CN115612628A

CN115612628A - 毕赤酵母、其制备方法及其在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用

Info

Publication number: CN115612628A
Application number: CN202210029348.8A
Authority: CN
Inventors: 朱佑民; 张慧; 金玉叶; 张文荟
Original assignee: Shanghai Guolong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Guolong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-12
Filing date: 2022-01-12
Publication date: 2023-01-17

Abstract

本发明公开了一种毕赤酵母，其细胞表面表达如SEQ ID No.7所示的蛋白。还公开了其在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用，及其制备方法。本发明将葡萄糖氧化酶‑果糖基转移酶融合酶展示在毕赤酵母表面，采用该毕赤酵母全细胞催化生产低聚果糖，在生产的同时消除葡萄糖对反应的抑制作用，可以有效提高低聚果糖的转化率。且本发明还发现，表面展示葡萄糖氧化酶‑果糖基转移酶融合酶的毕赤酵母比果糖基转移酶‑葡萄糖氧化酶融合酶的毕赤酵母在催化生产低聚果糖时酶活更高，低聚果糖的转化率更高。因此，本发明的毕赤酵母可用于生产低聚果糖并提高低聚果糖的转化率。

Description

毕赤酵母、其制备方法及其在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用

技术领域

本发明涉及一种毕赤酵母、其制备方法及其在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用，属于合成生物学领域。

背景技术

现有技术通过单一的表达果糖基转移酶，将酶分离纯化固定后催化蔗糖生产低聚果糖，或者使用2次发酵技术分别表达果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶，然后将果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶分别分离纯化固定后共同催化蔗糖生产低聚果糖。单一的表达果糖基转移酶再将酶分离纯化固定后催化蔗糖生产低聚果糖时，在反应过程中会产生葡萄糖副产物，对生产低聚果糖的反应有抑制作用，使得低聚果糖的转化率很低。在使用2次发酵技术分别表达果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶，然后将果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶分别分离纯化固定后共同催化蔗糖生产低聚果糖时，发酵次数多，分离纯化步骤繁琐，使得发酵的效率低成本高。

发明内容

本发明的目的是提供一种表面表达葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶融合酶的毕赤酵母。

本发明采取的技术方案为：

一种毕赤酵母，其特征在于其细胞表面表达如SEQ ID No.7所示的蛋白。

本发明还公开了上述的毕赤酵母在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用。

优选的，其步骤包括：收集培养的毕赤酵母全细胞，将毕赤酵母全细胞加入蔗糖水溶液中进行反应，制得低聚果糖。

本发明还公开了上述的毕赤酵母的制备方法，其特征在于其步骤包括：

(1)化学合成如SEQ ID No.6所示的融合基因anc-L-gody-L-ftfx，其中融合基因序列包含毕赤酵母锚定蛋白基因序列、葡萄糖氧化酶基因序列和果糖基转移酶基因序列，毕赤酵母锚定蛋白基因序列、葡萄糖氧化酶基因序列和果糖基转移酶基因序列三者以融合基因形式连接，毕赤酵母锚定蛋白基因序列与葡萄糖氧化酶基因序列之间有连接肽序列，葡萄糖氧化酶基因序列与果糖基转移酶基因序列之间有连接肽序列，融合基因序列两端包含EcoRI和Not1的酶切位点序列，以及载体pPIC9K的同源臂序列；

(2)将步骤(1)合成的融合基因片段和载体pPIC9K分别经EcoRI和Not1双酶切；

(3)将酶切后的融合基因片段与酶切后的pPIC9K载体连接，使融合基因构建到载体pPIC9K中；

(4)将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选出阳性克隆；

(5)培养大肠杆菌感受态细胞阳性克隆，从中抽提出质粒pPIC9K-anc-L-gody-L-ftfx；

(6)将质粒pPIC9K-anc-L-gody-L-ftfx线性化；

(7)将线性化的质粒电转化入毕赤酵母感受态细胞，筛选出阳性克隆，得到表面表达葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶融合酶的毕赤酵母。

优选的，步骤(3)中采用T4 DNA连接酶连接酶切后的融合基因片段与酶切后的pPIC9K载体。

优选的，步骤(6)中将质粒用SacI酶切线性化。

本发明具有以下有益效果：

本发明将葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶融合酶展示在毕赤酵母表面，采用该毕赤酵母全细胞催化生产低聚果糖，在生产的同时消除葡萄糖对反应的抑制作用，可以有效提高低聚果糖的转化率。且本发明还发现，表面展示葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶融合酶的毕赤酵母比果糖基转移酶-葡萄糖氧化酶融合酶的毕赤酵母在催化生产低聚果糖时酶活更高，低聚果糖的转化率更高。因此，本发明的毕赤酵母可用于生产低聚果糖并提高低聚果糖的转化率。

附图说明

图1为本发明与现有技术相比的流程对照图。

图2为本发明与现有技术相比的低聚果糖转化率对照图。图中标记：A：对比例1中使用表面展示果糖基转移酶-葡萄糖氧化酶的毕赤酵母全细胞催化蔗糖产低聚果糖，转化率约为50％；B：使用实施例1的表面展示葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶毕赤酵母全细胞催化蔗糖产低聚果糖，转化率达到60％以上；C：对比例2中单独使用果糖基转移酶分离纯化固定后催化蔗糖产低聚果糖，低聚果糖转化率约40％；D：葡萄糖对照；E：低聚果糖标准样对照；F：蔗糖对照。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。附图1可以展示本发明与现有技术相比的流程对照。

对比例1将融合果糖基转移酶-连接肽-葡萄糖氧化酶展示在毕赤酵母细胞表面的方法及其在全细胞直接催化生产低聚果糖的应用，包括如下步骤：

(1)优化毕赤酵母锚定蛋白基因、葡萄糖氧化酶基因、果糖基转移酶基因和连接肽的序列，如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；

