, a high-temperature DNA at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which colony or plaque-derived DNA is immobilized. After hybridization, the filter is washed at 65 ° C. using a 2 ⁇ concentration SSC solution (the composition of the 1 ⁇ concentration SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). The DNA which can be raised can be raised.
  • hybridization conditions have been described as described above, the conditions are not particularly limited.
  • a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize optimum stringency by appropriately selecting these factors.
  • the DNA that can hybridize under the above conditions is 70% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95%, with the DNA shown in SEQ ID NO: 2 or 4. %, More preferably 98% or more of the DNA, and the encoded polypeptide acts on 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one and NADPH (S)- As long as it has an activity to produce NADP with 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol, it is included in the DNA.
  • sequence identity means that the two DNAs to be compared are optimally aligned, and the nucleobases (eg, A, T, C, G, U, or I) match in both sequences.
  • the number of positions is divided by the total number of comparison bases, and the result is expressed by a value obtained by multiplying by 100.
  • Sequence identity can be calculated using, for example, the following sequence analysis tools: GCG Wisconsin Package (Program Manual for The Wisconsin Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Medison, Wisconsin 11, USA 5; 37 Rice, P.M. (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Center, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, England), and the ExPASy World Wide Web server for molecular biology (Geneva University Hospital and University of Geneva, Geneva, Switzerland).
  • Recombinant organisms producing polypeptides used in the present invention include (A1), (A2), (A3), (A4) described above. , (B1), (B2), (B3) or a recombinant organism into which the DNA according to any one of (B4) has been introduced.
  • a host organism is transformed with a polypeptide expression vector prepared by inserting a DNA encoding the polypeptide used in the present invention into an expression vector, a recombinant organism producing the polypeptide used in the present invention can be obtained.
  • the polypeptide of the present invention can be expressed by culturing using a medium in which this organism can grow. Furthermore, a method of introducing a polynucleotide encoding the polypeptide used in the present invention into a chromosome can also be used.
  • the expression vector used above is not particularly limited as long as it can express the polypeptide encoded by the DNA in a suitable host organism.
  • examples of such vectors include plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, and shuttle vectors that can exchange genes with other host strains can also be used.
  • such a vector in the case of Escherichia coli, such a vector usually contains regulatory elements such as lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter, etc., and operates with the DNA of the present invention. It can be suitably used as an expression vector comprising expression units that are ligated together. Examples thereof include pUCN18 (see Production Example 1), pSTV28 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUCNT (WO94 / 03613), and the like.
  • regulatory element refers to a base sequence having a functional promoter and any associated transcription element (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
  • operably linked means that a gene is operably linked to various regulatory elements such as promoters and enhancers that regulate the expression of the gene. It is well known to those skilled in the art that the type and kind of the control factor can vary depending on the host.
  • the host organism used to express the polypeptide used in the present invention is an organism that is transformed with a polypeptide expression vector containing DNA encoding each polypeptide and can express the polypeptide encoded by the introduced DNA. If there is no particular limitation, organisms for which host vector systems have been developed are preferred.
  • Examples of usable microorganisms include, for example, the genus Escherichia, the genus Bacillus, the genus Pseudomonas, the genus Serratia, the genus Brevibacterium, the genus Corynebacterium, Bacteria such as Streptococcus and Lactobacillus; Actinomycetes such as Rhodococcus and Streptomyces; Saccharomyces , Schizosaccharomyces genus of Omyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium, Pichia, and Candida; Examples include molds such as the genus Neurospora, the genus Aspergillus, the genus Cephalosporum, and the genus Trichoderma.
  • microorganisms In addition to microorganisms, various host / vector systems have been developed for plants and animals, and in particular, large quantities in insects such as moths (Nature 315, 592-594 (1985)), rapeseed, corn, potatoes, and other plants. Systems for expressing heterologous proteins have been developed and can be suitably used. Among these, microorganisms are preferable, bacterium is more preferable, and Escherichia coli (commonly called Escherichia coli) is particularly preferable in terms of introduction and expression efficiency.
  • a polypeptide expression vector containing a DNA encoding a polypeptide used in the present invention can be introduced into a host organism by a known method.
  • polypeptide expression vector pNBS see Production Example 1 in which the DNA shown in SEQ ID NO: 2 is introduced into the expression vector pUCN18 is introduced into Escherichia coli, which is a host microorganism, commercially available E. coli.
  • E. coli HB101 competent cells manufactured by TAKARA BIO INC.
  • TAKARA BIO INC. TAKARA BIO INC.
  • a polypeptide expression vector pNBM (see Production Example 3) in which the DNA shown in SEQ ID NO: 4 is introduced into the expression vector pUCN18 can be operated in the same manner as described above, and the recombinant organism E. E. coli HB101 (pNBM) (see Production Example 5) is obtained.
  • a recombinant organism in which both the polypeptide used in the present invention and the polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme described below are expressed in the same cell can also be bred. That is, it can be obtained by incorporating the DNA encoding the polypeptide used in the present invention and the DNA encoding the polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme into the same vector and introducing it into a host cell.
  • Examples of the recombinant organism thus obtained include E. coli. E. coli HB101 (pNBSG) (see Production Example 5).
  • This is a recombinant vector pNBSG (see Production Example 2) in which both the DNA shown in SEQ ID NO: 2 and the DNA encoding glucose dehydrogenase having the ability to regenerate reduced coenzyme are introduced into the expression vector pUCN18, E. E. coli is a recombinant organism introduced into HB101.
  • the DNA encoding the polypeptide used in the present invention and the DNA encoding the polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme are respectively incorporated into two types of vectors of different incompatibility groups, and these are incorporated into the same host cell.
  • a recombinant organism that produces both the polypeptide used in the present invention and the polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme in the same cell can be bred. Examples of the recombinant organism thus obtained include E. coli. E. coli HB101 (pNBS, pSTVG) (see Production Example 5).
  • Both recombinant vectors pSTVG introduced into E. It is a recombinant organism introduced into E. coli HB101 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • A represents a carbocyclic or heterocyclic ring.
  • the ring may be monocyclic or polycyclic, and may be saturated or unsaturated. Furthermore, you may have a substituent.
  • carbocyclic rings include saturated hydrocarbons, unsaturated hydrocarbons or aromatic hydrocarbons consisting of 3 to 10, preferably 4 to 6 carbon atoms.
  • saturated hydrocarbon examples include cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and the like.
  • unsaturated hydrocarbon examples include cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexynyl and the like.
  • Aromatic hydrocarbons include phenyl and the like.
  • heterocyclic ring examples include heterocycles having 1 to 4 heteroatoms selected from an oxygen atom, a nitrogen atom or a sulfur atom, and preferably 3 to 10, preferably 4 to 6 atoms.
  • furan, thiophene, pyrrole, oxazole, thiazole, imidazole, pyrazole, furazane, pyran, pyridine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine and the like can be mentioned.
  • Examples of the substituent when A is substituted include a halogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a hydroxyl group, a nitro group, and a thiol group.
  • a halogen atom shows a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom etc., for example.
  • the lower alkyl group represents a C1-C8 alkyl group, preferably a C1-C4 alkyl group, and examples thereof include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, and a tert-butyl group.
  • the lower alkoxy group represents an alkoxy group in which the alkyl portion is the lower alkyl group, and examples thereof include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propyloxy group, an i-propyloxy group, an n-butyloxy group, and a tert-butyloxy group. It is done.
  • A is preferably an optionally substituted 2-thienyl group or an optionally substituted phenyl group, more preferably a 2-thienyl group or a phenyl group.
  • R 1 is a halogen atom, a thiol group, a hydroxyl group, a nitro group, or a substituted or unsubstituted amino group represented by —NR 2 R 3 (R 2 and R 3 are Independently represents a hydrogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group).
