CN116200419A - 细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法及其应用 - Google Patents

细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法，将果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶分别与毕赤酵母锚定蛋白融合后，同时展示在毕赤酵母的细胞表面。还公开了毕赤酵母和其在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用。本发明将果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶同时展示在毕赤酵母表面，可以全细胞催化生产低聚果糖的同时消除葡萄糖对反应的抑制作用，同时保持高的酶活性，提高低聚果糖的转化率，相比将果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶分别发酵表达后纯化固定再共同催化生产低聚果糖提高了低聚果糖的转化率。

Description

细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方 法及其应用
技术领域
本发明涉及一种细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法及其应用，属于合成生物学领域。
背景技术
现有技术通过二次发酵分别表达果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶后分泌到胞外，然后将果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶分别分离纯化固定后再共同催化蔗糖生产低聚果糖。构建和发酵次数多，分离纯化固定步骤繁琐，使得效率低成本高。由于现有技术分别表达果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶后分泌到胞外后的酶是游离的酶，不能长久保持活性，酶活性会随着时间的推移逐渐降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法。
本发明采取的技术方案为：
一种细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法，其特征在于其步骤包括：
(1)合成SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的基因，或者合成SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示的基因，使果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶分别通过连接肽与锚定蛋白融合，形成anc-L-ftfx以及anc-L-gody的融合基因，或者形成ftfx-L-anc以及gody-L-anc的融合基因；
(2)将上述融合基因分别构建到质粒载体中；
(3)将上述连接产物分别转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选出阳性克隆；
(4)培养大肠杆菌感受态细胞阳性克隆，从中抽提出质粒anc-L-ftfx、质粒anc-L-gody，或者抽提出质粒ftfx-L-anc、质粒gody-L-anc；
(5)将质粒anc-L-ftfx以及质粒anc-L-gody线性化，或者将质粒ftfx-L-anc以及质粒gody-L-anc线性化；
(6)将线性化的质粒anc-L-ftfx以及质粒anc-L-gody混合后，或者将线性化的质粒ftfx-L-anc以及质粒gody-L-anc混合后，转化入毕赤酵母感受态细胞，筛选出阳性克隆，得到表面同时展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶的毕赤酵母。
优选的，融合基因的两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列，步骤(2)中所述质粒载体为pPIC9K，步骤(2)中将载体pPIC9K和融合基因分别进行EcoRI和Not1双酶切后，再分别进行连接。
优选的，步骤(2)中采用T4DNA连接酶连接酶切后的融合基因片段与酶切后的pPIC9K载体。
优选的，步骤(5)中将质粒用SacI酶切线性化。
优选的，步骤(6)中通过His缺陷和G418来筛选阳性克隆。
优选的，步骤(6)中还需要对筛选的阳性克隆进行PCR验证，第一对菌检上游引物PF1:TCCTCAAGTCATGCACCCAC，下游引物PR1:TGGCATGTCCCTGCTGATTT；第二对菌检上游引物PF2:TGTGCCCTCTCAGTCCAGTA，下游引物PR2:GAGCCACGGAGATGTTCACA。
本发明还公开了一种毕赤酵母，其特征在于果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶分别与毕赤酵母锚定蛋白融合后同时展示在该毕赤酵母的细胞表面。
本发明还公开了上述的毕赤酵母在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用。