(2)化学合成如SEQ ID No.5所示的锚定蛋白-连接肽-果糖基转移酶-连接肽-葡萄糖氧化酶融合基因anc-L-ftfx-L-gody；融合基因序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列；

(3)载体pPIC9K均经EcoRI和Not1双酶切，酶切体系如下：

(4)将带有同源臂的融合基因片段anc-L-ftfx-L-gody和酶切后的pPIC9K载体重组，重组体系如下：

(5)将重组产物转化入大肠杆菌Top10感受态细胞；

(6)涂布含氨苄青霉素的平板；

(7)PCR检测阳性克隆。菌检上游引物PF1:CAACCACCATCTCTTCCTTTGC，下游引物PR1:GAGCCACGGAGATGTTCACA；

(8)扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒p-anc-L-ftfx-L-gody；

(9)质粒均用SacI酶切线性化，酶切体系如下：

(10)跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认质粒完全线性化；

(11)将线性化的质粒电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞中，220rpm条件下进行摇床培养1-2h，5000rpm离心5min收集菌体；

(12)将菌体涂布在His缺陷平板上培养2-3天，挑选单菌落；

(13)通过3-5mg/mL G418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌p-anc-L-ftfx-L-gody；

(14)将毕赤酵母工程菌p-anc-L-ftfx-L-gody转接入含有10-15mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28℃，220rpm条件下进行摇床培养至OD600＝4-5；

(15)5000rpm离心5min收集菌体；

(16)菌体重悬于BMM培养基，220rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养4-5天，离心收集菌体；

(17)以蔗糖为底物，使用全细胞催化蔗糖生产低聚果糖，反应体系如下：1ml底物(50％蔗糖)+10mg全细胞

反应时间：3h

(18)跑PLC检测酶切结果。结果如图2所示。

对比例2单独表达果糖基转移酶的方法，包括如下步骤：

(1)优化果糖基转移酶基因序列，如SEQ ID No.3；

(2)化学合成如SEQ ID No.3所示的果糖基转移酶基因ftfx；基因序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列；

(3)基因片段和载体pPIC9K均经EcoRI和Not1双酶切，酶切体系如下：

(4)将基因片段与酶切后的pPIC9K载体连接，连接体系如下：

(5)将连接产物转化入大肠杆菌Top10感受态细胞；

(6)涂布含氨苄青霉素的平板；

(7)PCR检测阳性克隆。菌检上游引物PF1:ACTGTCGCAGGAAATCAGCA，下游引物PR1:GCACCTGGGGCTACTGAAAT；

(8)扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒p-ftfx；

(9)质粒均用SacI酶切线性化，酶切体系如下：

(10)跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认质粒完全线性化；

(11)将线性化的质粒电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞中，220rpm条件下进行摇床培养1-2h，6000rpm离心5min收集菌体；

(12)将菌体涂布在His缺陷平板上培养2-3天，挑选单菌落；

(13)通过3-5mg/mL G418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌pftfx；

(14)将毕赤酵母工程菌p-ftfx转接入含有10-15mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28℃，220rpm条件下进行摇床培养至OD600＝4-5；

(15)6000rpm离心5min收集菌体；

(16)菌体重悬于BMM培养基，220rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养4-5天；

(17)离心去除菌体，得粗酶液；

(18)酶纯化、固定；

(19)以蔗糖为底物，使用果糖基转移酶催化蔗糖生产低聚果糖，反应体系如下：1ml底物(50％蔗糖)+10u酶

反应时间：3h

(20)跑PLC检测酶切结果。结果如图2所示。

实施例1将融合葡萄糖氧化酶-连接肽-果糖基转移酶展示在毕赤酵母细胞表面的方法及其在全细胞直接催化提高低聚果糖转化率中的应用，包括如下步骤：

(2)化学合成如SEQ ID No.6所示的锚定蛋白-连接肽-葡萄糖氧化酶-连接肽-果糖基转移酶融合基因anc-L-gody-L-ftfx；融合基因序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列；

(3)融合基因片段和载体pPIC9K均经EcoRI和Not1双酶切，酶切体系如下：

(4)将酶切后的融合基因片段与酶切后的pPIC9K载体连接，连接体系如下：

(5)将连接产物转化入大肠杆菌Top10感受态细胞；

(6)涂布含氨苄青霉素的平板；

(7)PCR检测阳性克隆。菌检上游引物PF1:TCTGCCTGGACTGAGTACCA，下游引物PR1:TGGCATGTCCCTGCTGATTT；

(8)扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒p-anc-L-gody-L-ftfx；

(9)质粒均用SacI酶切线性化，酶切体系如下：

(10)跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认质粒完全线性化；

(11)将线性化的质粒电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞中，220rpm条件下进行摇床培养1-2h，4000rpm离心10min收集菌体；

(12)将菌体涂布在His缺陷平板上培养2-3天，挑选单菌落；

(13)通过3-5mg/mL G418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌p-anc-L-gody-L-ftfx；

(14)将毕赤酵母工程菌p-anc-L-gody-L-ftfx转接入含有10-15mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28℃，220rpm条件下进行摇床培养至OD600＝4-5；

(15)4000rpm离心10min收集菌体；

反应时间：5h

(18)跑PLC检测酶切结果。结果如图2所示。

以上实验结果表明，本方法将融合酶葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶展示在毕赤酵母表面，可以全细胞催化生产低聚果糖的同时消除葡萄糖对反应的抑制作用，相比将融合酶果糖基转移酶-葡萄糖氧化酶展示在毕赤酵母表面进行全细胞催化生产低聚果糖提高了低聚果糖的转化率。毕赤酵母表面展示融合酶葡萄糖氧化酶-果糖基转移酶比融合酶果糖基转移酶-葡萄糖氧化酶的酶活更高。因此，本发明可用于生产低聚果糖并提高低聚果糖的转化率。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<120> 毕赤酵母、其制备方法及其在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 693

