KR101110175B1

KR101110175B1 - 스피라마이신의 생합성에 관여하는 폴리펩티드, 이들폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101110175B1
Application number: KR1020057006111A
Authority: KR
Inventors: 마리 헬렌 브롱델레-라우올; 헬렌 도밍게즈; 엠마뉘엘 다르봉-롱제르; 클로드 제르보; 안느 곤드랑; 파트마 카레이; 파트리샤 라크로아; 나탈리 오스트리셔-메르메-부비에르; 장-뤽 뻬르노데; 카린 투필
Original assignee: 쌩뜨레 나티오날 데 라 르세르쉬 생띠끄 (씨. 엔. 알. 에스); 아방티 파르마 소시에테 아노님
Priority date: 2002-10-08
Filing date: 2003-10-08
Publication date: 2012-07-18
Also published as: WO2004033689A3; BR0314543A; IL167854A; WO2004033689A2; BRPI0314543B1; NO20052160L; NO335995B1; AU2003300479A1; BRPI0314543B8; KR20050084843A; AU2003300479B2; JP5042497B2; CA2501445A1; CA2501445C; EP1551975A2; MXPA05002852A; JP2006501863A

Abstract

본 발명은 스피라마이신에 대한 생합성 경로의 신규한 유전자의 분리와 동정, 및 이러한 생합성에 관여하는 신규한 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이들 폴리펩티드의 생성 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 스피라마이신의 생성 수준을 증가시키고, 생성된 스피라마이신의 순도를 증가시킬 목적으로 상기 유전자를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스피라마이신 I은 생산하지만, 스피라마이신 II와 III은 생산하지 않는 미생물, 및 이러한 미생물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 신규한 항생제를 합성할 수 있게 하거나 또는 유도된 형태의 스피라마이신을 생성시킬 수 있는 돌연변이체를 작제하기 위한, 스피라마이신에 대한 생합성 경로의 유전자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이들 유전자의 발현을 통하여 생성된 분자에 관한 것이고, 이러한 유전자의 발현을 통하여 생성된 분자의 약리학적 활성 조성물에 관한 것이다.

스피라마이신, 스트렙토마이세스 속 균주, 매크롤리드, 항생제, 스트렙토마이세스 암보파시엔스

Description

스피라마이신의 생합성에 관여하는 폴리펩티드, 이들 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 이의 용도{Polypeptides involved in spiramycin biosynthesis, nucleotide sequences encoding said polypeptides and uses thereof}

본 발명은 스피라마이신(spiramycin)에 대한 생합성 경로의 신규한 유전자의 분리와 동정, 및 이러한 생합성에 관여하는 신규한 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 스피라마이신의 생성 수준을 증가시키고, 생성된 스피라마이신의 순도를 증가시킬 목적으로 상기 유전자를 사용하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 신규한 항생제를 합성할 수 있게 하거나 유도된 형태의 스피라마이신을 생성시킬 수 있는 돌연변이체를 작제하기 위한 상기 유전자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이들 유전자의 발현을 통하여 생성된 분자에 관한 것이고, 최종적으로는 이러한 유전자의 발현을 통하여 생성된 분자의 약리학적 활성 조성물에 관한 것이다.

스트렙토마이세스(Streptomyces)는 그람-양성 사상 토양 세균(gram-positive filamentous soil baterium)이다. 이들 세균은 이들이 분비하는 상당히 광범위한 분해성 효소로 인해 유기 물질의 분해와 광화 작용(mineralization)에 있어 중요한 역할을 한다. 이들은 특별히 다양한 화학 구조와 생물학적 활성을 지닌 2차 대사물 생성을 특징으로 하는 대사적 분화를 수반하는, 원핵생물에서 독특한 형태학적 분화 현상을 나타낸다. 이들 대사물로는 특히, 세균 스트렙토마이세스 암보파시엔스(Streptomyces ambofaciens)에 의해 천연적으로 생산되는 스피라마이신이 있다.

스피라마이신은 수의학 분야와 인체 의학 분야 모두에 사용되는 매크롤리드(macrolide) 계열의 항생제이다. 매크롤리드는 1개 이상의 당이 접목된 락톤 환의 존재를 특징으로 한다. 스트렙토마이세스 암보파시엔스는 본래, 스피라마이신 I, II 및 III(도 1 참조)을 생산하지만; 스피라마이신 I의 항생제 활성이 스피라마이신 II 및 III 보다 훨신 더 크다[참조: Liu et al., 1990]. 스피라마이신 I 분자는 플라테놀리드(platenolide)로 불리우는 락톤계 매크로사이클과, 3개의 당, 즉 포로사민, 미카미노스 및 미카로스 로 이루어진다(도 1 참조). 스피라마이신의 항생제 활성은, 이러한 항생제가 세균성 리보솜에 결합하는 것에 관여하는 기전을 통하여 원핵생물에서 단백질 합성을 억제하는 것에 기인한다.

매크롤리드 계열의 구성원이고 락톤 환을 보유하기도 하는 특정 화합물은 항생제 분야 이외에서도 사용된다. 따라서, 생성물 FK506은 면역억제 효과를 지니고 있으며, 기관 이식 분야와 류마티스성 관절염 분야에 치료학적으로 적용될 전망이며, 보다 일반적으로는, 자가면역 반응과 관련된 병리학적 질환에 치료학적으로 적 용될 전망이다. 기타 매크롤리드, 예를 들면, 아베르멕틴(avermectin)은 살곤충 활성과 구충 활성을 지닌다.

현재까지, 각종 부류에 속하는 항생제와 기타 2차 대사물에 관한 많은 생합성 경로(참조: K, Chater, 1990)가 스트렙토마이세스에서 이미 연구되었다. 그러나, 스피라마이신에 대한 생합성 경로에 관해서는 극히 부분적인 지식만이 지금까지 알려져 있다.

스피라마이신 생합성은 많은 단계를 포함하고 많은 효소들이 관여하는 복잡한 과정이다[참조: Omura et al., 1979a, Omura et al., 1979b]. 스피라마이신은 토양에서 발견되는 미생물들 중에 특히 풍부한 복합 분자를 포함하는 큰 부류의 폴리케티드(polyketide)에 속한다. 이들 분자는 이들의 구조적 유사상에 근거하여 분류되는 것이 아니라, 이들의 생합성 경로 단계 상의 특정의 유사성에 근거하여 분류된다. 구체적으로 언급하면, 폴리케티드는 복합적인 연속 반응에 의해 생성되는데, 이러한 반응은 "폴리케티드 신타제"(PKS)로 불리우는 한 가지 이상의 효소에 의해 촉매된 일련의 반응들이 이의 생합성 경로에 존재한다는 공통점을 가진다. 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서는, 스피라마이신의 락톤계 매크로사이클(플라테놀리드)의 생합성이 5개의 PKS 유전자에 의해 암호화된 일련의 8개 모듈(module)에 의해 수행된다[참조: S. Kuhstoss, 1996, 미국 특허 제5,945,320호]. 스피라마이신은 이러한 락톤 환으로부터 수득된다. 그러나, 당 합성에 관여하고, 이를 락톤 환에 부착시키고 이러한 환을 변형시켜 스피라마이신을 수득하도록 하는데 관여하는 각종 효소와 단계는 오늘날까지 여전히 공지되어 있지 않다.

미국 특허 제5,514,544호에는 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 srmR로 지칭된 서열을 클로닝하는 것에 관해 기재되어 있다. 상기 특허에서는, srmR 유전자가 매크롤리드 생합성에 관여하는 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 암호화한다는 가설이 제안되었다.

1987년에, 리차드슨(Richardson) 등은 에스. 암보파시엔스(S. ambofaciens)의 스피라마이신 내성이 적어도 3가지 유전자, 즉 srmA, srmB 및 srmC로 지칭된 유전자에 의해 부여된다는 사실을 밝혀내었다[참조: Richardson et al., 1987]. 미국 특허 제4,886,757호에는 srmC 유전자를 함유하는 에스. 암보파시엔스의 DNA 단편의 성상 확인이 보다 특별히 기재되어 있다. 그러나, 이러한 유전자의 서열은 기재되지 않았다. 1990년에, 리차드슨 등은 srmB 에 근접한 스피라마이신 생합성을 위한 유전자가 3가지 존재한다는 가설을 제시하였다[참조: Richardson et al., 1990]. 미국 특허 제5,098,837호에는 스피라마이신 생합성에 잠재적으로 관여하는 5가지 유전자의 클로닝에 관해 보고되었다. 이들 유전자는 srmD, srmE, srmF, srmG 및 srmH으로 지칭되었다.

스피라마이신과 같은 화합물을 제조하는데 있어서 가장 곤란한 점 중의 하나는 비교적 소량의 생성물을 제조하기 위해서도 매우 큰 발효 용적이 필요하다는 사실이다. 따라서, 이러한 분자의 생산 비용을 줄이기 위해서는 이의 생산 효율을 증대시킬 수 있도록 하는 것이 요망된다.

스피라마이신에 대한 생합성 경로는 복잡한 과정이고, 이러한 과정 중에 존재할 수도 있는 기생(parasitic) 반응을 동정 및 제거하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 조작의 목적은 보다 순수한 항생제를 수득하고/하거나 생산성을 향상시키는 것이다. 이러한 측면에서, 스트렙토마이세스 암보파시엔스는 본래, 스피라마이신 I, II 및 III(도 1 참조)을 생산하지만; 스피라마이신 I의 항생제 활성이 스피라마이신 II 및 III 보다 훨신 더 크다[참조: Liu et al., 1990]. 따라서, 스피라마이신 I 만을 생산하는 균주를 갖는 것이 바람직할 것이다.

매크롤리드 항생제의 상업적 가치 때문에, 신규한 유도체, 특히 유리한 특성을 지닌 스피라마이신의 동족체를 생성시키고자 하는 연구가 집중적으로 수행되고 있다. 특히 스피라마이신-유도된 하이브리드 항생제를 제조할 목적으로, 스피라마이신 또는 스피라마이신 유도체에 대한 생합성 경로의 생합성 중간체를 충분한 양으로 생성시킬 수 있는 것이 바람직할 것이다.

발명의 일반적인 설명

본 발명은 스피라마이신 생합성에 관여하는 생성물을 생성시키는 유전자를 클로닝함으로써 비롯된 것이다. 본 발명은 무엇 보다도, 스피라마이신에 대한 생합성 경로의 신규한 유전자, 및 이러한 생합성에 관여하는 신규한 폴리펩티드에 관한 것이다.

상기 생합성 경로의 유전자와 이와 연관된 암호화 서열을 클로닝하고, 각 클론의 DNA 서열을 결정하였다. 이와 같이 클로닝된 암호화 서열은 orf1*c, orf2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*, orf6*, orf7*c, orf8*, orf9*, orf10*, orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orf9c, orf10, orf11c, orf12, orf13c, orf14, orf15c, orf16, orf17, orf18, orf19, orf20, orf21c, orf22c, orf23c, orf24c, orf25c, orf26, orf27, orf28c, orf29, orf30c, orf31, orf32c, orf33 및 orf34c로 명명될 것이다. 스피라마이신에 대한 생합성 경로에 있어서 이들 서열에 의해 암호화된 단백질의 기능은 다음 토의에서 전개되며, 이는 도 4, 5, 6 및 8로써 예시된다.

1) 본 발명의 제1 주제는 스피라마이신 생합성에 관여하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:

(a) 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 및 149의 서열들 중의 하나,

(b) 서열 (a)의 변이체로 이루어진 서열들 중의 하나,

(c) 유전 암호 축퇴성(degeneracy)으로 인해 서열 (a) 및 (b)로부터 유도된 서열 중의 하나.

2) 본 발명의 주제는 또한, 고도로 엄격한 하이브리드화 조건 하에서, 상기 1)에 따르는 폴리뉴클레오티드 중의 하나 이상과 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드이다.

3) 본 발명은 또한, 상기 단락 1)에 따르는 폴리뉴클레오티드의 10, 12, 15, 18, 20 내지 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 또는 1900개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 뉴클레오티드 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

4) 본 발명은 또한, 스트렙토마이세스 속(genus) 세균으로부터 분리되는, 상기 단락 2) 또는 3)에 따르는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

5) 본 발명은 또한, 매크롤리드의 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하는, 상기 단락 2), 3) 또는 4)에 따르는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

6) 본 발명은 또한, 당해 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화되거나 또는 당해 폴리뉴클레오티와 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질과 유사한 활성을 지닌 단백질을 암호화하는, 상기 단락 2), 3) 또는 4)에 따르는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

7) 본 발명은 또한, 상기 단락 1), 2), 3), 4), 5) 또는 6)에 따르는 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 생성된 폴리펩티드에 관한 것이다.

8) 본 발명의 또 다른 국면은 스피라마이신 생합성에 관여하는 폴리펩티드에 관한 것이며, 이러한 폴리펩티드의 서열은 다음과 같다:

(a) 서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 및 150의 서열들 중의 하나,

(b) 상기 서열 (a) 전반에 걸쳐, 이러한 서열의 기능적 특성에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 1개 이상의 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실된 것을 제외하고는, 상기 (a)에 규정된 바와 같은 서열들 중의 하나,

(c) 서열 (a) 및 (b)의 변이체로 이루어진 서열들 중의 하나.

9) 본 발명의 또 다른 주제는 상기 단락 8)에 따르는 폴리펩티드의 10, 15, 20, 30 내지 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 또는 640개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 아미노산 동일성을 나타내는 폴리펩티드에 관한 것이다.

10) 본 발명의 또 다른 국면은 스트렙토마이세스 속 세균으로부터 분리되는, 상기 단락 9)에 따르는 폴리펩티드에 관한 것이다.

11) 본 발명의 또 다른 국면은 매크롤리드의 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하는, 상기 단락 9) 또는 10)에 따르는 폴리펩티드에 관한 것이다.

12) 본 발명의 또 다른 국면은 동일성을 공유하고 있는 폴리펩티드와 유사한 활성을 지니고 있는, 상기 단락 9), 10) 또는 11)에 따르는 폴리펩티드에 관한 것이다.

13) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 단락 1), 2), 3), 4), 5) 및 6) 중의 하나에 따르는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA에 관한 것이다.

14) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 재조합 DNA가 벡터 내에 포함되어 있는, 상기 단락 13)에 따르는 재조합 DNA에 관한 것이다.

15) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 벡터가 박테리오파아지, 플라스미드, 파아지미드, 통합(integrative) 벡터, 포스미드, 코스미드, 셔틀 벡터, BAC 및 PAC 중에서 선택되는, 상기 단락 14)에 따르는 재조합 DNA에 관한 것이다.

16) 본 발명의 또 다른 국면은 pOS49.1, pOS49.11, pOSC49.12, pOS49.14, pOS49.16, pOS49.28, pOS44.1, pOS44.2, pOS44.4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, pOS49.88, pOS49.106, pOS49.120, pOS49.107, pOS49.32, pOS49.43, pOS49.44, pOS49.50, pOS49.99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPM1, pBXL1111, pBXL1112, pBXL1113, pSPM520, pSPM521, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51,pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74, pSPM75, pSPM79, pSPM83, pSPM107, pSPM543 및 pSPM106 중에서 선택되는, 상기 단락 15)에 따르는 재조합 DNA에 관한 것이다.

17) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 단락 7), 8), 9), 10), 11) 또는 12)에 따르는 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

18) 본 발명은 또한, 적합한 발현 벡터와, 상기 단락 7), 8), 9), 10), 11) 또는 12)에 따르는 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 허용해 주는 숙주 세포를 포 함하는 발현 시스템에 관한 것이다.

19) 본 발명은 또한, 원핵성 발현 시스템과 진핵성 발현 시스템 중에서 선택되는, 상기 단락 18)에 따르는 발현 시스템에 관한 것이다.

20) 본 발명은 또한, 이. 콜라이(E. coli) 세균에서의 발현 시스템, 곤충 세포에서의 발현을 허용해주는 바쿨로바이러스(baculovirus) 발현 시스템, 효모 세포에서의 발현을 허용해주는 발현 시스템, 및 포유류 세포에서의 발현을 허용해주는 발현 시스템 중에서 선택되는, 상기 단락 19)에 따르는 발현 시스템에 관한 것이다.

21) 본 발명은 또한, 상기 단락 1), 2), 3), 4), 5), 6), 13), 14), 15), 16) 및 17) 중의 하나에 따르는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 재조합 DNA 및/또는 하나 이상의 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다.

22) a) 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 적합한 벡터 내로 삽입하는 단계;

b) 단계 a)의 벡터로 미리 형질전환 또는 형질감염시킨 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;

c) 이와 같이 조건화된 배양 배지 또는 세포 추출물을 회수하는 단계;

d) 단계 c)에서 수득된 세포 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 폴리펩티드를 분리 및 정제하는 단계;

e) 경우에 따라, 이로써 생성된 재조합 폴리펩티드를 성상 확인하는 단계

를 포함하는, 상기 단락 7), 8), 9), 10), 11) 또는 12)에 따르는 폴리펩티 드의 생성 방법에 관한 것이다.

23) 본 발명의 또 다른 국면은 하나 이상의 매크롤리드에 대한 생합성 경로의 특정 단계에서 차단된 미생물에 관한 것이다.

24) 본 발명의 또 다른 국면은 이들 매크롤리드를 생산하는 미생물에서 상기 매크롤리드의 생합성에 관여하는 하나 이상의 단백질의 기능을 불활성화시킴으로써 수득되는, 상기 단락 23)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

25) 본 발명의 또 다른 국면은 이들 단백질을 불활성화시키는 것이, 상기 단백질을 암호화하는 유전자에서 돌연변이 유발시키거나 또는 상기 단백질을 암호화하는 메신저 RNA에 상보적인 하나 이상의 안티센스 RNA를 발현시킴으로써 수행되는, 상기 단락 24)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

26) 본 발명의 또 다른 국면은 이들 단백질을 불활성화시키는 것이, 방사선조사를 통하여 돌연변이 유발시키거나, 돌연변이 유발성 화학 제제를 작용시키거나, 부위-지시된 돌연변이 유발시키거나, 또는 유전자 대체시킴으로써 수행되는, 상기 단락 25)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

27) 본 발명의 또 다른 국면은 돌연변이 유발시키는 것이, 시험관내 또는 원위치에서, 고려 중인 유전자 내의 하나 이상의 염기를 억제, 치환, 결실 및/또는 부가시키거나 또는 유전자 불활성화시킴으로써 수행되는, 상기 25) 또는 26)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

28) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 미생물이 스트렙토마이세스 속 세균인, 상기 단락 23), 24), 25), 26) 또는 27)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

29) 본 발명의 또 다른 국면은 매크롤리드가 스피라마이신인, 상기 단락 23), 24), 25), 26), 27) 또는 28)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

30) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 미생물이 에스. 암보파시엔스 균주인, 상기 단락 23), 24), 25), 26), 27), 28) 또는 29)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

31) 본 발명의 또 다른 국면은 돌연변이 유발이 상기 단락 1), 2), 3), 4), 5) 및 6) 중의 하나에 따르는 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자에서 수행되는, 상기 단락 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29) 또는 30)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

32) 본 발명의 또 다른 국면은 돌연변이 유발이 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 및 149의 서열들 중의 하나 이상에 상응하는 서열들 중의 하나를 포함하는 하나 이상의 유전자에서 수행되는, 상기 단락 25), 26), 27), 28), 29), 30) 또는 31)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

33) 본 발명의 또 다른 국면은 돌연변이 유발이 서열 번호 13에 상응하는 서열을 포함하는 유전자를 유전자 불활성화시키는 것으로 이루어지는, 상기 단락 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31) 또는 32)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

34) 본 발명의 또 다른 국면은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures and Microorganisms]) (CNCM)에 등록 번호 I-2909, I-2911, I-2912, I-2913, I-2914, I-2915, I-2916 또는 I-2917로 기탁된 균주들 중의 하나로부터 선택된 균주인 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주에 관한 것이다.

35) 본 발명의 또 다른 국면은

a) 상기 단락 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31), 32), 33) 또는 34) 중의 하나에 따르는 미생물을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;

b) 이와 같이 조건화된 배양 배지 또는 세포 추출물을 회수하는 단계;

c) 단계 b)에서 수득된 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 매크롤리드 생합성 중간체를 분리 및 정제하는 단계

를 포함하는, 상기 매크롤리드 생합성 중간체의 제조 방법에 관한 것이다.

36) 본 발명의 또 다른 국면은 생합성 중간체를 상기 단락 35)의 방법에 따라서 제조하고, 이로써 제조된 중간체를 변형시키는, 매크롤리드로부터 유도된 분자의 제조 방법에 관한 것이다.

37) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 중간체가 화학적, 생화학적, 효소적 및/또는 미생물적으로 변형되는, 상기 단락 36)에 따르는 제조 방법에 관한 것이다.

38) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 중간체를 기질로서 사용함으로써 이러한 중간체를 변형시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 상기 미생물 내로 도입하는, 상기 단락 36) 또는 37)에 따르는 제조 방법에 관한 것이다.

39) 본 발명의 또 다른 국면은 매크롤리드가 스피라마이신인, 상기 단락 36), 37) 또는 38)에 따르는 제조 방법에 관한 것이다.

40) 본 발명의 또 다른 국면은 사용된 미생물이 에스. 암보파시엔스의 균주인, 상기 단락 36), 37), 38) 또는 39)에 따르는 제조 방법에 관한 것이다.

41) 본 발명의 또 다른 국면은 스피라마이신 I은 생산하지만, 스피라마이신 II와 III은 생산하지 않는 미생물에 관한 것이다.

42) 본 발명의 또 다른 국면은 스피라마이신 I의 생합성에 요구되는 유전자 모두를 포함하긴 하지만, 서열 번호 13의 서열 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하고 서열 번호 14의 폴리펩티드 또는 이의 변이체들 중의 하나를 암호화하는 유전자는 발현되지 않거나 또는 이를 불활성으로 만든, 상기 단락 41)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

43) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 불활성화가, 상기 단백질을 암호화하는 유전자에서 돌연변이 유발시키거나 또는 상기 단백질을 암호화하는 메신저 RNA에 상보적인 안티센스 RNA를 발현시킴으로써 수행되는, 상기 단락 42)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

44) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 돌연변이 유발이, 상기 유전자의 프로모터, 암호화 서열 또는 비-암호화 서열에서 수행되어, 암호화된 단백질을 불활성으로 만들거나, 또는 이의 발현이나 이로부터의 해독을 방지시키도록 하는, 상기 단락 43)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

45) 본 발명의 또 다른 국면은 돌연변이 유발이, 방사선조사, 돌연변이 유발성 화학 제제의 작용, 부위-지시된 돌연변이 유발 또는 유전자 대체에 의해 수행되는, 상기 단락 43) 또는 44)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

46) 본 발명의 또 다른 국면은 돌연변이 유발이, 시험관내 또는 원위치에서, 고려 중인 유전자 내의 하나 이상의 염기를 억제, 치환, 결실 및/또는 부가시키거나 또는 유전자 불활성화시킴으로써 수행되는, 상기 단락 43), 44) 또는 45)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

47) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 미생물이, 스피라마이신에 대한 생합성 경로의 유전자를 발현시킴으로써 수득되는데, 이들 유전자가 서열 번호 13에 상응하는 서열 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하고 서열 번호 14의 폴리펩티드 또는 이의 변이체들 중의 하나를 암호화하는 유전자는 포함하지 않는, 상기 단락 41) 또는 42)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

48) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 미생물이 스트렙토마이세스 속 세균인, 상기 단락 41), 42), 43), 44), 45), 46) 또는 47)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

49) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 미생물이 스피라마이신 I, II 및 III을 생산하는 출발 균주로부터 수득되는, 상기 단락 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47) 또는 48)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

50) 본 발명의 또 다른 국면은 서열 번호 13에 상응하는 서열 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하고 서열 번호 14의 폴리펩티드 또는 동일한 기능을 갖는 이의 변이체 들 중의 하나를 암호화하는 유전자 내에서 돌연변이 유발시킴으로써 수득되는, 상기 단락 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48) 또는 49)에 따르는 미생물 에 관한 것이다.

51) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 미생물이 서열 번호 13에 상응하는 서열 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하는 유전자의 유전자 불활성화가 수행되는, 스피라마이신 I, II 및 III을 생산하는 에스. 암보파시엔스 균주로부터 수득되는, 상기 단락 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49) 또는 50)에 따르는 미생물에 관한 것이다.

52) 본 발명의 또 다른 국면은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)(CNCM)에 등록 번호 I-2910으로 기탁된 균주인 에스. 암보파시엔스 균주에 관한 것이다.

53) 본 발명의 또 다른 국면은

a) 상기 단락 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49), 50), 51) 및 52) 중의 하나에 따르는 미생물을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;

c) 단계 b)에서 수득된 세포 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 스피라마이신 I을 분리 및 정제하는 단계

를 포함하는, 스피라마이신 I의 생성 방법에 관한 것이다.

54) 본 발명의 또 다른 국면은 미생물의 매크롤리드 생산을 향상시키기 위한, 상기 단락 1), 2), 3), 4), 5) 및 6) 중의 하나에 따르는 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.

55) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 단락 1), 2), 3), 4), 5) 또는 6) 중의 하나에 따르는 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자에서 유전자 변형을 지니고 있고, 상기 단락 1), 2), 3), 4), 5) 및 6) 중의 하나에 따르는 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자를 과발현하는, 매크롤리드-생산 돌연변이체 미생물에 관한 것이다.

56) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 유전자 변형이, 보다 큰 활성을 지닌 하나 이상의 단백질을 발현시키거나 또는 이들 단백질을 보다 높은 수준으로 발현시킬 목적으로, 고려 중인 유전자 내의 하나 이상의 염기를 억제, 치환, 결실 및/또는 부가시키는 것으로 이루어지는, 상기 단락 55)에 따르는 돌연변이체 미생물에 관한 것이다.

57) 본 발명의 또 다른 국면은 고려 중인 유전자의 과발현이, 이러한 유전자에 대한 복사물 수를 증가시키고/시키거나 야생형 프로모터 보다 더 활성인 프로모터를 도입함으로써 획득되는, 상기 단락 55)에 따르는 돌연변이체 미생물에 관한 것이다.

58) 본 발명의 또 다른 국면은 고려 중인 유전자의 과발현이, 매크롤리드-생산 미생물을 상기 단락 13), 14) 또는 17)에 따르는 재조합 DNA 작제물로 형질전환시켜 상기 유전자의 과발현을 허용함으로써 획득되는, 상기 단락 55) 또는 57)에 따르는 돌연변이체 미생물에 관한 것이다.

59) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 유전자 변형이, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 및 149 중의 하나 이상의 서열에 상응하는 서열들 중의 하나, 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하는 하나 이상의 유전자에서 수행되는, 상기 단락 55), 56), 57) 또는 58)에 따르는 돌연변이체 미생물에 관한 것이다.

60) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 미생물이, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 및 149 중의 하나 이상의 서열에 상응하는 서열들 중의 하나, 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하는 하나 이상의 유전자를 과발현하는, 상기 단락 55), 56), 57), 58) 또는 59)에 따르는 돌연변이체 미생물에 관한 것이다.

61) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 미생물이 스트렙토마이세스 속 세균인, 상기 단락 55), 56), 57), 58), 59) 또는 60)에 따르는 돌연변이체 미생물에 관한 것이다.

62) 본 발명의 또 다른 국면은 매크롤리드가 스피라마이신인, 상기 단락 55), 56), 57), 58), 59), 60) 또는 61)에 따르는 돌연변이체 미생물에 관한 것이다.

63) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 미생물이 에스. 암보파시엔스 균주인, 상기 단락 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61) 또는 62)에 따르는 돌연변이체 미생물에 관한 것이다.

64) 본 발명의 또 다른 국면은

a) 상기 단락 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61), 62), 63) 및 64) 중의 하나에 따르는 미생물을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;

c) 단계 b)에서 수득된 세포 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 생성된 매크롤리드(들)를 분리 및 정제하는 단계

를 포함하는, 상기 매크롤리드의 생성 방법에 관한 것이다.

65) 본 발명의 또 다른 국면은 하이브리드 항생제를 제조하기 위한, 상기 단락 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16) 및 17) 중의 하나에 따르는 서열 및/또는 재조합 DNA 및/또는 벡터의 용도에 관한 것이다.

66) 본 발명의 또 다른 국면은 한 가지 이상의 생체전환(bioconversion)을 수행하기 위한, 상기 단락 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16), 17) 및 21) 중의 하나에 따르는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 재조합 DNA 및/또는 하나 이상의 발현 벡터 및/또는 하나 이상의 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.

67) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 단락 1), 2), 3), 4), 5) 또는 6)에 따르는 폴리뉴클레오티드 중의 하나에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

68) 본 발명의 또 다른 국면은

- 다음 서열의 프라이머 쌍:

5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3'(서열 번호 138) 및

5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3'(서열 번호 139)

를 이용하고, 매트릭스로서 코스미드 pSPM36 또는 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 총 DNA를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득될 수 있는 유전자, 또는

- 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 유전자

를 과발현하는, 하나 이상의 스피라마이신을 생산하는 미생물에 관한 것이다.

69) 본 발명의 또 다른 국면은 스트렙토마이세스 속 세균인, 단락 68 또는 90에 따르는 미생물에 관한 것이다.

70) 본 발명의 또 다른 국면은 스트렙토마이세스 암보파시엔스 종 세균인, 단락 68, 69 또는 90에 따르는 미생물에 관한 것이다.

71) 본 발명의 또 다른 국면은 상기 유전자의 과발현이, 해당 미생물을 발현 벡터로 형질전환시킴으로써 수득되는, 단락 68, 69, 70 또는 90에 따르는 미생물에 관한 것이다.

72) 본 발명의 또 다른 국면은 2003년 10월 6일자로 기탁 기관{Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)[National Collection of Cultures and Microorganisms] Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France}에 등록 번호 I-3101로 기탁된 균주 OSC2/pSPM75(1) 또는 균주 OSC2/pSPM75(2)인, 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주에 관한 것이다.

73) 본 발명의 또 다른 국면은

- 다음 서열의 프라이머 쌍:

5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3'(서열 번호 138) 및

5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3'(서열 번호 139)

를 이용하고, 매트릭스로서 코스미드 pSPM36 또는 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 총 DNA를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 수득될 수 있는 폴리뉴클레오티드; 또는

- 이러한 폴리뉴클레오티드의 10, 12, 15, 18, 20 내지 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490 또는 1500개 이상의 연속되는 뉴클레오티드의 단편

을 포함하는 재조합 DNA에 관한 것이다.

74) 본 발명의 또 다른 국면은 벡터인, 단락 73 또는 91에 따르는 재조합 DNA에 관한 것이다.

75) 본 발명의 또 다른 국면은 발현 벡터인, 단락 73, 74 또는 91에 따르는 재조합 DNA에 관한 것이다.

76) 본 발명의 또 다른 국면은 단락 73, 74, 75 및 91 중의 하나에 따르는 하나 이상의 재조합 DNA를 도입시킨 숙주 세포에 관한 것이다.

77) 본 발명의 또 다른 국면은

a) 단락 75에 따르는 하나 이상의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;

b) 상기 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;

를 포함하는, 폴리펩티드의 생성 방법에 관한 것이다.

78) 본 발명의 또 다른 국면은 유전자 불활성화가, 서열 번호 13에 상응하는 서열 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하는 유전자 또는 이의 일부를 동위상(in-phase) 결실시킴으로써 수행되는, 단락 51에 따르는 미생물에 관한 것이다.

79) 본 발명의 또 다른 국면은

- 다음 서열의 프라이머 쌍:

5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3'(서열 번호 138) 및

5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3'(서열 번호 139)

를 이용하고, 매트릭스로서 코스미드 pSPM36 또는 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 총 DNA를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 수득될 수 있는 유전자, 또는

- 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 유전자

를 과발현하기도 하는, 단락 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 및 78 중의 하나에 따르는 미생물에 관한 것이다.

80) 본 발명의 또 다른 국면은 서열 번호 47의 폴리뉴클레오티드 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 폴리뉴클레오티드가, 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용해 주는 프로모터의 제어 하에 위치되어 있는 발현 벡터에 관한 것이다.

81) 본 발명의 또 다른 국면은 플라스미드 pSPM524 또는 pSPM525인, 단락 80에 따르는 발현 벡터에 관한 것이다.

82) 본 발명의 또 다른 국면은 단락 80 또는 81에 따르는 벡터로 형질전환시킨 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주에 관한 것이다.

83) 본 발명의 또 다른 국면은 서열 번호 47의 암호화 서열 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 암호화 서열을 갖는 유전자를 과발현하기도 하는, 단락 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 78, 79 및 92 중의 하나에 따르는 미생물에 관한 것이다.

84) 본 발명의 또 다른 국면은 2003년 2월 26일자로 기탁 기관{Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25 rue duDocteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France}에 등록 번호 I-2977로 기탁된 균주 SPM502 pSPM525인, 단락 83에 따르는 미생물에 관한 것이다.

85) 본 발명의 또 다른 국면은

a) 단락 68, 69, 70, 71, 72, 78, 79, 82, 83, 84, 90 및 92 중의 하나에 따르는 미생물을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;

c) 단계 b)에서 수득된 세포 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 스피라마이신을 분리 및 정제하는 단계

를 포함하는, 상기 스피라마이신(들)의 생성 방법에 관한 것이다.

86) 본 발명의 또 다른 국면은 서열 번호 112 또는 서열 번호 142의 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

87) 본 발명의 또 다른 국면은

- 다음 서열의 프라이머 쌍:

5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3'(서열 번호 138) 및

5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3'(서열 번호 139)

를 이용하고, 매트릭스로서 코스미드 pSPM36 또는 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 총 DNA를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득될 수 있는 유전자의 암호화 서열, 또는

- 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 유전자의 암호화 서열

로부터 해독된 서열에 상응하는 서열을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

88) 본 발명의 또 다른 국면은 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 단락 86, 87 또는 93에 따르는 폴리펩티드의 발현을 허용해 주는 발현 벡터에 관한 것이다.

89) 본 발명의 또 다른 국면은 플라스미드 pSPM75인, 단락 88에 따르는 발현 벡터에 관한 것이다.

90) 본 발명의 또 다른 국면은 폴리머라제 연쇄 증폭에 의해 수득될 수 있는 유전자가 서열 번호 141의 암호화 서열의 유전자, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 유전자인, 단락 68에 따르는 미생물에 관한 것이다.

91) 본 발명의 또 다른 국면은 폴리머라제 연쇄 증폭에 의해 수득될 수 있는 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 141의 폴리뉴클레오티드인, 단락 73에 따르는 재조합 DNA에 관한 것이다.

92) 본 발명의 또 다른 국면은 폴리머라제 연쇄 증폭에 의해 수득될 수 있는 유전자가 서열 번호 141의 암호화 서열의 유전자, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 유전자인, 단락 79에 따르는 미생물에 관한 것이다.

93) 본 발명의 또 다른 국면은 서열 번호 142의 서열로 이루어진 폴리펩티드에 관한 것이다.

일반적인 정의

본 발명의 목적상, 용어 "분리된"이란 본래의 환경(본래 위치하는 환경)으로부터 제거된 생물학적 물질(핵산 또는 단백질)을 의미한다.

예를 들어, 식물 또는 동물에 천연 상태로 존재하는 폴리뉴클레오티드는 분리되지 않은 것이다. 식물 또는 동물의 게놈 내에 천연적으로 삽입되는 인접한 핵산으로부터 격리된 동일한 폴리뉴클레오티드는 "분리된" 것으로 간주된다.

이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 포함될 수 있고/있거나 상기 폴리뉴클레오티드는 조성물 내에 포함될 수 있는데, 그럼에도 불구하고 분리된 상태로 유지될 수 있는 것은, 이러한 벡터 또는 조성물이 이의 본래 환경을 구성하고 있지 않다는 사실 때문이다.

용어 "정제된"이란 해당 물질이 기타 화합물의 존재를 배제한, 절대적으로 순수한 형태로만 존재해야 한다는 것을 의미하지는 않는다. 이는 오히려 상대적인 의미이다.

출발 물질 또는 천연 물질을 1 차수 (order-of-magnitude ) 이상, 바람직하게는 2 또는 3, 우선적으로는 4 또는 5 차수로 정제시킨 후 "정제된" 상태의 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 목적상, 용어 ORF("개방 판독 프레임")는 특히 유전자의 암호화 서열을 의미하기 위해 사용되었다.

본 발명의 목적상, 표현 "뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 또는 핵산에 동등하게 지칭되도록 사용될 수 있다. 표현 "뉴클레오티드 서열"은 유전 물질 그 자체를 포괄하므로, 이의 서열에 관한 정보로 제한되지 않는다.

용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 일본쇄 형태 또는 이중체 형태의, 1개 이상 뉴클레오티드의 RNA, DNA 또는 cDNA 서열, 또는 RNA/DAN 하이브리드 서열을 포괄한다.

용어 "뉴클레오티드"는 천연 뉴클레오티드(A, T, G, C)와, 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들면, (1) 푸린 동족체, (2) 피리미딘 동 족체 또는 (3) 당 동족체 둘 다를 의미하며, 이러한 변형된 뉴클레오티드의 예는 예를 들어, PCT 국제공개공보 WO 95/04064에 기재되어 있다.

본 발명의 목적상, 제1 폴리뉴클레오티드의 각 염기가, 이와 역배향인 제2 폴리뉴클레오티드의 상보적 염기와 쌍을 형성하는 경우에, 이러한 제1 폴리뉴클레오티드는 제2 폴리뉴클레오티드에 "상보적"인 것으로 간주된다. 상보적 염기는 A와 T(또는 A와 U), 또는 C와 G이다.

용어 "스피라마이신에 대한 생합성 경로의 유전자"에는 또한, 조절성 유전자와, 생산자 미생물에 내성을 부여해 주는 유전자가 포함된다.

본 발명에 따르면, 기준 핵산의 "단편"이란 용어는 기준 핵산과 비교해서 보다 짧고, 기준 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 공통 부분 위에 포함하는 뉴클레오티드 서열을 의미할 것이다.

본 발명에 따르면, 이러한 핵산 "단편"은 경우에 따라, 보다 큰 폴리뉴클레오티드 내에 구성분으로 포함될 수도 있다.

상기 단편은 본 발명에 따르는 핵산의 8, 10, 12, 15, 18, 20 내지 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 또는 1900개의 연속되는 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.

본 발명에 따르면, 폴리펩티드의 "단편"이란 용어는 이의 아미노산 서열이 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열 보다 짧고, 이들 기준 폴리펩티드와 공통인 전체 부분 전반에 걸쳐 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미할 것이다.

이러한 단편은 경우에 따라, 이를 일부로 하는 보다 큰 폴리펩티드 내에 포함될 수도 있다.

본 발명에 따르는 폴리펩티드의 상기 단편은 10, 15, 20, 30 내지 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 또는 640개 아미노산 길이일 수 있다.

본 발명의 목적상, "고도로 엄격한 하이브리드화 조건"이란 표현은 비-상동성 핵산 쇄의 하이브리드화에는 바람직하지 못한 하이브리드화 조건을 의미할 것이다. 고도로 엄격한 하이브리드화 조건은, 예를 들어, 하이브리드화 온도 55 내지 65℃, 바람직하게는 하이브리드화 온도 55℃, 보다 더 바람직하게는 하이브리드화 온도 60℃, 가장 바람직하게는 하이브리드화 온도 65℃에서 문헌[참조: Church & Gilbert, 1984]에 기재된 완충액 중에서 하이브리드화시킨 다음, 55 내지 65℃, 바람직하게는 55℃, 보다 더 바람직하게는 60℃, 가장 바람직하게는 65℃에서 2X SSC 완충액(1X SSC 완충액은 0.15M NaCl, 15mM 나트륨 시트레이트의 수용액에 상응한다)에서 1회 이상의 세척을 수행한 다음, 55 내지 65℃, 바람직하게는 55℃, 보다 더 바람직하게는 60℃, 가장 바람직하게는 65℃에서 0.5X SSC 완충액에서 1회 이상 세척하는 조건으로서 서술될 수 있다.

상기 언급된 하이브리드화 조건은 당업자에게 공지된 기술에 따라서, 하이브 리드화하고자 하는 핵산의 길이 또는 선택된 표지화 유형의 함수로서 조정할 수 있다. 적합한 하이브리드화 조건은, 예를 들어, 문헌[참조: F. Ausubel et al (2002)]에 따라서 조정할 수 있다.

본 발명에 따르는 핵산의 "변이체"란 용어는 기준 폴리뉴클레오티드와 비교해서 1개 이상의 염기가 상이한 핵산을 의미할 것이다. 변이체 핵산은 천연 기원, 예를 들면, 천연상 발견되는 대립유전자성 변이체일 수 있거나, 또는 예를 들어, 돌연변이 유발 기술에 의해 수득된 비-천연 변이체일 수도 있다.

일반적으로, 기준 핵산과 변이체 핵산 간의 차이는 작기 때문에, 기준 핵산의 뉴클레오티드 서열과 변이체 핵산의 뉴클레오티드 서열은 매우 유사하고, 많은 영역에 있어 동일하다. 변이체 핵산에 존재하는 뉴클레오티드 변형은 침묵(silent) 변형일 수 있는데, 이는 이러한 변형으로는, 상기 변이체 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열을 변형시키지 못한다는 것을 의미한다.

그러나, 변이체 핵산 상의 뉴클레오티드 변화로 인해, 기준 핵산에 의해 암호화된 펩티드와 비교해서 변이체 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드 내에서 치환, 부가 및/또는 결실이 유발될 수도 있다. 또한, 암호화 영역 상의 뉴클레오티드 변형으로 인해, 아미노산 서열 내에 보존적 또는 비-보존적 치환이 야기될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따르는 변이체 핵산이, 기준 핵산의 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보존하고 있거나 또는 초기 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 능력을 보존하고 있는 폴리펩티드를 암호화한다.

따라서, 몇몇 변이체 핵산은 폴리펩티드의 돌연변이된 형태를 암호화할 것인데, 이에 관한 체계적인 연구는 문제의 단백질의 구조-활성 관계를 추론할 수 있게 해줄 것이다.

본 발명에 따르는 폴리펩티드의 "변이체"란 용어는 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교해서, 1개 이상의 아미노산 잔기의 한 가지 이상의 치환, 부가 또는 결실을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 주로 의미할 것인데, 이러한 아미노산 치환은 차별 없이 보존적 또는 비-보존적일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따르는 변이체 폴리펩티드가, 기준 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보존하고 있거나 또는 초기 폴리펩티드에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 능력을 보존하고 있다.

본 발명의 목적상, 기준 폴리펩티드와 "유사한 활성"을 지닌 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정하는데 적합한 생물학적 검정으로 측정된 바와 같이, 기준 폴리펩티드의 생물학적 활성과 유사하긴 하지만, 반드시 동일할 필요는 없는 생물학적 활성을 지닌 폴리펩티드를 의미한다.

본 발명의 목적상, 용어 "하이브리드 항생제"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 인공 생합성 경로를 작제함으로써 생성된 화합물을 의미한다.

본 발명의 주제는 보다 특히, 다음의 상세한 설명에 제시된 바와 같은, 스피라마이신에 대한 생합성 경로의 신규한 유전자 및 이러한 생합성에 관여하는 신규한 폴리펩티드이다.

상기 생합성 경로의 유전자를 클로닝하고, 이들 유전자의 DNA 서열을 결정한다. 수득된 서열은 프레임플롯(FramePlot) 프로그램[참조: J. Ishikawa & K. Hotta, 1999]을 사용하여 분석하였다. 개방 판독 프레임 중에서, 스트렙토마이세스 특유의 코돈 활용을 나타내는 개방 판독 프레임을 동정한다. 이러한 분석 결과, 상기 영역이 효소 "폴리케티드 신타제"(PKS)를 암호화하는 5개 유전자의 어느 한쪽에 위치되고, 스트렙토마이세스 특유의 코돈 활용을 나타내는 44개 ORF를 포함한다는 사실이 밝혀졌다. PKS를 암호화하는 이들 5개 유전자의 어느 한쪽에, 10개 및 34개 ORF가 각각 하류 및 상류에서 동정되었다(하류 및 상류는 동일한 방향으로 모두 배향된 5개 PKS 유전자의 배향으로써 규정된다)(도 3 및 37 참조). 따라서, 대략 41.7 kb의 영역을 점유하고 있는 상기 유형의 34개 개방 판독 프레임[참조: 25개 ORF를 함유하는 31 kb의 제1 영역을 나타내는 서열 번호 1, 및 대략 12.1 kb의 영역(이의 1.4 kb는 선행 서열(서열 번호 1)과 중복되고, 이의 대략 10.7 kb는 후속 서열에 상응한데, 대략 10.7 kb의 후자 부분은 9개의 부가 ORF(부분 서열의 1개 ORF 포함)를 함유한다)을 나타내는 서열 번호 14(또한, 하기 도 3 및 37 참조)]을, 상기 PKS를 암호화하는 5개 유전자의 상류에서 동정하고, 대략 11.1 kb 영역을 점유하고 있는 10개(서열 번호 2 및 도 3)는 PKS 유전자의 하류에서 동정하였다. 따라서, 5개 PKS 유전자의 하류에 위치된 10개 유전자는 orf1*c, orf2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*, orf6*, orf7*c, orf8*, orf9* 및 orf10* (서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21)으로 명명되었다. 유전자 명칭에 부가된 "c"는 문제의 ORF에 대해, 암호화 서열이 역배향으로 존재한다는 것을 의미한다(따라서, 암호화 쇄는 이들 유전자에 대해 서열 번호 2에 제시된 서열에 상보적인 쇄이다). 동일한 명명법을 사용하여, PKS 유전자의 상류의 34개 ORF는 orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orf9c, orf10, orf11c, orf12, orf13c, orf14, orf15c, orf16, orf17, orf18, orf19, orf20, orf21c, orf22c, orf23c, orf24c, orf25c, orf26, orf27, orf28c, orf29, orf30c, orf31, orf32c, orf33 및 orf34c (서열 번호 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 및 149)로 명명되었다(참조: 도 3 및 37).

이들 개방 판독 프레임으로부터 추론된 단백질 서열을 다음과 같은 각종 프로그램을 사용하여 각종 데이터베이스에 존재하는 것과 비교하였다: BLAST[참조: Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997), CD-서치, COGs(Cluster of Orthologous Groups)(이들 3가지 프로그램은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)(Bethesda, Maryland, USA)로부터 특히 입수 가능하다), FASTA [참조: W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988; and W.R. Pearson, 1990], BEAUTY[참조: K.C. Worley et al., 1995](이들 2가지 프로그램은 INFOBIOGEN resource center, Evry, France로부터 특히 입수 가능하다). 이들 비교를 통해, 이들 유전자 생성물의 기능에 관한 가설을 공식화하고, 스피라마이신 생합성에 관여하기 쉬운 것을 동정할 수 있게 되었다.

PKS를 암호화하는 유전자의 하류에 위치한 유전자

해당 영역의 조직을 다이아그램으로 표시한 것이 도 3에 도시되어 있다. 다음에서 입증되는 바와 같이, PKS를 암호화하는 유전자의 하류에서 동정된 10개의 유전자 중에 9개가 스피라마이신의 생합성에 관여하거나 스피라마이신에 대한 내성을 나타내는 것으로 여겨진다. 이들 9개 유전자는 다음과 같다: orf1*c, orf2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*, orf6*, orf7*c, orf8* 및 orf9*.

다음 표 1에는, 5개의 PKS 유전자의 하류에서 동정된 10개 유전자의 DNA 서열과 아미노산 서열을 기준(참조)으로 하여 제시되어 있다.

유전자 명칭에 부가된 "c"는 암호화 서열이 역배향으로 존재한다는 것을 지시한다(따라서, 암호화 쇄는 이들 유전자에 대해 서열 번호 2에 제시된 서열에 상보적인 쇄이다).

동정된 폴리펩티드의 기능을 결정할 목적으로, 3가지 유형의 실험을 수행하였다: 동정된 서열을 공지된 기능의 서열과 비교하는 실험; 돌연변이체 균주를 작제시켜 주는 유전자 불활성화 실험; 및 이들 돌연변이체 균주에 의한 스피라마이신 생합성 중간체의 생산과 스피라마이신의 생산에 대한 분석 실험.

이들 개방 판독 프레임으로부터 추론된 단백질 서열을 우선적으로, 다음과 같은 각종 프로그램을 사용하여 각종 데이터베이스에 존재하는 것과 비교하였다: BLAST[참조: Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997), CD-서치, COGs(Cluster of Orthologous Groups), FASTA[참조: W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988 and W.R. Pearson, 1990], BEAUTY[참조: K.C. Worley et al., 1995]. 이들 비교를 통해, 이들 유전자 생성물의 기능에 관한 가설을 공식화하고, 스피라마이신 생합성에 관여하기 쉬운 것을 동정할 수 있게 되었다. 표 2에는 5개의 PKS 유전자의 하류에 위치한 10개 유전자 생성물과 강력한 유사성을 나타내는 단백질이 제시되어 있다.

* 보다 큰 서열 유사성은 보다 높은 BLAST 스코어와 연관이 있다[참조: Altschul et al., 1990].

이들 결과를 확인하기 위해, 유전자 불활성화 실험을 수행하였다. 사용된 방법은 유전자 대체를 수행하는 것으로 이루어진다. 개입중단된(interrupted) 표적 유전자를, 항생제[예를 들면, 아프라마이신(apramycin), 제네티신(geneticin) 또는 히그로마이신(hygromycin)]에 대한 내성을 부여해 주는 카세트에 의해 개입중단된 상기 유전자의 복사물로 대체시킨다. 사용된 카세트는 어느 한 쪽이, 모든 판독 프레임 내의 해독 종결 코돈과 접해있고, 스트렙토마이세스에서 활성인 전사 종결인자와 접해있다. 상기 카세트를 표적 유전자 내로 삽입하는 것은 이러한 표적 유전자에서의 결실을 수반하거나 수반하지 않을 수 있다. 상기 카세트를 플랭킹하는 영역의 크기는 수 백개 염기쌍에서 부터 수 천개 염기쌍 범위일 수 있다. "절제 가능한 카세트"로 지칭되는 제2 유형의 카세트를 유전자 불활성화에 사용할 수 있다. 이들 카세트는 에스. 암보파시엔스의 게놈 내로 도입된 후 부위-특이적 재조합 사건에 의해 스트렙토마이세스에서 절단될 수 있다는 이점을 지니고 있다. 이러한 목적은 최종 균주 내에, 이러한 균주에 속하지 않는 큰 DNA 서열이나 선별 마커를 잔존시키지 않으면서, 스트렙토마이세스 균주 내의 특정의 유전자를 불활성화시키는 것이다. 절제 후, 약 30개 염기쌍의 짧은 서열("반흔성(cicatricial)" 부위로 지칭됨) 만이 상기 균주의 게놈 내에 잔존한다(도 10 참조). 이러한 시스템의 사용은 초기에는, 표적 유전자의 야생형 복사물을 (2회 상동 재조합 사건을 통하여: 도 9 참조), 절제 가능한 카세트를 상기 표적 유전자 내로 삽입시킨 작제물로 대체시키는 것으로 이루어진다. 이러한 카세트의 삽입은 표적 유전자의 결실을 수반하게 된다(도 9 참조). 그 다음, 상기 균주의 게놈으로부터 절제 가능한 카세트를 절제시킨다. 절제 가능한 카세트는 부위-특이적 재조합 시스템을 통하여 기능하고, 결국에는 내성 유전자를 수반하지 않는 스트렙토마이세스 돌연변이체를 획득할 수 있게 해주는 이점을 지니고 있다. 불활성화된 유전자(들)의 하류에 위치한 유전자의 발현에 대한 가능한 극성 효과를 또한 피할 수 있다(도 10 참조). 이와 같이 하여 작제된 균주를 대상으로 하여, 이들의 스피라마이신 생산을 알아보기 위해 시험하였다.

orf1*c, orf2*c, orf3*c 및 orf4*c 유전자는 불활성화시키지 않았는데, 이는 서열 비교 실험 결과, 이들 유전자가 비교적 밀접한 항생제의 생합성에 관여하는 유전자와 비교적 높은 유사성을 지니고 있다는 사실을 결정할 수 있었기 때문이다. 따라서, orf1*c 유전자는 틸로신(tylosine)의 생합성에 관여하고 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae)에서 미카미노스의 생성 동안 3-N-메틸화를 촉매하는 N-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 tylMI 유전자에 의해 암호화된 단백질과 66%의 동일성(BLAST 프로그램을 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: A.R. Gandecha et al., 1997; 젠뱅크(GenBank) 수탁 번호: CAA57473; BLAST 스코어: 287]. 이와 같이, 비교적 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질, 보다 특히 미카미노스의 생합성에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf1*c 유전자가 포로사민 또는 미카미노스의 생합성 동안 N-메틸화에 책임이 있는 N-메틸트랜스퍼라제를 암호화한다는 사실을 제시해준다(도 5 및 6 참조). 이러한 가설은 orf1*c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 3 참조).

orf2*c 유전자는 스트렙토마이세스 프라디애에서 틸로신의 생합성에 관여하는 NDP 헥소스 3,4-이소머라제를 암호화하는 tylMIII 유전자에 의해 암호화된 단백질과 비교적 강력한 유사성(35% 동일성)을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: A.R. Gandecha et al., 1997; 젠뱅크 수탁 번호: CAA57471; BLAST 스코어: 130]. 이와 같이, 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질, 보다 특히 미카미노스의 생합성에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf2*c 유전자가 스피라마이신의 당 중의 하나, 가능하게는 미카미노스의 생합성 동안 이성체화에 책임이 있는 NDP 헥소스 3,4-이소머라제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 5 및 6 참조).

orf3*c 유전자는 스트렙토마이세스 프라디애에서 틸로신 생합성에 관여하는 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 tylMII 유전자에 의해 암호화된 단백질과 비교적 강력한 유사성(59% 동일성)을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: A.R. Gandecha et al., 1997; 젠뱅크 수탁 번호: CAA57472; BLAST 스코어: 448]. 이와 같이, 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf3*c 유전자가 글리코실트랜스퍼라제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다. 이러한 가설은 orf3*c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 4 참조)

orf4*c 유전자는 몇 가지 크로토닐-CoA 리덕타제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf4*c에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor)로부터의 크로토닐-CoA 리덕타제와 상당히 유사하다[참조: M. Redenbach et al., 1996; 젠뱅크 수탁 번호: NP_630556; BLAST 스코어: 772]. 이와 같이, 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf4*c 유전자가 크로토닐-CoA 리덕타제를 또한 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다. 이러한 가설은 orf4*c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 5 참조).

orf6* 유전자는 매크롤리드 항생제를 생산하는 스트렙토마이세스 미카로파시엔스(Streptomyces mycarofaciens)에 존재하는 mdmB 유전자와 특정의 유사성을 나타낸다[참조: Hara and Hutchinson, 1992; 젠뱅크 수탁 번호: A42719; BLAST 스코어: 489]. 이러한 생산자에서, 상기 유전자는 락톤 환의 아실화 반응에 관여한다. 따라서, orf6* 유전자는 아실트랜스퍼라제를 암호화하는 것으로 여겨진다. 이러한 가설은 orf6* 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 6 참조).

orf6* 유전자의 불활성화는 동위상 결실/역위에 의해 유발되었는데, 이는 생성된 균주가 스피라마이신 II와 III을 더 이상 생산하지 않고, 스피라마이신 I 만을 생산한다는 사실을 제시하였다(도 1 참조). 이는 orf6* 유전자가 실제로 스피라마이신 II와 III의 합성에 관여한다는 것을 확인시켜 준다. 상기 유전자에 의해 암호화된 효소는, 아세틸 또는 부티릴 그룹을 3-위치 내의 탄소에 부착시킴으로써 스피라마이신 II와 III의 형성에 책임이 있다. orf6* 유전자에 의해 암호화된 단백질을 더 이상 발현하지 않는 균주가 특히 유리한데, 이는 이들이 스피라마이신 II와 III은 더 이상 생산하지 않고, 스피라마이신 I 만을 생산하기 때문이다. 상기에 구체화된 바와 같이, 스피라마이신 I의 항생제 활성은 스피라마이신 II와 III의 항생제 활성 보다 훨씬 더 크다[참조: Liu et al., 1990].

