JPWO2010123067A1 - (s)−1−置換プロパン−1−オール誘導体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(a2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
(a3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
(b1)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b2)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、および
(b3)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または、該生物体の処理物を作用させて、前記化合物(1)を還元することを特徴とする方法に関する。
(A1)配列表の配列番号2に記載のDNA
(A2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(A3)配列表の配列番号2に記載のDNAと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(A4)配列表の配列番号2に記載の塩基配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(B1)配列表の配列番号4に記載のDNA
(B2)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(B3)配列表の配列番号4に記載のDNAと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(B4)配列表の配列番号4に記載の塩基配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(a1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(a2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
(a3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
(b1)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b2)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、および
(b3)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または、該生物体の処理物を作用させて、前記化合物(1)を還元する工程を有する、医薬品原薬の製造方法に関する。
本発明で用いるポリペプチドのアミノ酸配列としては、配列表の配列番号1または3に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる((a1)および(b1)のポリペプチド)。
(第1群:中性非極性アミノ酸)Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Met,Cys,Pro,Phe
(第2群:中性極性アミノ酸)Ser,Thr,Gln,Asn,Trp,Tyr
(第3群:酸性アミノ酸)Glu,Asp
(第4群:塩基性アミノ酸)His,Lys,Arg
本発明で用いるポリペプチドは、3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンを還元して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールを生成する能力を有する微生物から取得できる。該ポリペプチドを有する微生物は、例えば、以下の方法で見出すことができる。
3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンに対する還元活性は、100mMリン酸緩衝液(pH6.5)に、3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オン10mM、補酵素NADPH0.25mM、および粗酵素液を添加して30℃で1分間反応を行い、波長340nmにおける吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、1分間に1μmolのNADPHをNADPに酸化する酵素活性を1Uと定義した。
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門(NBRC)(〒292−0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)。
独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室(JCM)(〒351−0198 埼玉県和光市広沢2−1)
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH(DSMZ)(Marschroder Weg 1b,D−38124 Brunswick,Germany)
本発明で用いるポリペプチドをコードするDNAは、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。天然よりクローニングされたDNA、cDNAの他、合成によって得られるDNAも含まれる。
GCG Wisconsin Package(Program Manual for The Wisconsin Package,Version8,1994年9月,Genetics Computer Group,575 Science Drive Medison,Wisconsin,USA 53711;
Rice,P.(1996)Program Manual for EGCG Package,Peter Rice,The Sanger Centre,Hinxton Hall,Cambridge,CB10 1RQ,England)、及び、
the ExPASy World Wide Web分子生物学用サーバー(Geneva University Hospital and University of Geneva,Geneva,Switzerland)。
本発明で用いるポリペプチドを生産する組換え生物としては、上記で述べた(A1)、(A2)、(A3)、(A4)、(B1)、(B2)、(B3)または(B4)のいずれかに記載のDNAを導入された組換え生物を挙げることができる。
上記ポリペプチドもしくは該ポリペプチドを発現させた組換え生物を用いて、下記式(1):
本発明で用いるポリペプチドの生産能を有する組換え生物を用いて、1−置換プロパン−1−オン誘導体を還元して(S)−1−置換プロパン−1−オール誘導体を合成する場合、補酵素としてNADPHが必要となる。上記のように、反応系にNADPHを必要な量だけ添加しても実施しうる。しかし、酸化された該補酵素(NADP+)を還元型NADPHに変換する能力(以後還元型補酵素再生能と呼ぶ)を有する酵素をその基質と共に、つまり補酵素再生系を本発明で用いるポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。還元型補酵素再生能を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース−6−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。
本発明の方法で得られる(S)−1−置換プロパン−1−オール誘導体を原料として、有用な医薬品原薬を製造することができる。有用な医薬品原薬としては、(S)−1−置換プロパン−1−オール誘導体をビルディングブロックとして用いる医薬品原薬が好ましく、その中でも、デュロキセチンであることが特に好ましい。例えば、(S)−1−置換プロパン−1−オール誘導体として(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールを用いれば、公知の方法(例えば、J.Label.Compd.Radiopharm.34,213−223(1995)に記載の方法)により、(S)−N−メチル−3−(1−ナフタレニルオキシ)−3−(2−チオフェン)−プロパンアミン(デュロキセチン)を容易に製造できる。
Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、
Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley−Interscience)。
2YT培地5mlを大型試験管に分注し、120℃で20分間蒸気殺菌を行った。この培地に表1に示すBurkholderia属微生物を無菌的に一白金耳接種して、30℃で24時間振とう培養した。培養後、各微生物の培養液5mlを遠心分離にかけて菌体を集め、各菌体をグルコース8%を含んだ100mMリン酸緩衝液0.5ml(pH6.5)に懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オン2.5mgいれた試験管に加えて、30℃で24時間反応させた。反応後、酢酸エチルを加えて良く混合し、有機層の一部を後述の実施例1に記載の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析し、3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果を表1に示す。
(バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)YT株由来の3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オン還元活性を有するポリペプチドをコードするDNAの取得)
バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)YT株(NITE P−613)より、3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オン還元活性を有するポリペプチド(今後、本ポリペプチドをRBSと呼ぶ)をコードするDNAをPCRにより取得した。
500ml容坂口フラスコに、バクトトリプトン16g、酵母エキス10g、塩化ナトリウム5g、アデカノールLG−109(日油社製)0.1g(いずれも1L当たり)の組成からなる液体培地(pH7)50mlを調製し、120℃で20分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたバークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)YT株の培養液を5ml接種し、30℃で18時間振盪しながら培養を行った。この培養液から、Murray等の方法(Nucl.Acids Res.,8,4321,1980)に記載の方法に従って染色体DNAを抽出した。
プライマー1:5’−ATATATACATATGACCCACCCGCAACCCCG−3’(配列表の配列番号5)、プライマー2:5’−TATAGGTACCTTATCAAAGCTTGTCGAACGCGAG−3’(配列表の配列番号6)を用いて、バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)YT株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。その結果、配列表の配列番号2に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にNdeI認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に新たな終止コドン(TAA)とKpnI認識部位が付加された二本鎖DNA(RBS遺伝子)が得られた。PCRは、DNAポリメラ−ゼとして、PrimeSTAR HS DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
得られたRBS遺伝子をNdeI及びKpnIで消化し、プラスミドpUCN18(PCR法によりpUC18(タカラバイオ社製、GenBank Accession No.L09136)の185番目のTをAに改変してNdeIサイトを破壊し、更に471−472番目のGCをTGに改変することにより新たにNdeIサイトを導入したプラスミド)のlacプロモーターの下流のNdeI認識部位とKpnI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNBSを構築した。
プライマー3:5’−AAGGTACCCACACAGGAAACAACAATGTATAAAGATTTAGAAGGG−3’(配列表の配列番号7)と、プライマー4:5’−ATATATCTAGATTATTATCCGCGTCCTGCTTGGAATGATGGGTAC−3’(配列表の配列番号8)を用い、プラスミドpGDK1(Eur.J.Biochem.,186,389(1989)に記載の方法で当業者が取得及び調製可能)を鋳型としてPCRを行い、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)IAM1030株由来のグルコース脱水素酵素(以後、GDHと呼ぶ)遺伝子の開始コドンから5塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にKpnI認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後に更なる終止コドンTAAおよびXbaI認識部位が付加された二本鎖DNA(GDH遺伝子)を取得した。
(バークホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)NBRC102086株由来の3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オン還元活性を有するポリペプチドをコードするDNAの取得)
バークホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)NBRC102086株より、3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オン還元活性を有するポリペプチド(今後、本ポリペプチドをRBMと呼ぶ)をコードするDNAをPCRにより取得した。なお、バークホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)NBRC102086株からの染色体DNAの調製は、製造例1に記載したバークホルデリア・エスピー YT株の染色体DNAの調製と同様に行なった。
プライマー5:5’−ATATATACATATGCGCGCTGCACGCCCCCGTACG−3’(配列表の配列番号9)、プライマー6:5’−TATAGGTACCTTATCACCGCGCGTCGAACGCGAGCGTC−3’(配列表の配列番号10)を用いて、バークホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)NBRC102086株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。その結果、配列表の配列番号4に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にNdeI認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に新たな終止コドン(TAA)とKpnI認識部位が付加された二本鎖DNA(RBM遺伝子)が得られた。PCRは、DNAポリメラ−ゼとして、PrimeSTAR HS DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
得られたRBM遺伝子をNdeI及びKpnIで消化し、プラスミドpUCN18(製造例1参照)のlacプロモーターの下流のNdeI認識部位とKpnI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNBMを構築した。
プライマー7:5’−GCCGAATTCTAAGGAGGTTAACAATGTATAAAGATTTAGAAGG−3’(配列表の配列番号11)と、プライマー8:5’−CTGCAGGTCGACTTATCCGCGTCCTGCTTGG−3’(配列表の配列番号12)を用い、プラスミドpGDK1(Eur.J.Biochem.,186,389(1989)に記載の方法で当業者が取得及び調製可能)を鋳型としてPCRを行い、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)IAM1030株由来のグルコース脱水素酵素(以後、GDHと呼ぶ)遺伝子の開始コドンから5塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にEcoRI認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後にSalおよびPstI認識部位が付加された二本鎖DNA(GDH遺伝子)を取得した。