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 1

atgagttacc ttaaaatttc tgcctttctg tctgttctgt cagtcgcatt ggctgaccaa 60

agaatttccg ttactgttgt tggtgatggt atttacactg gattgcgatc tggtggttct 120

cattttgaag ctggtcctaa cgccgcaggt accccacttg acttgatcct ttatgagcct 180

tctggtttcc ttgttgatgc tgccgaccat tctaagtacg tcggttggga cgtcgctgct 240

ggtactttga cttccctgcc acctgatcag ggaggaaaag attggggaat tgttgctgga 300

aacttacgat tcaatgttgg tggtacaact ttctacgcat gcgaaactcg aactggcgtt 360

tgggaggtta aatcctacga agcttccggt tgtaacgccg ttgtcttgtc tgtggcctct 420

caccctgtgc cctctcagtc cagtacttcc tcaagtcatg cacccacatc ttctgttcca 480

agtacatcct ctcatgtttc tccaaccaca acacagccac ctcatactac ttcatctcat 540

accattcaca cctcaactac cttgactact tcaggtagaa acgactcaaa ttcaaaccat 600

actattcctc ctgttccaac tggcgctgcc atgggtgtgt cctctaacta cggtttgctt 660

gtggctgctg gtatagccgc cgctgccttg ctg 693

<210> 2

<211> 1824

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 2

atgcaagaca ccctggtaag tagtctggta gtgctgcttg ctgctccact gcactacatt 60

agatacaatg gtatcgaagc ttccttactt actgataacg acaaggacgt ctctggaaga 120

gttgattacg ctattcaagc tggcggtggc ttgaccattt taacgactgc tgatagatta 180

accgaaaatg tgaacatctc cgtggctcta gttatagaga gtcctagtga gagtgataga 240

ggacctatta acgaatcaga tttgaatgca tttgctgata ttttcggatc ctctgttgat 300

cattgggatt atgagactgt tcttgcaaca aaccataatc agcgtgcctt aattcgttcc 360

ggcatcaacg gtggtggttc tacattgatc aacggtggtc gtacctggac cgtcccaaag 420

gcccaagatg ttaacagttg ggagaccgtt ttcggtaatg aggcatggtc taacgataat 480

gtcgccgatt actcattggc tcaagccgaa atagctcgtg ctccttttaa tgctaaacag 540

ttggctggac attactttaa cgaaccatct tgtcacggaa ccaatggagc tgttcatact 600

gctccaaggg acacagttga tatatattcc cctgttaaag ctttgatgtc tgcttcagag 660

gatcgaggag tcccaaccaa gaaagccttt ggtaattgtg acccccacgg tgactcaatg 720

tttcctccaa ataatcttca cgaggatgtc agatcagatg ctgctagagg aaactggcta 780

ttgccatacc aaaggcctaa tctgcaggtt tggacgggta tgcaatacgt gggtaagcta 840

cttgctcaga actacggtac aactcctcgt gccgtcggag tagagttcac taaaggcaag 900

ggtaatactc ataatgtggt tgccgagcac gttcaccttt tggccgctgg ccatgctgtt 960

tctcctacta ttaggttgga gtctggcatt gttatgaaat ctattgagcc attgggtatt 1020

gctgatacag tggttgatat tcccgtcggt cttaatctgc aaattcaaac tactatcgct 1080

accagatcaa gagttacatc tgctggtgca ggatcaggtc aaggtgcttg gttcgctact 1140

tttaatgaaa cgttcataga ttattctgag gcccaccctg aattgttgaa cacaaagctt 1200

gaacaggctg ctgaagctgt cgctcgagtt ggaggttttc ataacactgc cgcattgatt 1260

cagtactacg aaaattacag agataacatt gtgaaccacg ttaatgttgc ctactcagag 1320

ttattggata ctgcaggagt tgcatccatg tttgccgttt gggatctgcc atttacccgt 1380

ggtaatgtcc atattcttga ctgggatcct cctttacatc attttgcata cgaccctgtt 1440

tactttcttg aaccactgga cttgttgggt cagcatgctg ccactcaatt agctagaatc 1500

tcaaataatt ccggtgctat tcagacttac ttcgcaggag agacaattcc aggagatttg 1560

gcatacttcg tagcagattt gtctgcctgg actgagtacc attaccattt tcgtccaaat 1620

atctatcacg taaaaacatg ttctatgatg ccaaaggagt tcatgggaat cgtagttaat 1680

gcagcaagag tgtacggtga tacgcagttg agagtgattg atggttccat acctccacaa 1740

gatatgtcct ctcatgttat gacggtattt atcgctgctt tacaaaaaat ttccgacgct 1800

attttagaag cttattcaat gcaa 1824

<210> 3

<211> 1575

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 3

atggtgatta agactccatt tattcctgca ctggcagccg ctgctcaggc atcatactcc 60

ggtgatttag aaccactgca aactcattcc cctccaagta attttatggg tgatccagga 120

aacggtctgt tcaacgacag taaacgtgga gtttatcata gtctttatca atataatttc 180

actgccactg tcgcaggaaa tcagcaggga catgccacgt caccagactt ggatcattgg 240

actaaccaag gaatcgcatt ggccggtgat aaagacgagg aatacatttt ctcctggggt 300

tccgctgttc catctaacaa cacctccggt ttttttccag atgatcagga cgatggtatt 360

gtaatctaca ccgttgatac acccaccctg gaaaccgagc aagatatcgc ttactcaagg 420

gacggtggta cattcactaa atacgaaaac aatcccgtta tcgactctat tggttctaag 480

cagttccgta tcccccaagt agtctggcat atggagactc agcaatgggt aatgcatatt 540

gcttacgttg cccaagattt ggttattttc tacaccttgc ctaaccttaa agactggacg 600

gcctctaatt tattttcaca ggaaggactt cccggtgacc aatttgaatg cccaaatttg 660