orf5* 유전자는 몇 가지 O-메틸트랜스퍼라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf5*에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 미카로파시엔스로부터의 O-메틸트랜스퍼라제(EC 2.1.1.-) MdmC와 상당한 유사성을 지닌다[참조: Hara & Hutchinson, 1992; 젠뱅크 수탁 번호: A42719; BLAST 스코어: 355]. 이와 같이, 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf5* 유전자가 O-메틸트랜스퍼라제를 또한 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다. orf5* 유전자는 락톤 환 내로 혼입된 전구체의 형성에 관여하는 것으로 여겨진다. 사실상, 서열 비교에 따르면, orf5* 유전자 생성물은 다음에 따르는 하이드록시말로닐-ACP의 메틸화에 책임이 있는 FkbG와 비교적 밀접하다[참조: Wu et al., 2000; Hoffmeister et al., 2000; 젠뱅크 수탁 번호: AAF86386; BLAST 스코어: 247](도 8 참조). 이러한 가설은 orf5* 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 7 참조).

orf6* 유전자 내로의 비-절제된 카세트의 삽입에 관한 극성 효과 때문에, orf5* 유전자가 스피라마이신에 대한 생합성 경로에 필수적이라는 사실을 결정할 수 있었다. 구체적으로 언급하면, 절제 가능한 카세트를 orf6* 유전자의 암호화 부위 내로 삽입하면, 스피라마이신 생산이 완전히 억제된다. 그러나, 삽입된 카세트가 일단 절제되면(그리고, 이에 따라 orf6* 유전자 만이 불활성화되는 경우; 실시예 14 및 15 참조), 스피라마이신 I의 생산이 다시 관찰된다. 이는 orf5* 유전자가 스피라마이신에 대한 생합성 경로에 필수적이란 사실을 보여주는데, 이는 이를 불활성화시키면 스피라마이신 생산이 완전히 억제되기 때문이다.

orf5* 유전자는 몇 가지 O-메틸트랜스퍼라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. orf5* 유전자는 플라테놀리드의 합성에 직접적으로 관여하거나, 또는 PKS에 의해 플라테놀리드 내로 혼입된 메틸화 전구체(메톡시말로닐, 도 8 참조)의 합성에 관여하는 O-메틸트랜스퍼라제인 것으로 여겨진다. 이러한 가설을 입증하기 위해, LC/SM 및 NMR 분석 실험을 유전자형: orf6*::att1Ωhyg+의 에스. 암보파시엔스 균주 상에서 수행하였다. 이러한 균주에서는, orf5* 유전자가 발현되지 않았는데, 이는 전사 종결인자를 함유하는 카세트가 orf6* 유전자 내로 삽입됨에 따른 극성 효과 때문이다(실시예 27 참조). 상기 균주는 UV 스펙트럼이 스피라마이신 I과 유사한 외형을 지니지만, 질량 스펙트럼은 829에서 분자상 이온을 나타내는 분자를 생산한다는 사실이 밝혀졌다. 스피라마이신의 질량과 비교한 14 질량 상의 차이점은 락톤 환(이러한 화합물의 구조는 도 39에 도시되어 있다)의 탄소 번호 4에 의해 생성된 산소 상의 메틸 부재로써 설명할 수 있다. NMR에 의해 수득된 결과는 이러한 가설에 부합된다. 829 하의 특정 화합물이 존재하면, orf5*이 스피라마이신 생합성에 있어 일정 역할을 한다는 가설을 실증할 수 있다. 또한, 메틸 그룹을 갖지 않는 스피라마이신에 상응하는 생성물은 변형되지 않은 스피라마이신과 비교해서 극히 약한 미생물 활성(10배 정도 더 약함)을 나타내는데, 이는 미생물 미크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus) 상에서 시험하였다.

orf7*c 유전자는 스트렙토마이세스 미카로파시엔스의 mdmA에 의해 암호화된 단백질과 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화하는데, 전자 단백질은 생산자 효소에서 미데카마이신 내성에 관여하는 단백질을 암호화한다[참조: Hara et al., 1990; 젠뱅크 수탁 번호: A60725; BLAST 스코어: 380]. 이와 같이, 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf7*c 유전자가 스피로마이신 내성에 관여한 단백질을 또한 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다. 보다 특히, orf7*c 유전자에 의해 암호화된 효소는 메틸트랜스퍼라제 활성을 지니고 있고, 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 스피라마이신 내성에 관여한다. 상기 유전자가 MLS I 유형의 내성(이러한 내성은 23S 리보솜성 RNA의 위치 A2058에서의 모노메틸화에 기인한 것으로 공지되어 있다)을 부여해 주는 것으로 입증되었다[참조: Pernodet et al., 1996]. 이러한 가설은 orf7*c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 8 참조).

orf8* 유전자는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)에서 ABC 수송인자 유형의 단백질과 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: Campelo, 2002; 젠뱅크 수탁 번호: CAC22119; BLAST 스코어: 191]. 이와 같이, ABC 수송인자 유형의 단백질과의 유사성은 orf8* 유전자가 스피라마이신 내성에 관여할 수 있는 ABC 수송인자 유형의 단백질을 또한 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다. 이러한 가설은 orf8* 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 9 참조).

orf9* 유전자는 스트렙토마이세스 그리세우스에서 ABC 수송인자 유형의 단백질과 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: Campelo, 2002; 젠뱅크 수탁 번호: CAC22118; BLAST 스코어: 269]. 이와 같이, ABC 수송인자 유형의 단백질과의 유사성은 orf9* 유전자가 스피라마이신 내성에 관여할 수 있는 ABC 수송인자 유형의 단백질을 또한 암호화한다는 사실을 제시해준다. 이러한 가설은 orf9* 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 10 참조).

orf10* 유전자는 공지되지 않은 기능의 단백질과 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 그러나, orf10*과 유사한 유전자는 항생제 생합성에 관여하는 유전자의 몇몇 그룹 중에서 발견된다. 따라서, orf10*와 밀접한 유전자는 에스. 코엘리콜로르(S. coelicolor)에서 발견된다[참조: Redenbach et al., 1996, 젠뱅크 수탁 번호: NP_627432, BLAST 스코어: 109]. 밀접한 유전자(CouY)가 또한, 에스. 리쉬리엔시스(S. rishiriensis)에서 발견된다[참조: Wang et al., 2000, 젠뱅크 수탁 번호: AAG29779, BLAST 스코어 97].

PKS를 암호화하는 유전자의 상류에 위치한 유전자

PKS를 암호화하는 유전자의 상류에 위치한 DNA 서열에서는(하류 및 상류는 동일한 방향으로 모두 배향된 5개 PKS 유전자의 배향으로써 규정된다)(도 3 참조), 34개 ORF가 동정되었다(상기 참조). 따라서, 이러한 유형의 34개 개방 판독 프레임은 대략 41.7 kb의 영역[참조: 25개 ORF를 함유하는 31 kb의 제1 영역을 나타내는 서열 번호 1, 및 대략 12.1 kb의 영역(이의 1.4 kb는 선행 서열(서열 번호 1)과 중복되고, 이의 대략 10.7 kb는 후속 서열에 상응한데, 대략 10.7 kb의 후자 부분은 9개의 부가 ORF(ORF 부분 서열 포함)를 함유한다)을 나타내는 서열 번호 140(또한, 하기 도 3 및 37 참조)]을 차지한다. 해당 영역의 조직을 다이아그램으로 표시한 것이 도 5 및 37에 도시되어 있다. 동정된 34개 유전자는 다음과 같이 명명되었다: orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orf9c, orf10, orf11c, orf12, orf13c, orf14, orf15c, orf16, orf17, orf18, orf19, orf20, orf21c, orf22c, orf23c, orf24c, orf25c, orf26, orf27, orf28c, orf29, orf30c, orf31, orf32c, orf33 및 orf34c.

다음 표 11에는, 5개의 PKS 유전자의 상류에서 동정된 34개 유전자의 DNA 서열과 아미노산 서열을 기준(참조)으로 하여 제시되어 있다.

¹유전자 명칭에 부가된 "c"는 암호화 서열이 역배향으로 존재한다는 것을 지시한다(따라서, 암호화 쇄는 이들 유전자에 대해 서열 번호 1 또는 서열 번호 140에 제시된 서열에 상보적인 쇄이다).

²몇 가지 단백질 서열이 단일 orf로 지시된 경우에는, 상응하는 단백질이 여러 개의 가능한 해독 개시 부위로부터 유도된 것이다.

상기 표 11에 동정된 폴리펩티드의 기능을 결정할 목적으로, 3가지 유형의 실험을 수행하였다: 동정된 서열을 공지된 기능의 서열과 비교하는 실험; 유전자 불활성화 실험; 및 이들 돌연변이체 균주에 의한 스피라마이신 생산에 대한 분석 실험.

이들 개방 판독 프레임으로부터 추론된 단백질 서열을 우선적으로, 다음과 같은 각종 프로그램을 사용하여 각종 데이터베이스에 존재하는 것과 비교하였다: BLAST[참조: Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997), CD-서치, COGs(Cluster of Orthologous Groups), FASTA[참조: W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988 and W.R. Pearson, 1990], BEAUTY[참조: K.C. Worley et al., 1995](상기 참조). 이들 비교를 통해, 이들 유전자 생성물의 기능에 관한 가설을 공식화하고, 스피라마이신 생합성에 관여하기 쉬운 것을 동정할 수 있게 되었다. 표 12에는 5개의 PKS 유전자의 상류에 위치한 34개 유전자와 강력한 유사성을 나타내는 단백질이 제시되어 있다.

이들 결과를 확인하기 위해, 유전자 불활성화 실험을 수행하였다. 사용된 방법은 유전자 대체를 수행하는 것으로 이루어진다. 개입중단시키고자 하는 표적 유전자를, 항생제(예를 들면, 아프라마이신 또는 히그로마이신)에 대한 내성을 부여해 주는 카세트에 의해 개입중단된 상기 유전자의 복사물로 대체시킨다. 사용된 카세트는 어느 한쪽이, 모든 판독 프레임 내의 해독 종결 코돈과 접해있고, 스트렙토마이세스에서 활성인 전사 종결인자와 접해있다. 상기 카세트를 표적 유전자 내로 삽입하는 것은 이러한 표적 유전자에서의 결실을 수반하거나 수반하지 않을 수 있다. 상기 카세트를 플랭킹하는 영역의 크기는 수 백개 염기쌍에서 부터 수 천개 염기쌍 범위일 수 있다. "절제 가능한 카세트"(상기 참조)로 지칭되는 제2 유형의 카세트를 유전자 불활성화에 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 작제된 균주를 대상으로 하여, 이들의 스피라마이신 생산을 알아보기 위해 시험하였다.

orf1 유전자는 몇 가지 시토크롬 P450와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf1에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 프라디애에서 틸로신의 생합성에 관여하는 tylI 유전자에 의해 암호화된 단백질과 상당히 유사하다[참조: L.A. Merson-Davies et al., 1994; 젠뱅크 수탁 번호: S49051; BLAST 스코어: 530]. 이와 같이, 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf1 유전자가 시토크롬 P450을 또한 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다. 이러한 가설은 orf1 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 13 참조).

orf2 유전자는 아네우리니바실루스 더모애로필루스(Aneurinibacillus thermoaerophilus)의 dTDP-6-데옥시-3,4-케토헥술로스 이소머라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: Pfoestl, A. et al., 2003, 젠뱅크 수탁 번호: AAO06351; BLAST 스코어: 118]. 이와 같은 유사성은 orf2 유전자가 스피라마이신 분자에 존재하는 당 중의 하나, 가능하게는 미카로스의 생합성에 요구되는 이성체화 반응에 책임이 있는 이소머라제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 5 참조). orf2 유전자의 불활성화를 수행하였다. 이로써 생성된 균주가 더 이상 스피라마이신을 생산하지 못한다는 사실이 밝혀졌다. 이는 orf2 유전자가 실제로 스피라마이신 생합성에 관여한다는 것을 확인시켜 준다.

orf3 유전자는 몇 가지 아미노트랜스퍼라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf3에 의해 암호화된 단백질은 올레안도마이신 생합성에 관여하는 스트렙토마이세스 안티비오티쿠스(Streptomyces antibioticus)의 아미노트랜스퍼라제와 상당히 유사하다[참조: G. Draeger et al., 1999; 젠뱅크 수탁 번호: AAF59939; BLAST 스코어: 431]. 이와 같이, 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf3 유전자가 스피라마이신의 아미노 당 중의 하나의 생합성에 필요한 아민기 전이 반응에 책임이 있는 3-아미노트랜스퍼라제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 5 참조). 이러한 가설은 orf3 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 15 참조).

orf3 유전자를 불활성화시킨다. 따라서, 이로써 생성된 균주가 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 이는 orf3 유전자가 실제로 스피라마이신 생합성에 관여한다는 것을 확인시켜 준다. 따라서, 상기 유전자에 의해 암호화된 효소는 스피라마이신 생합성에 필수적인 생체전환 단계에 명백히 책임이 있다. 스피라마이신 생성은 에스. 프라디애(S. fradiae)의 TylB 단백질의 발현에 의해 보충될 수 있다(실시예 23 참조). 이는 orf3 유전자가 미카미노스 생합성에 필요한 아민기 전이 반응에 책임이 있는 3-아미노트랜스퍼라제를 암호화한다는 사실을 입증해준다(도 5 참조). 미카미노스는 플라테놀리드에 부착될 제1 당이기 때문에, orf3 녹아웃(knockout)을 나타내는 균주(OS49.67)는 플라테놀리드를 축적할 것으로 예상된다.

orf3 유전자 녹아웃을 나타내는 균주의 생합성 중간체를 대상으로 연구하였다(실시예 20 참조). 이들 실험 결과, 상기 균주가 2가지 형태의 플라테놀리드, 즉 플라테놀리드 A와 플라테놀리드 B를 생산한다는 사실을 입증할 수 있었으며, 상기 2가지 분자의 추론되는 구조가 도 36에 도시되어 있다. 이러한 균주는 또한, 플라테놀리드 A + 미카로스와 플라테놀리드 B + 미카로스를 생산한다(실시예 20 및 도 40 참조). 이들 화합물은 당을 포함하지만, 어떠한 미카미노스도 포함하지 않는다. 또한, 이들을 스피라마이신과 비교할 경우(도 1 참조), 이들 화합물은 미카미노스 대신 미카로스를 포함한다. 이러한 결과는 orf3 유전자 생성물이 미카미노스 생합성에 관여하고 미카미노스 생합성에 요구되는 아민기 전이 반응에 책임이 있는 3-아미노트랜스퍼라제로서 역할을 한다는 사실과 일치한다(도 5 참조). 당화 특이성이 절대적인 것으로 여겨지지는 않는데, 이는 미카미노스에 의해 통상 점유된 위치에 부착된 미카로스를 갖는 분자가 발견되기 때문이라는 것을 인지할 수 있다(도 40 참조).

orf4 유전자는 몇 가지 NDP-글루코스 신테타제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf4에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)의 알파-D-글루코스-1-포스페이트 티미딜릴트랜스퍼라제와 상당히 유사하다[참조: Y. Xue et al., 1998; 젠뱅크 수탁 번호: AAC68682; BLAST 스코어: 404]. 이와 같이, 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf4 유전자가 스피라마이신 분자 내로 혼입된 3가지 불규칙한 당의 생합성에 필요한 NDP-글루코스의 합성에 책임이 있는 NDP-글루코스 신테타제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 4, 5 및 6 참조). 이러한 가설은 orf4 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 16 참조).

orf5 유전자는 몇 가지 글루코스 데하이드라타제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf5에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 테네브라리우스(Streptomyces tenebrarius)의 dTDP-글루코스-4,6-데하이드라타제와 상당히 유사하다[참조: T.B.Li et al., 2001; 젠뱅크 수탁 번호: AAG18457; BLAST 스코어: 476]. 이와 같이, 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf5 유전자가 스피라마이신 분자 내로 혼입된 3가지 불규칙한 당의 생합성에 필요한 NDP-글루코스 데하이드라타제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 4, 5 및 6 참조). 이러한 가설은 orf5 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 17 참조).

orf6 유전자는 몇 가지 티오에스테라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf6에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)의 티오에스테라제와 상당히 유사하다[참조: S. Omura et al., 2001; 젠뱅크 수탁 번호: BAB69315; BLAST 스코어: 234]. 이와 같이, 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf6 유전자가 티오에스테라제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다. 이러한 가설은 orf6 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 18 참조).

orf7 유전자는 몇 가지 헥소스 데하이드라타제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf7에 의해 암호화된 단백질은 틸로신 생합성에 관여하는 스트렙토마이세스 프라디애의 dNTP-헥소스 2,3-데하이드라타제(TylCVI 유전자에 의해 암호화됨)와 상당히 유사하다[참조: L.A. Merson-Davies et al., 1994; 젠뱅크 수탁 번호: AAF29379; BLAST 스코어: 461]. 이와 같이, 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf7 유전자가 스피라마이신 분자 내로 혼입된 2가지 불규칙한 당의 생합성에 필요한 헥소스 2,3-데하이드라타제를 또한 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 4 및 6 참조). 이러한 가설은 orf7 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 19 참조).

orf8 유전자는 몇 가지 아미노트랜스퍼라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf8에 의해 암호화된 단백질은 삭카로폴리스포라 스피노사(Saccharopolyspora spinosa)에서 포로사민 생합성에 관여하는 것으로 추정되는 아미노트랜스퍼라제와 상당히 유사하다[참조: C. Waldron et al., 2001; 젠뱅크 수탁 번호: AAG23279; BLAST 스코어: 465]. 이와 같이, 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf8 유전자가 포로사민 생합성에 필요한 아민기 전이 반응에 책임이 있는 4-아미노트랜스퍼라제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 6 참조). 이러한 가설은 orf8 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 20 참조).

orf8 유전자를 불활성화시킨다. 따라서, 이로써 생성된 균주가 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 이는 orf8 유전자가 실제로 스피라마이신 생합성에 관여한다는 것을 확인시켜 준다. 따라서, 상기 유전자에 의해 암호화된 효소는 스피라마이신 생합성에 필수적인 생체전환 단계에 명백히 책임이 있다. orf8 유전자 생성물이 포로사민 생합성에 있어 일정한 역할을 한다는 가설의 실증은, orf8 유전자에 대한 불활성화된 돌연변이체가 포로시딘을 생산하므로, 이러한 돌연변이체가 포로시딘 기(stage)에서 차단되고 어떠한 네오-스피라마이신도 생산하지 못한다는 사실에 의해 제공된다(도 7 및 실시예 25 참조). 이들 결과는 orf8 유전자 생성물이 포로사민 생합성에 관여한다는 사실에 부합된다(도 6 참조).

orf9c 유전자는 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 이미 동정되었으며, srmX로 명명되었다[참조: M. Geistlich et al., 1992]. 이러한 유전자에 의해 암호화된 단백질이, 밀접한 기타 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 몇 가지 메틸트랜스퍼라제와 유사하다는 것은, orf9c 유전자가 미카미노스 또는 포로사민 생합성에 필요한 메틸화 반응에 책임이 있는 메틸트랜스퍼라제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 5 및 6 참조). 이러한 가설은 orf9c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 21 참조).

orf10 유전자는 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 이미 동정되었으며, srmR로 명명되었다[참조: M. Geistlich et al., 1992]. 이러한 유전자에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 스피라마이신에 대한 생합성 경로의 조절에 관여한다. orf10 유전자를 불활성화시킨다. 따라서, 이로써 생성된 균주가 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 이는 orf10 유전자가 실제로 스피라마이신 생합성에 관여한다는 것을 확인시켜 준다. 따라서, 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질은 스피라마이신 생합성에 명백하게 필수적이다.

또한, orf10의 해독 개시 지점을 결정하였으며, 이러한 유전자를 과발현시키면, 스피라마이신 생산이 향상된다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 상기 해독 개시 부위는 문헌[참조: M. Geistlich et al., 1992]에 제안된 ATG의 상류에 위치한 ATG에 상응한다. 또한, 이러한 5' 말단이 Orf10의 기능에 필수적이란 사실이 입증되었는데, 이는 5'-절단된 메신저가 불활성이기 때문이다(실시예 17 참조). 스피라마이신 생산에 대한 목적하는 효과를 획득하기 위해서는, orf10의 5'-절단된 메신저는 발현되지 않도록 주의하면서 orf10의 과발현을 수행하는 것이 필수적이다.

orf11c 유전자는 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 이미 동정되었으며, srmB로 명명되었다[참조: M. Geistlich et al., 1992; and B. Schoner et al., 1992]. 이러한 유전자에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 스피라마이신 내성에 관여하고, 이는 ABC-유형 수송인자이다.

orf12 유전자는 몇 가지 헥소스 데하이드라타제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf12에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 프라디애의 UrdQ 유전자에 의해 암호화되고 우르다마이신(urdamycin) 생합성에 관여하는 NDP-헥소스 3,4-데하이드라타제와 상당히 유사하다[참조: D. Hoffmeister et al., 1994; 젠뱅크 수탁 번호: AAF72550; BLAST 스코어: 634]. 이와 같이, 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf12 유전자가 포로사민 생합성에 필요한 탈수 반응에 책임이 있는 3,4-데하이드라타제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 6 참조). 이러한 가설은 orf12 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 22 참조).

orf12 유전자를 불활성화시킨다. 따라서, 이로써 생성된 균주가 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 이는 orf12 유전자가 실제로 스피라마이신 생합성에 관여한다는 것을 확인시켜 준다. 따라서, 상기 유전자에 의해 암호화된 효소는 스피라마이신 생합성에 필수적인 생체전환 단계에 명백히 책임이 있다. orf12가 포로사민 생합성에 있어 일정한 역할을 한다는 가설의 실증은, orf12 유전자에 대한 불활성화된 돌연변이체가 더 이상 포로사민을 생산하지 못한다는 사실에 의해 제공된다. 그러나, 이는 소량의 포로시딘을 생산한다. 따라서, 이러한 변이체는 포로시딘 기에서 차단되고 어떠한 네오-스피라마이신도 생산하지 못한다(도 7 및 실시예 26 참조). 상기 돌연변이체는 또한, 도 38에 제시된 구조를 갖는 화합물을 생산한다. 후자 화합물은 2개의 당, 즉 미카미노스와 미카로스를 함유하지만, 포로사민은 전혀 함유하지 않는다. 또한, 이를 스피라마이신의 구조와 비교할 경우(도 1 참조), 상기 화합물은 포로사민의 예상된 위치에 당 미카로스를 함유한다. 이들 결과는 orf12 유전자 생성물이 포로사민 생합성에 관여한다는 사실에 부합된다(도 6 참조). 당화 특이성이 절대적인 것으로 여겨지지는 않는데, 이는 미카로스가 포로사민에 의해 통상 점유된 위치에 부착된 분자가 발견되기 때문이라는 것을 인지할 수 있다(도 38 참조).

orf13c 유전자는 스트렙토마이세스 코엘리콜로르에서 공지되지 않은 기능의 단백질과 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 이러한 단백질은 SC4H2.17(젠뱅크 수탁 번호: T35116; BLAST 스코어: 619)로 명명된다. orf13c 유전자에 의해 암호화된 단백질은 기타 유기체의 기타 단백질과 강력한 유사성을 또한 나타낸다(표 23 참조).

orf13c에 의해 암호화된 것과 밀접한 단백질에 기인하는 정확한 어떠한 기능도 없었다. 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 스피라마이신에 대한 생합성 경로에 있어서 상기 유전자의 기능을 연구할 목적으로 orf13c 유전자를 불활성화시켰다. 이로써 생성된 균주가 스피라마이신을 생산한다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 이는 orf13c 유전자가 스피라마이신 생합성에 필수적이지 않고 상기 세균의 생존에 필수적이지 않다는 것을 지시한다. 따라서, 상기 유전자에 의해 암호화된 효소는 스피라마이신 생합성에 필수적인 생체전환 단계에 책임이 없다.

orf14 유전자는 추정상의 리덕타제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: M. Redenbach et al., 1996; Bentley et al., 2002; 젠뱅크 수탁 번호: CAB90862; BLAST 스코어: 147].

orf14 유전자를 불활성화시킨다. 따라서, 이로써 생성된 균주가 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 이는 orf14 유전자가 실제로 스피라마이신 생합성에 관여한다는 것을 확인시켜 준다. 따라서, 상기 유전자에 의해 암호화된 효소는 스피라마이신 생합성에 필수적인 생체전환 단계에 명백히 책임이 있다. orf14 유전자 녹아웃을 나타내는 균주의 생합성 중간체를 대상으로 연구하였다(실시예 20 참조). 이들 실험 결과, 상기 균주가 플라테놀리드 A는 생산하지만, 플라테놀리드 B는 생산하지 못한다는 사실을 입증할 수 있었다(도 36 참조).

orf15c 유전자는 몇 가지 케토 리덕타제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf15c에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 안티비오티쿠스에서 3-케토 리덕타제와 상당히 유사하다[젠뱅크 수탁 번호: T51102; BLAST 스코어: 285]. 이러한 유사성은 orf15c 유전자가 포로사민 생합성에 필요한 환원 반응에 책임이 있는 3-케토 리덕타제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 6 참조). 이러한 가설은 orf15c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 24 참조).

orf16 유전자는 몇 가지 이소머라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf16에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 프라디애에서 NDP-헥소스 3,4-이소머라제와 상당히 유사하다[참조: Gandecha et al., 1997; 젠뱅크 수탁 번호: CAA57471; BLAST 스코어: 209]. 이러한 유사성은 orf16 유전자가 스피라마이신의 당 중의 하나의 생합성에 관여하는 단백질을 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 5 및 6 참조). 이러한 가설은 orf16 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 25 참조).

orf17 유전자는 몇 가지 글리코실트랜스퍼라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf17에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 베네주엘래의 글리코실트랜스퍼라제와 상당히 유사하다[참조: Y. Xue et al., 1998; 젠뱅크 수탁 번호: AAC68677; BLAST 스코어: 400]. orf17 유전자에 의해 암호화된 단백질이, 밀접한 기타 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 몇 가지 글리코실 트랜스퍼라제 유사하다는 것은, 상기 유전자가 글리코실트랜스퍼라제를 또한 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다. 이러한 가설은 orf17 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 26 참조).

orf18 유전자는 몇 가지 글리코실트랜스퍼라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf18에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 리쉬리엔시스의 글리코실트랜스퍼라제와 상당히 유사하다[참조: Wang et al., 2000; 젠뱅크 수탁 번호: AAG29785; BLAST 스코어: 185]. orf18 유전자에 의해 암호화된 단백질이, 밀접한 기타 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 몇 가지 글리코실 트랜스퍼라제와 유사하다는 것은, 상기 유전자가 글리코실트랜스퍼라제를 또한 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다. 이러한 가설은 orf18 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 27 참조).

orf19 유전자는 몇 가지 케토 리덕타제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf19에 의해 암호화된 단백질은 스트렙토마이세스 프라디애의 NDP-헥소스 4-케토 리덕타제(TylCIV)와 상당히 유사하다[참조: Bate et al., 2000; 젠뱅크 수탁 번호: AAD41822; BLAST 스코어: 266]. orf19 유전자에 의해 암호화된 단백질이, 밀접한 특정 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 상기 케토 리덕타제와 유사하다는 것은, 상기 유전자가 미카로스 생합성에 필요한 환원 반응에 책임이 있는 4-케토 리덕타제를 또한 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 4 참조). 이러한 가설은 orf19 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 28 참조).

orf20 유전자는 몇 가지 헥소스 리덕타제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf20에 의해 암호화된 단백질은 dTDP-4-케토-L-6-데옥시헥소스 2,3-리덕타제를 암호화하는 삭카로폴리스포라 에리트래아(Saccharopolyspora erythraea)의 EryBII와 상당히 유사하다[참조: R.G. Summers et al., 1997; 젠뱅크 수탁 번호: AAB84068; BLAST 스코어: 491]. orf20c 유전자에 의해 암호화된 단백질이, 밀접한 기타 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 몇 가지 헥소스 리덕타제와 유사하다는 것은, 상기 유전자가 미카로스 생합성에 필요한 환원 반응에 책임이 있는 2,3-리덕타제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 4 참조). 이러한 가설은 orf20c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 29 참조).

orf21c 유전자는 몇 가지 헥소스 메틸트랜스퍼라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. 특히, orf21c에 의해 암호화된 단백질은 NDP-헥소스 3-C-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 스트렙토마이세스 프라디애의 TylCIII 유전자와 상당히 유사하다[참조: N. Bate et al., 2000; 젠뱅크 수탁 번호: AAD41823; BLAST 스코어: 669]. orf21c 유전자에 의해 암호화된 단백질이, 밀접한 기타 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 몇 가지 헥소스 메틸트랜스퍼라제와 유사하다는 것은, 상기 유전자가 미카로스 생합성에 필요한 메틸화 반응에 책임이 있는 헥소스 메틸트랜스퍼라제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 4 참조). 이러한 가설은 orf21c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 30 참조).