  • a halogen atom shows a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom etc., for example.
  • the lower alkyl group of R 2 and R 3 represents a C1 to C8 alkyl group, preferably a C1 to C4 alkyl group, and includes a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a tert group, -A butyl group etc. are mentioned.
  • the lower alkoxy group of R 2 and R 3 represents an alkoxy group in which the alkyl portion is the lower alkyl group, and is a methoxy group, ethoxy group, n-propyloxy group, i-propyloxy group, n-butyloxy group, tert. -Butyloxy group and the like.
  • R 2 and R 3 are preferably a hydrogen atom, one is a hydrogen atom and the other is a lower alkyl group Is more preferable. Particularly preferred is a methylamino group (—NHMe).
  • R 1 is preferably a halogen atom or a methylamino group, more preferably a chlorine atom or a bromine atom, and particularly preferably a chlorine atom.
  • Substrate 1-substituted propan-1-one derivatives such as 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one can be synthesized with thiophene according to the method described in Phosphorus and Sulfur, 33, 25 (1987).
  • a 3-chloropropionic acid chloride can be produced in good yield by acylation reaction in the presence of Friedel-Craft catalyst.
  • a suitable solvent such as 100 mM phosphate buffer (pH 6.5)
  • a suitable solvent such as 100 mM phosphate buffer (pH 6.5)
  • a substituted propan-1-one derivative is added, a coenzyme such as NADPH or NADP + , and a culture and / or processed product of the recombinant organism are added, and the mixture is reacted with stirring under pH adjustment.
  • the treated product is, for example, a crushed cell, a crude extract, a cultured cell, a freeze-dried organism, an acetone-dried organism, or a ground product thereof, or a mixture thereof, and the polypeptide catalyst.
  • the activity remains.
  • a recombinant organism that produces both the polypeptide of the present invention and the polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme for example, E. coli, etc. coli HB101 (pNBSG) (see Production Example 5) and E. coli. If E. coli HB101 (pNBM, pSTVG) (see Production Example 5) is used, the amount of coenzyme used can be greatly reduced.
  • the polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme will be described in detail later.
  • the reaction is carried out at a temperature of 5 to 80 ° C., preferably 10 to 60 ° C., more preferably 20 to 40 ° C., and the pH of the reaction solution during the reaction is 3 to 10, preferably 4 to 9, more preferably 5 to 8. To maintain.
  • the reaction can be carried out batchwise or continuously.
  • the reaction substrate can be added at a feed concentration of 0.01 to 100% (w / v), preferably 0.1 to 70%, more preferably 0.5 to 50%. Further, a substrate may be newly added during the reaction.
  • a surfactant such as Triton (manufactured by Nacalai Tesque), Span (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.), Tween (manufactured by Nacalai Tesque) to the reaction solution.
  • an organic solvent insoluble in water such as ethyl acetate, butyl acetate, isopropyl ether, toluene, hexane, or the like is added to the reaction solution in order to avoid inhibition of the reaction by the substrate and / or the alcohol that is the product of the reduction reaction. May be.
  • an organic solvent soluble in water such as methanol, ethanol, acetone, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide and the like can be added.
  • the collection of the (S) -1-substituted propan-1-ol derivative produced by the reduction reaction is not particularly limited, but ethyl acetate, toluene, t-butyl methyl ether directly from the reaction solution or after separating the cells, etc. Extraction with a solvent such as hexane, n-butanol, or dichloromethane, followed by dehydration and purification by distillation, silica gel column chromatography, etc., can easily obtain a high-purity (S) -1-substituted propan-1-ol derivative Can do.
  • the (S) -1-substituted propan-1-ol derivative obtained in the present invention means that the (S) -1-substituted propan-1-ol derivative is more than the (R) -1-substituted propan-1-ol derivative. It is a 1-substituted propan-1-ol which is contained abundantly. Its optical purity is usually 85% e.e. e. Or more, preferably 90% e.e. e. Or more, more preferably 95% e.e. e. More preferably, 97% e.e. e. The most preferable is 99% e.e. e. That's it.
  • the 1-substituted propan-1-one derivative is reduced (S) -1.
  • NADPH is required as a coenzyme.
  • the present invention can also be carried out by adding a necessary amount of NADPH to the reaction system.
  • an enzyme having the ability to convert the oxidized coenzyme (NADP + ) into reduced NADPH (hereinafter referred to as reduced coenzyme regeneration ability) together with its substrate, that is, a polyenzyme using the coenzyme regeneration system in the present invention.
  • the amount of expensive coenzyme used can be greatly reduced.
  • the enzyme having the ability to regenerate reduced coenzyme hydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucose dehydrogenase and the like can be used.
  • glucose dehydrogenase is used.
  • Such a reaction can also be carried out by adding a coenzyme regeneration system into the asymmetric reduction reaction system, but it encodes a DNA encoding the enzyme of the present invention and a polypeptide having a reduced coenzyme regeneration ability.
  • a recombinant organism transformed with both DNAs is used as a catalyst, the reaction can be efficiently performed without separately preparing an enzyme having the ability to regenerate reduced coenzyme and adding it to the reaction system. .
  • Such a recombinant organism can be obtained by the method described above.
  • a useful drug substance can be produced using a substituted propan-1-ol derivative as a raw material.
  • a useful drug substance is preferably a drug substance using a (S) -1-substituted propan-1-ol derivative as a building block, of which duloxetine is particularly preferable.
  • a known method for example, J. Label. Compd. Radiopharm.34, 213-223 (1995)
  • This cell suspension was added to a test tube containing 2.5 mg of 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one in advance and reacted at 30 ° C. for 24 hours. After the reaction, ethyl acetate was added and mixed well, and a part of the organic layer was analyzed under the conditions of high performance liquid chromatography described in Example 1 described later to obtain 3-chloro-1- (2-thienyl) propane-1 -Conversion to all and its optical purity were measured. The results are shown in Table 1.
  • PCR reaction Using Primer 1: 5′-ATATACATATGACCCCACCGCCAACCCCG-3 ′ (SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing), Primer 2: 5′-TATAGGTACCCTTATCAAAGCTTGTCGAACCGCGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing), Burkholderia sp. ) PCR was performed using the chromosomal DNA of the YT strain as a template. As a result, an NdeI recognition site was added to the start codon portion of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and a new stop codon (TAA) and a KpnI recognition site were added immediately after the stop codon. Double-stranded DNA (RBS gene) was obtained. PCR was performed using PrimeSTAR HS DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase, and the reaction conditions were in accordance with the instruction manual.
  • the obtained RBS gene was digested with NdeI and KpnI, and the 185th T of the plasmid pUCN18 (pUC18 (manufactured by Takara Bio Inc., GenBank Accession No. L09136) was altered to A by PCR to destroy the NdeI site.
  • the 471-472th GC was changed to TG to insert it between the NdeI recognition site and the KpnI recognition site downstream of the lac promoter of the plasmid into which the NdeI site was newly introduced to construct a recombinant vector pNBS.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • the obtained GDH gene was digested with KpnI and XbaI, and inserted between the KpnI recognition site and the XbaI recognition site downstream of the RBS gene of plasmid pNBS described in Production Example 1 to construct a recombinant vector pNBSG.
  • PCR reaction Using primer 5: 5′-ATATACATATGCGCGCTGCCACGCCCCCGTACG-3 ′ (SEQ ID NO: 9 in the sequence listing), primer 6: 5′-TATAGGTACCCTTATCACCGCCGCGTCCGACACCGGACGCGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) multivorans) PCR was performed using NBRC102086 strain chromosomal DNA as a template. As a result, an NdeI recognition site was added to the start codon portion of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and a new stop codon (TAA) and a KpnI recognition site were added immediately after the stop codon. Double-stranded DNA (RBM gene) was obtained. PCR was performed using PrimeSTAR HS DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase, and the reaction conditions were in accordance with the instruction manual.