aagttttcct ttgacagggc agtgtccgaa gaaaccaagt caaagtttag tctgttcatt 720

tcagtagccc caggtgctcc tctacaggga tctggtactt tctacgtggt cggtgacgac 780

aacactactc attttacctc tgaggtggca caagaaactt tggattttga caaggacaat 840

cgttatgcag ctcagctata ctctggtatt gaaaatgaac ctccagtgtc tattggtttc 900

tgggctagta actgggacta cactgagaga gtgataccta caggtcctct ggaaggctgg 960

cgagcccaga cattgcctag agcccacaca ttgactttgg tcaacagtgt atggactgta 1020

actcattctc cttttgaggg attggatgct ttgaaattca gacaacttgt ctctaagtct 1080

ggacacagtg gtgatgttaa gaattttagt ggagttgttt tttcaaacgc tgtttatttt 1140

gatgtaaccc taaaaggcgg agatgtggtt gccaaaccta ctggaagagt ttttaatatc 1200

actacctcaa gtgtttctgg tgaatttttg gatggtctag tatctttgct ggattcatca 1260

ttctggattt caagagcagg tgcccatttg tttacaattg aagataacgg taattatagt 1320

tctagtacaa ccaccatctc ttcctttgct aatggtactt ttagtttcgt ctctggcaga 1380

gatcgatcag tgtttgaagt atttctagga caagatggaa tccaatctgg ttttgatatg 1440

actttctttc catctaaact agataccttg gctgtatctg ctgaggataa cggtgataga 1500

tcagcttccg ttagtgttaa ggcttcaggt ttgagtggtt ggaacagtac aacagctagt 1560

aagcgtttcg tggca 1575

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 4

ggaggaggtg gttcaggtgg aggaggtagt ggtggaggtg gttca 45

<210> 5

<211> 4236

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 5

gagaggctga agcttacgta gaattcatga gttaccttaa aatttctgcc tttctgtctg 60

ttctgtcagt cgcattggct gaccaaagaa tttccgttac tgttgttggt gatggtattt 120

acactggatt gcgatctggt ggttctcatt ttgaagctgg tcctaacgcc gcaggtaccc 180

cacttgactt gatcctttat gagccttctg gtttccttgt tgatgctgcc gaccattcta 240

agtacgtcgg ttgggacgtc gctgctggta ctttgacttc cctgccacct gatcagggag 300

gaaaagattg gggaattgtt gctggaaact tacgattcaa tgttggtggt acaactttct 360

acgcatgcga aactcgaact ggcgtttggg aggttaaatc ctacgaagct tccggttgta 420

acgccgttgt cttgtctgtg gcctctcacc ctgtgccctc tcagtccagt acttcctcaa 480

gtcatgcacc cacatcttct gttccaagta catcctctca tgtttctcca accacaacac 540

agccacctca tactacttca tctcatacca ttcacacctc aactaccttg actacttcag 600

gtagaaacga ctcaaattca aaccatacta ttcctcctgt tccaactggc gctgccatgg 660

gtgtgtcctc taactacggt ttgcttgtgg ctgctggtat agccgccgct gccttgctgg 720

gaggaggtgg ttcaggtgga ggaggtagtg gtggaggtgg ttcaatggtg attaagactc 780

catttattcc tgcactggca gccgctgctc aggcatcata ctccggtgat ttagaaccac 840

tgcaaactca ttcccctcca agtaatttta tgggtgatcc aggaaacggt ctgttcaacg 900

acagtaaacg tggagtttat catagtcttt atcaatataa tttcactgcc actgtcgcag 960

gaaatcagca gggacatgcc acgtcaccag acttggatca ttggactaac caaggaatcg 1020

cattggccgg tgataaagac gaggaataca ttttctcctg gggttccgct gttccatcta 1080

acaacacctc cggttttttt ccagatgatc aggacgatgg tattgtaatc tacaccgttg 1140

atacacccac cctggaaacc gagcaagata tcgcttactc aagggacggt ggtacattca 1200

ctaaatacga aaacaatccc gttatcgact ctattggttc taagcagttc cgtatccccc 1260

aagtagtctg gcatatggag actcagcaat gggtaatgca tattgcttac gttgcccaag 1320

atttggttat tttctacacc ttgcctaacc ttaaagactg gacggcctct aatttatttt 1380

cacaggaagg acttcccggt gaccaatttg aatgcccaaa tttgaagttt tcctttgaca 1440

gggcagtgtc cgaagaaacc aagtcaaagt ttagtctgtt catttcagta gccccaggtg 1500

ctcctctaca gggatctggt actttctacg tggtcggtga cgacaacact actcatttta 1560

cctctgaggt ggcacaagaa actttggatt ttgacaagga caatcgttat gcagctcagc 1620

tatactctgg tattgaaaat gaacctccag tgtctattgg tttctgggct agtaactggg 1680

actacactga gagagtgata cctacaggtc ctctggaagg ctggcgagcc cagacattgc 1740

ctagagccca cacattgact ttggtcaaca gtgtatggac tgtaactcat tctccttttg 1800

agggattgga tgctttgaaa ttcagacaac ttgtctctaa gtctggacac agtggtgatg 1860

ttaagaattt tagtggagtt gttttttcaa acgctgttta ttttgatgta accctaaaag 1920

gcggagatgt ggttgccaaa cctactggaa gagtttttaa tatcactacc tcaagtgttt 1980

ctggtgaatt tttggatggt ctagtatctt tgctggattc atcattctgg atttcaagag 2040

caggtgccca tttgtttaca attgaagata acggtaatta tagttctagt acaaccacca 2100

tctcttcctt tgctaatggt acttttagtt tcgtctctgg cagagatcga tcagtgtttg 2160

aagtatttct aggacaagat ggaatccaat ctggttttga tatgactttc tttccatcta 2220

aactagatac cttggctgta tctgctgagg ataacggtga tagatcagct tccgttagtg 2280