orf22c 유전자는 메톡시말로닐 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 변종 아스코마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus)의 fkbH 유전자에 의해 암호화된 단백질과 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: K. Wu et al., 2000; 젠뱅크 수탁 번호: AAF86387; BLAST 스코어: 463]. orf22c 유전자에 의해 암호화된 단백질이, 밀접한 또 다른 매크롤리드에 대한 생합성 경로에 관여하는 상기 단백질과 유사하다는 것은, 이러한 유전자가 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 메톡시말로닐 생합성에 관여하는 효소를 또한 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 8 참조).

orf23c 유전자는 메톡시말로닐에 관여하는 아실-CoA 데하이드로게나제를 암호화하는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 변종 아스코마이세티쿠스의 fkbI 유전자에 의해 암호화된 단백질과 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: K. Wu et al., 2000; 젠뱅크 수탁 번호: AAF86388; BLAST 스코어: 387]. orf23c 유전자에 의해 암호화된 단백질이, 밀접한 기타 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 몇 가지 아실-CoA 데하이드로게나제와 유사하다는 것은, 이러한 유전자가 메톡시말로닐 생합성에 관여하는 아실-CoA 데하이드로게나제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 8 참조). 이러한 가설은 orf23c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 31 참조).

orf24c 유전자는 메톡시말로닐 생합성에 관여하는 아실 운반체 단백질(ACP)를 암호화하는 것으로 여겨지는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 변종 아스코마이세티쿠스의 fkbJ 유전자에 의해 암호화된 단백질과 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: K. Wu et al., 2000; 젠뱅크 수탁 번호: AAF86389; BLAST 스코어: 87]. orf24c 유전자에 의해 암호화된 단백질이, 밀접한 또 다른 매크롤리드에 대한 생합성 경로에 관여하는 상기 단백질과 유사하다는 것은, 이러한 유전자가 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 메톡시말로닐 생합성에 관여하는 단백질을 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 8 참조).

orf25c 유전자는 메톡시말로닐 생합성에 관여하는 아실-CoA 데하이드로게나제를 암호화하는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 변종 아스코마이세티쿠스의 fkbK 유전자에 의해 암호화된 단백질과 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: K. Wu et al., 2000; 젠뱅크 수탁 번호: AAF86390; BLAST 스코어: 268]. orf25c 유전자에 의해 암호화된 단백질이, 밀접한 기타 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 몇 가지 아실-CoA 데하이드로게나제와 유사하다는 것은, 이러한 유전자가 메톡시말로닐 생합성에 관여하는 아실-CoA 데하이드로게나제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 8 참조). 이러한 가설은 orf25c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 32 참조).

orf26 유전자는 스트렙토마이세스 프라디애에서 틸로신 생합성에 관여하는 미카로실트랜스퍼라제를 암호화하는 tylCV 유전자에 의해 암호화된 단백질과 65% 동일성(BLAST 프로그램을 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: N. Bate et al., 2000; 젠뱅크 수탁 번호: AAD41824; BLAST 스코어: 471]. 보다 특히, TylCV는 틸로신 합성 동안 미카로스 분자와 결합하는 글리코실트랜스퍼라제이다. 이와 같이, 비교적 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로, 보다 특히 미카로스 전이에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf26 유전자가 글리코실트랜스퍼라제라는 사실을 제시해준다. 이러한 가설은 orf26 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 33 참조).

orf27 유전자는 스트렙토마이세스 프라디애에서 틸로신 생합성에 관여하는 NDP-헥소스 3,5-(또는 5-) 에피머라제를 암호화하는 tylCVII 유전자에 의해 암호화된 단백질과 70% 동일성(BLAST 프로그램을 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: N. Bate et al., 2000; 젠뱅크 수탁 번호: AAD41825; BLAST 스코어: 243]. 보다 특히, TylCVII는 미카로스 생합성에 관여하는 헥소스 3,5-(또는 5-) 에피머라제이다. 이와 같이, 비교적 밀접한 또 다른 항생제에 대한 생합성 경로, 보다 특히 미카로스 생합성에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf27 유전자가 에피머라제를 암호화한다는 사실을 제시해준다. 이러한 가설은 orf27 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 34 참조). BLAST 프로그램을 사용하여 수득된 밀접한 서열 분석 결과는, orf27 유전자가 미카로스 생합성에 필요한 에피머화 반응에 책임이 있는 5-에피머라제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 4 참조).

orf28c의 서열을 초기에 부분적으로 결정하였는데, 이는 대략 450개 염기쌍 영역의 서열 만이 서열 분석 후에 결정되었기 때문이다(이러한 영역은 서열 번호 106의 불완전 서열에서 "N"으로 상징된다). 그럼에도 불구하고, 이러한 ORF의 부분 서열(서열 번호 111)은 상기 설명된 바와 같은 각종 컴퓨터 프로그램을 이용한 분석에 사용되었다. 따라서, orf28c 유전자가, 스트렙토마이세스 더모톨레란스(Streptomyces thermotolerans)에서 카보마이신 생합성에 관여하는 조절성 단백질을 암호화하는 acyB2 유전자에 의해 암호화된 단백질과, 결정된 서열(Orf28c 단백질의 부분 서열인 서열 번호 112) 상에서 64% 동일성(BLAST 프로그램을 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다는 것을 결정할 수 있었다[참조: A. Arisawa et al., 1993; 젠뱅크 수탁 번호: JC2032; BLAST 스코어: 329]. 이와 같은, 비교적 밀접한 항생제에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은, orf28c 유전자가 스피라마이신 생합성에 관여하는 조절성 단백질을 암호화한다는 사실을 제시해준다. 이러한 가설은 orf28c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 스트렙토마이세스 프라디애에서 틸로신 생합성에 관여하는 조절성 단백질인 TylR 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다[참조: N. Bate et al., 1999; 젠뱅크 수탁 번호: AAF29380; BLAST 스코어: 167].

결정되지 않은 서열의 어느 한쪽에 위치한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 orf28c 유전자를 증폭시키고, 이를 발현 벡터 내로 아클로닝시키는 것이 가능하였다. 따라서, orf28c 유전자의 과발현이 OSC2 균주에서 스피라마이신 생산을 상당히 증가시킨다는 사실을 결정할 수 있었다(실시예 24 참조). 이는, orf28c 유전자를 과발현시키면, 스피라마이신 생산이 증가된다는 것을 입증해주며, 스피라마이신에 대한 생합성 경로의 조절인자로서의 이의 역할을 확인시켜 준다.

orf28c의 부분 서열을 후속 완성시키고, 대략 450개 염기쌍의 결손 영역을 결정하였다(서열 번호 140 및 서열 번호 141 참조). 이러한 ORF의 완전한 서열(서열 번호 141)은 상기 설명된 바와 같은 각종 컴퓨터 프로그램을 이용한 분석에 사용되었다. 따라서, orf28c 유전자가, 스트렙토마이세스 더모톨레란스에서 카보마이신 생합성에 관여하는 조절성 단백질을 암호화하는 acyB2 유전자에 의해 암호화된 단백질과, 결정된 서열(Orf28c 단백질의 완전한 서열인 서열 번호 142) 상에서 69% 동일성(BLAST 프로그램을 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다는 것을 결정할 수 있었다[참조: A. Arisawa et al., 1993; 젠뱅크 수탁 번호: JC2032; BLAST 스코어: 451]. 이와 같은, 비교적 밀접한 항생제의 생합성을 조절하는데 관여하는 단백질과의 유사성은, orf28c 유전자가 스피라마이신 생합성에 관여하는 조절성 단백질을 암호화한다는 사실을 제시해준다. 이러한 가설은 orf28c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 스트렙토마이세스 프라디애에서 틸로신 생합성을 조절하는데 관여하는 조절성 단백질인 TylR 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다[참조: N. Bate et al., 1999; 젠뱅크 수탁 번호: AAF29380; BLAST 스코어: 224]. 상기 유전자를 과발현시킨 결과(실시예 24 참조), 이것이 스피라마이신 생합성 경로의 조절인자로 역할을 한다는 사실을 확인하였다.

orf28c 유전자를 불활성화시킨다. 따라서, 이로써 생성된 균주가 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 이는 orf28c 유전자가 명백하게도 스피라마이신 생합성에 관여하고 있고, 스피라마이신 생합성에 필수적이란 사실을 확인시켜 준다. 이들 결과를, 상기 유전자의 과발현 결과와 조합해 보면(실시예 24 참조), Orf28c가 스피라마이신 생합성에 필수적인 활성인자로서의 역할을 한다는 사실과 일치한다.

orf29 유전자는 소란기움 셀룰로숨(Sorangium cellulosum)에서 소라펜(soraphen) A(폴리케티드 부류의 항진균제)의 생합성에 관여하는 유전자 그룹 내에 위치한 것으로 예상되는 글리코실 하이드롤라제와 31% 동일성(BLAST 프로그램을 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다[참조: J. Ligon et al., 2002; 젠뱅크 수탁 번호: AAK19890; BLAST 스코어: 139]. 이와 같이, 비교적 밀접한 분자에 대한 생합성 경로에 관여하는 단백질과의 유사성은 orf29 유전자가 글리코실 하이드롤라제 활성을 지닌 단백질을 암호화한다는 사실을 제시해준다. 이러한 가설은 orf29 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 35 참조). CD-서치 프로그램(상기 참조)을 사용하여, orf29에 의해 암호화된 단백질의 서열을 분석한 결과는 orf29 유전자가 글리코실 하이드롤라제를 암호화한다는 사실을 또한 제시해준다.

SignalP 프로그램(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[참조: Nielsen, H., et al., 1997]을 사용하여, orf29로부터 추론된 단백질 서열을 분석한 결과, 상기 단백질이 위치 30과 31 사이에 예정된 절단 부위를 갖는 C-말단 시그널 서열(QSA/QA)를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 단백질은 세포외 단백질인 것으로 예상할 수 있다. 이는 글리코실하이드롤라제로서, 글리코실트랜스퍼라제 GimA 및/또는 GimB에 의한 당화에 의해 불활성화된 스피라마이신의 재활성화에 일정 역할을 할 수도 있다[참조: Gourmelen et al, 1998].

orf30c 유전자는 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 뉴클레오시드-디포스페이트 당 에피머라제와 31% 동일성(BLAST 프로그램을 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다[젠뱅크 수탁 번호: NP_600590; BLAST 스코어: 89]. 이러한 유사성은 orf30c 유전자가 에피머라제를 암호화한다는 사실을 제시해준다. 이러한 가설은 CD-서치 프로그램(상기 참조)을 사용하여 상기 서열을 분석한 결과, orf30c 유전자가 에피머라제를 암호화한다는 사실을 또한 제시해준다는 사실에 의해 뒷받침된다.

orf30c은 각각 345개 및 282개 아미노산의 2가지 가능한 단백질(서열 번호 116 및 117)을 제공해주는 2가지 가능한 개시 코돈(서열 번호 115 참조)을 나타낸다. 그러나, 코돈 활용은 단지 제2 ATG로부터 유래된 스트렙토마이세스에 전형적인 것이며; 또한, 제1 ATG와 제2 ATG 간의 서열의 추론된 단백질 서열은 동정된 밀접한 서열과 정렬되지 않는 반면, 보다 짧은 단백질 서열(제2 ATG로부터 유래됨: 서열 번호 144)은 이들 단백질의 개시부와 정확하게 정렬된다. 따라서, 이로부터, 제2 ATG가 정확한 개시 코돈이므로, 이러한 orf의 서열이 서열 번호 143에 제시된 것인데, 이는 일단 해독되면, 서열 번호 144의 단백질에 상응한다는 사실을 추론할 수 있다.

orf31 유전자는 스트렙토마이세스 코엘리콜로르에서 옥시도리턱타제와 52% 동일성(BLAST 프로그램을 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다[젠뱅크 수탁 번호: NP_631148; BLAST 스코어: 261]. 이러한 유사성은 orf31 유전자가 리덕타제를 암호화한다는 사실을 제시해준다. 이러한 가설은 CD-서치 프로그램(상기 참조)을 사용하여 상기 서열을 분석한 결과, orf31 유전자가 리덕타제를 암호화한다는 사실을 또한 제시해준다는 사실에 의해 뒷받침된다. 이러한 가설은 또한, orf31 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 36 참조).

orf31 유전자를 불활성화시킨다. 따라서, 이로써 생성된 균주가 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 이는 orf31 유전자가 실제로 스피라마이신 생합성에 관여한다는 사실을 확인시켜 준다. 따라서, 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질은 스피라마이신 생합성에 필수적인 생체전환 단계에 명백히 책임이 있다.

orf32c의 서열을 우선적으로, 부분적으로 결정하였는데(실시예 19 참조), 이는 5' 위치에서의 암호화 서열이 제2 단계에서만 결정되었기 때문이다. 그러나, 이러한 orf의 부분 서열(서열 번호 120)은 상기 설명된 바와 같은 각종 컴퓨터 프로그램을 이용한 분석에 사용되었다. 따라서, orf32c 유전자가, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르에서 GntR 계열의 조절성 단백질과, 결정된 서열(Orf32c 단백질의 부분 서열인 서열 번호 121) 상에서 47% 동일성(BLAST를 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다는 것을 결정할 수 있었다[젠뱅크 수탁 번호: NP_625576; BLAST 스코어: 229]. 이러한 유사성은, orf32c 유전자가 GntR 계열의 전사 조절인자를 암호화한다는 사실을 제시해준다. 이러한 가설은 orf32c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다.

orf32c의 부분 서열을 후속 완성시키고, 결손 영역을 결정하였다(서열 번호 140 및 서열 번호 145 참조). 이러한 orf의 완전한 서열은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 GntR 계열의 조절성 단백질과 44% 동일성(BLAST 프로그램을 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다[젠뱅크 수탁 번호: NP_824604; BLAST 스코어: 282]. 이러한 유사성은, orf32c 유전자가 GntR 계열의 전사 조절인자를 암호화한다는 사실을 제시해준다. 이러한 가설은 orf32c 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기타 유기체 내의 유사한 기능의 기타 단백질과 강력한 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 37 참조).

스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성 경로에 있어서의 상기 유전자의 기능을 연구할 목적으로 orf32c 유전자를 불활성화시켰다. 이로써 생성된 균주가 스피라마이신을 생산한다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 이는 orf32c 유전자가 스피라마이신 생합성에 필수적이지 않고 상기 세균의 생존에 필수적이지 않다는 것을 지시한다.

orf33 유전자는 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)의 가상의 단백질과 49% 동일성(BLAST 프로그램을 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다[젠뱅크 수탁 번호: NP_635564; BLAST 스코어: 54].

orf34c의 서열은 부분적이다. 사실상, 이러한 orf의 생성물과 데이터베이스 간에 수행된 비교 결과는, 상기 단백질의 C-말단 부분이 해당 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 생성물 내에 존재하지 않으므로, 상기 orf가 서열 분석된 영역 보다 더 길고 이러한 영역을 벗어나서 연장된다는 사실을 제시해준다. 그러나, 상기 ORF의 부분 서열은 상기 설명된 바와 같은 각종 컴퓨터 프로그램을 이용한 분석에 사용되었다. 따라서, orf34c 유전자가, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르로부터의 아라비노푸라노시다제와, 결정된 서열(Orf34c 단백질의 부분 서열인 서열 번호 150) 상에서 91% 동일성(BLAST를 사용하여 결정함)을 나타내는 단백질을 암호화한다는 것을 결정할 수 있었다[참조: Bentley et al., 2002; 젠뱅크 수탁 번호: NP_630049; BLAST 스코어: 654]. 에스. 코엘리콜로르(S. coelicolor)에서는, 이러한 아라비노푸라노시다제를 암호화하는 유전자가 2차 대사물 생합성에 관여하는 것으로 여겨지지 않는다. 따라서, 에스. 암보파시엔스에서는 상기 유전자가 스피라마이신 생합성에 관여하지 않는 것으로 예상된다.

본 발명의 주제는 또한, 고도로 엄격한 하이브리드화 조건 하에서, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 및 149의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나와 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드이다. 우선적으로는, 이들 폴리뉴클레오티드를 스트렙토마이세스 속 세균으로부터 분리시키고, 보다 우선적으로는 이들 폴리뉴클레오티드가 매크롤리드의 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하며, 보다 더 우선적으로는 이들 폴리뉴클레오티드가, 이들과 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질과 유사한 활성을 지닌 단백질을 암호화한다. 고도로 엄격한 하이브리드화 조건은 비-상동성 핵산 쇄의 하이브리드화에는 바람직하지 못한 하이브리드화 조건으로서 규정될 수 있다. 고도로 엄격한 하이브리드화 조건은, 예를 들어, 하이브리드화 온도 55 내지 65℃, 바람직하게는 하이브리드화 온도 55℃, 보다 더 바람직하게는 하이브리드화 온도 60℃, 가장 바람직하게는 하이브리드화 온도 65℃ 하에 문헌[참조: Church & Gilbert, 1984]에 기재된 완충액 중에서 하이브리드화시킨 다음, 55 내지 65℃, 바람직하게는 55℃, 보다 더 바람직하게는 60℃, 가장 바람직하게는 65℃ 하에 2X SSC 완충액에서 1회 이상의 세척을 수행한 다음, 55 내지 65℃, 바람직하게는 55℃, 보다 더 바람직하게는 60℃, 가장 바람직하게는 65℃ 하에 0.5X SSC 완충액에서 1회 이상 세척하는 조건으로서 서술될 수 있다. 상기 언급된 하이브리드화 조건은 당업자에게 공지된 기술에 따라서, 하이브리드화하고자 하는 핵산의 길이 또는 선택된 표지화 유형의 함수로서 조정할 수 있다. 적합한 하이브리드화 조건은, 예를 들어, 문헌[참조: F. Ausubel et al (2002)]에 따라서 조정할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 및 149의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오티드, 또는 상보적 서열의 폴리뉴클레오티드의 10, 12, 15, 18, 20 내지 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 또는 1900개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 85%, 보다 더 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 뉴클레오티드 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 우선적으로는, 이들 폴리뉴클레오티드를 스트렙토마이세스 속 세균으로부터 분리시키고, 보다 우선적으로는 이들 폴리뉴클레오티드가 매크롤리드의 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하며, 보다 더 우선적으로는 이들 폴리뉴클레오티드가, 이들과 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질과 유사한 활성을 지닌 단백질을 암호화한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 및 149의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나 또는 상보 서열의 폴리뉴클레오티드이다.

비교를 위해 서열을 최적으로 정렬시키는 것은 공지된 연산방식, 예를 들면, 특히 공급원[INFOBIOGEN resource center, Evry, France]로부터 입수 가능한 FASTA 패키지[참조: W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988 and W.R. Pearson, 1990]의 연산방식을 이용하여 컴퓨터 상에서 수행할 수 있다. 예시하자면, 서열 동일성(%)은 LFASTA[참조: K.-M. Chao et al., 1992] 또는 LALIGN[참조: X. Huang and W. Miller, 1991] 소프트웨어를 사용하여 결정할 수 있다. LFASTA 및 LALIGN 프로그램은 FASTA 패키지의 일부이다. LALIGN은 최적의 국소 정렬을 제공해주는데, 이러한 프로그램은 보다 정밀하지만, LFASTA 보다 느리다.

본 발명의 또 다른 국면은 상기 규정된 바와 같은 핵산 서열의 발현으로부터 비롯되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 우선적으로, 본 발명에 따르는 폴리펩티드는 서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 및 150; 또는 기능적 특성에는 전혀 영향을 미치지 않으면서, 모든 서열을 따라 1개 이상의 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실된 것을 제외한 상기 서열들 중의 하나; 또는 이들 서열의 변이체들 중의 하나 중에서 선택된 폴리펩티드의 10, 15, 20, 30 내지 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 또는 640개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 85%, 보다 더 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 이상의 아미노산 동일성을 나타낸다. 우선적으로는, 본 발명에 따르는 폴리펩티드가 스트렙토마이세스 속 세균에 의해 천연 상태로 발현되고, 보다 우선적으로는 이들 폴리펩티드가 매크롤리드의 생합성에 관여하며, 보다 더 우선적으로는 이들 폴리펩티드가, 이들과 동일성을 공유하는 폴리펩티드와 유사한 활성을 지닌다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 폴리펩티드가 서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 및 150의 폴리펩티드 서열; 또는 기능적 특성에는 전혀 영향을 미치지 않으면서, 모든 서열을 따라 1개 이상의 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실된 것을 제외한 상기 서열들 중의 하나; 또는 이들 서열의 변이체들 중의 하나로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따르는 폴리펩티드가 서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 및 150의 폴리펩티드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

비교를 위해 서열을 최적으로 정렬시키는 것은 공지된 연산방식, 예를 들면, 특히 공급원[INFOBIOGEN resource center, Evry, France]로부터 입수 가능한 FASTA 패키지[참조: W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988 and W.R. Pearson, 1990]의 연산방식을 이용하여 컴퓨터 상에서 수행할 수 있다. 예시하자면, 서열 동일성(%)은 공급원[INFOBIOGEN resource center, Evry, France]에 의해 규정된 바와 같은 디폴트(default) 파라미터를 이용하는 LFASTA[참조: K.-M. Chao et al., 1992] 또는 LALIGN[참조: X. Huang and W. Miller, 1991] 소프트웨어를 사용하여 결정할 수 있다. LFASTA 및 LALIGN 프로그램은 FASTA 패키지의 일부이다. LALIGN은 최적의 국소 정렬을 제공해주는데, 이러한 프로그램은 보다 정밀하지만, LFASTA 보다 느리다.

본 발명의 또 다른 국면은 상기 규정된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA에 관한 것이다. 우선적으로는, 이러한 재조합 DNA가 벡터이다. 보다 더 우선적으로는, 상기 벡터가 박테리오파아지, 플라스미드, 파아지미드, 통합 벡터, 포스미드, 코스미드, 셔틀 벡터, BAC(세균성 인공 염색체) 및 PAC(P1-유도된 인공 염색체) 중에서 선택된다. 예시하자면, 람다 파아지와 M13 파아지가 박테리오파아지로서 언급될 수 있다. 플라스미드로서, 이. 콜라이에서 복제되는 플라스미드, 예를 들면, pBR322 및 이의 유도체, pUC18 및 이의 유도체, pUC19 및 이의 유도체, pGB2 및 이의 유도체[참조: G. Churchward et al., 1984], pACYC177(젠뱅크 수탁 번호: X06402) 및 이의 유도체, 및 pACYC184(젠뱅크 수탁 번호: X06403) 및 이의 유도체가 언급될 수 있다. 또한, 스트렙토마이세스에서 복제되는 플라스미드, 예를 들면, pIJ101 및 이의 유도체, pSG5 및 이의 유도체, SLP1 및 이의 유도체, 및 SCP2* 및 이의 유도체[참조: Kieser et al. 2000]를 언급할 수 있다. 파아지미드로서, 예를 들면, pBluescript II 및 이의 유도체[특히, Stratagene(LaJolla, California, USA) 회사로부터 시판됨], pGEM-T 및 이의 유도체[Promega(Madison, Wisconsin, USA) 회사로부터 시판됨], [lacuna] IS117 통합 시스템[참조: Kieser et al., 2000]을 언급할 수 있다. 포스미드로서, 예를 들면, 포스미드 pFOS1[New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA 회사로부터 시판됨] 및 이의 유도체를 언급할 수 있다. 코스미드로서, 예를 들면, 코스미드 SuperCos 및 이의 유도체[특히, Stratagene(LaJolla, California, USA) 회사로부터 시판됨] 및 코스미드 pWED15[참조: Wahl et al., 1987] 및 이의 유도체가 언급될 수 있다. 셔틀 벡터로서, 이. 콜라이/스트렙토마이세스 셔틀 플라스미드, 예를 들면, pIJ903 및 이의 유도체, 플라스미드 pUWL, pCAO106, pWHM3 및 pOJ446 시리즈 및 이의 유도체[참조: Kieser et al. 2000], 및 이. 콜라이/스트렙토마이세스 셔틀 BAC, 예를 들면, WO 01/40497에 기재된 것을 언급할 수 있다. BAC (세균성 인공 염색체)로서, 예를 들면, BAC pBeloBAC11(젠뱅크 수탁 번호: U51113)를 언급할 수 있다. PAC(P1-유도된 인공 염색체)로서, 예를 들면, 벡터 pCYPAC6(젠뱅크 수탁 번호: AF133437)를 언급할 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따르는 벡터가 pOS49.1, pOS49.11, pOSC49.12, pOS49.14, pOS49.16, pOS49.28, pOS44.1, pOS44.2, pOS44.4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, pOS49.88, pOS49.106, pOS49.120, pOS49.107, pOS49.32, pOS49.43, pOS49.44, pOS49.50, pOS49.99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPM1, pBXL1111, pBXL1112, pBXL1113, pSPM520, pSPM521, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74, pSPM75, pSPM79, pSPM83, pSPM107, pSPM543 및 pSPM106 중에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 국면은 생물학적 시스템에서 상기 언급된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 허용해 주는 숙주 세포와 적합한 발현 벡터를 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다. 본 발명에 따르는 발현 벡터는 상기 언급된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 당업자에게 널리 공지된 각종 숙주 세포에서 본 발명에 따르는 각종 폴리펩티드의 발현을 위해 의도될 수 있다. 예를 들면, 원핵성 발현 시스템, 예를 들어, 세균 이. 콜라이에서의 발현 시스템, 및 진핵성 발현 시스템, 예를 들어, 곤충 세포에서의 발현을 허용해 주는 바쿨로바이러스 발현 시스템, 및 효모 세포에서의 발현을 허용해 주는 발현 시스템, 또는 포유류 세포, 특히 사람 세포에서의 발현을 허용해 주는 발현 시스템을 언급할 수 있다. 이러한 시스템에 사용될 수 있는 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있는데, 원핵성 세포에 관해서는, 예를 들어, 이. 콜라이에서의 발현 벡터, 예를 들면, pET[Stratagene (LaJolla, California, USA) 회사에 의해 시판됨], GATEWAY 계열의 벡터[Invitrogen (Carlsbad, California, USA) 회사에 의해 시판됨], pBAD 계열의 벡터[Invitrogen (Carlsbad, California, USA) 회사에 의해 시판됨], pMAL 계열의 벡터[New England Bioloabs Inc. (Beverly, Massachussetts, USA) 회사에 의해 시판됨], 및 공개문헌[참조: B. Wilms et al., 2001]에 언급된 람노스-유도성 발현 벡터 및 이의 유도체를 언급할 수 있고; 또한, 스트렙토마이세스에서의 발현 벡터, 예를 들면, 벡터 pIJ4123, pIJ6021, pPM927, pANT849, pANT 850, pANT 851, pANT1200, pANT1201 및 pANT1202, 및 이의 유도체[참조: Kieser et al., 2000]를 언급할 수 있다. 효모 세포에 관해서는, 예를 들어, 벡터 pESC[Stratagene (LaJolla, California, USA) 회사에 의해 시판됨]를 언급할 수 있다. 곤충 세포에서의 발현을 허용해 주는 바쿨로바이러스 발현 시스템에 관해서는, 예를 들어, 벡터 BacPAK6[BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, California, USA) 회사에 의해 시판됨]를 언급할 수 있다. 포유류 세포에 관해서는, 예를 들어, CMV(시토메갈로바이러스) 즉발 초기(immediate early) 유전자 프로모터를 포함하는 벡터[예를 들면, Stratagene (LaJolla, California, USA) 회사에 의해 시판된 벡터 pCMV 및 이의 유도체], 또는 공포형성(vacuolating) 원숭이 바이러스의 SV40 초기 프로모터를 포함하는 벡터[예를 들면, Stratagene (LaJolla, California, USA) 회사에 의해 시판된 벡터 pSG5]를 언급할 수 있다.