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase manufactured by
  • the obtained RBM gene was digested with NdeI and KpnI, and inserted between the NdeI recognition site and the KpnI recognition site downstream of the lac promoter of plasmid pUCN18 (see Production Example 1) to construct a recombinant vector pNBM.
  • GDH strain-derived glucose dehydrogenase
  • the obtained GDH gene was digested with EcoRI and PstI, and inserted into the EcoRI-PstI site of plasmid pSTV28 (manufactured by Takara Bio Inc.) to construct a recombinant vector pSTVG.
  • E. coli HB101 competent cell manufactured by Takara Bio Inc.
  • coli HB101 pNBSG
  • E. coli HB101 competent cell manufactured by Takara Bio Inc.
  • coli HB101 pNBM
  • E. coli HB101 pNBS
  • E. coli HB101 pNBSG
  • E. coli HB101 pNBM
  • recombination including the vector plasmid pUCN18 E. a living organism
  • Each of E. coli HB101 (pUCN18) (comparative example) is inoculated into 5 ml of 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin. And cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours.
  • E. coli HB101 (pNBS, pSTVG), E. coli HB101 (pNBM, pSTVG)), and E. coli HB101 (pNBM, pSTVG), which are recombinant organisms including the vector plasmids pUCN18 and pSTV28.
  • Each of E. coli HB101 (pUCN18, pSTV28) (comparative example) was mixed with 2 ⁇ YT medium containing 200 ⁇ g / ml ampicillin and 100 ⁇ g / ml chloramphenicol (tryptone 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl0). 0.5%, pH 7.0) was inoculated into 5 ml, and cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours.
  • Manufacture example 7 Measurement of reduction activity About each culture solution obtained by said culture
  • the reduction activity for 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one is 10 mM 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one in 100 mM phosphate buffer (pH 6.5).
  • the coenzyme NADPH 0.25 mM and the crude enzyme solution were added and reacted at 30 ° C. for 1 minute, and calculated from the rate of decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm. Under these reaction conditions, the enzyme activity that oxidizes 1 ⁇ mol of NADPH to NADP per minute was defined as 1 U.
  • GDH activity was determined by adding 0.1 M glucose, 2 mM coenzyme NADP, and crude enzyme solution to 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), reacting at 25 ° C. for 1 minute, and increasing absorbance at a wavelength of 340 nm. Calculated. Under these reaction conditions, the enzyme activity for reducing 1 ⁇ mol of NADP to NADPH per minute was defined as 1 U.
  • E. E. coli HB101 pUCN18
  • E. coli HB101 pUCN18, pSTV28
  • the 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one reducing activity and the GDH activity were both 0.1 U / mg or less.
  • E. coli HB101 had a 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one reduction activity of 25 U / mg.
  • E. co-expressed RBS and GDH E. coli HB101 (pNBSG) had a 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one reduction activity of 15 U / mg and a GDH activity of 440 U / mg.
  • E. coli HB101 had a 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one reduction activity of 30 U / mg and a GDH activity of 120 U / mg.
  • E. coli HB101 had a 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one reduction activity of 10 U / mg.
  • E. co-expressed RBM and GDH E. coli HB101 had a 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one reduction activity of 10 U / mg and a GDH activity of 140 U / mg.
  • Example 1 Recombinant organism Preparation of (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol using E. coli HB101 (pNBS) After culturing E. coli HB101 (pNBS) in the same manner as in Production Example 6, the cells were disrupted with an ultrasonic homogenizer to obtain 20 ml of a cell-free extract. To 20 ml of this cell-free extract, glucose dehydrogenase (trade name: GLUCDH “Amano” II, manufactured by Amano Enzyme) 700 U, glucose 400 mg, NADP + 3 mg, 3-chloro-1- (2-thienyl) propane-1 200 mg of ON was added, and the mixture was stirred at 30 ° C.
  • glucose dehydrogenase trade name: GLUCDH “Amano” II, manufactured by Amano Enzyme
  • Example 2 Recombinant organism Preparation of (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol using E. coli HB101 (pNBSG) coli HB101 (pNBSG) was cultured in the same manner as in Production Example 6 to obtain 100 ml of a culture solution. To 100 ml of this culture solution, 10 g of glucose, 3 mg of NADP + and 1 g of 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one were added, and adjusted to pH 6.25 by dropwise addition of 5N aqueous sodium hydroxide solution. The mixture was stirred at 30 ° C.
  • Example 3 Recombinant organism Production of (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol using E. coli HB101 (pNBS, pSTVG) E. coli HB101 (pNBS, pSTVG) was cultured in the same manner as in Production Example 6 to obtain 100 ml of a culture solution. To 100 ml of this culture solution, 10 g of glucose, 3 mg of NADP + and 1 g of 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one were added, and the pH was adjusted to 6.25 by dropwise addition of 5N aqueous sodium hydroxide solution. The mixture was stirred at 30 ° C.
  • Example 4 Recombinant organism Preparation of (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol using E. coli HB101 (pNBM) After culturing E. coli HB101 (pNBM) in the same manner as in Production Example 6, the cells were disrupted with an ultrasonic homogenizer to obtain 20 ml of a cell-free extract.
  • glucose dehydrogenase (trade name: GLUCDH “Amano” II, manufactured by Amano Enzyme) 700 U, glucose 400 mg, NADP + 3 mg, 3-chloro-1- (2-thienyl) propane-1 -200 mg of ON was added, and the mixture was stirred at 30 ° C for 5 hours while adjusting pH to 6.25 by dropwise addition of 5N aqueous sodium hydroxide solution.
  • a part of the reaction solution was sampled, treated and analyzed in the same manner as in Example 1 to obtain a conversion rate to (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol and its optical purity.
  • the conversion rate is 99% or more, and the optical purity is 99% e.e. e. That was all.
  • Example 5 Recombinant organism Production of (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol using E. coli HB101 (pNBM, pSTVG) coli HB101 (pNBM, pSTVG) was cultured in the same manner as in Production Example 6 to obtain 100 ml of a culture solution. To 100 ml of this culture solution, 10 g of glucose, 3 mg of NADP + and 1 g of 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one were added, and adjusted to pH 6.25 by dropwise addition of 5N aqueous sodium hydroxide solution. The mixture was stirred at 30 ° C.
  • Example 6 Recombinant organism Production of (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol using E. coli HB101 (pNBS, pSTVG) coli HB101 (pNBS, pSTVG) was cultured in the same manner as in Production Example 6 to obtain 200 ml of a culture solution. To 200 ml of this culture solution, 41 g of glucose, 3 mg of NADP + and 2 g of 3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-one were added, and the pH was adjusted to 6.25 by dropwise addition of 5N aqueous sodium hydroxide solution. The mixture was stirred at 30 ° C.
  • Example 7 Recombinant organism Production of (S) -3-chloro-1-phenylpropan-1-ol using E. coli HB101 (pNBS, pSTVG) coli HB101 (pNBS, pSTVG) was cultured in the same manner as in Production Example 6 to obtain 200 ml of a culture solution. To 200 ml of this culture solution, 45 g of glucose, 3 mg of NADP + , 2 g of 3-chloro-1-phenylpropan-1-one were added, and 5N aqueous sodium hydroxide solution was added dropwise to adjust the pH to 6.25 at 30 ° C. And stirred.