优选的，将毕赤酵母全细胞发酵液加入蔗糖水溶液中进行反应，制得低聚果糖。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种将果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶分别与毕赤酵母锚定蛋白融合后展示在同一毕赤酵母细胞表面的方法及其在全细胞直接催化生产低聚果糖中的应用。只通过单次发酵就可以生产出具有2种酶活性的毕赤酵母细胞，理论上2倍提高发酵效率。并且通过全细胞催化的方法可以省略酶的分离纯化固定的繁琐过程。表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶的毕赤酵母细胞既有果糖基转移酶的活性，又有葡萄糖氧化酶的活性，可以通过带有2种酶活性的毕赤酵母细胞一次性催化蔗糖生产低聚果糖的同时，节省发酵时间，降低成本。由于果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶被共同展示在同一毕赤酵母细胞上，可以长久保持活性，其酶活相比于游离的酶的活性更高，可以提高低聚果糖转化率。
附图说明
图1为本发明与现有技术相比的流程对照图。
图2为本发明与现有技术相比的低聚果糖转化率对照图。图中标记：A：蔗糖对照；B：使用对比例1的游离的果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶共同催化蔗糖产低聚果糖，转化率约为50％；C：使用本发明的实施例1的毕赤酵母表面共同展示葡萄糖氧化酶和果糖基转移酶全细胞催化蔗糖产低聚果糖，转化率达到60％以上；D：单糖对照；E：低聚果糖标准样对照。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。附图1可以展示本发明与现有技术相比的流程对照。
实施例1将果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶分别与毕赤酵母锚定蛋白N端融合后共同展示在同一毕赤酵母细胞表面的方法及其在全细胞直接催化生产低聚果糖中的应用，包括如下步骤：
(1)优化毕赤酵母锚定蛋白基因、果糖基转移酶、葡萄糖氧化酶和连接肽的序列，如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；
(2)化学合成如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的锚定蛋白-连接肽-果糖基转移酶融合基因anc-L-ftfx和锚定蛋白-连接肽-葡萄糖氧化酶融合基因anc-L-gody；基因序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列；
(3)载体pPIC9K均经EcoRI和Not1双酶切，酶切体系如下：
Figure BDA0003815139220000031
(4)将带有同源臂的融合基因片段anc-L-ftfx和anc-L-gody分别与酶切后的pPIC9K载体重组，重组体系如下：
Figure BDA0003815139220000032
Figure BDA0003815139220000041
(5)将重组产物分别转化入大肠杆菌Top10感受态细胞；
(6)涂布含氨苄青霉素的平板；
(7)PCR检测阳性克隆。anc-L-ftfx的菌检上游引物PF1:TCCTCAAGTCATGCACCCAC，下游引物PR1:TGGCATGTCCCTGCTGATTT；anc-L-gody的菌检上游引物PF2:TGTGCCCTCTCAGTCCAGTA，下游引物PR2:GAGCCACGGAGATGTTCACA。
(8)扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒p-anc-L-ftfx和p-anc-L-gody；
(9)质粒均用SacI酶切线性化，酶切体系如下：
Figure BDA0003815139220000042
(10)跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认质粒完全线性化；
(11)将线性化的两种质粒混合；
(12)将混合后的线性化质粒共同电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞中，220rpm条件下进行摇床培养1-2h，5000rpm离心5min收集菌体；
(13)将菌体涂布在His缺陷平板上培养2-3天，挑选单菌落；
(14)通过3-5mg/mLG418的平板筛选出含有筛选标记的毕赤酵母工程菌；
(15)将毕赤酵母工程菌转接入含有10-15mLBMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28℃，220rpm条件下进行摇床培养至OD600＝4-5；
(16)5000rpm离心5min收集菌体；
(17)菌体重悬于BMM培养基，220rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养4-5天；
(18)PCR检测同时有anc-L-ftfx基因和anc-L-gody基因插入的阳性克隆。第一对菌检上游引物PF1:TCCTCAAGTCATGCACCCAC，下游引物PR1:TGGCATGTCCCTGCTGATTT；第二对菌检上游引物PF2:TGTGCCCTCTCAGTCCAGTA，下游引物PR2:GAGCCACGGAGATGTTCACA。
(19)以蔗糖为底物，使用全细胞催化蔗糖生产低聚果糖，反应体系如下：1ml底物(50％蔗糖，质量/体积浓度)+10uL全细胞发酵液充分混匀后在45℃常压条件下反应时间：3h
(20)跑PLC检测酶切结果。结果如图2所示。
实施例2将果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶分别与毕赤酵母锚定蛋白C端融合后共同展示在同一毕赤酵母细胞表面的方法及其在全细胞直接催化生产低聚果糖中的应用，包括如下步骤：
(1)优化毕赤酵母锚定蛋白基因、果糖基转移酶、葡萄糖氧化酶和连接肽的序列，如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；