본 발명은 또한,

a) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 적합한 벡터 내로 삽입하는 단계;

c) 이와 같이 조건화된 배양 배지 또는 세포 추출물을, 예를 들어, 초음파 처리하거나 삼투압 쇽에 의해 회수하는 단계;

를 포함하는, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드의 생성 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르는 재조합 폴리펩티드는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[참조: F. Ausubel et al., (2002)]에 언급된 방법에 따라서, 적당한 일련의 크로마토그래피 칼럼 상으로 통과시킴으로써 정제할 수 있다. 예시하자면, 생성하고자 하는 폴리펩티드에 짧은 폴리히스티딘 서열을 부가하는 것으로 이루어진 "히스티딘-태그" 기술을 언급할 수 있는데, 이는 상기 폴리펩티드가 닉켈 칼럼 상에서 정제될 수 있게 해준다. 본 발명에 따르는 폴리펩티드는 시험관내 합성 기술에 의해 제조할 수도 있다. 이러한 기술의 예를 들면, 본 발명에 따르는 폴리펩티드를 "신속한 해독 시스템(RTS)"[Roche Diagnostics France S.A., Meylan, France 회사에 의해 시판됨]을 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 또 다른 국면은 본 발명에 따르는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 재조합 DNA 및/또는 하나 이상의 발현 벡터를 도입시킨 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 국면은 하나 이상의 매크롤리드에 대한 생합성 경로의 특정 단계에서 차단된 미생물에 관한 것이다. 이점은 첫째, 돌연변이된 단백질의 기능을 연구하는데 있고, 둘째 생합성 중간체를 생산하는 미생물을 생성시키는데 있다. 이들 중간체는 임의로 분리 후, 특정 성분을 생산 배지에 부가함으로써 변형시키거나, 또는 이로써 돌연변이된 미생물에, 상기 중간체를 기질로서 사용함으로써 이를 변형시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 기타 유전자를 도입함으로써 변형시킬 수 있다. 따라서, 이들 중간체는 화학적, 생화학적, 효소적 및/또는 미생물적으로 변형시킬 수 있다. 매크롤리드에 대한 생합성 경로의 특정 단계에서 차단된 미생물은, 이러한 매크롤리드(들)를 생산하는 미생물에서 이러한 매크롤리드(들)의 생합성에 관여하는 하나 이상의 단백질의 기능을 불활성화시킴으로써 수득할 수 있다. 불활성화된 단백질(들)에 따라서, 상기 매크롤리드(들)에 대한 생합성 경로의 각종 단계에서 차단된 미생물을 수득할 수 있다. 이러한 단백질(들)의 불활성화는 당업자에게 공지된 모든 방법에 의해 수행할 수 있는데, 예를 들어, 상기 단백질(들)을 암호화하는 유전자에서 돌연변이 유발시키거나 또는 상기 단백질(들)을 암호화하는 메신저 RNA(s)에 상보적인 하나 이상의 안티센스 RNA(s)를 발현시킴으로써 수행할 수 있다. 상기 돌연변이 유발은, 예를 들여, 방사선조사, 돌연변이 유발성 화학 제제의 작용, 부위-지시된 돌연변이 유발, 유전자 대체, 또는 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 돌연변이 유발에 적합한 조건은, 예를 들어, 문헌[참조: T. Kieser et al., (2000) and Ausubel et al., (2002)]에 기재된 교시에 따라서 조정할 수 있다. 돌연변이 유발은 시험관내 또는 원위치에서, 고려 중인 유전자 중의 하나 이상의 염기를 억제, 치환, 결실 및/또는 부가시키거나, 또는 유전자 불활성화시킴으로써 수행할 수 있다. 이러한 돌연변이 유발은 상기 언급된 바와 같은 서열을 포함하는 유전자에서 수행할 수 있다. 우선적으로는, 매크롤리드에 대한 생합성 경로의 특정 단계에서 차단된 미생물이 스트렙토마이세스 속 세균이다. 보다 우선적으로는, 문제의 매크롤리드(들)의 생합성에 관여한 하나 이상의 단백질의 기능을 불활성화시키는 것은 돌연변이 유발에 의해 수행한다. 보다 더 우선적으로는, 문제의 매크롤리드가 스피라마이신이고 돌연변이 유발(들)이 수행되는 미생물이 에스. 암보파시엔스 균주이다. 보다 우선적으로는, 돌연변이 유발이 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 및 149의 서열 하나 이상에 상응하는 서열들 중의 하나를 포함하는 하나 이상의 유전자에서 수행된다. 바람직하게는, 돌연변이 유발(들)이 유전자 불활성화에 의해 수행된다. 가장 바람직하게는, 돌연변이 유발이 서열 번호 13에 상응하는 서열을 포함하는 유전자의 유전자 불활성화로 이루어진다.

예시하자면, 이러한 미생물의 예로서 다음 미생물을 언급할 수 있다: OS49.16(orf3:: Ωhyg, 실시예 2 참조), OS49.67(orf3 동위상 결실, 실시예 6 참조), OS49.107(orf8:: Ωhyg, 실시예 7 참조), OS49.50(orf10:: Ωhyg, 실시예 8 참조), SPM21(orf2::att3Ωaac-, 실시예 10 참조), SPM22(orf2::att3 동위상 결실, 실시예 10 참조), SPM501(orf6*::att1Ωhyg+, 실시예 14 참조), SPM502(orf6*::att1 동위상 결실, 실시예 14 참조), SPM507(orf12::att3Ωaac-, 실시예 11 참조), SPM508(orf13c::att3Ωaac-, 실시예 12 참조), 및 SPM509(orf14::att3Ωaac-, 실시예 13 참조), SPM107(orf28c::att3aac+, 실시예 29 참조), SPM543(orf31::att3aac+, 실시예 30 참조), SPM106(orf32c::att3aac+, 실시예 31 참조).

본 발명의 또 다른 국면은 상기 언급된 바와 같은, 매크롤리드에 대한 생합성 경로의 특정 단계에서 차단된 미생물을 사용하여, 매크롤리드 생합성 중간체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 상기 언급된 바와 같은, 매크롤리드에 대한 생합성 경로의 특정 단계에서 차단된 미생물을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 이와 같이 조건화된 배양 배지 또는 세포 추출물을, 예를 들어, 초음파 처리하거나 삼투압 쇽에 의해 회수하는 단계; 및 전 단계에서 수득된 세포 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 상기 생합성 중간체를 분리 및 정제하는 단계로 이루어진다. 상기 미생물의 배양 조건은 당업자에게 널리 공지된 기술에 따라서 결정할 수 있다. 배양 배지는, 예를 들어, 스트렙토마이세스, 특히 스트렙토마이세스 암보파시엔스에 대한 SL11 배지 또는 MP5 배지일 수 있다[참조: Pernodet et al., 1993]. 당업자는 특히, 스트렙토마이세스의 배양에 관해서는 문헌[참조: Kieser et al., (2000)]의 교시를 참조할 수 있다. 생성된 중간체는 당업자에게 공지된 모든 기술에 의해 회수할 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 미국 특허 제3,000,785호에 교시된 기술, 보다 특히 상기 특허에 기재된 스피라마이신 추출 방법을 참조할 수 있다.

본 발명의 또 다른 국면은 상기 언급된 바와 같은, 매크롤리드에 대한 생합성 경로의 특정 단계에서 차단된 미생물을 사용하여, 매크롤리드로부터 유도된 분자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 상기 방법에 따라서 생합성 중간체를 수득하는 단계; 및 이로써 생성된 중간체를 임의로 해당 배지로부터 분리시킨 후에, 이러한 중간체를 변형시키는 단계로 이루어진다. 상기 미생물의 배양 조건은 당업자에게 널리 공지된 기술에 따라서 결정할 수 있다. 배양 배지는, 예를 들어, 스트렙토마이세스, 특히 스트렙토마이세스 암보파시엔스에 대한 SL11 배지 또는 MP5 배지일 수 있다[참조: Pernodet et al., 1993]. 당업자는 특히, 스트렙토마이세스의 배양에 관해서는 문헌[참조: Kieser et al., (2000)]의 교시를 참조할 수 있다. 생성된 중간체는 임의 분리 후, 적합한 성분을 생산 배지에 부가함으로써 변형시키거나, 또는 해당 미생물에, 상기 중간체를 기질로서 사용함으로써 이를 변형시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 기타 유전자를 도입함으로써 변형시킬 수 있다. 따라서, 이들 중간체는 화학적, 생화학적, 효소적 및/또는 미생물적으로 변형시킬 수 있다. 보다 우선적으로는, 문제의 매크롤리드가 스피라마이신이고 돌연변이 유발(들)이 수행되는 미생물이 에스. 암보파시엔스 균주이다.

본 발명은 또한, 스피라마이신 I은 생산하지만, 스피라마이신 II와 III은 생산하지 못하는 미생물에 관한 것이다. 이러한 미생물은 스피라마이신 I의 생합성에 필요한 유전자 모두를 포함하지만, 스피라마이신 II와 III은 생산하지 못하는데, 이는 서열 번호 13에 상응하는 서열 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하고 서열 번호 14의 폴리펩티드 또는 이의 변이체들 중의 하나를 암호화하는 유전자가 발현되지 않거나 또는 불활성화되었기 때문이다. 상기 단백질의 불활성화는 당업자에게 공지된 모든 방법, 예를 들면, 상기 단백질을 암호화하는 유전자에서 돌연변이 유발시키거나 또는 상기 단백질을 암호화하는 메신저 RNA에 상보적인 안티센스 RNA를 발현시킴으로써 수행할 수 있는데, orf5*의 발현이 이러한 조작에 의해 영향을 받을 경우에는, orf5* 유전자가 정확하게 발현되도록 또 다른 변형을 수행하는 것이 필요할 것이란 사실을 인지해야 한다. 돌연변이 유발은 암호화된 단백질을 불활성으로 만들거나 또는 이로부터 이의 발현 또는 해독을 방지하기 위해 비-암호화 서열 또는 암호화 서열에서 수행할 수 있다. 돌연변이 유발은 부위-지시된 돌연변이 유발, 유전자 대체, 또는 당업자에게 공지된 기타 모든 방법에 의해 수행할 수 있다. 이러한 돌연변이 유발에 적합한 조건은, 예를 들어, 문헌[참조: T. Kieser et al., (2000) and Ausubel et al., (2002)]에 기재된 교시에 따라서 조정할 수 있다. 돌연변이 유발은 시험관내 또는 원위치에서, 고려 중인 유전자 중의 하나 이상의 염기를 억제, 치환, 결실 및/또는 부가시키거나, 또는 유전자 불활성화시킴으로써 수행할 수 있다. 미생물은 또한, 서열 번호 13의 서열 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하고 서열 번호 14의 폴리펩티드 또는 이의 변이체들 중의 하나를 암호화하는 유전자를 포함하지 않으면서, 스피라마이신에 대한 생합성 경로의 유전자를 발현시킴으로써 수득할 수 있다. 우선적으로는, 상기 미생물이 스트렙토마이세스 속 세균이다. 보다 우선적으로는, 스피라마이신 I은 생산하지만, 스피라마이신 II와 III은 생산하지 못하는 미생물이, 스피라마이신 I, II 및 III을 생산하는 출발 미생물로부터 수득된다. 보다 더 우선적으로는, 상기 미생물이 서열 번호 13의 서열 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하고 서열 번호 14의 폴리펩티드 또는 동일한 기능을 갖는 이의 변이체들 중의 하나를 암호화하는 유전자에서 돌연변이 유발시킴으로써 수득된다. 보다 더 우선적으로는, 이러한 돌연변이 유발이 유전자 불활성화에 의해 수행된다. 바람직하게는, 상기 미생물이 스피라마이신 I, II 및 III을 생산하는 에스. 암보파시엔스의 균주로부터 수득되는데, 서열 번호 13의 서열, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하는 유전자의 불활성화가 수행된다. 가장 바람직하게는, 유전자 불활성화가 서열 번호 13의 서열, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하는 유전자 또는 이의 일부를 동위상 결실시킴으로써 수행된다. 예시하자면, 스피라마이신 I은 생산하지만, 스피라마이신 II와 III은 생산하지 못하는 미생물로서, 균주 SPM502(orf6*::att1, 실시예 14 참조)를 언급할 수 있다.

본 발명은 또한,

- 다음 서열의 프라이머 쌍:

5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3'(서열 번호 138) 및

5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3'(서열 번호 139)

를 이용하고, 매트릭스로서 코스미드 pSPM36 또는 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 총 DNA를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 수득될 수 있는 유전자, 보다 바람직하게는 서열 번호 141의 암호화 서열의 유전자, 또는

- 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 유전자

를 과발현하는, 상기 언급된 바와 같이, 스피라마이신 I은 생산하지만, 스피라마이신 II와 III은 생산하지 못하는 미생물에 관한 것이다.

이러한 유전자의 서열의 한 예가 서열 번호 111(DNA)에 제시되어 있지만, 이러한 서열은 부분적인데, 이는 상응하는 암호화 서열의 3' 부분을 포함하지 않기 때문이다. 이러한 암호화 서열 부분을 단백질로 해독시킨 것이 서열 번호 112에 제시되어 있다. 당업자는 특히 실시예 24에 제시된 교시를 이용하여 이를 용이하게 완성할 수 있을 것이다. 서열 번호 111에서 결정되지 않은 서열을 제2 단계에서 결정하였는데, 이러한 orf(orf28c)의 완전한 서열이 서열 번호 141에 제시되어 있다. 이러한 암호화 서열을 단백질로 해독시킨 것이 서열 번호 142에 제시되어 있다. 실시예 24에는 orf28c 유전자의 클로닝 방법과, orf28c의 발현을 허용해 주는 발현 벡터의 생성 방법이 제시되어 있다. 상기 실시예는 또한, 균주 OSC2에서 orf28c 유전자를 과발현시키면, 이러한 균주에서의 스피라마이신 생산이 향상된다는 사실을 나타낸다. orf28c 유전자의 과발현은 이러한 유전자의 복사물 수를 증가시키고/시키거나 야생형 프로모터 보다 더 활성인 프로모터를 도입함으로써 획득될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자의 과발현이, 이러한 유전자의 과발현을 허용해 주는 재조합 DNA 작제물을 해당 미생물 내로 도입함으로써 획득된다. 바람직하게는, 이러한 재조합 DNA 작제물이 상기 유전자의 복사물 수를 증가시키고 상기 유전자의 과발현 획득을 가능하게 만든다. 이러한 재조합 DNA 작제물에서는, 유전자의 암호화 서열을, 야생형 프로모터 보다 더 활성인 프로모터의 제어 하에 위치시킬 수 있다. 예시하자면, 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 활성인 ptrc 프로모터[참조: E. Amann et al., 1988], 및 ermE* 프로모터를 언급할 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 작제물 pSPM75의 경우와 같이(실시예 24 참조), 도입된 orf28c 유전자의 복사물(들)을 ermE* 프로모터의 제어 하에 위치시킨다.

본 발명은 또한, 서열 번호 47의 암호화 서열을 갖거나 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 암호화 서열을 갖는 유전자를 과발현하기도 하는, 상기 언급된 바와 같이, 스피라마이신 I은 생산하지만, 스피라마이신 II와 III은 생산하지 못하는 미생물에 관한 것이다. 우선적으로는, 이러한 미생물이 2003년 2월 26일자로 기탁 기관{Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures and Microorganisms] (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France}에 등록 번호 I-2977로 기탁된 균주 SPM502 pSPM525이다.

본 발명은 또한, 스피라마이신 I의 생성 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 상기 언급된 바와 같이, 스피라마이신 I은 생산하지만, 스피라마이신 II와 III은 생산하지 못하는 미생물을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 이와 같이 조건화된 배양 배지 또는 세포 추출물을 회수하는 단계; 및 전 단계에서 수득된 세포 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 스피라마이신 I을 분리 및 정제하는 단계로 이루어진다. 상기 미생물의 배양 조건은 당업자에게 널리 공지된 기술에 따라서 결정할 수 있다. 배양 배지는, 예를 들어, 스트렙토마이세스, 특히 스트렙토마이세스 암보파시엔스에 대한 SL11 배지 또는 MP5 배지일 수 있다[참조: Pernodet et al., 1993]. 당업자는 특히, 스트렙토마이세스의 배양에 관해서는 문헌[참조: Kieser et al., (2000)]의 교시를 참조할 수 있다. 생성된 스피라마이신 I은 당업자에게 공지된 모든 기술에 의해 회수할 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 미국 특허 제3,000,785호에 교시된 기술, 보다 특히 상기 특허에 기재된 스피라마이신 추출 방법을 참조할 수 있다.

본 발명의 또 다른 국면은 미생물의 매크롤리드 생산을 향상시키기 위한, 본 발명에 따르는 뉴클레오티드 서열의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 규정된 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자에서 유전자 변형을 나타내고/내거나 상기 규정된 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자를 과발현하는 매크롤리드-생산 돌연변이체 미생물에 관한 것이다. 상기 유전자 변형은 보다 큰 활성을 지닌 하나 이상의 단백질을 발현할 목적으로 또는 이러한 단백질(들)을 보다 높은 수준으로 발현할 목적으로, 고려 중인 유전자(들) 내의 하나 이상의 염기를 억제, 치환, 결실 및/또는 부가하는 것으로 이루어질 수 있다. 고려 중인 유전자의 과발현은 이러한 유전자의 복사물 수를 증가시키고/시키거나 야생형 프로모터 보다 더 활성인 프로모터를 도입함으로써 획득될 수 있다. 예시하자면, 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 활성인 ptrc 프로모터[참조: E. Amann et al., 1988], 및 ermE* 프로모터[참조: Bibb et al., 1985 and Bibb et al., 1994]를 언급할 수 있다. 따라서, 고려 중인 유전자의 과발현은, 이러한 유전자의 과발현을 허용해 주는 본 발명에 따르는 재조합 DNA 작제물을, 고려 중인 매크롤리드-생산 미생물 내로 도입함으로써 획득할 수 있다. 구체적으로 언급하면, 매크롤리드 생합성의 특정 단계들이 제한성이고, 이들 제한성 단계에 관여한 야생형 단백질(들) 보다 활성이거나 이들 단백질 보다 높은 수준으로 발현되는 하나 이상의 단백질이 발현되는 경우에는, 관련 매크롤리드(들)의 생산을 향상시키는 것이 가능하다. 틸로신의 생산율을 증가시키는 것은, 예를 들어, 매크로신을 틸로신으로 전환시키는 제한성 메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자를 복제시킴으로써 스트렙토마이세스 프라디애에서 획득할 수 있다[참조: R. Baltz, 1997]. 보다 활성인 단백질의 발현 생성은 특히 돌연변이 유발에 의해 획득할 수 있는데; 당업자는 예를 들어, 이와 관련하여 문헌[F. Ausubel et al., (2002)]의 연구 내용을 참조할 수 있다. 우선적으로는, 이들의 매크롤리드 생산 측면에서 향상된 돌연변이체 미생물이 스트렙토마이세스 속 세균이다. 보다 우선적으로는, 문제의 매크롤리드가 스피라마이신이고, 돌연변이 유발(들)이 수행되는 미생물은 에스. 암보파시엔스 균주이다. 보다 우선적으로는, 유전자 변형이 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 및 149의 하나 이상에 상응하는 서열들 중의 하나, 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하는 하나 이상의 유전자에서 수행된다. 바람직하게는, 상기 미생물이 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 및 149의 하나 이상에 상응하는 서열들 중의 하나, 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하는 하나 이상의 유전자를 과발현한다. 바람직하게는, 상기 미생물이 서얼 번호 111 또는 141에 상응하는 서열, 또는 이의 변이체들 중의 하나, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 서열들 중의 하나를 포함하는 유전자를 과발현한다. 서열 번호 111에 제시된 서열은 부분적이지만; 당업자는 특히 실시예 24에 제시된 교시를 이용하여 이를 용이하게 완성할 수 있을 것이다. 서열 번호 111에 결정되지 않은 서열을 제2 단계에서 결정하고, 이러한 orf(orf28c)의 완전한 서열이 서열 번호 141에 제시되어 있다. 이러한 암호화 서열을 단백질로 해독한 것이 서열 번호 142에 제시되어 있다. 실시예 24에는 orf28c 유전자의 클로닝 방법과, orf28c의 발현을 허용해 주는 발현 벡터의 생성 방법이 제시되어 있다. 상기 실시예는 또한, 균주 OSC2에서 orf28c 유전자를 과발현시키면, 이러한 균주에서의 스피라마이신 생산이 향상된다는 사실을 나타낸다. orf28c 유전자의 과발현은 이러한 유전자의 복사물 수를 증가시키고/시키거나 야생형 프로모터 보다 더 활성인 프로모터를 도입함으로써 획득될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자의 과발현이, 이러한 유전자의 과발현을 허용해 주는 재조합 DNA 작제물을 해당 미생물 내로 도입함으로써 획득된다. 바람직하게는, 이러한 재조합 DNA 작제물이 상기 유전자의 복사물 수를 증가시키고 상기 유전자의 과발현 획득을 가능하게 만든다. 이러한 재조합 DNA 작제물에서는, 유전자의 암호화 서열을, 야생형 프로모터 보다 더 활성인 프로모터의 제어 하에 위치시킬 수 있다. 예시하자면, 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 활성인 ptrc 프로모터[참조: E. Amann et al., 1988], 및 ermE* 프로모터를 언급할 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 작제물 pSPM75의 경우와 같이(실시예 24 참조), 도입된 orf28c 유전자의 복사물(들)을 ermE* 프로모터의 제어 하에 위치시킨다.

본 발명의 또 다른 국면은 전 단락에서 언급된 미생물을 사용하여, 매크롤리드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 전 단락에서 규정된 미생물을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 이와 같이 조건화된 배양 배지 또는 세포 추출물을 회수하는 단계; 및 전 단계에서 수득된 세포 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 생성된 매크롤리드(들)를 분리 및 정제하는 단계로 이루어진다. 상기 미생물의 배양 조건은 당업자에게 널리 공지된 기술에 따라서 결정할 수 있다. 배양 배지는, 예를 들어, 스트렙토마이세스, 특히 스트렙토마이세스 암보파시엔스에 대한 SL11 배지 또는 MP5 배지일 수 있다[참조: Pernodet et al., 1993]. 당업자는 특히, 스트렙토마이세스의 배양에 관해서는 문헌[Kieser et al., (2000)]의 교시를 참조할 수 있다. 이로써 생성된 매크롤리드는 당업자에게 공지된 모든 기술에 의해 회수할 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 미국 특허 제3,000,785호에 교시된 기술, 보다 특히 상기 특허에 기재된 스피라마이신 추출 방법을 참조할 수 있다. 우선적으로는, 이러한 방법에 사용된 미생물이 스트렙토마이세스 속 세균이다. 보다 우선적으로는, 문제의 매크롤리드가 스피라마이신이고, 이들의 스피라마이신 생산 측면에서 향상된 돌연변이체 미생물이 에스. 암보파시엔스이다.

본 발명의 또 다른 국면은 하이브리드 항생제를 제조하기 위한, 본 발명에 따르는 서열 및/또는 벡터의 용도에 관한 것이다. 구체적으로 언급하면, 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오티드는, 기질 특이성 측면에서 변형을 유발시키는 하나 이상의 돌연변이체 단백질을 발현하는 미생물을 수득하는데 사용될 수 있거나, 또는 하이브리드 항생제 제조 목적으로 수 많은 항생제-생산 미생물에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오티드는 생산자 미생물들 간의 유전자 전이에 의해, 유리한 약리학적 특성을 지닌 하이브리드 항생제를 생성시킬 수 있다[참조: Hopwood et al., 1985a, Hopwood et al., 1985b, Hutchinson et al., 1989]. 하이브리드 항생제 생성을 가져다 줄 수 있는 유전 공학 원리는 호프우드(Hopwood) 등에 의해(1981년) 가장 먼저 제안되었다. 항생제의 생합성에 관여하는 효소가, 구조적으로는 관련되긴 하지만 이의 천연 기질과는 상이한 기질을 종종 수용한다는 사실이 제안되었다. 항생제에 대한 생합성 경로의 유전자에 의해 암호화된 효소가 1차 대사 효소 보다 덜 엄격한 기질 특이성을 나타낸다는 사실이 일반적으로 받아들여지고 있다[참조: Hopwood 1981, Hutchinson 1988, Robinson 1988]. 따라서, 다수의 비-천연 기질이 항생제-생산 미생물에 의해, 이들 항생제에 대한 생합성 경로의 돌연변이체 또는 정제된 효소로 전환된다는 것을 밝혀내는 것이 가능하였다[참조: Hutchinson 1988]. 이러한 교시를 이용하여, 당업자는 하이브리드 항생제를 생성시킬 목적으로, 기질 특이성 측면에서 변형을 유발시키는 하나 이상의 돌연변이체 단백질을 발현하는 미생물을 작제할 수 있다.

본 발명은 또한, 한 가지 이상의 생체전환을 수행하기 위한, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 재조합 DNA 및/또는 하나 이상의 발현 벡터 및/또는 하나 이상의 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따르는 하나 이상의 단백질을 적합한 발현 시그널의 제어 하에 발현시키는 세균성 또는 진균성 균주를 작제하는 것을 가능케 한다. 이어서, 이러한 균주를 사용하여 한 가지 이상의 생체전환을 수행할 수 있다. 이러한 생체전환은 완전 세포를 사용하거나, 또는 이러한 세포의 비세포성 추출물을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 생체전환은 생합성 경로 효소를 사용하여, 특정 분자를 유도된 형태로 전환시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Carreras et al., 2002]에는 신규한 에리트로마이신 유도체를 생성시키기 위한, 삭카로폴리스포라 에리트래아 및 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 균주의 용도가 기재되어 있다. 문헌[참조: Walczak et al., 2001]에는 데스아세틸아드리아미신(안트라사이클린 동족체)를 신규한 안트라사이클린으로 생체전환시키기 위한, 스트렙토마이세스 P450 모노옥시게나제의 용도가 기재되어 있다. 문헌[참조: Olonao et al., 1999]에는 엡실론-로도마이시논을 로도마이신 D로 생체전환시키기 위한, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)의 변형된 균주의 용도가 기재되어 있다. 당업자는 이러한 원리를 모든 생합성 중간체에 적용할 수 있다.

본 발명은 또한,

- 다음 서열의 프라이머 쌍:

5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3'(서열 번호 138) 및

5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3'(서열 번호 139)

을 이용하고, 매트릭스로서 코스미드 pSPM36 또는 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 총 DNA를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 수득될 수 있는 폴리뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 서열 번호 141의 폴리뉴클레오티드; 또는

을 포함하는 재조합 DNA에 관한 것이다.