組換えベクターpNBSを用いて、E.coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、組換え生物E.coli HB101(pNBS)を得た。
3種の組換え生物(E.coli HB101(pNBS)、E.coli HB101(pNBSG)、E.coli HB101(pNBM))、および、ベクタープラスミドpUCN18を含む組換え生物であるE.coli HB101(pUCN18)(比較例)のそれぞれを、200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl0.5%、pH7.0)5mlに接種し、37℃で24時間振盪培養した。
上記の培養で得られたそれぞれの培養液について、遠心分離により菌体を集め、5mlの100mMリン酸緩衝液(pH6.5)に懸濁した。これを、UH−50型超音波ホモゲナイザー(日本SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液の3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オン還元活性およびGDH活性を測定した。
E.coli HB101(pNBS)を製造例6と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液20mlを得た。この無細胞抽出液20mlに、グルコース脱水素酵素(商品名:GLUCDH”Amano”II、天野エンザイム社製)700U、グルコース400mg、NADP+3mg、3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンを200mg添加し、5Nの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりpH6.25に調整しながら、30℃で5時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、酢酸エチルで抽出した。抽出液を下記の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析し、(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールへの変換率は98%であり、その光学純度は99%e.e.以上であった。
カラム:Chiralcel OD−H(4.6μm(内径)×250mm;ダイセル化学工業社製)
カラム温度:30℃
検出波長:240nm
移動相:n−ヘキサン/イソプロパノール=97.5/2.5
保持時間:
(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オール 約19.9分
(R)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オール 約21.5分
3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オン 約12.2分
E.coli HB101(pNBSG)を製造例6と同様に培養し、培養液100mlを得た。この培養液100mlに、グルコース10g、NADP+3mg、3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンを1g添加し、5Nの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりpH6.25に調整しながら、30℃で攪拌した。反応開始後1、2、3、4時間目に1gの3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンを添加した(合計5g)。反応開始後10時間目に反応液の一部をサンプリングし、実施例1と同様に処理、分析することにより、(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は97%であり、その光学純度は99%e.e.以上であった。
E.coli HB101(pNBS,pSTVG)を製造例6と同様に培養し、培養液100mlを得た。この培養液100mlに、グルコース10g、NADP+3mg、3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンを1g添加し、5Nの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりpH6.25に調整しながら、30℃で攪拌した。反応開始後1、2、3、4時間目に1gの3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンを添加した(合計5g)。反応開始後10時間目に反応液の一部をサンプリングし、実施例1と同様に処理、分析することにより、(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は98%であり、その光学純度は99%e.e.以上であった。
E.coli HB101(pNBM)を製造例6と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液20mlを得た。この無細胞抽出液20mlに、グルコース脱水素酵素(商品名:GLUCDH”Amano”II、天野エンザイム社製)700U、グルコース400mg、NADP+3mg、3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オン200mgを添加し、5Nの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりpH6.25に調整しながら、30℃で5時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、実施例1と同様に処理、分析することにより、(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は99%以上であり、その光学純度は99%e.e.以上であった。
E.coli HB101(pNBM,pSTVG)を製造例6と同様に培養し、培養液100mlを得た。この培養液100mlに、グルコース10g、NADP+3mg、3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンを1g添加し、5Nの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりpH6.25に調整しながら、30℃で攪拌した。反応開始後2、4時間目に1gの3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンを添加した(合計3g)。反応開始後10時間目に反応液の一部をサンプリングし、実施例1と同様に処理、分析することにより、(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は97%であり、その光学純度は99%e.e.以上であった。
E.coli HB101(pNBS,pSTVG)を製造例6と同様に培養し、培養液200mlを得た。この培養液200mlに、グルコース41g、NADP+3mg、3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンを2g添加し、5Nの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりpH6.25に調整しながら30℃で攪拌した。反応開始9時間目までは1時間おきに3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンを2g添加した(合計20g添加)。25時間反応後、反応液の3倍量の酢酸エチルで3回抽出した。減圧下で溶媒を留去すると、19.7gのオイル状の(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールが得られた。実施例1記載の方法で分析したところ、得られた(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールの光学純度は99%e.e.以上であった。
