KR101092302B1 - 재조합 미생물을 이용한 수소 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대장균 NiFe 수소화효소 1 오페론 (Escherichia coli NiFe hydrogenase 1 operon) 중 hyaA 및 hyaB 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물, 및 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 수소를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 획득한 대장균의 NIFe 수소화효소는 호기 조건에서 수소를 생산함에 따라 생물학적 수소생산의 효율성을 현저히 증대시킬 수 있다.
NiFe 수소화효소 단백질, 재조합 벡터, 미생물, 수소

Description

재조합 미생물을 이용한 수소 생산 방법 {Method for Producing Hydrogen Using Recombinant Microorganism}
본 발명은 재조합 미생물을 이용한 수소 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 대장균 NiFe 수소화효소 1 오페론 (Escherichia coli NiFe hydrogenase 1 operon) 중 hyaA 및 hyaB 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물, 및 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 수소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
현재 화석 연료로 인한 환경문제와 에너지 위기 극복을 위한 에너지원으로서 수소를 주목하고 있다. 수소는 물과 유기 물질의 구성성분으로부터 제조되므로 원료물질의 고갈 우려가 적고, 단위 중량당 에너지만이 발생하는 청정 에너지이고, 연료 전지 등 이용 기술의 실용화 가능성도 크다. 태양광을 에너지로 이용하는 광합성 미생물은 수소를 발생시킬 뿐만 아니라 공기 중 이산화탄소를 저감시키는 적극적인 환경처리 기술이다. 미생물에 의한 수소 발생 연구는 이미 1800년대 말부터 시작되었으며, 조류(algae)와 세균(bacteria)을 이용하여 기초 연구가 수행되고 있다. 이러한 생물학적 수소 생산은 많은 장점을 가지고 있다. 환경친화적이며, 재생하여 사용 가능하며, 또한 음식물 쓰레기나 하수 슬러지 처리 시에 사용 가능하다.
일반적인 조류는 빛을 받아서 광합성 작용에 의해 공기 중 이산화탄소를 고정하고, 동시에 물을 분해하여, 산소와 동시에 수소를 발생한다. 이처럼 조류가 수소를 발생할 수 있는 이유는 수소 생산을 돕는 수소화효소(수소화효소)를 갖고 있기 때문이다. 생물학적인 수소 생산에서 수소화효소가 주요 역할을 한다. 수소화효소는 수소분자의 가역적인 산화반응을 촉매하며, 미생물의 에너지 대사에 중요한 역할을 한다. 그러나 현재 기술로는 상용화하기 위해 해결해야 할 많은 도전이 있다. 그 중에서도 반응에 관여하는 수소화효소가 동시에 발생하는 산소에 매우 민감하여 수소 발생을 저해하기 때문에 무산소 조건이 수소생산에 필수적이며 이는 비효율적인 공정이 된다. 이에, 수소생산의 효율을 증대시키기 위해 많은 연구자들이 수소화효소에 관심을 가지고 개량화 연구를 수행하고 있으며, 이를 위하여 수소화효소들을 검출하고 탐색하는 기술의 개발이 필요하다.
수소화효소는 수소를 활성화하는 부분(hydrogen-activating site)의 구성에 따라 [철]-수소화효소(Fe 수소화효소), [니켈-철]-수소화효소 및 금속이온이 없는 수소화효소(metal-free 수소화효소)로 분류된다. 이 중 [니켈-철]-수소화효소는 [철]-수소화효소에 비해 활성도는 낮아도, 기질에 대한 친화도가 높다는 장점을 가지고 있다. 그럼에도 [니켈-철]-수소화효소는 [철]-수소화효소에 비하여 알려진 바가 거의 없다.