우선적으로는, 이러한 재조합 DNA가 벡터이다. 보다 더 우선적으로는, 상기 벡터가 박테리오파아지, 플라스미드, 파아지미드, 통합 벡터, 포스미드, 코스미드, 셔틀 벡터, BAC(세균성 인공 염색체) 및 PAC(P1-유도된 인공 염색체) 중에서 선택된다. 예시하자면, 람다 파아지와 M13 파아지가 박테리오파아지로서 언급될 수 있다. 플라스미드로서, 이. 콜라이에서 복제되는 플라스미드, 예를 들면, pBR322 및 이의 유도체, pUC18 및 이의 유도체, pUC19 및 이의 유도체, pGB2 및 이의 유도체[참조: G. Churchward et al., 1984], pACYC177(젠뱅크 수탁 번호: X06402) 및 이의 유도체, 및 pACYC184(젠뱅크 수탁 번호: X06403) 및 이의 유도체가 언급될 수 있다. 또한, 스트렙토마이세스에서 복제되는 플라스미드, 예를 들면, pIJ101 및 이의 유도체, pSG5 및 이의 유도체, SLP1 및 이의 유도체, 및 SCP2* 및 이의 유도체[참조: Kieser et al. 2000]를 언급할 수 있다. 파아지미드로서, 예를 들면, pBluescript II 및 이의 유도체[특히, Stratagene(LaJolla, California, USA) 회사로부터 시판됨], pGEM-T 및 이의 유도체[Promega(Madison, Wisconsin, USA) 회사로부터 시판됨], λZAPII 및 이의 유도체[Stratagene(LaJolla, California, USA) 회사로부터 시판됨]를 언급할 수 있다. 통합 벡터로서, 예를 들어, 스트렙토마이세스에서 통합되는 벡터, 예를 들면, SLP1로부터 유도된 벡터[참조: Kieser et al, 2000], pSAM2로부터 유도된 벡터[참조: Kieser et al, 2000], PhiC31 파아지 통합 시스템을 이용하는 벡터[참조:Kieser et al, 2000][예를 들면, pSET152(참조: Bierman et al., 1992)] 또는 VWB 통합 시스템을 이용하는 벡터[참조: L. van Mellaert et al. 1998], 및 IS117 통합 시스템을 이용하는 벡터[참조: Kieser et al., 2000]을 언급할 수 있다. 포스미드로서, 예를 들면, 포스미드 pFOS1[New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA 회사로부터 시판됨] 및 이의 유도체를 언급할 수 있다. 코스미드로서, 예를 들면, 코스미드 SuperCos 및 이의 유도체[특히, Stratagene(LaJolla, California, USA) 회사로부터 시판됨] 및 코스미드 pWED15[참조: Wahl et al., 1987] 및 이의 유도체가 언급될 수 있다. 셔틀 벡터로서, 이. 콜라이/스트렙토마이세스 셔틀 플라스미드, 예를 들면, pIJ903 및 이의 유도체, 플라스미드 pUWL, pCAO106, pWHM3 및 pOJ446 시리즈 및 이의 유도체[참조: Kieser et al. 2000], 및 이. 콜라이/스트렙토마이세스 셔틀 BAC, 예를 들면, WO 01/40497에 기재된 것을 언급할 수 있다. BAC(세균성 인공 염색체)로서, 예를 들면, BAC pBeloBAC11(젠뱅크 수탁 번호: U51113)를 언급할 수 있다. PAC(P1-유도된 인공 염색체)로서, 예를 들면, 벡터 pCYPAC6(젠뱅크 수탁 번호: AF133437)를 언급할 수 있다. 보다 우선적으로는, 상기 재조합 DNA가 발현 벡터이다. 이러한 시스템에 사용될 수 있는 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있는데, 원핵성 세포에 관해서는, 예를 들어, 이. 콜라이에서의 발현 벡터, 예를 들면, pET[Stratagene (LaJolla, California, USA) 회사에 의해 시판됨], GATEWAY 계열의 벡터[Invitrogen (Carlsbad, California, USA) 회사에 의해 시판됨], pBAD 계열의 벡터[Invitrogen (Carlsbad, California, USA) 회사에 의해 시판됨], pMAL 계열의 벡터[New England Bioloabs Inc. (Beverly, Massachussetts, USA) 회사에 의해 시판됨], 및 공개문헌[참조: B. Wilms et al., 2001]에 언급된 람노스-유도성 발현 벡터 및 이의 유도체를 언급할 수 있고; 또한, 스트렙토마이세스에서의 발현 벡터, 예를 들면, 벡터 pIJ4123, pIJ6021, pPM927, pANT849, pANT 850, pANT 851, pANT1200, pANT1201 및 pANT1202, 및 이의 유도체[참조: Kieser et al., 2000]를 언급할 수 있다. 효모 세포에 관해서는, 예를 들어, 벡터 pESC[Stratagene (LaJolla, California, USA) 회사에 의해 시판됨]를 언급할 수 있다. 곤충 세포에서의 발현을 허용해 주는 바쿨로바이러스 발현 시스템에 관해서는, 예를 들어, 벡터 BacPAK6[BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, California, USA) 회사에 의해 시판됨]를 언급할 수 있다. 포유류 세포에 관해서는, 예를 들어, CMV(시토메갈로바이러스) 즉발 초기 유전자 프로모터를 포함하는 벡터[예를 들면, Stratagene (LaJolla, California, USA) 회사에 의해 시판된 벡터 pCMV 및 이의 유도체], 또는 공포형성 원숭이 바이러스의 SV40 초기 프로모터를 포함하는 벡터[예를 들면, Stratagene (LaJolla, California, USA) 회사에 의해 시판된 벡터 pSG5]를 언급할 수 있다. 본 발명의 또 다른 국면은 본 단락에서 언급된 하나 이상의 재조합 DNA를 도입시킨 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 국면은

a) 상기 단락에 기재된 바와 같은 하나 이상의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;

b) 상기 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;

를 포함하는, 폴리펩티드의 생성 방법에 관한 것이다.

이로써 생성된 재조합 폴리펩티드는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[참조: F. Ausubel et al., (2002)]에 언급된 방법에 따라서, 적당한 일련의 크로마토그래피 칼럼 상으로 통과시킴으로써 정제할 수 있다. 예시하자면, 생성하고자 하는 폴리펩티드에 짧은 폴리히스티딘 서열을 부가하는 것으로 이루어진 "히스티딘-태그" 기술을 언급할 수 있는데, 이는 상기 폴리펩티드가 닉켈 칼럼 상에서 정제될 수 있게 해준다. 이러한 폴리펩티드는 시험관내 합성 기술에 의해 제조할 수도 있다. 이러한 기술의 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 "신속한 해독 시스템(RTS)"[Roche Diagnostics France S.A., Meylan, France 회사에 의해 시판됨]을 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 또 다른 국면은

- 다음 서열의 프라이머 쌍:

5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3'(서열 번호 138) 및

5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3'(서열 번호 139)

을 이용하고, 매트릭스로서 코스미드 pSPM36 또는 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 총 DNA를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득될 수 있는 유전자, 보다 바람직하게는 서열 번호 141의 암호화 서열의 유전자, 또는

- 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 유전자

이러한 유전자의 서열의 한 예가 서열 번호 111(DNA)에 제시되어 있지만, 이러한 서열은 부분적인데, 이는 상응하는 암호화 서열의 3' 부분을 포함하지 않기 때문이다. 이러한 암호화 서열 부분을 단백질로 해독시킨 것이 서열 번호 112에 제시되어 있다. 당업자는 특히 실시예 24에 제시된 교시를 이용하여 이를 용이하게 완성할 수 있을 것이다. 상기 실시예에는 orf28c 유전자의 클로닝 방법과, orf28c의 발현을 허용해 주는 발현 벡터의 생성 방법이 제시되어 있다. 상기 실시예는 또한, 균주 OSC2에서 orf28c 유전자를 과발현시키면, 이러한 균주에서의 스피라마이신 생산이 향상된다는 사실을 나타낸다. 바람직하게는,

- 다음 서열의 프라이머 쌍:

5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3'(서열 번호 138) 및

5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3'(서열 번호 139)

- 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 유전자

를 과발현하는 미생물이, 스트렙토마이세스 속 세균이고, 보다 더 바람직하게는 스트렙토마이세스 암보시엔스 종 세균이다. 바람직하게는, 상기 유전자의 과발현이, 상기 미생물을 발현 벡터로 형질전환시킴으로써 획득되고, 보다 바람직하게는 이러한 미생물 균주가 2003년 10월 6일자로 기탁 기관{Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)[National Collection of Cultures and Microorganisms] Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France}에 등록 번호 I-3101로 기탁된 균주 OSC2/pSPM75(1) 또는 균주 OSC2/pSPM75(2)이다.

본 발명의 또 다른 국면은 전 단락에서 언급된 미생물을 사용하여, 스피라마이신(들)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 전 단락에서 규정된 미생물을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 이와 같이 조건화된 배양 배지 또는 세포 추출물을 회수하는 단계; 및 전 단계에서 수득된 세포 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 생성된 스피라마이신(들)을 분리 및 정제하는 단계로 이루어진다. 상기 미생물의 배양 조건은 당업자에게 널리 공지된 기술에 따라서 결정할 수 있다. 배양 배지는, 예를 들어, 스트렙토마이세스, 특히 스트렙토마이세스 암보파시엔스에 대한 SL11 배지 또는 MP5 배지일 수 있다[참조: Pernodet et al., 1993]. 당업자는 특히, 스트렙토마이세스의 배양에 관해서는 문헌[Kieser et al., (2000)]의 교시를 참조할 수 있다. 이로써 생성된 스피라마이신(들)은 당업자에게 공지된 모든 기술에 의해 회수할 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 미국 특허 제3,000,785호에 교시된 기술, 보다 특히 상기 특허에 기재된 스피라마이신 추출 방법을 참조할 수 있다. 우선적으로는, 이러한 방법에 사용된 미생물이 스트렙토마이세스 속 세균이다. 보다 우선적으로는, 상기 미생물이 에스. 암보파시엔스 균주이다.

본 발명의 또 다른 국면은 서열 번호 47의 폴리뉴클레오티드, 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 유도된 폴리뉴클레오티드를, 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용해주는 프로모터의 제어 하에 위치시킨 발현 벡터에 관한 것이다. 스트렙토마이세스에서 사용될 수 있는 발현 벡터의 예는 상기 제시되어 있다. 우선적으로는, 이러한 발현 벡터가 플라스미드 pSPM524 또는 pSPM525이다.

본 발명의 또 다른 국면은 전 단락에서 규정된 벡터로 형질전환시킨 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 국면은 서열 번호 112의 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한,

- 다음 서열의 프라이머 쌍:

5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3'(서열 번호 138) 및

5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3'(서열 번호 139)

을 이용하고, 매트릭스로서 코스미드 pSPM36 또는 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 총 DNA를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득될 수 있는 유전자의 암호화 서열, 보다 바람직하게는 서열 번호 141의 암호화 서열의 유전자의 암호화 서열, 또는

로부터 해독된 서열에 상응하는 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 우선적으로는, 이들 폴리펩티드가 스트렙토마이세스 속 세균에 의해 천연 상태로 발현되고, 보다 우선적으로는 이들 폴리펩티드가 스피라마이신 생합성에 관여한다.

본 발명의 또 다른 국면은 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 전 단락에서 규정된 바와 같은 폴리펩티드의 발현을 허용해 주는 발현 벡터에 관한 것이다. 스트렙토마이세스에서 사용될 수 있는 발현 벡터의 예는 상기 제시되어 있다. 우선적으로는, 문제의 발현 벡터가 플라스미드 pSPM75이다.

도 1: 스피라마이신 I, II 및 III의 화학적 구조.

도 2: 해당 영역을 서열 분석하는데 사용된 코스미드.

도 3: 스피라마이신에 대한 생합성 경로에 관여한 유전자 그룹의 조직도.

도 4: 미카로스에 대해 제안된 생합성 경로.

도 5: 미카미노스에 대해 제안된 생합성 경로.

도 6: 포로사민에 대해 제안된 생합성 경로.

도 7: 스피라마이신 분자 및 중간체에 당을 부가하는 우선 순위.

도 8: 에스. 암보파시엔스에서 메톡시말로닐에 대해 제안된 생합성 경로. 이 경로는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 변종 아스코마이세티쿠스에서 메톡시말로닐의 생합성과 유사하게 제안되었다[참조: K. Wu et al., 2000].

도 9: 특정 유전자를 불활성화시키기 위한 단계:

A) 이. 콜라이에서는 복제되지만 스트렙토마이세스에서는 복제되지 않는 벡터 내로 표적 유전자를 클로닝하는 단계;

B) 내성 카세트를 (동일한 짧은 서열들 간의 재조합 또는 클로닝에 의해) 상기 표적 유전자 내로 삽입하는 단계;

C) 상기 플라스미드를 스트렙토마이세스 암보파시엔스 내로 도입하고(이. 콜라이와의 접합 또는 형질전환에 의함), 통합된 카세트를 갖는 클론을 선별한 다음, 유전자 대체물을 가지도록 벡터 부분을 상실한 클론을 스크리닝하는 단계;

D) 유전자 대체시킴으로써 표적 유전자를 불활성화시킨 돌연변이체 균주의 염색체 영역을 수득하는 단계.

도 10: 절제 가능한 카세트를 이용하여 표적 유전자를 개입중단시킨 경우에 수행할 수도 있는, 도 9에 기재된 방법에 따라서 유전자를 불활성화시킨 이후의 임의 단계:

E) 상기 돌연변이체 균주 내로, pSAM2의 xis 및 int 유전자를 수반하는 플라스미드 pOSV508를 도입하는 단계(이의 생성물은 상기 카세트를 둘러싸고 있는 attL 서열과 attR 서열 간의 부위-특이적 재조합에 의해 효과적으로 절제될 것이다);

F) 절제 가능한 카세트를 상실하고, 카세트가 내성을 제공하는 항생제에 민감한 클론을 생성하는 단계;

G) 항생제를 함유하지 않는 고형 배지 상에서 성장시키고 포자 형성시킨 후, 플라스미드 pOSV508이 높은 빈도로 상실된다. 따라서, 표적 유전자가 동위상 결실을 함유하는 티오스트렙톤에 대해 민감한 클론을 수득하는 것이 가능하다. 이와 같이 결실된 표적 유전자 서열은 PCR 증폭시키고 PCR 생성물을 서열 분석함으로써 제어할 수 있다.

도 11: 절제 가능한 카세트를 상동 재조합 실험에 사용할 목적으로, 이러한 카세트를 증폭시킴. 짧은 상동 서열을 통하여 상동 재조합시키는 기술이 문헌[참조: Chaveroche et al., 2000]에 기재되어 있다. 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한 39개 또는 40개 데옥시뉴클레오티드는, 불활성화시키고자 하는 유전자의 서열에 상응하는 서열을 포함하고, 가장 3' 부위에 위치한 20개 데옥시뉴클레오티드는 절제 가능한 카세트의 말단 중의 하나의 서열에 상응한다.

도 12: 문헌[참조: Chaveroche et al., 2000]에 기재된 기술을 사용하여 표적 유전자를 불활성화시키기 위한 작제물의 생성.

도 13: 플라스미드 pWHM3의 지도. 스트렙토 ori: 스트렙토마이세스 복제 기점.

도 14: 플라스미드 pOSV508의 지도.

도 15: 절제 가능한 카세트 구조의 예. 이는 attR 및 attL 부위[참조: Raynal et al., 1998]에 의해 둘러싸인[이들 간의 재조합 사건은 xis 및 int 유전자의 발현을 통하여 상기 카세트를 절제시킬 수 있을 것이다] Ωhyg 카세트[참조: Blondelet-Rouault et al., 1997]로 이루어진다.

도 16: 플라스미드 pBXL1111의 지도.

도 17: 플라스미드 pBXL1112의 지도.

도 18: 스피라마이신에 대한 미크로코쿠스 루테우스 균주의 민감성에 근거한, 스피라마이신 생성에 대한 미생물학적 시험. 사용된 미크로코쿠스 루테우스 균주는 스피라마이신에 대해서는 천연적으로 민감하지만 콘고시딘(congocidine)에 대해서는 내성인 균주이다. 시험하고자 하는 각종 스트렙토마이세스 균주를, 70ml 의 MP5 배지를 함유하는 500ml용 에를렌마이어 플라스크에서 배양하고, 2.5 x 10⁶개 포자/ml의 초기 농도로 접종하며, 250rpm으로 궤도 진탕시키면서 27℃ 하에 성장시킨다. 배양한지 48, 72 및 96시간 후에, 발효 과실즙(musts) 샘플을 취하고, 원심분리시킨다. 이들 상청액을 멸균용 배양 배지에서 10배 희석시킨 것을 본 시험에 사용한다. 콘고시딘에 대해서는 내성이지만 스피라마이신에는 민감한 미크로코쿠스 루테우스 지시 균주[참조: Gourmelen et al., 1998]를 12 x 12cm 사각형 디쉬에서 배양한다. 왓트만(Whatman) AA 종이 디스크를 각 상청액의 10배 희석물 70ℓ에 침지시키고, 디쉬 표면 상에 놓아둔다. 각종 농도(MP5 중의 2-4-8㎍/ml)의 스피라마이신 용액에 침지시킨 디스크를 표준 범위로서 희석시킨다. 이러한 디쉬를 37℃에서 24 내지 48시간 동안 항온 배양한다. 디쉬가 스피라마이신을 함유하는 경우, 이를 한천 내로 확산시키고 미크로코쿠스 루테우스 지시 균주의 성장을 억제시킨다. 이와 같이 억제시키면, 디스크 주변에 "할로"가 창출되는데, 이러한 할로는 미크로코쿠스 루테우스 균주가 성장하지 않은 영역을 반영한 것이다. 따라서, 상기 할로가 존재하는 것은 스피라마이신의 존재를 지시해주며, 이로써 문제의 에스. 암보파시엔스가 스피라마이신 생산자인지 아닌지를 결정할 수 있다. 표준 범위에 대해 수득된 억제 직경과 비교한 결과, 상기 균주에 의해 생산된 스피라마이신의 양에 관한 지표를 획득할 수 있다.

도 19: 균주 OSC2의 여과된 배양 배지 상청액에 대한 HPLC 크로마토그램.

도 20: 균주 SPM501의 여과된 배양 배지 상청액에 대한 HPLC 크로마토그램.

도 21: 균주 SPM502의 여과된 배양 배지 상청액에 대한 HPLC 크로마토그램.

도 22: 균주 SPM507의 여과된 배양 배지 상청액에 대한 HPLC 크로마토그램.

도 23: 균주 SPM508의 여과된 배양 배지 상청액에 대한 HPLC 크로마토그램.

도 24: 균주 SPM509의 여과된 배양 배지 상청액에 대한 HPLC 크로마토그램.

도 25: FASTA 프로그램을 사용하여 생성된 에스. 프라디애의 TylB 단백질(서열 번호 87)과, Orf3 단백질(서열 번호 29)의 정렬.

도 26: FASTA 프로그램을 사용하여 생성된 SrmD 단백질(서열 번호 16)과, 에스. 미카로파시엔스(S. mycarofaciens)의 MdmA 단백질(서열 번호 88)의 정렬.

도 27: 절제 가능한 카세트의 절제 후 잔여 부위 서열의 예. 진하게 표시된 것은 문헌[참조: Raynal et al., 1998]에 규정된 바와 같은 최소 att26 부위이다. 33개 뉴클레오티드의 상 1 서열(att1)은 서열 번호 104에 제시되어 있고, 34개 뉴클레오티드의 상 2 서열(att2)은 서열 번호 105에 제시되어 있으며, 35개 뉴클레오티드의 상 3 서열(att3)은 서열 번호 95에 제시되어 있다.

도 28: orf10 유전자의 다이아그램 표시, 사용된 PCR 프라이머의 위치 및 각 쌍의 프라이머를 사용하여 수득된 작제물.

도 29: 카세트 pac-oritT의 작제.

도 30: 코스미드 pWED2의 지도.

도 31: 스피라마이신에 대한 생합성 경로에 관여하는 유전자 그룹의 다이아그램 표시, 및 이. 콜라이에서 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2의 게놈 DNA 라이브러리의 코스미드를 분리시키기 위해 사용된 3가지 프로브의 위치(실시예 19 참조).

도 32: 이. 콜라이에서 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2의 게놈 DNA 라이브러리로부터 분리된 코스미드의 삽입물의 위치(실시예 19 참조). 신규한 코스미드 DNA 라이브러리.

도 33: 코스미드 pSPM36의 PstI-PstI 단편(플라스미드 pSPM58의 삽입물)의 아클로닝, 코스미드 pSPM36의 StuI-StuI 단편(플라스미드 pSPM72의 삽입물)의 아클로닝, 및 EcoRI-StuI(플라스미드 pSPM73의 삽입물)의 아클로닝.

도 34: 플라스미드 pSPM58의 PstI-PstI 삽입물 및 플라스미드 pSPM73의 EcoRI-StuI 삽입물에서 동정된 개방 판독 프레임의 위치.

도 35: 238nm 및 280nm 하에 생성된 균주 OS49.67의 여과된 배양 배지 상청액에 대한 HPLC 크로마토그램(상류)과, 33.4분 및 44.8분에 용출된 분자의 UV 스펙트럼(하류)의 중첩.

도 36: 플라테놀리드 A 분자와 플라테놀리드 B 분자의 분자 구조.

도 37: 스피라마이신에 대한 생합성 경로에 관여하는 유전자 그룹의 조직도.

도 38: 균주 SPM507에 의해 생성된 생합성 중간체의 분자 구조.

도 39: 스피라마이신을 과생산하는 균주로부터 수득된 유전자형 orf6*::att1Ωhyg+의 에스. 암보파시엔스 균주에 의해 생성된 생합성 중간체의 구조. 카세트 att1Ωhyg+를 orf6* 내로 삽입하면, orf5*의 발현을 방지시키는 극성 효과가 발휘된다.

도 40: 균주 OS49.67에 의해 생산된, 플라테놀리드 A + 미카로스 및 플라테 놀리드 B + 미카로스 분자의 분자 구조.

도 41: 코스미드 pSPM36의 PstI-PstI 단편(플라스미드 pSPM79의 삽입물)의 아클로닝, 플라스미드 pSPM79의 PstI-PstI 삽입물에서 동정된 개방 판독 프레임의 위치결정, 및 서열 번호 140의 위치결정.

본 발명은 다음 실시예를 사용하여 예시되지만, 이로써 제한되지 않는다.

요약하면, 스피로마이신에 대한 생합성 경로의 유전자를 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 게놈 DNA 라이브러리로부터 분리시킨다. 이 라이브러리는 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 게놈 DNA를 BamHI 제한 효소로 부분 분해시킴으로써 수득한다. 평균 35 내지 45kb의 큰 DNA 단편을 코스미드 pWED15[참조: Wahl et al., 1987]로부터 유도된 코스미드 pWED1[참조: Gourmelen et al., 1998] 내로 클로닝시킨다. 이들 코스미드를, 파아지 입자를 사용하여 이. 콜라이 내로 도입한다. 이로써 수득된 라이브러리를 에스. 프라디애의 tylB 유전자의 일정 부분에 상응하는 프로브(서열 번호 86)와 하이브리드화시킨다[참조: Merson-Davies & Cundliffe, 1994, 젠뱅크 수탁 번호: U08223]. 하이브리드화한 후, 상기 프로브와 하이브리드화한 4개의 코스미드 중에서 1개의 코스미드를 보다 특별히 선별한다. 이어서, pOS49.1로 명명된 코스미드를 SacI로 분해시키고, 상기 프로브와 하이브리드화된 영역을 함유하는 3.3kb 단편을 벡터 pUC19 내로 아클로닝시키고 서열 분석하였다. 4개의 개방 판독 프레임을 동정하면, 이들 중의 하나는 에스. 프라디애의 TylB 단백질(서열 번호 87)과 강력한 서열 유사성을 나타내는 단백질(서열 번호 29)을 암호화한다(도 25 참조). 이러한 유전자는 orf3(서열 번호 28)로 명명되고, 이를 에 스. 암보파시엔스에서 불활성시킨다. orf3 유전자를 불활성화시킨 클론은 더 이상 스피로마이신을 생성하지 않는다는 사실을 입증할 수 있었다. 이는 orf3 유전자, 또는 하류에 위치한 유전자가 스피라마이신 생합성에 관여한다는 것을 보여준다.

이러한 사항을 일단 확인하면, 보다 큰 영역의 코스미드 pOS49.1을 대상으로 하여, 앞서 연구된 SacI 단편의 어느 한쪽을 서열 분석하였다. 이로써, 코스미드 pOS49.1로부터, 7개의 완전한 개방 판독 프레임과 이러한 7개의 완전한 개방 판독 프레임의 어느 한쪽에 위치한 2개의 기타 불완전한 판독 프레임을 포함하는 영역의 서열을 수득할 수 있었다. 데이터베이스에서의 조사를 통하여, 불완전한 개방 판독 프레임 중의 하나가 srmG 유전자 자리("폴리케티드 신타제"(PKS)로 지칭되는 효소를 암호화하는 영역)에 상응한다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 상응하는 유전자를 문헌[참조: S. Burgett et al. in 1996 (US patent 5,945,320)]에 의해 아클로닝시킨다. 더우기, 기타 개방 판독 프레임, 7개의 완전한 ORF[orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6 및 orf7(서열 번호 23, 25, 28, 30, 34, 36 및 40)로 명명됨] 및 orf8로 명명된 8번째 ORF의 출발부는 데이터베이스에서 발견되지 않았다.

연속해서, 스피라마이신 생합성에 관여하는 기타 유전자를 클로닝할 목적으로, 이와 동일한 영역 중의 에스. 암보파시엔스 게놈의 단편을 포함하는 기타 코스미드를 분리하였다. 이를 위해, 3가지 프로브를 사용하여, 콜로니 상에서 일련의 추가 하이브리드화를 수행하였다. 제1 프로브는 pOS49.1로부터 아클로닝된, orf1, orf2 및 orf3의 출발부를 함유하는 3.7kb DNA 단편에 상응한다. 제2 프로브는 pOS49.1로부터 아클로닝된, orf7의 일정 부분과 orf8의 일정 부분을 함유하는 2kb DNA 단편에 상응한다. 제3 프로브를 또한 사용하였다. 이러한 후자 프로브는 srmD 유전자를 함유하는 1.8kb DNA 단편에 상응한다. srmD 유전자는 스피라마이신 내성을 부여할 수 있는 에스. 암보파시엔스로부터 분리된 유전자이다. 구체적으로 언급하면, 기존의 연구는 에스. 그리세오푸스쿠스(S. griseofuscus) 균주(스피라마이신-민감성 균주)에 스피라마이신 내성을 부여해주는, 에스. 암보파시엔스의 몇 가지 내성 결정기를 클로닝할 수 있게 해주었다[참조: Pernodet et al., 1993 and Pernodet et al., 1999]. 내성 유전자를 분리하기 위해, 에스. 암보파시엔스 균주의 게놈 DNA의 코스미드 라이브러리를 코스미드 pKC505[참조: Richardson MA et al., 1987]에서 생성시켰다. 이러한 코스미드 풀을, 스피라마이신에 본래 민감한 에스. 그리세오푸스쿠스 내로 도입하였다. 이로써, 에스. 그리세오푸스쿠스에 아프라마이신 내성과 스피라마이신 내성을 부여할 수 있는 5개 코스미드를 수득하였다. 이들 5개 코스미드 중에서, pOS44.1로 명명된 코스미드는 이의 삽입물 내에, 스트렙토마이세스 미카로파시엔스의 mdmA 유전자에 의해 암호화되고 상기 생산자 유기체 내의 미데카마이신 내성과 관련된 단백질과 특정의 유사성을 나타내는 단백질을 암호화하는 srmD 유전자를 함유한다[참조: Hara et al., 1990, 젠뱅크 수탁 번호: A60725)(도 26). 스피라마이신 생합성 유전자를 위치시키기 위해 사용된 제3 프로브는 srmD 유전자를 포함하는 대략 1.8kb의 삽입물이다.

이들 3가지 프로브를 사용하여 상기 언급된 게놈 DNA 라이브러리를 하이브리드화하고, 가장 긴 삽입물을 함유하기 쉽고 공통의 밴드는 전혀 갖지 않는 2개의 코스미드(pSPM7 및 pSPM5)를 선택하는 것이 가능하였다. 코스미드 pSPM5는 제1 및 제2 프로브와 하이브리드화하였지만, 제3 프로브와는 하이브리드화하지 않은 반면, 코스미드 pSPM7은 제3 프로브와만 하이브리드화하였다. 이들 2개의 코스미드는 "숏건(shotgun) 서열 분석" 기술을 사용하여 완전히 서열 분석하였다. 이들 2개의 코스미드 pSPM5 및 pSPM7의 삽입물 서열을 어셈블리할 수 있었는데, 이는 이들이 중복되지는 않았지만, 각각의 삽입물이 이의 한쪽 말단에 공지된 서열을 포함하였기 때문이다. 구체적으로 언급하면, 이들 삽입물 각각이 "폴리케티드 신타제"(PKS)로 지칭된 효소를 암호화하는 유전자들 중의 하나의 서열 단편을 포함하였다. 이들 5개 유전자를 문헌[참조: S. Burgett et al. in 1996 (US patent 5,945,320)]에 의해 클로닝하였다(도 2 참조). 이로써, 단일 에스. 암보파시엔스 게놈 DNA 서열을 결정하는 것이 가능하였다. 5' 위치에서, 제1 PKS 유전자 내에 위치한 EcoRI 부위로부터 출발하고 3' 위치에 BamHI 부위 까지 범위의 30 943 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1에 제시되어 있다. 이러한 서열은 PKS 유전자의 상류 영역에 상응한다(도 2 및 3 참조). 제5 PKS 유전자 내에 위치한, 5' 위치에서 PstI로부터 출발하여 3' 위치에서 BstEII 부위 까지 범위의 11 171 뉴클레오티드의 제2 영역이 서열 번호 2에 제시되어 있다. 이러한 영역은 PKS 유전자의 하류 영역이다(하류 및 상류는 모두 동일한 방향으로 배향된 5개 PKS 유전자의 배향으로써 규정된다)(도 2 및 3 참조).

다음에는, 스피라마이신 생합성에 관여하는 기타 유전자를 클로닝할 목적으로, 이와 동일한 영역 중의 에스. 암보파시엔스 게놈의 단편을 포함하는 기타 코스미드를 분리하였다(실시예 18 및 19 참조).