  • Example 8 Production of (S) -N-methyl-3- (1-naphthalenyloxy) -3- (2-thiophene) -propanamine hydrochloride (Step 1) To 93 g of 40% methylamine / methanol solution, 21.6 g of (S) -3-chloro-1- (2-thienyl) propan-1-ol obtained by the method described in Example 7 was added dropwise at room temperature. Reacted for 1 minute. Methanol and methylamine were distilled off under reduced pressure, water was added, and the mixture was extracted with methyl-t-butyl ether. The organic layer was washed with brine and then concentrated under reduced pressure.

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Abstract

医薬品の中間体として有用な(Ｓ)-１-置換プロパン-１-オール誘導体、特に(Ｓ)-３-クロロ-１-(２-チエニル)プロパン-１-オール、の効率的かつ工業的な製造方法を提供する。 １-置換プロパン-１-オン誘導体に特定のポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または該生物体の処理物を作用させて還元することにより、(Ｓ)-１-置換プロパン-１-オール誘導体を製造する。

Description

（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体の製造方法
本発明は、（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体の製造方法に関する。１－置換プロパン－１－オール誘導体は、医薬品、農薬等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。特に、（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールは、医薬品であるデュロキセチンを合成するための重要な中間体である。
（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体、例えば（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールの製造方法の一つに、微生物菌体を触媒とした３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンの不斉還元法が挙げられる。
ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物の菌体を用いた３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンの不斉還元が報告されている（特許文献１）。
しかし、これら微生物のうち、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンをＳ体の３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールへ還元することが明らかとなっているのは、ラクトバシラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオトリカム・カンジドウム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ）、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｇｎｏｌｉａｅ）の３株のみであり、他の微生物に関しては、生成した３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールの絶対立体配置及びその光学純度については明らかとなっていない（特許文献１）。
また、このような微生物菌体を用いた反応では、その菌体に由来する不純物、あるいはその微生物が有する他の酵素による副反応、などにより、生成物の単離が煩雑になることがしばしばある。また、生成物の光学純度が低い、生成物の蓄積濃度が低い、などの問題点もある。
また、特定の酵素を触媒とした３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンの不斉還元に関する報告はある。しかし、報告されている酵素は、ラクトバシラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｇｎｏｌｉａｅ）の微生物由来の酵素（特許文献１）、アゾアルカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）属の微生物由来の酵素（特許文献２）、およびサーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来の酵素（特許文献３）に限られている。
このうち、酵素の構造遺伝子が取得されているのは、ラクトバシラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）由来の酵素（特許文献１）とアゾアルカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）属の微生物由来の酵素（特許文献２）だけである。更に、該構造遺伝子を導入して該酵素を大量生産する組換え生物が育種されているのは、アゾアルカス（Ａｚｏａｒｃｕｓ）属の微生物由来の酵素（特許文献２）のみである。
特開２００７－５３３６２８ 特開２００７－５３５９５６ 国際公開パンフレット　ＷＯ２００７／０７４０６０
本発明の課題は、医薬品の中間体として有用な（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体、特に（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールを効率的かつ工業的に製造することにある。
本発明者らは、（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体の簡便かつ効率的な製造方法を開発すべく検討を重ねた結果、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールに変換するポリペプチドを微生物より見出して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の１又は複数の特徴を有する。
本発明は、下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、Ａは炭素環式または複素環式の環であり、Ｒ１はハロゲン原子、チオール基、水酸基、ニトロ基、または－ＮＲ２Ｒ３で表される置換または無置換のアミノ基（Ｒ２、Ｒ３は互いに独立して水素原子、低級アルキル基、または低級アルコキシ基を示す）を示す）で表される（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体の製造方法であって、下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ａ及びＲ１は前記と同じ）で表される１－置換プロパン－１－オン誘導体に、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、および（ｂ３）：　
（ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｂ１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、および
（ｂ３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または、該生物体の処理物を作用させて、前記化合物（１）を還元することを特徴とする方法に関する。
上記製造方法において、Ａが２－チエニル基もしくはフェニル基であり、Ｒ１がハロゲン原子もしくはメチルアミノ基であることが好ましい。
上記製造方法において、上記の（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、および（ｂ３）からなる群から選択されるポリペプチドを産生する生物が、下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ｂ１）、（Ｂ２）、（Ｂ３）および（Ｂ４）からなる群から選択されるＤＮＡを導入された組換え生物であることが好ましい。
（Ａ１）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ
（Ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ａ３）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ａ４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｂ１）配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ
（Ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｂ３）配列表の配列番号４に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｂ４）配列表の配列番号４に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
上記製造方法において、組換え生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（大腸菌）であることが好ましい。
上記製造方法において、さらに、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドを作用させることが好ましい。
上記製造方法において、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドが、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの生産能を付与された組換え生物により生産されたものであることが好ましい。
上記製造方法において、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドがグルコース脱水素酵素であることが好ましい。
本発明は、また、下記式（２）：
（式中、Ａは炭素環式または複素環式の環であり、Ｒ１はハロゲン原子、チオール基、水酸基、ニトロ基、または－ＮＲ２Ｒ３で表される置換または無置換のアミノ基（Ｒ２、Ｒ３は互いに独立して水素原子、低級アルキル基、または低級アルコキシ基を示す）を示す）で表される（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体の製造方法であって、下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式中、Ａ及びＲ１は前記と同じ）で表される１－置換プロパン－１－オン誘導体に、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、および（ｂ３）：　
（ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｂ１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、および
（ｂ３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または、該生物体の処理物を作用させて、前記化合物（１）を還元する工程を有する、医薬品原薬の製造方法に関する。
（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体は、（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールであることが好ましく、医薬品原薬がデュロキセチンであることが好ましい。
本発明の方法によれば、高い光学純度の（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体、特に（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールを効率的かつ工業的に製造することができる。
以下、本発明について実施形態を用いて詳細に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
本発明で用いるポリペプチド
本発明で用いるポリペプチドのアミノ酸配列としては、配列表の配列番号１または３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる（（ａ１）および（ｂ１）のポリペプチド）。
また、本発明で用いるポリペプチドとしては、配列表の配列番号１または３に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい（（ａ２）および（ｂ２）のポリペプチド）。これらのポリペプチドは、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有する限りは、上記ポリペプチドに包含される。
ここで「複数個のアミノ酸」とは、例えば、３５個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸を意味する。
配列表の配列番号１または３に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素について、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１または３に示したアミノ酸配列と、公知の微生物由来のアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ　
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ　
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ
また、本発明で用いるポリペプチドとしては、配列表の配列番号１または３に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドであってもよい（（ａ３）および（ｂ３）のポリペプチド）。
配列表の配列番号１または３のアミノ酸配列に対する配列同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上が更に好ましく、９９％以上がより最も好ましい。
なお、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列の配列同一性は８９．４％である。
アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１または３に示したアミノ酸配列と評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのようなタグ配列を付加しても良い。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
また、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性のレベルが低下する場合であっても、実質的に同等の活性があれば、本発明のポリペプチドに包含される。ここで「実質的に同等の活性」とは、元の活性に対して、例えば５０～１００％、通常７０～１００％、好ましくは８０～１００％、より好ましくは９０％あるいは９５～１００％の活性を言う。活性の測定は、後述の方法で実施できる。
本発明で用いるポリペプチドの取得方法
本発明で用いるポリペプチドは、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを還元して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールを生成する能力を有する微生物から取得できる。該ポリペプチドを有する微生物は、例えば、以下の方法で見出すことができる。
微生物を適当な培地で培養し、集菌後、緩衝液中、グルコースなどの栄養存在下で３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンと反応させる。反応後、溶剤などで抽出を行い、高速液体クロマトグラフィーなどで分析することにより、生成する３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールの生成量およびその光学純度を確認すればよい。
微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。培養は、例えば、温度２５℃から３７℃、ｐＨ４～８で振とうもしくは通気することで行い得る。