(2)化学合成如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的果糖基转移酶-连接肽-锚定蛋白融合基因ftfx-L-anc和葡萄糖氧化酶-连接肽-锚定蛋白融合基因gody-L-anc；基因序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列；
(3)载体pPIC9K均经EcoRI和Not1双酶切，酶切体系如下：
Figure BDA0003815139220000051
(4)将带有同源臂的融合基因片段ftfx-L-anc和gody-L-anc分别与酶切后的pPIC9K载体重组，重组体系如下：
Figure BDA0003815139220000052
Figure BDA0003815139220000061
(5)将重组产物分别转化入大肠杆菌Top10感受态细胞；
(6)涂布含氨苄青霉素的平板；
(7)PCR检测阳性克隆。ftfx-L-anc的菌检上游引物PF1:CTGGCAGAGATCGATCAGTGT，下游引物PR1:AGAATGGTCGGCAGCATCAA；gody-L-anc的菌检上游引物PF2:GCAGCAAGAGTGTACGGTGA，下游引物PR2:AGAATGGTCGGCAGCATCAA。
(8)扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒p-ftfx-L-anc和p-gody-L-anc；
(9)质粒均用SacI酶切线性化，酶切体系如下：
Figure BDA0003815139220000062
(10)跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认质粒完全线性化；
(11)将线性化的两种质粒混合；
(12)将混合后的线性化质粒共同电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞中，220rpm条件下进行摇床培养1-2h，5000rpm离心5min收集菌体；
(13)将菌体涂布在His缺陷平板上培养2-3天，挑选单菌落；
(14)通过3-5mg/mLG418的平板筛选出含有筛选标记的毕赤酵母工程菌；
(15)将毕赤酵母工程菌转接入含有10-15mLBMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28℃，220rpm条件下进行摇床培养至OD600＝4-5；
(16)5000rpm离心5min收集菌体；
(17)菌体重悬于BMM培养基，220rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养4-5天；
(18)PCR检测同时有ftfx-L-anc基因和gody-L-anc基因插入的阳性克隆。第一对菌检上游引物PF1:CTGGCAGAGATCGATCAGTGT，下游引物PR1:AGAATGGTCGGCAGCATCAA；第二对菌检上游引物PF2:GCAGCAAGAGTGTACGGTGA，下游引物PR2:AGAATGGTCGGCAGCATCAA。(19)以蔗糖为底物，使用全细胞催化蔗糖生产低聚果糖，反应体系如下：1ml底物(50％蔗糖，质量/体积浓度)+10uL全细胞发酵液
充分混匀后在45℃常压条件下反应时间：3h
(20)跑PLC检测酶切结果。
对比例1单独表达果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步骤：
(1)优化果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶基因序列，如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3；
(2)化学合成如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的果糖基转移酶基因ftfx和葡萄糖氧化酶基因gody；基因序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列；
(3)基因片段和载体pPIC9K均经EcoRI和Not1双酶切，酶切体系如下：
Figure BDA0003815139220000071
(4)将基因片段与酶切后的pPIC9K载体连接，连接体系如下：
Figure BDA0003815139220000072
Figure BDA0003815139220000081
(5)将连接产物转化入大肠杆菌Top10感受态细胞；
(6)涂布含氨苄青霉素的平板；
(7)PCR检测阳性克隆。含果糖基转移酶基因ftfx的克隆的菌检上游引物PF1:ACTGTCGCAGGAAATCAGCA，下游引物PR1:GCACCTGGGGCTACTGAAAT；含葡萄糖氧化酶基因gody的克隆的菌检上游引物PF2:TGTGAACATCTCCGTGGCTC，下游引物PR2:GCCAGTTTCCTCTAGCAGCA；
(8)扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒p-ftfx和p-gody；
(9)两种质粒均用SacI酶切线性化，酶切体系如下：
Figure BDA0003815139220000082
(10)跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认质粒完全线性化；
(11)将线性化的两种质粒分别电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞中，220rpm条件下进行摇床培养1-2h，6000rpm离心5min收集菌体；
(12)将菌体涂布在His缺陷平板上培养2-3天，挑选单菌落；
(13)通过3-5mg/mLG418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌p-ftfx和p-gody；
(14)将毕赤酵母工程菌p-ftfx和p-gody分别转接入含有10-15mLBMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28℃，220rpm条件下进行摇床培养至OD600＝4-5；