실시예 1: 이. 콜라이에서 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 ATCC23877의 게놈 DNA 라이브러리의 작제

1.1 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 ATCC23877의 게놈 DNA 추출

스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 ATCC23877[특히, 기탁 기관(American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, Virginia, USA))으로부터 번호 23877로 입수 가능함]을 YEME(효모 추출물-맥아 추출물)[참조: Kieser, T, et al., 2000]에서 배양하고 이러한 균주의 게놈 DNA를 용해 및 침전 표준 기술에 따라서 추출 및 정제하였다[참조: Kieser T. et al., 2000].

1.2 게놈 DNA 라이브러리의 작제

상기 분리된 바와 같은 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 ATCC23877의 게놈 DNA를 BamHI 제한 효소로 부분적으로 분해시켜, 크기가 대략 35 내지 45 kb인 DNA 단편을 수득한다. 이들 단편을, BamHI으로 미리 분해시킨 코스미드 pWED1[참조: Gourmelen et al., 1998] 내로 클로닝시켰다. 코스미드 pWED1은 포유류에서 활성인 발현 모듈(module)을 함유하는 4.1 kb HpaI-HpaI 단편을 결실시킴으로써[참조: Gourmelen et al., 1998] 코스미드 pWE15[참조: Wahl, et al., 1987]로부터 유도된 것이다. 이어서, 이러한 연결 혼합물을 시험관내에서, 프로메가(Promega) 회사에 의해 시판되고 있는 "Packagene®람다 DNA 패키징 시스템"을 제조업자의 권고 사항에 따라서 사용하여 람다 파아지 입자 내에서 단백질 막으로 싼다. 수득된 파아지 입자를 사용하여, 공급원[Stratagene(LaJolla, California, USA)]에 의해 시판되고 있는 이. 콜라이의 SURE® 균주를 감염시킨다. 코스미드 pWED1은 앰피실린 내성을 제공해주기 때문에, 상기 클론을 LB 배지 + 앰피실린(50㎍/ml) 상에서 선별하였다.

실시예 2: 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 관여하는 유전자의 분리 및 성상 확인

2.1 스트렙토마이세스 암보파시엔스 ATCC23877의 게놈 라이브러리의 이. 콜라이 클론의 콜로니 하이브리드화

상기 수득된 라이브러리의 대략 2,000개 이. 콜라이 클론을, 콜로니 하이브리드화를 위해 필터 상으로 옮긴다. 이러한 하이브리드화에 사용된 프로브는 스트렙토마이세스 프라디애의 tylB 유전자의 일정 부분을 포함하는 NaeI-NaeI DNA 단편(서열 번호 86)이다. 이러한 단편은 tylB 유전자의 암호화 서열이 2677번에서 부터 3843번 까지의 뉴클레오티드에 상응하는, 다음 문헌에 의해 기재된 DNA 단편의 2663번에서 부터 3702번 까지의 뉴클레오티드에 상응한다[참조: L.A. Merson-Davies & E. Cundliffe (L.A. Merson-Davies & E. Cundliffe, 1994, 젠뱅크 수탁 번호: U08223].

스트렙토마이세스 프라디애의 tylB 유전자의 일정 부분을 수반하는 NaeI-NaeI DNA 단편(서열 번호 86)을, 무작위 프라이밍 기술 (Roche 회사에 의해 시판되 고 있는 키트)을 이용하여 ³²P로 표지시키고, 이를 프로브로서 사용하여, 필터 상에 옮긴 상기 라이브러리의 2,000개 클론을 하이브리드화하였다. 사용된 막은 공급원[Amersham (Amersham Biosciences, Orsay, France) 회사]에 의해 시판되고 있는 Hybond N 나일론 막이고, 하이브리드화는 문헌[참조: Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984)]에 기재된 완충액 중에서 55℃ 하에 수행한다. 세척을 15분 동안 55℃ 하에 2X SSC에서 수행한 다음, 55℃ 하에 각각 15분 동안 0.5X SSC에서 2회 연속해서 세척한다. 이러한 하이브리드화 및 세척 조건 하에서, 하이브리드화된 2,000개 중에서 4개 클론이 강력한 하이브리드화 시그널을 나타내었다. 이들 4개 클론을 LB 배지 + 앰피실린(50㎍/ml)에서 배양하고 상응하는 4개 코스미드를 표준 알칼리성 용해에 의해 추출시킨다[참조: Sambrook et al., 1989]. 이어서, 이러한 하이브리드화는 실제로, 이들 4개 코스미드의 삽입물 내에 존재하는 DNA 단편에 기인한다는 사실을 확인하였다. 이를 위해, 코스미드를 여러 개의 효소(BamHI, PstI 및 SacI)로 독립적으로 분해시킨다. 분해 생성물을 아가로스 겔 상에서 분리시키고, 나일론 막 상으로 옮긴 다음, 상기와 동일한 조건 하에서 스트렙토마이세스 프라디애의 tylB 유전자의 일정 부분을 포함하는 NaeI-NaeI DNA 단편(상기 참조)와 하이브리드화시킨다. 4개 코스미드를 실증하는 것이 가능하였고, 이들 코스미드 중의 1개가 보다 특별힌 선별되어 pOS49.1로 명명되었다.

2.2 코스미드 pOS49.1의 삽입물의 서열 분석 및 동정된 영역의 관련 여부 확인

코스미드 pOS49.1의 삽입물의 몇 가지 단편을 아클로닝시키고 이들의 서열을 결정하였다. 코스미드 pOS49.1을 SacI 효소로 분해시키고, 이를 상기 언급된 조건 하에 서던 블롯팅한 결과, 3.3 kb 단편이 tylB 프로브와 하이브리드화되는 영역을 함유하고 있는 것으로 나타났다. 이러한 3.3 kb 단편을 0.8% 아가로스 겔로부터 전기용출시킴으로써 분리시킨 다음, 벡터 pUC19(젠뱅크 수탁 번호: M77789) 내로 클로닝시키고 서열 분석하였다. 이로써 수득된 플라스미드는 pOS49.11로 명명되었다. 프레임플롯(FramePlot) 프로그램(참조: J. Ishikawa & K. Hotta, 1999)을 사용하여, 스트렙토마이세스 특유의 코돈 활용을 나타내는 4개의 개방 판독 프레임을 상기 단편에서 동정할 수 있었다(2개는 완전한 개방 판독 프레임이고 2개는 절단된 개방 판독 프레임이다). FASTA 프로그램[참조: W.R. Pearson & D.J Lipman, 1988 and W.R. Pearson, 1990, 특히 INFOBIOGEN resource center, Evry, France로부터 입수 가능함]을 이용한 서열 비교 결과, 이들 4개의 개방 판독 프레임 중의 1개로부터 추론된 단백질이 에스. 프라디애의 TylB 단백질(서열 번호 87; 젠뱅크 수탁 번호: U08223)과 강력한 서열 유사성을 나타낸다는 사실을 밝혀낼 수 있었다(도 25 참조). 이러한 단백질은 Orf3로 명명되었다(서열 번호 29).

상응하는 유전자(orf3 유전자(서열 번호 28))가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 관여하는지를 시험할 목적으로, Ωhyg 카세트(참조: M-H. Blondelet-Rouault et al., 1997, 젠뱅크 수탁 번호: X99315)를 이용하여 상기 유전자를 개입중단시켰다. 이를 위해, 플라스미드 pOS49.11을 XhoI 효소로 분해시키고, 4개의 개방 판독 프레임(2개는 완전한 개방 판독 프레임이고 2개는 절단된 프 레임이며, 이에는 원형 상태의 orf3가 포함된다)를 공급원[Stratagene (LaJolla, California, USA)]에 의해 시판되고 있는 벡터 pBC SK+의 XhoI 부위 내로 아클로닝시킨다. 이로써 수득된 플라스미드는 pOS49.12로 명명되었다. orf3을 불활성화시킬 목적으로, orf3 내부의 PmlI-BstEII 단편을 후자 플라스미드 내로의 평활-말단 클로닝에 의해 Ωhyg 카세트로 대체시킨다. 이를 위해, 플라스미드 pOS49.12를 PmlI 및 BstEII 효소로 분해시키는데, 이에 대한 독특한 부위는 orf3 유전자의 암호화 서열이다. 상기 벡터에 상응하는 단편의 말단을 클레노우(Klenow) 효소(DNA 폴리머라제 I 큰 단편)로 처리함으로써 이를 평활 말단화한다. Ωhyg 카세트는 플라스미드 pHP45 Ωhyg[참조: Blondelet-Rouault et al., 1997, 젠뱅크 수탁 번호: X99315]를 BamHI 효소로 분해시킴으로써 수득된다. Ωhyg 카세트에 상응하는 단편을 아가로스 겔 상에서 회수하고, 이의 말단을 클레노우 효소로 처리함으로써 이를 평활 말단화한다. 이로써 수득된 2개의 평활 말단 단편(Ωhyg 카세트 및 플라스미드 pOS49.12)을 연결하고, 이러한 연결 생성물을 사용하여 이. 콜라이 세균을 형질전환시킨다. 이로써 수득된 플라스미드는 pOS49.14로 명명되었으며, 이는 Ωhyg 카세트를 이용하여 개입중단시킨 orf3 유전자를 함유하고 있다.

XhoI-XhoI 단편 형태(이의 말단은 클레노우 효소로 처리함으로써 비-점착성으로 만들었다)의, 플라스미드 pOS49.14의 삽입물을 플라스미드 pOJ260[이러한 플라스미드 pOJ260는 이. 콜라이에서는 복제할 수 있지만, 에스. 암보파시엔스에서는 복제할 수 없는 접합 플라스미드(참조: M. Bierman et al., 1992)이고, 상기 플라스미드는 이. 콜라이와 스트렙토마이세스에 아프라마이신 내성을 부여해준다]의 EcoRV 부위 내로 클로닝시킨다. 이로써 수득된 플라스미드(플라스미드 pOJ260 내로 클로닝된 플라스미드 pOS49.14의 삽입물)는 pOS49.16로 명명되었다. 후자를 문헌[참조: Mazodier et al., 1989]에 기재된 바와 같이, 접합된 이. 콜라이 균주 S17-1을 사용하여 접합시킴으로써 에스. 암보파시엔스 균주 ATCC23877 내로 전이시킨다. 이. 콜라이 균주 S17-1은 이. 콜라이 균주 294로부터 유도된 것이다[참조: Simon et al., 1983 and Simon, et al., 1986]. Ωhyg 카세트에 의해 수반된 히그로마이신 내성 마커를 보유하고 있고 벡터 pOJ260에 의해 수반된 아프라마이신 내성 마커를 상실한 피전달접합균주(transconjugant) 클론을 수득하는 것이 가능하였다. 이를 위해, 접합 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 히그로마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 히그로마이신-내성 클론을 각각, 히그로마이신(항생제 B) 함유 배지와 아프라마이신(항생제 A) 함유 배지 상에서 계대배양하였다(도 9 참조). 히그로마이신에 내성인 유전자(HygR)와 아프라마이신에 민감한 유전자(ApraS)는 원칙적으로, 이중 재조합 사건이 발생하였으므로 Ωhyg 카세트를 이용하여 개입중단시킨 orf3 유전자를 보유하고 있는 것이다. orf3의 야생형 복사물을 상기 개입중단된 복사물로 대체시키는 것은 2회 연속되는 하이브리드화에 의해 확인되었다. 따라서, 수득된 클론의 총 DNA를 각종 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, Ωhyg 카세트에 상응하는 프로브(상기 참조)와 하이브리드화시켜, 수득된 클론의 게놈 DNA 내에 상기 카세트가 존재하는지를 확인하였다. 프로브로서, 4개의 개방 판독 프레임(2개는 완전한 개방 판독 프레임이고 2개는 절단된 프레임이며, 이에는 원형 상태의 orf3가 포함된다)을 함유 하는 플라스미드 pOS49.11의 XhoI-XhoI을 사용하여 제2 하이브리드화를 수행하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 유전형을 확인할 수 있다. 이로써 수득된 orf3::Ωhyg 클론들 중의 하나(이의 유전자형은 확인하였다)를 선택하고, 이를 OS49.16으로 명명하였다.

이와 같이 하여 수득된 OS49.16 클론의 스피라마이신 생성 여부는 다음에 기재되는 생성 시험을 이용하여 시험하였다(실시예 15 참조). 따라서, 상기 균주가 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다는 사실을 입증할 수 있었는데, 이는 orf3 및/또는 하류에 위치한 유전자, 예를 들면, orf4가 스피라마이신 생합성에 관여한다는 사실을 확인시켜 준다.

이러한 사실이 일단 확인되면, 코스미드 pOS49.1의 보다 큰 영역을 기존에 연구된 SacI 단편의 어느 한쪽 위에서 서열 분석하였다. 따라서, 코스미드 pOS49.1로부터, 7개의 완전한 개방 판독 프레임과 이러한 7개의 개방 판독 프레임의 한쪽에 위치한 2개의 기타 불완전한 개방 판독 프레임을 포함하는 영역의 서열을 수득하는 것이 가능하였다. 데이터베이스 내에서의 조사를 통하여, 불완전한 개방 판독 프레임 중의 하나가 srmG 유전자 자리("폴리케티드 신타제"(PKS)로 지칭되는 효소를 암호화하는 영역)에 상응한다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 상응하는 유전자를 문헌[참조: S. Burgett et al. in 1996 (US patent 5,945,320)]에 의해 아클로닝시킨다. 더우기, 기타 개방 판독 프레임: 7개의 완전한 ORF[orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6 및 orf7(서열 번호 23, 25, 28, 30, 34, 36 및 40)로 명명 됨] 및 orf8로 명명된 8번째 ORF의 출발부(이러한 orf의 완전한 서열은 서열 번호 43에 제시되어 있다)는 데이터베이스에서 발견되지 않았다.

실시예 3: 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 관여하는 기타 유전자의 분리 및 성상 확인

두 번째로, 스피라마이신 생합성에 관여하는 기타 유전자를 클로닝할 목적으로, 이와 동일한 영역 중의 에스. 암보파시엔스 게놈의 단편을 포함하는 기타 코스미드를 분리하였다. 이를 위해, 3가지 프로브를 사용하여, 일련의 추가 콜로니 하이브리드화를 수행하였다:

- 사용된 제1 프로브는 pOS49.1로부터 아클로닝된, orf1, orf2 및 orf3의 출발부와 PKS 유전자의 단편[PKS에 상응하는 유전자는 문헌(참조: S. Burgett et al. in 1996 (US patent 5,945,320)에 의해 클로닝하였다]를 함유하고, 서열 번호 1의 EcoRI 부위를 한정하는 위치 1의 1,300개 염기쌍 상류에 위치한 BamHI 부위에서 부터 2472번에 위치한(서열 번호 1) PstI 부위까지 범위의 3.7kb BamHI-PstI DNA 단편에 상응한다. 이러한 BamHI-PstI 단편을 pOS49.1로부터 플라스미드 pBC SK+ 내로 아클로닝시켜, 플라스미드 pOS49.28을 수득하였다.

- 사용된 제2 프로브는 pOS49.1로부터 아클로닝된 orf7과 orf8의 단편을 함유하고, 서열 번호 1의 6693번에 위치한 PstI 부위에서 부터 서열 번호 1의 8714번에 위치한 BamHI 부위까지 범위의 대락 2 kb의 PstI-BamHI DNA 단편에 상응한다. 이러한 PstI-BamHI 단편을 pOS49.1로부터 플라스미드 pBC SK+ 내로 아클로닝시켜, 플라스미드 pOS49.76을 수득하였다.

- 제3 프로브를 또한 사용하였다. 이는 srmD 유전자를 함유하는 1.8kb EcoRI-HindIII DNA 단편에 상응한다. srmD 유전자는 스피라마이신 내성을 부여할 수 있는 에스. 암보파시엔스로부터 분리된 유전자이다. 구체적으로 언급하면, 기존의 연구는 에스. 그리세오푸스쿠스 균주(스피라마이신-민감성 균주)에 스피라마이신 내성을 부여해주는, 에스. 암보파시엔스의 몇 가지 내성 결정기를 클로닝할 수 있게 해주었다[참조: Pernodet et al., 1993 and Pernodet et al., 1999]. 내성 유전자를 분리하기 위해, 에스. 암보파시엔스 균주 ATCC23877의 게놈 DNA의 코스미드 라이브러리를 코스미드 pKC505[참조: M.A. Richardson MA et al., 1987]에서 생성시켰다. 이를 위해, 에스. 암보파시엔스 균주 ATCC23877의 게놈 DNA를 Sau3AI로 부분적으로 분해시켜, 크기가 대략 30 내지 40kb인 단편을 수득한다. 이로써 분해된 게놈 DNA(3㎍)을, BamHI 효소로 미리 분해시킨 1㎍의 pKC505와 연결시켰다[참조: Permodet et al., 1999]. 이어서, 이러한 연결 혼합물을 시험관 내에서 파아지 입자 내에 단백질 막으로 싼다. 수득된 파아지 입자를 사용하여, 이. 콜라이 균주 HB101(특히, American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, Virginia, USA)로부터 번호 33694로 입수 가능함)를 감염시켰다. 대략 20,000개의 아프라마이신-내성 이. 콜라이 클론을 모으고, 이들 클론의 코스미드를 추출하였다. 이러한 코스미드 풀을, 스피라마이신에 본래 민감한 에스. 그리세오푸스쿠스 균주 DSM 10191[참조: K.L. Cox & R.H. Baltz, 1984] 내로 원형질체 형질전환에 의해 도입하였다[참조: R.N. Rao et al., 1987; 상기 균주는 특히, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschweig, Germany)로부터 번호 DSM 10191로 입수 가능하다]. 아프라마이신을 함유하는 배지 상에서 상기 형질전환체를 선별하였다. 아프라마이신을 함유하는 배지 상에서 성장하는 클론들 중의 1,300개를 5㎍/ml의 스피라마이신을 함유하는 배지 상으로 옮겼다. 여러 개의 아프라마이신-내성 클론을 또한, 스피라마이신 함유 배지 상에서 성장시키고, 이들 클로니의 코스미드를 추출하여, 이. 콜라이와 에스. 그리세오푸스쿠스를 형질전환시키는데 사용하였다[참조: Pernodet et al., 1999]. 이로써, 에스. 그리세오푸스쿠스에 아프라마이신 내성과 스피라마이신 내성을 동시에 부여할 수 있고 이. 콜라이에 아프라마이신 내성을 부여할 수 있는 5개 코스미드를 수득하였다. 이들 5개 코스미드 중에서, pOS44.1로 명명된 코스미드는 이의 삽입물 내에, 스트렙토마이세스 미카로파시엔스의 mdmA 유전자에 의해 암호화된 단백질(서열 번호 88)과 특정의 유사성을 나타내는 단백질(서열 번호 16)을 암호화하는 유전자(서열 번호 15)를 함유하는 것으로 결정되었으며; 이러한 유전자는 srmD로 명명되었다{FASTA 프로그램[참조: W.R. Pearson & D.J Lipman, 1988 and W.R. Pearson, 1990, 특히 INFOBIOGEN resource center, Evry, France로부터 입수 가능함]을 사용하여 수행된, 도 26에 제시된 정렬 참조}.

플라스미드 pOS44.1 내에 함유된 내성 결정기를 분리하기 위해, 후자를 Sau3AI 제한 효소로 부분적으로 분해시켜 크기가 대략 1.5 내지 3kb인 단편을 수득하고, 이들 단편을 BamHI 효소로 선형화시킨 벡터 pIJ486에 연결하였다[참조: Ward et al., 1986]. 스피라마이신에 본래 내성인, 에스. 그리세오푸스쿠스 균주 DSM 10191[참조: R.N. Rao et al., 1987]에 스피라마이신 내성을 부여할 수 있는 능력을 알아보기 위해 플라스미드를 선별하였다(상기 참조). 이를 위해, 벡터 pIJ486에 연결된 pOS44.1의 Sau3AI 단편에 상응하는 플라스미드 풀(상기 참조)을 균주 DSM 10191 내로 원형질체 형질전환시킴으로써 도입하고, 이러한 형질전환체를 대상으로 하여, 이들의 티오스트렙톤 내성(pIJ486에 의해 수반된 tsr 유전자에 기인함)에 대해 선별하였다. 티오스트렙톤을 함유하는 배지 상에서 성장하는 클론을 스피라마이신 함유 배지 상으로 옮긴다. 몇 가지 티오스트렙톤-내성 클론이 또한, 스피라마이신 함유 배지 상에서 성장하였으며, 이들 콜로니의 플라스미드를 추출하였다. 내성이 부여되고 대략 1.8kb 삽입물을 함유하는 플라스미드를 선별하고, 이를 pOS44.2로 명명하였다. 이러한 1.8kb 삽입물은, 삽입물 한쪽 상의 벡터 내에 존재하는 HindIII 부위와 EcoRI 부위를 통하여 용이하게 절제될 수 있다. 이러한 1.8kb HindIII-EcoRI 삽입물을 서열 분석하고, 이를 함유하는 내성 유전자를 srmD로 명명하였다. 이로써, srmD 유전자를 함유하는 상기 단편을, EcoRI-HindIII로 개방시킨 벡터 pUC19(젠뱅크 수탁 번호: M77789) 내로 용이하게 아클로닝시킬 수 있었으며, 이와 같이 하여 수득된 플라스미드는 pOS44.4로 명명되었다. srmD 유전자를 함유하는, 상기 플라스미드의 1.8kb HindIII-EcoRI 삽입물을 프로브로서 사용하여 스피라마이신 생합성 유전자를 위치시켰다(하기 참조).

플라스미드 pOS44.4를 함유하는 에스케리챠 콜라이(Escherichia Coli) DH5α 균주를 2002년 7월 10일자로 기탁 기관{Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures and Microorganisms] (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France}에 등록 번호 I-2918로 기탁하였다.

상기 수득된(실시예 1 참조) 라이브러리의 대략 2,000개 클론을 통상적인 기술에 따라서[참조: Sambrook et al., 1989] 콜로니 하이브리드화하기 위해 필터 상으로 옮겼다.

상기 언급된 3가지 프로브를 무작위 프라이밍 기술 (Roche에 의해 시판되고 있는 키트)을 이용하여 ³²P로 표지시키고, 이를 사용하여, 필터 상에 옮긴 상기 라이브러리의 2,000개 클론을 하이브리드화하였다. 하이브리드화는 문헌[참조: Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984)]에 기재된 완충액 중에서 65℃ 하에 수행한다. 세척을 15분 동안 65℃ 하에 2X SSC에서 수행한 다음, 65℃ 하에 각각 15분 동안 0.5X SSC에서 2회 연속해서 세척한다. 이러한 하이브리드화 및 세척 조건 하에서, 하이브리드화된 2,000개 중에서 16개 클론이 적어도 1개의 프로브와 강력한 하이브리드화 시그널을 나타내었다. 그러나, 어떠한 코스미드도 상기 3가지 프로브와 하이브리드화하지 않았다. 상기 16개 코스미드를 추출하고, BamHI 제한 효소로 분해시킨다. 이들 각종 코스미드의 제한 프로필을 서로 비교한 결과, 가장 긴 삽입물 영역을 함유하기 쉽고 공통의 밴드는 전혀 갖지 않는 2개의 코스미드를 선택하게 되었다. 이로써, pSPM5로 명명된 것과 pSPM7로 명명된 2개의 코스미드를 선택하였다. 코스미드 pSPM5는 프로브 orf1 내지 orf4 및 프로브 orf8와 하이브리 드화하였지만, 프로브 srmD와는 하이브리드화하지 않았다. pSPM7은 프로브 srmD와만 하이브리드화하였고, 다른 2가지 프로브와는 하이브리드화하지 않았다.

이들 2개의 코스미드는 "숏건 서열 분석" 기술을 사용하여 완전히 서열 분석하였다. 이들 2개의 코스미드 pSPM7 및 pSPM5의 삽입 서열을 어셈블리할 수 있었는데, 이는 이들이 중복되지는 않았지만, 각각의 삽입물이 이의 한쪽 말단에 공지된 서열을 포함하였기 때문이다. 구체적으로 언급하면, 이들 삽입물 각각이 "폴리케티드 신타제"(PKS)로 지칭된 효소를 암호화하는 유전자들 중의 하나의 서열 단편을 포함하였다. 이들 5개 유전자를 문헌[참조: S. Burgett et al. in 1996 (US patent 5,945,320)]에 의해 클로닝하였다(도 2 참조). 이로써, 단일 에스. 암보파시엔스 게놈 DNA 서열을 결정하는 것이 가능하였다. 5' 위치에서, 제1 PKS 유전자 내에 위치한 EcoRI 부위로부터 출발하고 3' 위치에 BamHI 부위 까지 범위의 30,943개 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1에 제시되어 있다. 이러한 서열은 PKS 유전자의 상류 영역에 상응한다(도 2 및 3 참조). 제5 PKS 유전자 내에 위치한, 5' 위치에서 PstI로부터 출발하여 3' 위치에서 NcoI 부위 까지 범위의 11,171개 뉴클레오티드의 제2 영역이 서열 번호 2에 제시되어 있다. 이러한 제2 영역은 PKS 유전자의 하류 영역이다(하류 및 상류는 모두 동일한 방향으로 배향된 5개 PKS 유전자의 배향으로써 규정된다)(도 2 및 3 참조).

실시예 4: 뉴클레오티드 서열 분석, 개방 판독 프레임의 결정, 및 스피라마이신 생합성에 관여하는 유전자의 성상 확인

수득된 서열은 프레임플롯 프로그램[참조: J. Ishikawa & K. Hotta, 1999]을 사용하여 분석하였다. 이로써, 개방 판독 프레임 중에서, 스트렙토마이세스 특유의 코돈 활용을 나타내는 개방 판독 프레임을 동정하는 것이 가능하였다. 이러한 분석 결과, 상기 영역이 효소 "폴리케티드 신타제"(PKS)를 암호화하는 5개 유전자의 어느 한 쪽에 위치한 35개 ORF를 포함한다는 사실이 결정되었다. 10개 및 25개 ORF가 각각 이들 유전자의 하류 및 상류에서 동정되었다(하류 및 상류는 모두 동일한 방향으로 배향된 5개 PKS 유전자의 배향으로써 규정된다)(도 3 참조). 따라서, 대략 31 kb의 영역을 점유하고 있는 상기 유형의 25개 개방 판독 프레임(서열 번호 1 및 도 37)을 상기 5개 PKS 유전자의 상류에서 동정하였고, 대략 11.1 kb 영역을 점유하고 있는 10개(서열 번호 2 및 도 3)는 PKS 유전자의 하류에서 동정하였다. 상류 영역 유전자는 orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orf9c, orf10, orf11c, orf12, orf13c, orf14, orf15c, orf16, orf17, orf18, orf19, orf20, orf21c, orf22c, orf23c, orf24c 및 orf25c(서열 번호 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 및 84)로 명명되었다. 하류 영역 유전자는 orf1*c, orf2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*, orf6*, orf7*c, orf8*, orf9* 및 orf10*(서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21)로 명명되었다. 유전자 명칭에 부가된 "c"는 문제의 ORF에 대해, 암호화 서열이 역배향으로 존재한다는 것을 의미한다(따라서, 암호화 쇄는 이들 유전자에 대해 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 제시된 서열에 상보적인 쇄이다)(도 3 참조).

실시예 5: 유전자 불활성화: 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 녹-아웃 균주의 작제 원리

사용된 방법은 유전자 대체를 수행하는 것으로 이루어진다. 개입중단시키고자 하는 표적 유전자를 도 9에 예시된 바와 같이, 항생제(예를 들면, 아프라마이신 또는 히그로마이신)에 대한 내성을 부여해 주는 카세트를 이용하여 개입중단시킨 상기 유전자의 복사물로 대체시킨다. 사용된 카세트는 어느 한 쪽이, 모든 판독 프레임 내의 해독 종결 코돈과 접해있고, 스트렙토마이세스에서 활동성인 전사 종결인자와 접해있다.

상기 카세트를 표적 유전자 내로 삽입하는 것은 이러한 표적 유전자에서의 결실을 수반하거나 수반하지 않을 수 있다. 상기 카세트를 플랭킹하는 영역의 크기는 수 백개 염기쌍에서 부터 수 천개 염기쌍 범위일 수 있다.

상기 카세트를 사용하여 유전자를 불활성화시키는데 요구되는 작제물은 재조합 DNA 작제물을 수득하기 위한 기준 유기체인 이. 콜라이에서 수득하였다. 개입중단된 유전자는 이. 콜라이에서는 복제될 수 있지만, 스트렙토마이세스에서는 복제될 수 없는 플라스미드에서 수득하였다.