본 발명자들은 수소 에너지의 유용성을 인지하고, 대장균 NiFe 수소화효소 1 오페론 (Escherichia coli NiFe hydrogenase 1 operon) 중 hyaA 및 hyaB 유전자를 대장균 (E. coli)에서 재조합 단백질의 형태로 발현시켜 in vivo 상태로 수소생산이 가능한 재조합 균주를 개발하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 대장균 NiFe 수소화효소 1 오페론 (Escherichia coli NiFe hydrogenase 1 operon) 중 hyaA 및 hyaB 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 수소를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의해 획득한 대장균의 NIFe 수소화효소는 호기 조건에서 수소를 생산함에 따라 생물학적 수소생산의 효율성을 현저히 증대시킬 수 있다. 또한, 바이오연료 전지(biofuel cell)와 바이오센서(biosensor)의 개발에 전기적인 촉매(electrocatalyst)로서도 응용되어질 것이다. 현재 연료전지에서 많이 사용되는 화학적 반응 대신에, 수소화효소를 사용하게 되면, 더 간단한 공정과정과 오염이 없는 청정연료전지로 개발되어질 것이다. 추가로, 혐기성 미생물에 의해 유도된 생물부식(biocorrosion)에서도 활용이 가능할 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부도면을 참조하여 상세히 설명한다. 우선 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호로 표기되었음에 유의하여야 한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균 NiFe 수소화효소 1 오페론 중 hyaA 및 hyaB 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
NiFe 수소화효소는 Fe 수소화효소에 비해 활성도는 낮아도, 기질에 대한 친화도가 높다는 장점을 가지며 철뿐만 아니라 니켈 이온을 포함하는 삼차원적인 구조를 하고 있다. NiFe 수소화효소는 큰 서브유닛(large subunit)과 작은 서브유닛(small subunit)의 2개의 서브유닛으로 이루어져 있다. 일반적으로 큰 서브유닛은 크기가 약 1800bp로 보존적(conserved) 서열을 주로 포함하고 있으며, 작은 서브유닛은 크기가 약 1100bp로 가변성(variable) 서열들이 주로 존재한다. 이 중 작은 서브유닛에 외막과 내막사이, 즉 페리플라즘(periplasm)으로의 위치를 신호하는 분비 신호(secretion signal) 서열이 존재하며, 분비가 일어나기 전에 작은 서브유닛과 큰 서브유닛이 결합한다. 결합된 NiFe 수소화효소는 트윈-아르기닌의 전달경로(twin-arginine translocation pathway)를 통해 막으로 이동된다.
대장균 (E. coli)의 경우 4 종류의 NiFe 수소화효소를 가지고 있다. 그 중 수소화효소 3은 포름산염 탈수소효소 (formate dehydrogenase)와 함께 FHL (formate hydrogenlyase complex)를 형성하여 수소 생산에 관여하고, 수소화효소 2는 수소 흡수에 관여하는 것으로 알려져 있으나, hya 오페론 (hyaABCDEF. Menon, N.K., ROBBINS,J., Wendt,J.C., Shanmugam,K.T., and Przybyla,A.E. 1991, J.Bacteriol. 173:4851-4861)으로 암호화되는 수소화효소 1은 그 기능에 대해 확립된 견해가 없다.
이에 본 발명자들이 수소를 생산하지 못하는 대장균 BL21 균주에 대장균 NiFe 수소화효소 1 유전자를 발현시켜 상기 효소의 기능을 밝히는 한편, 수소의 바이오생산에 응용하는 방안을 완성하였다.
사용한 유전자는 대장균 NIFe 수소화효소 1 오페론 중 hyaA 및 hyaB 유전자이며, 상기 유전자의 염기 서열은 NCBI 데이터베이스 (M34825)로부터 확보하였다.
본 발명의 재조합 벡터에 포함되는 유전자는 상기 염기 서열 뿐만 아니라 그 변이체 역시 포함된다. 상기 변이체는 상기 염기 서열과 일부 상이하나. 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 본 발명의 범주에 속하는 염기 서열은 상기 hyaA 및 hyaB 의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 염기 서열을 갖는 유전자를 미생물에 도입하는 데 바람직한 벡터는 pQE70, pQE60 및 pQE-9(Qiagen); pBS 벡터, PHAGESCRIPT 벡터, Bluescript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia); pRSET-B(Invitrogen Inc.); 및 pET21b(Novagen)를 포함한다. 바람직한 진핵세포 벡터는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG(Stratagene); 및 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Pharmacia)이다. 기타 적당한 벡터는 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 진핵세포 배양에 대해 디히드로폴레이트 환원효소, 네오마이신 내성 등을 포함하며, 대장균 및 기타 박테리아에서 배양을 위해 테트라사이클린, 앰피실린 내성 유전자 등을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 NiFe 수소화효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 도 1에 기재된 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
재조합 구축물은 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 트랜스벡션, 전기천공 및 형질전환과 같은 주지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포; 및 진균 세포, 예를 들면, 효모 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 숙주 세포에 대한 적당한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다.