微生物からの本発明に用いるポリペプチドの単離は、公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得る。そして、熱処理、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明に用いるポリペプチドを単離する。
単離したポリペプチドの３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンに対する還元活性および立体選択性は、評価したいポリペプチドと３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとを作用させた後に、高速液体クロマトグラフィーなどで分析することにより評価できる。また、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性については、以下の簡便な方法でも評価できる。
［３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンに対する還元活性の測定方法］
３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンに対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭ、および粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。
本発明で用いるポリペプチドの起源は限定されるものではないが、好ましくはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物である。バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌としては、例えば、バークホルデリア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ａｍｂｉｆａｒｉａ）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）、バークホルデリア・アンチナ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ａｎｔｈｉｎａ）、バークホルデリア・カレドニカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃａｌｅｄｏｎｉｃａ）、バークホルデリア・カリオフィリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ）、バークホルデリア・カリベンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃａｒｉｂｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデアリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・ドロサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｄｏｌｏｓａ）、バークホルデリア・エンドフンゴラム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｅｎｄｏｆｕｎｇｏｒｕｍ）、バークホルデリア・フェラリアエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｅｒｒａｒｉａｅ）、バークホルデリア・フンゴラム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｕｎｇｏｒｕｍ）、バークホルデリア・ギンセンギソリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、バークホルデリア・グラディオリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｇｌａｄｉｏｌｉ）、バークホルデリア・グラセイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｇｌａｔｈｅｉ）、バークホルデリア・グルマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｇｌｕｍａｅ）、バークホルデリア・グラミニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）、バークホルデリア・ホスピタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｈｏｓｐｉｔａ）、バークホルデリア・クルリエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア・フェナジニウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）、バークホルデリア・フェノリラプトリクス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｈｅｎｏｌｉｒｕｐｔｒｉｘ）、バークホルデリア・フィマタム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｈｙｍａｔｕｍ）、バークホルデリア・フィトファーマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、バークホルデアリア・プランタリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｌａｎｔａｒｉｉ）、バークホルデリア・ピロシニア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ）、バークホルデリア・リゾキニカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｒｈｉｚｏｘｉｎｉｃａ）、バークホルデリア・サッカリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓａｃｃｈａｒｉ）、バークホルデリア・セディミニコーラ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｅｄｉｍｉｎｉｃｏｌａ）、バークホルデリア・ソリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｏｌｉ）、バークホルデリア・ソルディデコーラ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｏｒｄｉｄｉｃｏｌａ）、バークホルデリア・スタビリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｔａｂｉｌｉｓ）、バークホルデリア・テラエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｔｅｒｒａｅ）、バークホルデリア・テリコーラ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｔｅｒｒｉｃｏｌａ）、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、バークホルデルリア・トロピカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｔｒｏｐｉｃａ）、バークホルデリア・チュベラム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｔｕｂｅｒｕｍ）、バークホルデリア・ウボネンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｕｂｏｎｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ウナマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｕｎａｍａｅ）、バークホルデリア・ベトナミエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）などが挙げられる。
また、新たに自然界から分離した新種のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌、例えばバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）なども挙げられる。好ましくは、バークホルデリア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ａｍｂｉｆａｒｉａ）、バークホルデリア・アンチナ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ａｎｔｈｉｎａ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデアリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア・ピロシニア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ）、バークホルデリア・スタビリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｔａｂｉｌｉｓ）、バークホルデリア・ベトナミエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）などが挙げられる。特に好ましくは、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＹＴ株（ＮＩＴＥ　Ｐ－６１３）、バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０２０８６株が挙げられる。
上記のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌は、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部　生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）。
独立行政法人理化学研究所　バイオリソースセンター 微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒３５１－０１９８　埼玉県和光市広沢２－１）
Ｇｅｒｍａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（Ｍａｒｓｃｈｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　１ｂ，Ｄ－３８１２４　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＹＴ株は、平成２０年８月１８日付けで、受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－６１３として、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に寄託されている。
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡ
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡは、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。天然よりクローニングされたＤＮＡ、ｃＤＮＡの他、合成によって得られるＤＮＡも含まれる。
該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で、このようなＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。
なお、本明細書において後述する、ＤＮＡクローニング、ベクターの調製及び形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等の成書に記載されている方法により実施することができる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。
まず、先の「本発明で用いるポリペプチドの取得方法について」で記載した方法により単離された本発明で用いるポリペプチドについて、適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，４１５（２０００））により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌ　ジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）等を用いて行うことができる。
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、インバース（Ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６，８１８６（１９８８））により、その全体の配列を決定することができる。
このようにして得られる本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとして、例えば、配列表の配列番号１に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ（（Ａ２）のＤＮＡ）、または、配列表の配列番号３に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ（（Ｂ２）のＤＮＡ）が挙げられる。具体的には、配列表の配列番号２に示すＤＮＡ（（Ａ１）のＤＮＡ）、配列表の配列番号４に示すＤＮＡ（（Ｂ１）のＤＮＡ）を挙げることができる。
また、本発明で用いるＤＮＡとしては、配列表の配列番号２または４に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい（（Ａ３）および（Ｂ３）のＤＮＡ）。
また、本発明で用いるＤＮＡとしては、配列表の配列番号２または４に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい（（Ａ４）および（Ｂ４）のＤＮＡ）。
ここで、「配列表の配列番号２または４に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号２または４に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡで、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを意味する。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２または４に示されるＤＮＡと、配列同一性が７０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。
ここで、「配列同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：
ＧＣＧ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｔｈｅ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ８，１９９４年９月，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒｉｖｅ　Ｍｅｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ　５３７１１；　
Ｒｉｃｅ，Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　ＥＧＣＧ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｐｅｔｅｒ　Ｒｉｃｅ，Ｔｈｅ　Ｓａｎｇｅｒ　Ｃｅｎｔｒｅ，Ｈｉｎｘｔｏｎ　Ｈａｌｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＣＢ１０　１ＲＱ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、及び、
ｔｈｅ　ＥｘＰＡＳｙ　Ｗｏｒｌｄ　Ｗｉｄｅ　Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ａｎｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｖａ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
本発明で用いるポリペプチドを生産する組換え生物
本発明で用いるポリペプチドを生産する組換え生物としては、上記で述べた（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ｂ１）、（Ｂ２）、（Ｂ３）または（Ｂ４）のいずれかに記載のＤＮＡを導入された組換え生物を挙げることができる。