ttaaggcttc aggtttgagt ggttggaaca gtacaacagc tagtaagcgt ttcgtggcag 2340

gaggaggtgg ttcaggtgga ggaggtagtg gtggaggtgg ttcaatgcaa gacaccctgg 2400

taagtagtct ggtagtgctg cttgctgctc cactgcacta cattagatac aatggtatcg 2460

aagcttcctt acttactgat aacgacaagg acgtctctgg aagagttgat tacgctattc 2520

aagctggcgg tggcttgacc attttaacga ctgctgatag attaaccgaa aatgtgaaca 2580

tctccgtggc tctagttata gagagtccta gtgagagtga tagaggacct attaacgaat 2640

cagatttgaa tgcatttgct gatattttcg gatcctctgt tgatcattgg gattatgaga 2700

ctgttcttgc aacaaaccat aatcagcgtg ccttaattcg ttccggcatc aacggtggtg 2760

gttctacatt gatcaacggt ggtcgtacct ggaccgtccc aaaggcccaa gatgttaaca 2820

gttgggagac cgttttcggt aatgaggcat ggtctaacga taatgtcgcc gattactcat 2880

tggctcaagc cgaaatagct cgtgctcctt ttaatgctaa acagttggct ggacattact 2940

ttaacgaacc atcttgtcac ggaaccaatg gagctgttca tactgctcca agggacacag 3000

ttgatatata ttcccctgtt aaagctttga tgtctgcttc agaggatcga ggagtcccaa 3060

ccaagaaagc ctttggtaat tgtgaccccc acggtgactc aatgtttcct ccaaataatc 3120

ttcacgagga tgtcagatca gatgctgcta gaggaaactg gctattgcca taccaaaggc 3180

ctaatctgca ggtttggacg ggtatgcaat acgtgggtaa gctacttgct cagaactacg 3240

gtacaactcc tcgtgccgtc ggagtagagt tcactaaagg caagggtaat actcataatg 3300

tggttgccga gcacgttcac cttttggccg ctggccatgc tgtttctcct actattaggt 3360

tggagtctgg cattgttatg aaatctattg agccattggg tattgctgat acagtggttg 3420

atattcccgt cggtcttaat ctgcaaattc aaactactat cgctaccaga tcaagagtta 3480

catctgctgg tgcaggatca ggtcaaggtg cttggttcgc tacttttaat gaaacgttca 3540

tagattattc tgaggcccac cctgaattgt tgaacacaaa gcttgaacag gctgctgaag 3600

ctgtcgctcg agttggaggt tttcataaca ctgccgcatt gattcagtac tacgaaaatt 3660

acagagataa cattgtgaac cacgttaatg ttgcctactc agagttattg gatactgcag 3720

gagttgcatc catgtttgcc gtttgggatc tgccatttac ccgtggtaat gtccatattc 3780

ttgactggga tcctccttta catcattttg catacgaccc tgtttacttt cttgaaccac 3840

tggacttgtt gggtcagcat gctgccactc aattagctag aatctcaaat aattccggtg 3900

ctattcagac ttacttcgca ggagagacaa ttccaggaga tttggcatac ttcgtagcag 3960

atttgtctgc ctggactgag taccattacc attttcgtcc aaatatctat cacgtaaaaa 4020

catgttctat gatgccaaag gagttcatgg gaatcgtagt taatgcagca agagtgtacg 4080

gtgatacgca gttgagagtg attgatggtt ccatacctcc acaagatatg tcctctcatg 4140

ttatgacggt atttatcgct gctttacaaa aaatttccga cgctatttta gaagcttatt 4200

caatgcaagc ggccgcgaat taattcgcct tagaca 4236

<210> 6

<211> 4236

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 6

gagaggctga agcttacgta gaattcatga gttaccttaa aatttctgcc tttctgtctg 60

ttctgtcagt cgcattggct gaccaaagaa tttccgttac tgttgttggt gatggtattt 120

acactggatt gcgatctggt ggttctcatt ttgaagctgg tcctaacgcc gcaggtaccc 180

cacttgactt gatcctttat gagccttctg gtttccttgt tgatgctgcc gaccattcta 240

agtacgtcgg ttgggacgtc gctgctggta ctttgacttc cctgccacct gatcagggag 300

gaaaagattg gggaattgtt gctggaaact tacgattcaa tgttggtggt acaactttct 360

acgcatgcga aactcgaact ggcgtttggg aggttaaatc ctacgaagct tccggttgta 420

acgccgttgt cttgtctgtg gcctctcacc ctgtgccctc tcagtccagt acttcctcaa 480

gtcatgcacc cacatcttct gttccaagta catcctctca tgtttctcca accacaacac 540

agccacctca tactacttca tctcatacca ttcacacctc aactaccttg actacttcag 600

gtagaaacga ctcaaattca aaccatacta ttcctcctgt tccaactggc gctgccatgg 660

gtgtgtcctc taactacggt ttgcttgtgg ctgctggtat agccgccgct gccttgctgg 720

gaggaggtgg ttcaggtgga ggaggtagtg gtggaggtgg ttcaatgcaa gacaccctgg 780

taagtagtct ggtagtgctg cttgctgctc cactgcacta cattagatac aatggtatcg 840

aagcttcctt acttactgat aacgacaagg acgtctctgg aagagttgat tacgctattc 900

aagctggcgg tggcttgacc attttaacga ctgctgatag attaaccgaa aatgtgaaca 960

tctccgtggc tctagttata gagagtccta gtgagagtga tagaggacct attaacgaat 1020

cagatttgaa tgcatttgct gatattttcg gatcctctgt tgatcattgg gattatgaga 1080

ctgttcttgc aacaaaccat aatcagcgtg ccttaattcg ttccggcatc aacggtggtg 1140

gttctacatt gatcaacggt ggtcgtacct ggaccgtccc aaaggcccaa gatgttaaca 1200

gttgggagac cgttttcggt aatgaggcat ggtctaacga taatgtcgcc gattactcat 1260

tggctcaagc cgaaatagct cgtgctcctt ttaatgctaa acagttggct ggacattact 1320