바람직하게는, 상기 형질전환된 미생물은 대장균이며, 더욱 바람직하게는 대장균 BL21이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 미생물을 Ni 및 Fe을 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 미생물에서 수소를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 수소 생산 방법은 먼저 본 발명의 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 단계를 포함하는데, 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 방법은 전술한 바와 같다. 다음 단계로, 상기 형질전환된 미생물을 Ni 및 Fe을 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는데, 미생물을 배양하는데 필요한 배지, 배양 온도, 배양 시간 등은 당업계에 주지된 방법을 이용한다. 또한, 배양 배지는 특히, Ni 및 Fe을 포함할 수 있으며, 추가로 포름산염을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 미생물은 대장균이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의 해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
실시예 1: 니켈-철 수소화효소 1 유전자의 분리 및 벡터의 제조
Wizard genomic DNA purification kit (Promega)를 유전자 증폭용 주형으로 사용하여 대장균 BL21(DE3)로부터 대장균 유전자를 추출하였다. NCBI 데이터베이스로부터 대장균 NIFe 수소화효소 1 오페론 염기서열을 수득하고 전 hya 오페론 수득을 위한 프라이머를 설계하였다: forward - AAG AGG TAT ATA TTA ATG AAT AAC GAG GAA ACA TTT TAC CAG G, reverse - TTA CGT CGG TGC AGC TTC GGC CAG CCA CTG. PCR 후 증폭된 DNA 조각을 pGem-T easy vector (Promega)에 클로닝하고 도 1의 과정을 거쳐 발현 벡터를 제조하였다.
실시예 2: 대장균에서 재조합 수소화효소의 발현 및 수소생산
상기 수득된 벡터를 대장균에 삽입하고, 형질전환된 대장균 BL21 균주를 M9CA 배지 (Na2HPO4 6 g, KH2PO4 3 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0.5 g, 카사미노산 5 g, 티아민 1 mg/l, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2으로 보충)가 담긴 125 ml serum bottle에 배양하였다. 균 접종 후 3시간이 지난 후, 1mM의 IPTG로 유도(induction)하였으며, 야생형(WT)과 수소 생산을 비교하였다.
비교결과는 도 2에 나타내었으며, 수소의 정량화는 고무마개로 밀봉된 serum bottle의 상단 기체부분으로부터 기밀 주사기(gas tight syringe)를 이용하여 채집된 기체를 기체 크로마토그래피(GC)를 이용하여 분석하였다. 생산된 수소량의 정 량화는 1% H2 표준 기체 (Scott사)를 이용하여 표준 기체의 피크 면적에 대한 표준 곡선을 얻은 후 시료별 GC에 의한 수소 피크의 면적 값으로부터 환산하였다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 수소 생산능력이 없는 야생형 대장균 BL21 균주가 hyaA 및 hyaB 유전자로 형질전환시 호기 환경에서 수소를 생산하였으며, 이는 혐기 환경에서만 수소를 생산하는 대장균 W3110 등에 비해 세포 생장 측면에서 대단히 유리한 장점을 지닌다.
실시예 3: 금속 이온의 영향
실시예 2와 동일한 과정을 거치되, 수소 생산에 대한 Fe 및/또는 Ni의 영향을 확인하기 위해 0.1 M의 FeSO4 및/또는 1 M NiCl2를 첨가하였고, 각 금속 이온의 최종 농도와 함께 수소 생산량을 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 수소 생산은 Fe와 Ni 모두 존재하는 경우 가장 활발하게 이루어졌으며, 이 때 Fe와 Ni의 농도는 10 μM 이상인 것이 바람직한 것으로 나타났다.
실시예 4: 포름산염의 영향
실시예 2와 동일한 과정을 거치되, 수소 생산에 대한 포름산염의 영향을 확인하기 위해, 배양 후 6 시간 경과시점에 포름산염을 첨가 (최종 농도 10 mM)하였다. 도 4에 도시된 바와 같이 야생형 대장균 BL21은 포름산염의 첨가와 무관하게 수소가 발생하지 않았으나, 형질전환되면 수소가 발생하고, 그 발생량은 포름산염의 첨가에 의해 월등히 증가하는 것을 확인할 수 있다.
그리고, 이상의 실험으로부터 종래 수소를 기질로만 사용한다고 알려져 있던 대장균의 NIFe 수소화효소 1의 수소 생산능을 확인할 수 있었다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.
도 1은 본 발명의 수소화효소를 대장균에서 발현하기 위한 벡터 개요도를 나타낸다.
도 2는 야생형 대장균 BL21과 형질전환된 대장균 BL21의 수소 생산능을 비교한 그래프이다.
도 3은 금속 이온이 수소 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 포름산염이 수소 생산에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 대장균에서 수소를 생산하는 방법으로서,
    대장균 NiFe 수소화효소 1 오페론(Escherichia coli NiFe hydrogenase 1 operon) 중 hyaA 및 hyaB 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 대장균을 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 대장균을 Ni, Fe 및 포름산염(formate)을 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계;
    를 포함하는 수소생산방법.
  6. 삭제
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