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入して作製したポリペプチド発現ベクターを用いて宿主生物を形質転換すれば、本発明で用いるポリペプチドを生産する組換え生物が得られる。この生物が生育しうる培地を用いて培養することにより、本発明のポリペプチドを発現させることができる。更に、本発明で用いるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体中に導入する方法なども利用できる。
上記で用いる発現ベクターとしては、適当な宿主生物内で当該ＤＮＡがコードするポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（製造例１参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）などが挙げられる。
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
本発明で用いるポリペプチドを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターにより形質転換され、導入したＤＮＡがコードするポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限されないが、宿主ベクター系の開発されている生物が好ましい。
利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、及びキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などのカビなどが挙げられる。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ　３１５，５９２－５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率からは微生物が好ましく、細菌がより好ましく、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）（通称は大腸菌）が特に好ましい。
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターは、公知の方法により宿主生物に導入できる。
例えば、発現ベクターｐＵＣＮ１８に配列番号２に示すＤＮＡを導入したポリペプチド発現ベクターｐＮＢＳ（製造例１参照）を、宿主微生物である大腸菌に導入する場合、市販のＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）（製造例５参照）が得られる。また、発現ベクターｐＵＣＮ１８に配列番号４に示すＤＮＡを導入したポリペプチド発現ベクターｐＮＢＭ（製造例３参照）についても、上記と同様に操作すれば、当該ベクターを宿主細胞に導入した組換え生物　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ）（製造例５参照）が得られる。
また、本発明で用いるポリペプチド及び後述する還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両ポリペプチドを、同一菌体内で発現させた組換え生物も育種することができる。すなわち、本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。このようにして得られる組換え生物としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）（製造例５参照）などが挙げられる。これは、配列番号２に示すＤＮＡ、及び還元型補酵素再生能を有するグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ、の両ＤＮＡを発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクターｐＮＢＳＧ（製造例２参照）を、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１に導入した組換え生物である。
また、本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても、本発明で用いるポリペプチド及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両ポリペプチドを同一菌体内で生産する組換え生物が育種できる。このようにして得られる組換え生物としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１(ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ)（製造例５参照）などが挙げられる。これは、配列番号２に示すＤＮＡを発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクターｐＮＢＳ（製造例１参照）、還元型補酵素再生能を有するグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡをプラスミドｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）に導入した組換えベクターｐＳＴＶＧ（製造例４参照）、の両組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入した組換え生物である。
ポリペプチドもしくは組換え生物を用いた（Ｓ）－１－（２－チエニル）プロパン－１－オール誘導体の製造
上記ポリペプチドもしくは該ポリペプチドを発現させた組換え生物を用いて、下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
で表される１－置換プロパン－１－オン誘導体を還元して下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
で表される（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体を製造する場合、以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。
前記式（１）および（２）において、Ａは炭素環式または複素環式の環を示す。環は単環であっても多環であっても良く、また、飽和であっても不飽和であっても良い。更に、置換基を有していてもよい。
炭素環式の環としては、３～１０、好ましくは４～６個の炭素原子からなる飽和炭化水素、不飽和炭化水素もしくは芳香族炭化水素が挙げられる。例えば、飽和炭化水素としては、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。不飽和炭化水素としては、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキシニルなどが挙げられる。芳香族炭化水素としては、フェニルなどが挙げられる。
複素環式の環としては、酸素原子、窒素原子もしくは硫黄原子から選択されるヘテロ原子を１～４個を有する、３～１０、好ましくは４～６個の原子からなる複素環が挙げられる。例えば、フラン、チオフェン、ピロール、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、フラザン、ピラン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジンなどが挙げられる。
Ａが置換されている場合の置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ニトロ基、チオール基などが挙げられる。ハロゲン原子は、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などを示す。低級アルキル基は、Ｃ１～Ｃ８のアルキル基、好ましくＣ１～Ｃ４のアルキル基を表し、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。低級アルコキシ基とは、アルキル部分が前記低級アルキル基であるアルコキシ基を表し、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロピルオキシ基、ｉ－プロピルオキシ基、ｎ－ブチルオキシ基、ｔｅｒｔ－ブチルオキシ基等が挙げられる。
Ａとして、好ましくは、置換されていても良い２－チエニル基もしくは置換されていてもよいフェニル基であり、より好ましくは２－チエニル基もしくはフェニル基である。
前記式（１）および（２）において、Ｒ１はハロゲン原子、チオール基、水酸基、ニトロ基、または－ＮＲ２Ｒ３で表される置換または無置換のアミノ基（Ｒ２、Ｒ３は互いに独立して水素原子、低級アルキル基、または低級アルコキシ基を示す）を示す。ハロゲン原子は、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などを示す。
Ｒ２、Ｒ３の低級アルキル基は、Ｃ１～Ｃ８のアルキル基、好ましくＣ１～Ｃ４のアルキル基を表し、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。Ｒ２、Ｒ３の低級アルコキシ基とは、アルキル部分が前記低級アルキル基であるアルコキシ基を表し、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロピルオキシ基、ｉ－プロピルオキシ基、ｎ－ブチルオキシ基、ｔｅｒｔ－ブチルオキシ基等が挙げられる。
－ＮＲ２Ｒ３で表される置換または無置換のアミノ基としては、Ｒ２、Ｒ３のうち少なくとも一方が水素原子であることが好ましく、一方が水素原子でもう一方が低級アルキル基であるのがより好ましい。特に好ましくは、メチルアミノ基（－ＮＨＭｅ）である。
Ｒ１として好ましくはハロゲン原子もしくはメチルアミノ基であり、より好ましくは塩素原子、臭素原子であり、特に好ましくは塩素原子である。
基質である１－置換プロパン－１－オン誘導体、例えば３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンは、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ａｎｄ　Ｓｕｌｆｕｒ，３３，２５（１９８７）に記載の方法に従い、チオフェンと３－クロロプロピオン酸クロライドをフリーデル－クラフト触媒存在下でアシル化反応することにより、収率良く製造することができる。
１－置換プロパン－１－オン誘導体を（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体へ変換する場合は、適当な溶媒、例えば１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）など、中に１－置換プロパン－１－オン誘導体を加え、ＮＡＤＰＨやＮＡＤＰ＋等の補酵素、及び該組換え生物の培養物及び／またはその処理物などを添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。
ここで、処理物とは、例えば、菌体破砕物、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物であり、該ポリペプチドの触媒活性が残存している物を意味する。また、本反応を行う際に、本発明のポリペプチド及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両者を生産する組換え生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）（製造例５参照）やＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）（製造例５参照）などを用いれば、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能となる。還元型補酵素再生能を有するポリペプチドについては後に詳説する。
反応は５～８０℃、好ましくは１０～６０℃、より好ましくは２０～４０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは３～１０、好ましくは４～９、より好ましくは５～８に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合は、反応基質は０．０１～１００％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１～７０％、より好ましくは０．５～５０％の仕込み濃度で添加されうる。また、反応の途中で新たに基質を追加添加しても良い。
また更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。更に、基質及び／または還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液に添加してもよい。更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。
還元反応により生成した（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体の採取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ－ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ｎ－ブタノール、ジクロロメタン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度の（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体を容易に得ることができる。
本発明で得られる（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体とは、（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体が（Ｒ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体よりも多く含まれる１－置換プロパン－１－オールである。その光学純度としては、通常８５％ｅ．ｅ．以上、好ましくは９０％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは９５％ｅ．ｅ．以上、更に好ましくは９７％ｅ．ｅ．以上であり、最も好ましいのは９９％ｅ．ｅ．以上である。
還元型補酵素再生能を有するポリペプチド
本発明で用いるポリペプチドの生産能を有する組換え生物を用いて、１－置換プロパン－１－オン誘導体を還元して（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体を合成する場合、補酵素としてＮＡＤＰＨが必要となる。上記のように、反応系にＮＡＤＰＨを必要な量だけ添加しても実施しうる。しかし、酸化された該補酵素（ＮＡＤＰ＋）を還元型ＮＡＤＰＨに変換する能力（以後還元型補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素をその基質と共に、つまり補酵素再生系を本発明で用いるポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。還元型補酵素再生能を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース－６－リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。
このような反応は、補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによっても行われ得るが、本発明の酵素をコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者により形質転換された組換え生物を触媒とした場合は、還元型補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような組換え生物は、先述の方法により得られる。
ポリペプチドもしくは形質転換体を用いて製造した（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体を原料とする医薬品原薬の製造方法
本発明の方法で得られる（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体を原料として、有用な医薬品原薬を製造することができる。有用な医薬品原薬としては、（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体をビルディングブロックとして用いる医薬品原薬が好ましく、その中でも、デュロキセチンであることが特に好ましい。例えば、（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体として（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールを用いれば、公知の方法（例えば、Ｊ．Ｌａｂｅｌ．Ｃｏｍｐｄ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．３４，２１３－２２３（１９９５）に記載の方法）により、（Ｓ）－Ｎ－メチル－３－（１－ナフタレニルオキシ）－３－（２－チオフェン）－プロパンアミン（デュロキセチン）を容易に製造できる。
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、
Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
（参考例１）Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属微生物を用いた３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンの還元反応
２ＹＴ培地５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この培地に表１に示すＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で２４時間振とう培養した。培養後、各微生物の培養液５ｍｌを遠心分離にかけて菌体を集め、各菌体をグルコース８％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン２．５ｍｇいれた試験管に加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応後、酢酸エチルを加えて良く混合し、有機層の一部を後述の実施例１に記載の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析し、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（製造例１）組換えベクターｐＮＢＳの構築
（バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＹＴ株由来の３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの取得）
バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＹＴ株（ＮＩＴＥ　Ｐ－６１３）より、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性を有するポリペプチド（今後、本ポリペプチドをＲＢＳと呼ぶ）をコードするＤＮＡをＰＣＲにより取得した。
（バークホルデリア・エスピー　ＹＴ株の染色体ＤＮＡの調製）
５００ｍｌ容坂口フラスコに、バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アデカノールＬＧ－１０９（日油社製）０．１ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５０ｍｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＹＴ株の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で１８時間振盪しながら培養を行った。この培養液から、Ｍｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，８，４３２１，１９８０）に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。
（ＰＣＲ反応）
プライマー１：５’－ＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＧ－３’（配列表の配列番号５）、プライマー２：５’－ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＣＧＣＧＡＧ－３’（配列表の配列番号６）を用いて、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＹＴ株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に新たな終止コドン（ＴＡＡ）とＫｐｎＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＲＢＳ遺伝子）が得られた。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ－ゼとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
（プラスミドへの挿入）
得られたＲＢＳ遺伝子をＮｄｅＩ及びＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１－４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＢＳを構築した。
（製造例２）グルコース脱水素酵素遺伝子をさらに含む組換えベクターｐＮＢＳＧの構築
プライマー３：５’－ＡＡＧＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＧＧ－３’（配列表の配列番号７）と、プライマー４：５’－ＡＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧＡＡＴＧＡＴＧＧＧＴＡＣ－３’（配列表の配列番号８）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８６，３８９（１９８９）に記載の方法で当業者が取得及び調製可能）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＫｐｎＩ認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後に更なる終止コドンＴＡＡおよびＸｂａＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＧＤＨ遺伝子）を取得した。
得られたＧＤＨ遺伝子をＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化し、製造例１記載のプラスミドｐＮＢＳのＲＢＳ遺伝子の下流のＫｐｎＩ認識部位とＸｂａＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＢＳＧを構築した。
（製造例３）組換えベクターｐＮＢＭの構築
（バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０２０８６株由来の３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの取得）
バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０２０８６株より、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性を有するポリペプチド（今後、本ポリペプチドをＲＢＭと呼ぶ）をコードするＤＮＡをＰＣＲにより取得した。なお、バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０２０８６株からの染色体ＤＮＡの調製は、製造例１に記載したバークホルデリア・エスピー　ＹＴ株の染色体ＤＮＡの調製と同様に行なった。
（ＰＣＲ反応）
プライマー５：５’－ＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＣＣＣＧＴＡＣＧ－３’（配列表の配列番号９）、プライマー６：５’－ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＡＣＣＧＣＧＣＧＴＣＧＡＡＣＧＣＧＡＧＣＧＴＣ－３’（配列表の配列番号１０）を用いて、バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０２０８６株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に新たな終止コドン（ＴＡＡ）とＫｐｎＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＲＢＭ遺伝子）が得られた。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ－ゼとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
（プラスミドへの挿入）
得られたＲＢＭ遺伝子をＮｄｅＩ及びＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（製造例１参照）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＢＭを構築した。
（製造例４）組換えベクターｐＳＴＶＧの構築
プライマー７：５’－ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＧ－３’（配列表の配列番号１１）と、プライマー８：５’－ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧ－３’（配列表の配列番号１２）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８６，３８９（１９８９）に記載の方法で当業者が取得及び調製可能）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＥｃｏＲＩ認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後にＳａｌおよびＰｓｔＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＧＤＨ遺伝子）を取得した。
得られたＧＤＨ遺伝子をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、プラスミドｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）のＥｃｏＲＩ－ＰｓｔＩ部位に挿入して、組換えベクターｐＳＴＶＧを構築した。
（製造例５）ポリペプチドを発現する組換え生物の作製
組換えベクターｐＮＢＳを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を得た。
また同様に、組換えベクターｐＮＢＳＧを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）を得た。
さらに、組換えベクターｐＮＢＳおよびｐＳＴＶＧの２つの組換えベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を得た。
さらに、組換えベクターｐＮＢＭを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ）を得た。
さらに、組換えベクターｐＮＢＭおよびｐＳＴＶＧの２つの組換えベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）を得た。
（製造例６）ポリペプチドの発現
３種の組換え生物（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ））、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮ１８を含む組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）（比較例）のそれぞれを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。
また、２種の組換え生物（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ））、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮ１８及びｐＳＴＶ２８を含む組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８，ｐＳＴＶ２８）（比較例）のそれぞれを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。
（製造例７）還元活性の測定
上記の培養で得られたそれぞれの培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（日本ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液の３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性およびＧＤＨ活性を測定した。
３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンに対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭ、および粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。
ＧＤＨ活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１Ｕと定義した。
それぞれの組換え生物の３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性およびＧＤＨ活性を以下に示す。　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）およびＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８，ｐＳＴＶ２８）（共に比較例）については、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性、ＧＤＨ活性共に０．１Ｕ／ｍｇ以下であった。
ＲＢＳのみを発現させたＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）の３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性は２５Ｕ／ｍｇであった。ＲＢＳ、ＧＤＨを共発現させたＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）の３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性は１５Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ活性は４４０Ｕ／ｍｇであった。また、ＲＢＳ、ＧＤＨを共発現させたＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）の３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性は３０Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ活性は１２０Ｕ／ｍｇであった。
ＲＢＭのみを発現させたＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ）の３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性は１０Ｕ／ｍｇであった。ＲＢＭ、ＧＤＨを共発現させたＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）の３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性は１０Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ活性は１４０Ｕ／ｍｇであった。
以上のように、製造例５で得られた５種の組換え生物のいずれにおいても、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン還元活性を有し、ＲＢＳもしくはＲＢＭの発現が認められた。また、ＧＤＨ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）では、ＧＤＨの発現がそれぞれ認められた。
（実施例１）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を用いた（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を製造例６と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液２０ｍｌを得た。この無細胞抽出液２０ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”ＩＩ、天野エンザイム社製）７００Ｕ、グルコース４００ｍｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを２００ｍｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．２５に調整しながら、３０℃で５時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、酢酸エチルで抽出した。抽出液を下記の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析し、（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールへの変換率は９８％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ　ＯＤ－Ｈ（４．６μｍ（内径）×２５０ｍｍ；ダイセル化学工業社製）