E.coli HB101(pNBS,pSTVG)を製造例6と同様に培養し、培養液200mlを得た。この培養液200mlに、グルコース45g、NADP+3mg、3−クロロ−1−フェニルプロパン−1−オンを2g添加し、5Nの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりpH6.25に調整しながら30℃で攪拌した。反応開始9時間目までは1時間おきに3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンを2g添加した(合計20g添加)。25時間反応後、反応液の3倍量の酢酸エチルで3回抽出した。減圧下で溶媒を留去すると、19.2gの(S)−3−クロロ−1−フェニルプロパン−1−オールが得られた。下記に記載の方法で分析したところ、得られた(S)−3−クロロ−1−フェニルプロパン−1−オールの光学純度は97.8%e.e.であった。
カラム:Chiralcel OD−H(4.6μm(内径)×250mm;ダイセル化学工業社製)
カラム温度:30℃
検出波長:254nm
移動相:n−ヘキサン/イソプロパノール=97.5/2.5
保持時間:
(S)−3−クロロ−1−フェニルプロパン−1−オール 約18.2分
(R)−3−クロロ−1−フェニルプロパン−1−オール 約20.7分
(工程1)
40%メチルアミン/メタノール溶液93gに実施例7に記載の方法で得られた(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オール21.6gを室温で滴下し、30分間反応した。メタノール及びメチルアミンを減圧下で留去した後、水を加えメチル−t−ブチルエーテルで抽出した。有機層を食塩水で洗浄した後、減圧濃縮した。濃縮物にn−ヘプタンを加え、析出した固体をろ別し、(S)−3−N−メチルアミノ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールの微黄色結晶17.4gを得た。
ペンタンで洗浄した水素化ナトリウム5gをジメチルアセトアミドに懸濁し、(S)−3−N−メチルアミノ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オール17gを添加した後、70℃で加熱しながら攪拌した。溶液が透明になった後、1−フルオロナフタレン26gを添加し、90℃で2時間攪拌した。反応後、水を添加し、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、減圧濃縮した。濃縮液をカラムクロマトグラフィーで精製し、(S)−N−メチル−3−(1−ナフタレニルオキシ)−3−(2−チオフェン)−プロパンアミン17gを得た。次に(S)−N−メチル−3−(1−ナフタレニルオキシ)−3−(2−チオフェン)−プロパンアミンを酢酸エチルに溶解した後、0.44M塩酸/酢酸エチル溶液を滴下し、結晶化させた。室温で1時間攪拌後、冷却し、ジエチルエーテルを混合して、結晶をろ別し、(S)−N−メチル−3−(1−ナフタレニルオキシ)−3−(2−チオフェン)−プロパンアミン塩酸塩15gを得た。
Claims (10)
- 下記式(2):
(a1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(a2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
(a3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
(b1)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b2)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、および
(b3)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または、該生物体の処理物を作用させて、前記化合物(1)を還元することを特徴とする製造方法。 - Aが2−チエニル基もしくはフェニル基であり、R1がハロゲン原子もしくはメチルアミノ基である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記(a1)、(a2)、(a3)、(b1)、(b2)および(b3)からなる群から選択されるポリペプチドを産生する生物が、下記(A1)、(A2)、(A3)、(A4)、(B1)、(B2)、(B3)および(B4)からなる群から選択されるDNAを導入された組換え生物である請求項1または2に記載の製造方法:
(A1)配列表の配列番号2に記載のDNA、
(A2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA、
(A3)配列表の配列番号2に記載のDNAと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(A4)、配列表の配列番号2に記載の塩基配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(B1)配列表の配列番号4に記載のDNA、
(B2)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA、
(B3)配列表の配列番号4に記載のDNAと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(B4)配列表の配列番号4に記載の塩基配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 組換え生物がEscherichia coli(大腸菌)である請求項3に記載の製造方法。
- 還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをさらに作用させる請求項1〜4のいずれかに記載の製造方法。
- 前記ポリペプチドが、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの生産能を付与された組換え生物により生産されたものである請求項5に記載の製造方法。
- 還元型補酵素再生能を有するポリペプチドがグルコース脱水素酵素である請求項5または6に記載の製造方法。
- 下記式(2):
(a1)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(a2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
(a3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
(b1)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b2)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、および
(b3)配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有し、かつ3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オンとNADPHに作用して(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールとNADPを生成する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または、該生物体の処理物を作用させて、前記化合物(1)を還元する工程を有する、医薬品原薬の製造方法。 - (S)−1−置換プロパン−1−オール誘導体が(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールである、請求項8に記載の製造方法。
- (S)−1−置換プロパン−1−オール誘導体が(S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)プロパン−1−オールであり、医薬品原薬がデュロキセチンである、請求項8に記載の製造方法。
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