ttaacgaacc atcttgtcac ggaaccaatg gagctgttca tactgctcca agggacacag 1380

ttgatatata ttcccctgtt aaagctttga tgtctgcttc agaggatcga ggagtcccaa 1440

ccaagaaagc ctttggtaat tgtgaccccc acggtgactc aatgtttcct ccaaataatc 1500

ttcacgagga tgtcagatca gatgctgcta gaggaaactg gctattgcca taccaaaggc 1560

ctaatctgca ggtttggacg ggtatgcaat acgtgggtaa gctacttgct cagaactacg 1620

gtacaactcc tcgtgccgtc ggagtagagt tcactaaagg caagggtaat actcataatg 1680

tggttgccga gcacgttcac cttttggccg ctggccatgc tgtttctcct actattaggt 1740

tggagtctgg cattgttatg aaatctattg agccattggg tattgctgat acagtggttg 1800

atattcccgt cggtcttaat ctgcaaattc aaactactat cgctaccaga tcaagagtta 1860

catctgctgg tgcaggatca ggtcaaggtg cttggttcgc tacttttaat gaaacgttca 1920

tagattattc tgaggcccac cctgaattgt tgaacacaaa gcttgaacag gctgctgaag 1980

ctgtcgctcg agttggaggt tttcataaca ctgccgcatt gattcagtac tacgaaaatt 2040

acagagataa cattgtgaac cacgttaatg ttgcctactc agagttattg gatactgcag 2100

gagttgcatc catgtttgcc gtttgggatc tgccatttac ccgtggtaat gtccatattc 2160

ttgactggga tcctccttta catcattttg catacgaccc tgtttacttt cttgaaccac 2220

tggacttgtt gggtcagcat gctgccactc aattagctag aatctcaaat aattccggtg 2280

ctattcagac ttacttcgca ggagagacaa ttccaggaga tttggcatac ttcgtagcag 2340

atttgtctgc ctggactgag taccattacc attttcgtcc aaatatctat cacgtaaaaa 2400

catgttctat gatgccaaag gagttcatgg gaatcgtagt taatgcagca agagtgtacg 2460

gtgatacgca gttgagagtg attgatggtt ccatacctcc acaagatatg tcctctcatg 2520

ttatgacggt atttatcgct gctttacaaa aaatttccga cgctatttta gaagcttatt 2580

caatgcaagg aggaggtggt tcaggtggag gaggtagtgg tggaggtggt tcaatggtga 2640

ttaagactcc atttattcct gcactggcag ccgctgctca ggcatcatac tccggtgatt 2700

tagaaccact gcaaactcat tcccctccaa gtaattttat gggtgatcca ggaaacggtc 2760

tgttcaacga cagtaaacgt ggagtttatc atagtcttta tcaatataat ttcactgcca 2820

ctgtcgcagg aaatcagcag ggacatgcca cgtcaccaga cttggatcat tggactaacc 2880

aaggaatcgc attggccggt gataaagacg aggaatacat tttctcctgg ggttccgctg 2940

ttccatctaa caacacctcc ggtttttttc cagatgatca ggacgatggt attgtaatct 3000

acaccgttga tacacccacc ctggaaaccg agcaagatat cgcttactca agggacggtg 3060

gtacattcac taaatacgaa aacaatcccg ttatcgactc tattggttct aagcagttcc 3120

gtatccccca agtagtctgg catatggaga ctcagcaatg ggtaatgcat attgcttacg 3180

ttgcccaaga tttggttatt ttctacacct tgcctaacct taaagactgg acggcctcta 3240

atttattttc acaggaagga cttcccggtg accaatttga atgcccaaat ttgaagtttt 3300

cctttgacag ggcagtgtcc gaagaaacca agtcaaagtt tagtctgttc atttcagtag 3360

ccccaggtgc tcctctacag ggatctggta ctttctacgt ggtcggtgac gacaacacta 3420

ctcattttac ctctgaggtg gcacaagaaa ctttggattt tgacaaggac aatcgttatg 3480

cagctcagct atactctggt attgaaaatg aacctccagt gtctattggt ttctgggcta 3540

gtaactggga ctacactgag agagtgatac ctacaggtcc tctggaaggc tggcgagccc 3600

agacattgcc tagagcccac acattgactt tggtcaacag tgtatggact gtaactcatt 3660

ctccttttga gggattggat gctttgaaat tcagacaact tgtctctaag tctggacaca 3720

gtggtgatgt taagaatttt agtggagttg ttttttcaaa cgctgtttat tttgatgtaa 3780

ccctaaaagg cggagatgtg gttgccaaac ctactggaag agtttttaat atcactacct 3840

caagtgtttc tggtgaattt ttggatggtc tagtatcttt gctggattca tcattctgga 3900

tttcaagagc aggtgcccat ttgtttacaa ttgaagataa cggtaattat agttctagta 3960

caaccaccat ctcttccttt gctaatggta cttttagttt cgtctctggc agagatcgat 4020

cagtgtttga agtatttcta ggacaagatg gaatccaatc tggttttgat atgactttct 4080

ttccatctaa actagatacc ttggctgtat ctgctgagga taacggtgat agatcagctt 4140

ccgttagtgt taaggcttca ggtttgagtg gttggaacag tacaacagct agtaagcgtt 4200

tcgtggcagc ggccgcgaat taattcgcct tagaca 4236

<210> 7

<211> 1398

<212> PRT

<213> artifical sequence

<400> 7

Met Ser Tyr Leu Lys Ile Ser Ala Phe Leu Ser Val Leu Ser Val Ala

1 5 10 15

Leu Ala Asp Gln Arg Ile Ser Val Thr Val Val Gly Asp Gly Ile Tyr

20 25 30

Thr Gly Leu Arg Ser Gly Gly Ser His Phe Glu Ala Gly Pro Asn Ala

35 40 45

Ala Gly Thr Pro Leu Asp Leu Ile Leu Tyr Glu Pro Ser Gly Phe Leu

50 55 60

Val Asp Ala Ala Asp His Ser Lys Tyr Val Gly Trp Asp Val Ala Ala

65 70 75 80

Gly Thr Leu Thr Ser Leu Pro Pro Asp Gln Gly Gly Lys Asp Trp Gly