カラム温度：３０℃
検出波長：２４０ｎｍ
移動相：ｎ－ヘキサン／イソプロパノール＝９７．５／２．５
保持時間：
（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オール　約１９．９分
（Ｒ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オール　約２１．５分
３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン　約１２．２分
（実施例２）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）を用いた（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）を製造例６と同様に培養し、培養液１００ｍｌを得た。この培養液１００ｍｌに、グルコース１０ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを１ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．２５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応開始後１、２、３、４時間目に１ｇの３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを添加した（合計５ｇ）。反応開始後１０時間目に反応液の一部をサンプリングし、実施例１と同様に処理、分析することにより、（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は９７％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
（実施例３）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を用いた（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を製造例６と同様に培養し、培養液１００ｍｌを得た。この培養液１００ｍｌに、グルコース１０ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを１ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．２５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応開始後１、２、３、４時間目に１ｇの３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを添加した（合計５ｇ）。反応開始後１０時間目に反応液の一部をサンプリングし、実施例１と同様に処理、分析することにより、（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は９８％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
（実施例４）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ）を用いた（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ）を製造例６と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液２０ｍｌを得た。この無細胞抽出液２０ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”ＩＩ、天野エンザイム社製）７００Ｕ、グルコース４００ｍｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オン２００ｍｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．２５に調整しながら、３０℃で５時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、実施例１と同様に処理、分析することにより、（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は９９％以上であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
（実施例５）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）を用いた（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）を製造例６と同様に培養し、培養液１００ｍｌを得た。この培養液１００ｍｌに、グルコース１０ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを１ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．２５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応開始後２、４時間目に１ｇの３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを添加した（合計３ｇ）。反応開始後１０時間目に反応液の一部をサンプリングし、実施例１と同様に処理、分析することにより、（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は９７％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
（実施例６）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を用いた（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を製造例６と同様に培養し、培養液２００ｍｌを得た。この培養液２００ｍｌに、グルコース４１ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを２ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．２５に調整しながら３０℃で攪拌した。反応開始９時間目までは１時間おきに３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを２ｇ添加した（合計２０ｇ添加）。２５時間反応後、反応液の３倍量の酢酸エチルで３回抽出した。減圧下で溶媒を留去すると、１９．７ｇのオイル状の（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールが得られた。実施例１記載の方法で分析したところ、得られた（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
（実施例７）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を用いた（Ｓ）－３－クロロ－１－フェニルプロパン－１－オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を製造例６と同様に培養し、培養液２００ｍｌを得た。この培養液２００ｍｌに、グルコース４５ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３－クロロ－１－フェニルプロパン－１－オンを２ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．２５に調整しながら３０℃で攪拌した。反応開始９時間目までは１時間おきに３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンを２ｇ添加した（合計２０ｇ添加）。２５時間反応後、反応液の３倍量の酢酸エチルで３回抽出した。減圧下で溶媒を留去すると、１９．２ｇの（Ｓ）－３－クロロ－１－フェニルプロパン－１－オールが得られた。下記に記載の方法で分析したところ、得られた（Ｓ）－３－クロロ－１－フェニルプロパン－１－オールの光学純度は９７．８％ｅ．ｅ．であった。
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ　ＯＤ－Ｈ（４．６μｍ（内径）×２５０ｍｍ；ダイセル化学工業社製）
カラム温度：３０℃
検出波長：２５４ｎｍ
移動相：ｎ－ヘキサン／イソプロパノール＝９７．５／２．５
保持時間：
（Ｓ）－３－クロロ－１－フェニルプロパン－１－オール　約１８．２分
（Ｒ）－３－クロロ－１－フェニルプロパン－１－オール　約２０．７分
（実施例８）（Ｓ）－Ｎ－メチル－３－（１－ナフタレニルオキシ）－３－（２－チオフェン）－プロパンアミン塩酸塩の製造
（工程１）
４０％メチルアミン／メタノール溶液９３ｇに実施例７に記載の方法で得られた（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オール２１．６ｇを室温で滴下し、３０分間反応した。メタノール及びメチルアミンを減圧下で留去した後、水を加えメチル－ｔ－ブチルエーテルで抽出した。有機層を食塩水で洗浄した後、減圧濃縮した。濃縮物にｎ－ヘプタンを加え、析出した固体をろ別し、（Ｓ）－３－Ｎ－メチルアミノ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールの微黄色結晶１７．４ｇを得た。
（工程２）
ペンタンで洗浄した水素化ナトリウム５ｇをジメチルアセトアミドに懸濁し、（Ｓ）－３－Ｎ－メチルアミノ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オール１７ｇを添加した後、７０℃で加熱しながら攪拌した。溶液が透明になった後、１－フルオロナフタレン２６ｇを添加し、９０℃で２時間攪拌した。反応後、水を添加し、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、減圧濃縮した。濃縮液をカラムクロマトグラフィーで精製し、（Ｓ）－Ｎ－メチル－３－（１－ナフタレニルオキシ）－３－（２－チオフェン）－プロパンアミン１７ｇを得た。次に（Ｓ）－Ｎ－メチル－３－（１－ナフタレニルオキシ）－３－（２－チオフェン）－プロパンアミンを酢酸エチルに溶解した後、０．４４Ｍ塩酸／酢酸エチル溶液を滴下し、結晶化させた。室温で１時間攪拌後、冷却し、ジエチルエーテルを混合して、結晶をろ別し、（Ｓ）－Ｎ－メチル－３－（１－ナフタレニルオキシ）－３－（２－チオフェン）－プロパンアミン塩酸塩１５ｇを得た。
製造した（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールを原料に用いて、容易に医薬品原薬（Ｓ）－Ｎ－メチル－３－（１－ナフタレニルオキシ）－３－（２－チオフェン）－プロパンアミン塩酸塩（塩酸デュロキセチン）を製造できた。

Claims (10)

  1. 下記式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ａは炭素環式または複素環式の環であり、Ｒ１はハロゲン原子、チオール基、水酸基、ニトロ基、または－ＮＲ２Ｒ３で表される置換または無置換のアミノ基（Ｒ２、Ｒ３は互いに独立して水素原子、低級アルキル基、または低級アルコキシ基を示す）を示す）で表される（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体の製造方法であって、下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ａ及びＲ１は前記と同じ）で表される１－置換プロパン－１－オン誘導体に、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、および（ｂ３）：
    （ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
    （ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
    （ｂ１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、および
    （ｂ３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
    からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または、該生物体の処理物を作用させて、前記化合物（１）を還元することを特徴とする製造方法。
  2. Ａが２－チエニル基もしくはフェニル基であり、Ｒ１がハロゲン原子もしくはメチルアミノ基である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）からなる群から選択されるポリペプチドを産生する生物が、下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ｂ１）、（Ｂ２）、（Ｂ３）および（Ｂ４）からなる群から選択されるＤＮＡを導入された組換え生物である請求項１または２に記載の製造方法：
    （Ａ１）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ、
    （Ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （Ａ３）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （Ａ４）、配列表の配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
    （Ｂ１）配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ、
    （Ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （Ｂ３）配列表の配列番号４に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （Ｂ４）配列表の配列番号４に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
  4. 組換え生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（大腸菌）である請求項３に記載の製造方法。
  5. 還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをさらに作用させる請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
  6. 前記ポリペプチドが、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの生産能を付与された組換え生物により生産されたものである請求項５に記載の製造方法。
  7. 還元型補酵素再生能を有するポリペプチドがグルコース脱水素酵素である請求項５または６に記載の製造方法。
  8. 下記式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ａは炭素環式または複素環式の環であり、Ｒ１はハロゲン原子、チオール基、水酸基、ニトロ基、または－ＮＲ２Ｒ３で表される置換または無置換のアミノ基（Ｒ２、Ｒ３は互いに独立して水素原子、低級アルキル基、または低級アルコキシ基を示す）を示す）で表される（Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体の製造方法であって、下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ａ及びＲ１は前記と同じ）で表される１－置換プロパン－１－オン誘導体に、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）、および（ｂ３）：　
    （ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
    （ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
    （ｂ１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、および
    （ｂ３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
    からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または、該生物体の処理物を作用させて、前記化合物（１）を還元する工程を有する、医薬品原薬の製造方法。
  9. （Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体が（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールである、請求項８に記載の製造方法。
  10. （Ｓ）－１－置換プロパン－１－オール誘導体が（Ｓ）－３－クロロ－１－（２－チエニル）プロパン－１－オールであり、医薬品原薬がデュロキセチンである、請求項８に記載の製造方法。
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