(15)6000rpm离心5min收集菌体；
(16)菌体重悬于BMM培养基，220rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养4-5天；
(17)离心去除菌体，分别得两种粗酶液FTFX和GODY；
(18)以蔗糖为底物，使用果糖基转移酶FTFX和葡萄糖氧化酶GODY共同催化蔗糖生产低聚果糖，反应体系如下：
1ml底物(50％蔗糖，质量/体积浓度)+5μl果糖基转移酶FTFX+5μl浓缩的葡萄糖氧化酶GODY
充分混匀后在45℃常压条件下反应3h；
(19)跑PLC检测酶切结果，结果如图2所示。
以上实验结果表明，本方法将果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶共同展示在毕赤酵母表面，可以全细胞催化生产低聚果糖的同时消除葡萄糖对反应的抑制作用，同时保持高的酶活性，提高低聚果糖的转化率，相比将果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶分别发酵表达后纯化固定再共同催化生产低聚果糖提高了低聚果糖的转化率。由于果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶被共同展示在同一毕赤酵母细胞上，活细胞可以使酶长久保持活性，毕赤酵母表面共同展示混合酶果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶比游离的果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶酶活更高。因此，本发明可用于生产低聚果糖并提高低聚果糖的转化率。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法，其特征在于其步骤包括：
(1)合成SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的基因，或者合成SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示的基因，使果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶分别通过连接肽与锚定蛋白融合，形成anc-L-ftfx以及anc-L-gody的融合基因，或者形成ftfx-L-anc以及gody-L-anc的融合基因；
(2)将上述融合基因分别构建到质粒载体中；
(3)将上述连接产物分别转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选出阳性克隆；
(4)培养大肠杆菌感受态细胞阳性克隆，从中抽提出质粒anc-L-ftfx、质粒anc-L-gody，或者抽提出质粒ftfx-L-anc、质粒gody-L-anc；
(5)将质粒anc-L-ftfx以及质粒anc-L-gody线性化，或者将质粒ftfx-L-anc以及质粒gody-L-anc线性化；
(6)将线性化的质粒anc-L-ftfx以及质粒anc-L-gody混合后，或者将线性化的质粒ftfx-L-anc以及质粒gody-L-anc混合后，转化入毕赤酵母感受态细胞，筛选出阳性克隆，得到表面同时展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶的毕赤酵母。
2.根据权利要求1所述的细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法，其特征在于：融合基因的两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列，步骤(2)中所述质粒载体为pPIC9K，步骤(2)中将载体pPIC9K和融合基因分别进行EcoRI和Not1双酶切后，再分别进行连接。
3.根据权利要求2所述的细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法，其特征在于：步骤(2)中采用T4 DNA连接酶连接酶切后的融合基因片段与酶切后的pPIC9K载体。
4.根据权利要求1所述的细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法，其特征在于：步骤(5)中将质粒用SacI酶切线性化。
5.根据权利要求1所述的细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法，其特征在于：步骤(6)中通过His缺陷和G418来筛选阳性克隆。
6.根据权利要求1所述的细胞表面展示果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶混合酶制剂的方法，其特征在于：步骤(6)中还需要对筛选的阳性克隆进行PCR验证，第一对菌检上游引物PF1:TCCTCAAGTCATGCACCCAC，下游引物PR1:TGGCATGTCCCTGCTGATTT；第二对菌检上游引物PF2:TGTGCCCTCTCAGTCCAGTA，下游引物PR2:GAGCCACGGAGATGTTCACA。
7.一种毕赤酵母，其特征在于果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶分别与毕赤酵母锚定蛋白融合后同时展示在该毕赤酵母的细胞表面。
8.权利要求7所述的毕赤酵母在催化蔗糖生产低聚果糖中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于其步骤包括：将毕赤酵母全细胞发酵液加入蔗糖水溶液中进行反应，制得低聚果糖。
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