85 90 95

Ile Val Ala Gly Asn Leu Arg Phe Asn Val Gly Gly Thr Thr Phe Tyr

100 105 110

Ala Cys Glu Thr Arg Thr Gly Val Trp Glu Val Lys Ser Tyr Glu Ala

115 120 125

Ser Gly Cys Asn Ala Val Val Leu Ser Val Ala Ser His Pro Val Pro

130 135 140

Ser Gln Ser Ser Thr Ser Ser Ser His Ala Pro Thr Ser Ser Val Pro

145 150 155 160

Ser Thr Ser Ser His Val Ser Pro Thr Thr Thr Gln Pro Pro His Thr

165 170 175

Thr Ser Ser His Thr Ile His Thr Ser Thr Thr Leu Thr Thr Ser Gly

180 185 190

Arg Asn Asp Ser Asn Ser Asn His Thr Ile Pro Pro Val Pro Thr Gly

195 200 205

Ala Ala Met Gly Val Ser Ser Asn Tyr Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly

210 215 220

Ile Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gln Asp Thr Leu Val Ser Ser Leu Val

245 250 255

Val Leu Leu Ala Ala Pro Leu His Tyr Ile Arg Tyr Asn Gly Ile Glu

260 265 270

Ala Ser Leu Leu Thr Asp Asn Asp Lys Asp Val Ser Gly Arg Val Asp

275 280 285

Tyr Ala Ile Gln Ala Gly Gly Gly Leu Thr Ile Leu Thr Thr Ala Asp

290 295 300

Arg Leu Thr Glu Asn Val Asn Ile Ser Val Ala Leu Val Ile Glu Ser

305 310 315 320

Pro Ser Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Asn Glu Ser Asp Leu Asn Ala

325 330 335

Phe Ala Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Trp Asp Tyr Glu Thr

340 345 350

Val Leu Ala Thr Asn His Asn Gln Arg Ala Leu Ile Arg Ser Gly Ile

355 360 365

Asn Gly Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly Gly Arg Thr Trp Thr Val

370 375 380

Pro Lys Ala Gln Asp Val Asn Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu

385 390 395 400

Ala Trp Ser Asn Asp Asn Val Ala Asp Tyr Ser Leu Ala Gln Ala Glu

405 410 415

Ile Ala Arg Ala Pro Phe Asn Ala Lys Gln Leu Ala Gly His Tyr Phe

420 425 430

Asn Glu Pro Ser Cys His Gly Thr Asn Gly Ala Val His Thr Ala Pro

435 440 445

Arg Asp Thr Val Asp Ile Tyr Ser Pro Val Lys Ala Leu Met Ser Ala

450 455 460

Ser Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Ala Phe Gly Asn Cys Asp

465 470 475 480

Pro His Gly Asp Ser Met Phe Pro Pro Asn Asn Leu His Glu Asp Val

485 490 495

Arg Ser Asp Ala Ala Arg Gly Asn Trp Leu Leu Pro Tyr Gln Arg Pro

500 505 510

Asn Leu Gln Val Trp Thr Gly Met Gln Tyr Val Gly Lys Leu Leu Ala

515 520 525

Gln Asn Tyr Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Thr Lys

530 535 540

Gly Lys Gly Asn Thr His Asn Val Val Ala Glu His Val His Leu Leu

545 550 555 560

Ala Ala Gly His Ala Val Ser Pro Thr Ile Arg Leu Glu Ser Gly Ile

565 570 575

Val Met Lys Ser Ile Glu Pro Leu Gly Ile Ala Asp Thr Val Val Asp

580 585 590

Ile Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Ile Gln Thr Thr Ile Ala Thr Arg

595 600 605

Ser Arg Val Thr Ser Ala Gly Ala Gly Ser Gly Gln Gly Ala Trp Phe

610 615 620

Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Ile Asp Tyr Ser Glu Ala His Pro Glu

625 630 635 640

Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Ala Ala Glu Ala Val Ala Arg Val

645 650 655

Gly Gly Phe His Asn Thr Ala Ala Leu Ile Gln Tyr Tyr Glu Asn Tyr

660 665 670

Arg Asp Asn Ile Val Asn His Val Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Leu

675 680 685

Asp Thr Ala Gly Val Ala Ser Met Phe Ala Val Trp Asp Leu Pro Phe

690 695 700

Thr Arg Gly Asn Val His Ile Leu Asp Trp Asp Pro Pro Leu His His

705 710 715 720

Phe Ala Tyr Asp Pro Val Tyr Phe Leu Glu Pro Leu Asp Leu Leu Gly

725 730 735

Gln His Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Ile Ser Asn Asn Ser Gly Ala

740 745 750

Ile Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Leu Ala Tyr

755 760 765

Phe Val Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr His Tyr His Phe Arg

770 775 780

Pro Asn Ile Tyr His Val Lys Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Phe

785 790 795 800

Met Gly Ile Val Val Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Asp Thr Gln Leu

805 810 815

Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Gln Asp Met Ser Ser His Val

820 825 830

Met Thr Val Phe Ile Ala Ala Leu Gln Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu

835 840 845

Glu Ala Tyr Ser Met Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

850 855 860

Gly Gly Gly Gly Ser Met Val Ile Lys Thr Pro Phe Ile Pro Ala Leu

865 870 875 880

Ala Ala Ala Ala Gln Ala Ser Tyr Ser Gly Asp Leu Glu Pro Leu Gln

885 890 895

Thr His Ser Pro Pro Ser Asn Phe Met Gly Asp Pro Gly Asn Gly Leu

900 905 910

Phe Asn Asp Ser Lys Arg Gly Val Tyr His Ser Leu Tyr Gln Tyr Asn

915 920 925

Phe Thr Ala Thr Val Ala Gly Asn Gln Gln Gly His Ala Thr Ser Pro

930 935 940

Asp Leu Asp His Trp Thr Asn Gln Gly Ile Ala Leu Ala Gly Asp Lys

945 950 955 960

Asp Glu Glu Tyr Ile Phe Ser Trp Gly Ser Ala Val Pro Ser Asn Asn

965 970 975

Thr Ser Gly Phe Phe Pro Asp Asp Gln Asp Asp Gly Ile Val Ile Tyr

980 985 990

Thr Val Asp Thr Pro Thr Leu Glu Thr Glu Gln Asp Ile Ala Tyr Ser

995 1000 1005

Arg Asp Gly Gly Thr Phe Thr Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Val Ile Asp

1010 1015 1020

Ser Ile Gly Ser Lys Gln Phe Arg Ile Pro Gln Val Val Trp His Met

1025 1030 1035 1040

Glu Thr Gln Gln Trp Val Met His Ile Ala Tyr Val Ala Gln Asp Leu

1045 1050 1055

Val Ile Phe Tyr Thr Leu Pro Asn Leu Lys Asp Trp Thr Ala Ser Asn

1060 1065 1070

Leu Phe Ser Gln Glu Gly Leu Pro Gly Asp Gln Phe Glu Cys Pro Asn

1075 1080 1085

Leu Lys Phe Ser Phe Asp Arg Ala Val Ser Glu Glu Thr Lys Ser Lys

1090 1095 1100

Phe Ser Leu Phe Ile Ser Val Ala Pro Gly Ala Pro Leu Gln Gly Ser

1105 1110 1115 1120

Gly Thr Phe Tyr Val Val Gly Asp Asp Asn Thr Thr His Phe Thr Ser

1125 1130 1135

Glu Val Ala Gln Glu Thr Leu Asp Phe Asp Lys Asp Asn Arg Tyr Ala

1140 1145 1150

Ala Gln Leu Tyr Ser Gly Ile Glu Asn Glu Pro Pro Val Ser Ile Gly

1155 1160 1165

Phe Trp Ala Ser Asn Trp Asp Tyr Thr Glu Arg Val Ile Pro Thr Gly

1170 1175 1180

Pro Leu Glu Gly Trp Arg Ala Gln Thr Leu Pro Arg Ala His Thr Leu

1185 1190 1195 1200

Thr Leu Val Asn Ser Val Trp Thr Val Thr His Ser Pro Phe Glu Gly

1205 1210 1215

Leu Asp Ala Leu Lys Phe Arg Gln Leu Val Ser Lys Ser Gly His Ser

1220 1225 1230

Gly Asp Val Lys Asn Phe Ser Gly Val Val Phe Ser Asn Ala Val Tyr

1235 1240 1245

Phe Asp Val Thr Leu Lys Gly Gly Asp Val Val Ala Lys Pro Thr Gly

1250 1255 1260

Arg Val Phe Asn Ile Thr Thr Ser Ser Val Ser Gly Glu Phe Leu Asp

1265 1270 1275 1280

Gly Leu Val Ser Leu Leu Asp Ser Ser Phe Trp Ile Ser Arg Ala Gly

1285 1290 1295

Ala His Leu Phe Thr Ile Glu Asp Asn Gly Asn Tyr Ser Ser Ser Thr

1300 1305 1310

Thr Thr Ile Ser Ser Phe Ala Asn Gly Thr Phe Ser Phe Val Ser Gly

1315 1320 1325

Arg Asp Arg Ser Val Phe Glu Val Phe Leu Gly Gln Asp Gly Ile Gln

1330 1335 1340

Ser Gly Phe Asp Met Thr Phe Phe Pro Ser Lys Leu Asp Thr Leu Ala

1345 1350 1355 1360

Val Ser Ala Glu Asp Asn Gly Asp Arg Ser Ala Ser Val Ser Val Lys

1365 1370 1375

Ala Ser Gly Leu Ser Gly Trp Asn Ser Thr Thr Ala Ser Lys Arg Phe

1380 1385 1390

Val Ala Ala Ala Ala Asn

1395

Claims

1.一种毕赤酵母，其特征在于其细胞表面表达如SEQ ID No.7所示的蛋白。

2.权利要求1所述的毕赤酵母在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于其步骤包括：收集培养的毕赤酵母全细胞，将毕赤酵母全细胞加入蔗糖水溶液中进行反应，制得低聚果糖。

4.权利要求1所述的毕赤酵母的制备方法，其特征在于其步骤包括：

(1)化学合成如SEQ ID No.6所示的融合基因anc-L-gody-L-ftfx；

(3)将酶切后的融合基因片段与酶切后的pPIC9K载体连接，将融合基因构建到载体pPIC9K中；

(6)将质粒pPIC9K-anc-L-gody-L-ftfx线性化；

5.根据权利要求4所述的毕赤酵母的制备方法，其特征在于：步骤(3)中采用T4 DNA连接酶连接酶切后的融合基因片段与酶切后的pPIC9K载体。

6.根据权利要求4所述的毕赤酵母的制备方法，其特征在于：步骤(6)中将质粒用SacI酶切线性化。