이어서, 상기 작제물을 벡터 내로 아클로닝시켜 에스. 암보파시엔스에서 목적하는 유전자를 불활성화 및 형질전환시킬 수 있다. 이를 위해, 다음 2가지 플라스미드를 사용하였다:

- pOJ260[참조: M. Bierman et al., 1992](실시예 2 참조). 이는 이. 콜라이와 스트렙토마이세스에 아프라마이신 내성을 부여해 주고, 히그로마이신 내성을 부여해 주는 카세트를 이용하여 표적 유전자를 개입중단시킨 경우에 사용된다.

- pOSK1205(4726 bp). 이러한 플라스미드는 네오마이신/카나마이신 내성을 암호화하는 서열을 함유하는 AvrII 단편을 히그로마이신 내성을 암호화하는 서열로 대체시켰지만, P SV40 프로모터는 보존하고 있는 플라스미드 pBK-CMV(Stratagene (LaJolla, California, USA)에 의해 시판됨)로부터 유도된 것이다. 이를 위해, 플라스미드 pHP45-Ωhyg[참조: Blondelet-Rouault et al., 1997]를 NotI 및 PflmI 효소로 분해시키고; 말단 모두를 클레노우 효소로 처리함으로써 평활 말단화시킨 후에, 히그로마이신 내성 부여 단편을 벡터 pBK-CMV의 AvrII 부위 내로 아클로닝시킨다. pOSK1205에서는, 히그로마이신 내성을 부여해 주는 카세트가 pSV40 프로모터 보다 앞에 있다. 이러한 플라스미드는 이. 콜라이와 스트렙토마이세스에 히그로마이신 내성을 부여해 주고, 아프라마이신 내성을 부여해 주는 카세트를 이용하여 표적 유전자를 개입중단시킨 경우에 사용된다.

상기 카세트는 표적 유전자 내에 존재하는 제한 부위를 사용하여 클로닝시키거나, 또는 예를 들어, 문헌[참조: M.K. Chaveroche et al., 2000]에 기재된 바와 같은 동일한 짧은 서열들 간을 재조합시킴으로써 표적 유전자 내로 도입하였다.

이어서, 카세트에 의해 개입중단된 유전자를 수반하는 플라스미드를, 예를 들어, 이. 콜라이와 스트렙토마이세스 간을 접합시킴으로써 스트렙토마이세스 암보파시엔스 내로 도입할 수 있다[참조: P. Mazodier et al., 1989]. 이러한 기술은 기본 벡터가 벡터 pOJ260인 경우에 사용된다. 예를 들어, 문헌[참조: Oh & Chater, 1997]에 의해 기재된 바와 같이 재조합 횟수를 증가시키기 위해, DNA을 알칼리 처리함으로써 변성시킨 후[참조: T. Kieser et al., 2000] 원형질체 형질전환시키는 기술인 제2 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 기본 벡터가 pOJ260 또는 pOSK1205(하기 참조)인 경우에 사용된다. 이어서, 표적 유전자 내에 존재하는 카세트에 상응하는 항생제로 형질전환체를 선별한다(도 9, 항생제 B 참조). 이로써, 1회 또는 2회 재조합 사건에 의해 통합이 이루어진 클론의 혼합물을 선별한다. 이어서, 이에 대한 내성 유전자가 벡터 내에 존재하는(재조합 카세트 외부) 항생제(참조: 도 9, 항생제 A)에 민감한 클론을 찾아낸다. 이로써, 원칙적으로 2회 재조합 사건으로 인해 야생형 유전자가 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체된 클론을 선별하는 것이 가능하다. 이들 단계는 도 9에 도식적으로 제시되어 있다.

몇 가지 카세트를 사용하여 표적 유전자를 개입중단시킬 수 있다. 히그로마이신 내성을 부여해 주는 Ωhyg 카세트[참조: Blondelet-Rouault et al., 1997, 젠뱅크 수탁 번호: X99315]를 사용할 수 있다.

실시예 6: orf3 유전자에서 동위상 녹아웃을 나타내는 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주의 작제

orf3 유전자를 Ωhyg 카세트(실시예 2.2 참조)로 개입중단시키면, orf3::Ωhyg 균주가 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다는 사실을 입증하는 것이 가능한데, 이는 클로닝된 영역의 하나 이상의 유전자가 스피라마이신 생합성에 관여한다는 사실을 확인시켜 준다(실시예 2.2 참조). 이들의 배향 측면에서는, ORF 1 내지 7이 동시 전사되는 것으로 예상되고(도 3 참조) 관찰된 표현형(스피라마이신의 비-생산자)는 orf3과 동시 전사되는 유전자 하나 이상을 불활성화시킴으로써 기인된 것일 수 있다. orf3가 스피라마이신 생합성에 관여한다는 사실을 확인하기 위해, orf3 유전자를 추가로 불활성화시키는데, 후반 불활성화는 동위상으로 수행된다. 이를 위해, orf3 내부의 504개 염기쌍의 DraIII 단편을 결실시킨다. 1번(서열 번호 1)에 위치한 EcoRI 부위에서 부터 5274번(서열 번호 1)에 위치한 SacI 부위 까지의 범위이고 2563번과 3067번에 위치한 2개의 DraIII 부위 사이를 결실시킨(504개 뉴클레오티드가 제거됨), pOS49.1로부터 수득된 DNA 단편을 플라스미드 pOJ260 내로 클로닝시킨다[참조: M. Bierman et al., 1992]. 이로써 수득된 플라스미드는 pOS49.67로 명명되었다.

따라서, pOS49.67의 삽입물은 orf1 유전자, orf2 유전자, 동위상 결실시킨 orf3 유전자, orf4 유전자 및 orf5의 일정 부분을 함유하는 에스. 암보파시엔스의 DNA 단편으로 구성된다. 이러한 삽입물이 아클로닝된 벡터가 pOJ260이므로, 플라스미드 pOS49.67은 아프라마이신 내성을 제공해주고, 이를 원형질체 형질전환에 의해 균주 OS49.16 내로 도입시킨다(실시예 2 참조). 균주 OS49.16은 히그로마이신에 내성이기 때문에, hygR 및 apraR 형질전환체가 수득되었다. 이러한 클론을 비-선별성 배지 상에서 2회 계대접종한 후, 아프라마이신에 민감한 클론과 히그로마이신에 민감한 클론(apraS 및 hygS)를 찾아내었다. 이들 클론 중 몇몇에서는, 상동 서열 간의 재조합 사건으로 인해 실제로, (균주 OS49.16의 게놈 내에 함유된) Ωhyg 카세트로 개입중단된 orf3 복사물이, 해당 벡터 상에 존재하는 동위상 결실이 수반된 orf3 복사물로 대체될 것으로 예상된다. 이러한 재조합으로부터 생성된 클론은 벡터 서열의 제거 후 apraS 및 hygS일 것으로 예상된다. 이로써 수득된 균주의 유전자형은 하이브리드화 또는 PCR에 의해 확인할 수 있으며, (orf3의 단지 1개의 동위상 결실된 복사물이 상기 수득된 클론의 게놈 내에 존재한다는 것을 확인하기 위해) PCR 생성물을 서열 분석하였다. 이로써, 동위상 결실된 orf3 복사물을 1개만 갖는 클론을 수득하였으며, 이들의 유전자형을 확인하였다. 목적하는 특징을 나타내는 클론을 보다 특별히 선별하였으며, 이는 OS49.67로 명명되었다.

균주 OS49.67 샘플은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-2916로 기탁되었다.

실시예 7: orf8 유전자에서 녹아웃을 나타내는 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주의 작제

orf8 유전자의 불활성화를 수행하기 위해, Ωhyg 카세트를 orf8의 암호화 서열 내로 도입한 작제물을 수득하였다. 이를 위해, 플라스미드 pOS49.88를 우선적으로 작제하였다. 플라스미드 pOS49.88은 pUC19의 PstI-EcoRI 부위 내로 클로닝된, orf7의 말단부, orf8 및 orf9의 출발부를 함유하는 3.7kb 단편(코스미드 pSPM5로부터 수득된 PstI-EcoRI 단편)을 삽입함으로써 플라스미드 pUC19(젠뱅크 수탁 번호: M77789)로부터 유도된 것이다. (클레노우 효소로 처리시킴으로써 평활 말단화된 BamHI 단편 형태의) Ωhyg 카세트를, 클레노우 효소로 처리함으로써 말단 모두를 평활 말단화시킨 후에 orf8에 위치한 pOS49.88의 독특한 SalI 부위 내로 클로닝시킨다.

상기 클로닝이 평활 말단화되었기 때문에, 해당 카세트의 삽입 방향에 따라서 2가지 유형의 플라스미드가 수득되었다: hyg 유전자와 orf8 유전자가 동일한 배향으로 존재하는 pOS49.106; 및 hyg 유전자와 orf8 유전자가 반대 배향으로 존재하는 pOS49.120. 이어서, 플라스미드 pOS49.106의 삽입물을 플라스미드 pOJ260 내로 아클로닝시켜 pOS49.107을 수득한다. 이를 위해, 플라스미드 pOS49.106을 Asp718I 효소로 분해시키고, 클레노우 효소로 처리함으로써 말단을 평활 말단화시키며; 이러한 분해 생성물을 PstI 효소로 재분해시키고, Ωhyg 카세트가 삽입된 orf8 유전자를 함유하는 단편을 벡터 pOJ260(상기 참조) 내로 클로닝시킨다. 이를 위해, 벡 터 pOJ260을 EcoRV 및 PstI 효소로 분해시키고, 연결을 위해 사용한다. 따라서, 이러한 조작으로 특정 배향의 연결을 획득할 수 있는데, 이는 상기 2개 단편 중의 하나를 한쪽에서 평활 말단시키고, 다른 쪽에는 PstI를 평활 말단시키기 때문이다. 이로써 수득된 플라스미드는 pOS49.107로 명명되었다.

플라스미드 pOS49.107을 원형질체 형질전환에 의해 에스. 암보파시엔스 균주 ATCC23877 내로 도입하였다[참조: T. Kieser et al., 2000]. 원형질체 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 히그로마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 히그로마이신-내성 클론을 각각, 히그로마이신(항생제 B) 함유 배지와 아프라마이신(항생제 A) 함유 배지 상에서 계대배양하였다(도 9 참조). 히그로마이신에 내성인 유전자(HygR)와 아프라마이신에 민감한 유전자(ApraS)는 원칙적으로, 이중 유전자교환 사건이 발생하였으므로 Ωhyg 카세트에 의해 개입중단된 orf8 유전자를 함유하고 있는 것이다. orf8의 야생형 복사물을 Ωhyg 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키는 것은 서던 블롯팅에 의해 확인되었다. 따라서, 수득된 클론의 총 DNA를 여러 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, Ωhyg 카세트에 상응하는 프로브와 하이브리드화시켜, 수득된 클론의 게놈 DNA 내에 상기 카세트가 존재하는지를 확인하였다. 프로브로서, 크기가 대략 3.7kb인, orf7의 말단부, orf8 및 orf9의 출발부를 함유하는 플라스미드 pOS49.88의 PstI-EcoRI 삽입물을 사용하여 제2 하이브리드화를 수행하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 유전자형을 확인할 수 있다.

orf8::Ωhyg 클론을 선택하고, 이를 OS49.107로 명명하였다. 균주 OS49.107 샘플은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-2917 기탁되었다.

실시예 8: orf10 유전자에서 녹아웃을 나타내는 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주의 작제

매트릭스로서 에스. 암보파시엔스의 게놈 DNA를 사용하고 다음 프라이머를 이용함으로써 PCR하여, orf10 유전자 내부의 1.5kb DNA 단편을 수득하였다:

이러한 PCR-유도된 DNA 단편을 벡터 pCR2.1[Invitrogen (Carlsbad, California, USA) 회사에 의해 시판됨] 내로 클로닝하였다. 이로써 수득된 플라스미드는 pOS49.32로 명명되었다. (BamHI 단편 형태의) Ωhyg 카세트(상기 참조)를, 클레노우 효소로 처리함으로써 말단 모두를 평활 말단화시킨 후에 orf10 유전자 단편 내부의 독특한 BstEII 부위 내로 클로닝시킨다. 상기 클로닝이 평활 말단화되었기 때문에, 해당 카세트의 삽입 방향에 따라서 2가지 유형의 플라스미드가 수득되었다: hyg 유전자와 orf10 유전자가 동일한 배향으로 존재하는 pOS49.43; 및 hyg 유전자와 orf10 유전자가 반대 배향으로 존재하는 pOS49.44. 플라스미드 pOS49.43 의 삽입물(이의 말단을 클레노우 효소로 처리함으로써 평활 말단화시킨 Asp718I-XbaI 단편 형태)을 플라스미드 pOJ260의 EcoRV 부위 내로 전이시켜, 플라스미드 pOS49.50을 수득할 수 있다. Ωhyg 카세트에 의해 개입중단된 orf10 유전자를 함유하는 플라스미드 pOS49.50을 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 ATCC23877 내로 도입하였다. 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 히그로마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 히그로마이신-내성 클론을 각각, 히그로마이신(항생제 B) 함유 배지와 아프라마이신(항생제 A) 함유 배지 상에서 계대배양하였다(도 9 참조). 히그로마이신에 내성인 유전자(HygR)와 아프라마이신에 민감한 유전자(ApraS)는 원칙적으로, 이중 유전자교환 사건이 발생하였으며 Ωhyg 카세트에 의해 개입중단된 orf10 유전자를 함유하고 있는 것이다. 이로써, 상기 카세트에 의해 수반된 히그로마이신 내성 마커를 함유하고 있고 벡터 pOJ260에 의해 수반된 아프라마이신 내성 마커를 상실한 클론을 수득하였다. orf10의 야생형 복사물을 orf10::Ωhyg 개입중단된 복사물로 대체시키는 것으로 이루어진 사건은 서던 블롯팅에 의해 확인하였다. 따라서, 수득된 클론의 총 DNA를 여러 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, Ωhyg 카세트에 상응하는 프로브와 하이브리드화시켜, 수득된 클론의 게놈 DNA 내에 상기 카세트가 존재하는지를 확인하였다. 프로브로서, orf10 유전자 내의 1.5kb PCR 생성물을 사용하여 제2 하이브리드화를 수행하였다(상기 참조).

예상된 특징을 나타내는 클론(orf10::Ωhyg )을 보다 특별히 선택하고, 이를 OS49.50으로 명명하였다. 사실상, 2회 하이브리드화를 통하여, Ωhyg 카세트가 상 기 클론의 게놈 내에 존재한다는 사실과, 이러한 클론의 게놈 내에서 야생형 복사물을 Ωhyg 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키고, 연속해서 이중 재조합 사건을 수행한 경우에, 예상된 분해 프로필을 사실상 수득할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 유전자형을 확인할 수 있다.

실시예 9: 유전자 불활성화: "절제 가능한 카세트" 기술에 따라서 녹아웃된 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주의 작제 원리(도 9 및 10 참조)

"절제 가능한 카세트"로 지칭되는 제2 유형의 카세트를 유전자 불활성화에 사용할 수 있다. 이들 카세트는 에스. 암보파시엔스의 게놈 내로 도입된 후 부위-특이적 재조합 사건에 의해 스트렙토마이세스에서 절단될 수 있다는 이점을 지니고 있다. 이러한 목적은 최종 균주 내에, 이러한 균주에 속하지 않는 큰 DNA 서열이나 선별 마커를 잔존시키지 않으면서, 스트렙토마이세스 균주 내의 특정의 유전자를 불활성화시키는 것이다. 절제 후, 대략 30개 정도 염기쌍의 짧은 서열("반흔성(scar)" 부위로 지칭됨) 만이 상기 균주의 게놈 내에 잔존한다(도 10 참조).

이러한 시스템의 사용은 초기에는, 표적 유전자의 야생형 복사물을 (2회 상동 재조합 사건을 통하여: 도 9 참조), 절제 가능한 카세트를 상기 표적 유전자 내로 삽입시킨 작제물로 대체시키는 것으로 이루어진다. 이러한 카세트의 삽입은 표적 유전자의 결실을 수반하게 된다(도 9 참조). 그 다음, 상기 균주의 게놈으로부 터 절제 가능한 카세트를 절제시킨다. 절제 가능한 카세트는 부위-특이적 재조합 시스템을 통하여 기능하고, 결국에는 내성 유전자를 수반하지 않는 스트렙토마이세스 돌연변이체를 획득할 수 있게 해주는 이점을 지니고 있다. 불활성화된 유전자(들)의 하류에 위치한 유전자의 발현에 대한 가능한 극성 효과를 또한 피할 수 있다(도 10 참조).

절제 가능한 카세트의 이용에 관해 당해 분야에 보고되었으며, 이는 포유류 세포, 효소 세포 및 이. 콜라이를 포함한 많은 유기체에서 사용되었다[참조: Bayley et al., 1992; Brunelli and Pall, 1993; Camilli et al., 1994; Dale and Ow, 1991; Russell et al., 1992; Lakso et al., 1992]. 이들 절제 가능한 카세트는 모두, lox 부위 상에서 작용하는 Cre 부위-특이적 레컴비나제(recombinase)를 이용한다. 이러한 재조합 시스템은 P1 박테리오파아지로부터 유래한다.

"절제 가능한 카세트" 유형 시스템을 스트렙토마이세스에서 작제하기 위해, 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 이동 유전 요소 pSAM2에 대한 부위-특이적 재조합 시스템을 이용한다[참조: Boccard et al., 1989a and b]. 이러한 시스템 설정은 초기에는, 절제 가능한 카세트가 삽입되는, 개입중단될 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 작제하는 것으로 구성된다. 절제 가능한 카세트를 표적 유전자 내로 삽입하는 것은 표적 유전자의 결실을 수반하게 된다. 이는 표적 유전자 내에 존재하는 제한 부위를 사용하여 클로닝시키거나, 또는 예를 들어, 문헌[참조: M.K. Chaveroche et al., 2000]에 기재된 바와 같은 동일한 짧은 서열들 간을 재조합시킴으로써 수행할 수 있다. 절제 가능한 카세트는 예를 들어, Ωhyg 카세트를 사용 하여 작제할 수 있다[참조: Blondelet Rouault et al.,1997]. 이러한 카세트는 pSAM2의 통합된 복사물을 정상적으로 플랭킹하는 attR 및 attL 서열과 접해있다(도 15 참조). attL 및 attR 서열은 pSAM2의 절제를 허용하거나 또는 이들 두 영역 사이에 위치한 모든 DNA 단편의 절제를 허용해 주는 부위-특이적 재조합에 필요한 부위 모두를 함유한다[참조: Sezonov et al., 1997, Raynal et al.,1998]. 이러한 카세트의 작제가 Ωhyg 카세트의 사용으로만 제한되지 않는 것은 명백하며, 기타 내성 카세트를 이러한 카세트 작제에 대한 기본으로서 사용할 수 있다[예를 들면, Ωaac 또는 Ωvph 카세트(참조: Blondelet Rouault et al.,1997)].

상기 작제물을 수득한 후, 재조합 플라스미드를 사용하여 스트렙토마이세스 균주를 형질전환시킨다. 이어서, 표적 유전자 내에 존재하는 카세트에 상응하는 항생제로 형질전환체를 선별한다(참조: 도 9, 항생제 B, 이는, 예를 들어, 절제 가능한 카세트가 Ωhyg 카세트로부터 유도되는 경우에는 히그로마이신으로의 선별을 포함한다). 이로써, 1회 또는 2회 재조합 사건에 의해 통합이 이루어진 클론의 혼합물을 선별한다. 이어서, 이에 대한 내성 유전자가 벡터 내에 존재하는(재조합 카세트 외부) 항생제(참조: 도 9, 항생제 A)에 민감한 클론을 찾아낸다. 이로써, 원칙적으로 2회 재조합 사건으로 인해 야생형 유전자가 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체된 클론을 선별하는 것이 가능하다. 이들 단계는 도 9에 도식적으로 제시되어 있으며; 이로써 수득된 클론의 유전자형은 서던 블롯팅에 의해 확인하고 목적하는 특징(야생형 유전자를 절제 가능한 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시킴)을 나타내는 클론을 선별한다.

그 다음, 상기 선별된 균주를, attR 부위와 attL 부위 간의 부위-특이적 재조합에 필요한 xis 및 int 유전자의 발현을 허용해 주는 플라스미드로 형질전환시킨다. 이러한 재조합으로 인해, 재조합 사건을 통하여 상기 균주의 게놈 내에 절제 가능한 카세트가 잔존하게 된다(도 10 참조)[참조: Raynal et al., 1998]. 스트렙토마이세스에서 비교적 안정한 벡터로부터의 xis 및 int 유전자를 수반하는 벡터[스트렙토마이세스 벡터 pWHM3로부터 유도됨(참조: Vara et al., 1989)]를 선택하는 것이 유리한데, 이로써 선별 압력의 부재 하에 포자형성 몇 주기 후에 후자 벡터를 상실한 균주를 수득하는 것이 가능해진다.

상기 카세트를 절제하기 위해, 예를 들어, 절제 가능한 카세트에 의해 개입중단된 유전자를 함유하는 에스. 암보파시엔스 균주 내로 원형질체 형질전환시킴으로써 도입되는 플라스미드 pOSV508(도 14 참조)를 사용하는 것이 가능하다. 플라스미드 pOSV508는 ptrc 프로모터(참조: E. Amann et al., 1988)의 제어 하에 위치된, pSAM2의 xis 및 int 유전자(참조: F. Boccard et al., 1989b)가 부가된 플라스미드 pWHM3(참조: J. Vara et al.,1989)(도 13 참조)으로부터 유도된 것이다. ptrc 프로모터의 제어 하에 위치된 xis 및 int 유전자를 플라스미드 pOSint3으로부터의 플라스미드 pWHM3 내로 아클로닝시킨다(참조: Raynal et al., 1998)(도 14 참조). pSAM2의 xis 및 int 유전자를 수반하는 플라스미드 pOSV508을 돌연변이체 균주 내로 도입하면, 절제 가능한 카세트를 플랭킹하는 attL 부위와 attR 부위 간의 부위-특이적 재조합에 의해 이러한 절제 가능한 카세트를 효과적으로 절제시켜 줄 것이다(참조: A. Raynal et al., 1998)(도 10). pOSV508에 의해 수반된 tsr 유전 자에 기인하여 이들의 티오스트렙톤 내성에 대해 선별된 형질전환체 중에서, 해당 카세트의 존재가 내성을 부여해 주는 항생제에 대해 민감한 형질전환체를 선택한다(도 10 참조). 이러한 절제는 효과적이고, 형질전환체의 90% 이상이 이러한 유형인 것으로 관찰되었다. 티오스트렙톤이 결여된 고체 배지 상에서의 성장과 포자형성을 1회 이상 수행한 후, 플라스미드 pOSV508을 상실한 클론을 수득한다. 이들 클론은 티오스트렙톤에 대한 이들의 민감성 측면에서 탐지될 수 있다. 결실된 표적 유전자의 서열은 PCR에 의해 확인할 수 있고 이러한 PCR 생성물을 서열 분석함으로써 확인할 수 있다.

최종적으로, 이로써 생성된 균주는 불활성화 유전자(예를 들어, 내부 결실물) 내에, attR 부위와 attL 부위 간의 재조합으로부터 유도된, 최소 attB 부위(참조: Raynal et al., 1998)에 상응하는 "반흔성" att 부위를 수반한다. 잔존하는 최소 attB 부위는 스트렙토마이세스 암보파시엔스, 스트렙토마이세스 프리스티내스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis) 및 스트렙토마이세스 리비단스 균주에 천연적으로 존재하는 것과 유사하다(참조: Sezonov et al., 1997).

불활성화시키고자 하는 유전자를 하류에 위치한 기타 유전자와 동시 전사시킬 수 있다. 오페론에서 하류 유전자의 발현에 대한 극성 효과를 지니고 있는 유전자들 중의 하나가 불활성화되는 것을 피하기 위해서는, 카세트를 절제한 후 동위상 결실을 획득하는 것이 중요하다. 상기 언급된 바와 같은 절제 가능한 카세트 시스템은 이러한 요구 사항을 충족시켜 줄 수 있다. 당업자는 사실상, 3가지 상이한 절제 가능한 카세트를 용이하게 작제할 수 있는데, 이러한 카세트는 절제 후, 판독 프레임이 무엇이든지 간에 중지 코돈을 수반하지 않는 33, 34 또는 35개 뉴클레오티드 서열을 각각 잔존시킨다. 상기 카세트의 삽입과 연관된 결실 크기와 표적 유전자의 서열이 공지된 경우에는, 이들 3가지 절제 가능한 카세트 중에서, 절제시키면 동위상 결실되는 것을 선택하는 것이 가능하다. 부가된 33, 34 또는 35개 뉴클레오티드 중에서, 26개가 최소 attB 부위에 상응한다(도 27 참조).

본 출원의 경우에는, 2가지 절제 가능한 카세트를 사용하였다. 이들 2가지 카세트는 다음과 같다: att1Ωhyg+(서열 번호 91) 및 att3Ωaac-(서열 번호 92); 이들 카세트는 절제 후 각각 33 및 35개 뉴클레오티드를 잔존시킨다. 이들은 각각, Ωhyg 카세트 또는 Ωaac 카세트를 포함하며, + 및 - 부호는 내성 카세트의 배향에 상응한다. 이들 두 카세트를 작제하고 벡터 pBC SK+의 EcoRV 부위 내로 클로닝하였는데, 이의 HindIII 부위는 미리 결실시켰다. 이로써 수득된 플라스미드는 patt1Ωhyg+ 및 patt3Ωaac-로 각각 명명되었다. 절제 가능한 카세트는 플라스미드를 EcoRV로 분해시킴으로써 용이하게 꺼낼 수 있다.

실시예 10: orf2 유전자에서 녹아웃을 나타내는 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주의 작제

orf2 유전자의 불활성화는 절제 가능한 카세트를 사용하여 수행하였다(상기 참조). 사용된 출발 균주는 균주 ATCC23877로부터 유도되는 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2이다. 그러나, 균주 OSC2는 이동 유전 요소 pSAM2를 상실하였다는 점에서 균주 ATCC23877와 상이하다(참조: Boccard et al., 1989a and b). 이러한 이동 요소는 균주 ATCC23877의 원형질체 형성(세포벽을 분해시키고 균사체를 단편으로 만드는 리소자임의 작용(참조: Kieser et al., 2000)) 및 상기 균주의원형질체 재생 동안 자발적으로 상실될 수 있다. pSAM2 요소를 상실한 클론을 선별하기 위해, KorSA 전사 억제인자에 의한 pra 유전자의 억제에 근거하여 스크린을 설정하였다(참조: Sezonov et al., 1995 and G. Sezonov et al., 2000). 이를 위해, aph 유전자(카나마이신 내성을 부여해 주고 자신의 프로모터가 결여되어 있음)의 상류에 위치한 pra 유전자의 프로모터를 함유하는 DNA 단편을 불안정한 벡터 pWHM3Hyg 내로 클로닝하는데, 후자는 tsr 유전자를 hyg 유전자(히그로마이신 내성을 부여함)로 대체시킨 플라스미드 pWHM3(참조: Vara et al., 1989)로부터 유도된다. 이로써 수득된 플라스미드는 pOSV510로 명명되었다. 균주 ATCC23877는 원형질체 형성 후에 플라스미드 pOSV510로 형질전환시켰다. Pra 프로모터는 KorSA 억제인자에 의해 억제되는 프로모터이고, 후자를 암호화하는 유전자는 pSAM2 이동 요소 내에 위치해 있다(참조: Sezonov G. et al., 2000). 플라스미드 pOSV510로 형질전환시킨 후, 형질전환된 세균을 대상으로 하여, 이의 카나마이신 내성에 대해 선별하였다(pOSV510에 의해 수반된 aph 유전자에 기인함). pSAM2 통합 요소를 상실한 클론은 KorSA 억제인자를 상실하였으며, Pra 프로모터는 더 이상 억제되지 않으며 aph 카나마이신 내성 유전자의 발현을 허용해 준다. 따라서, 플라스미드 pOSV510로의 형질전환 후 카나마이신으로 선별하게 되면, pSAM2 통합 요소를 상실하고(이에 따라 KorSA를 상실함) 플라스미드 pOSV510을 함유하는 클론을 선별하는 것이 가능해진다. 플라스미드 pOSV510은 불안정하기 때문에, 항생제 없이 포자 형 성을 수회 수행한 후에 분리된 클론을 카나마이신 함유 배지, 히그로마이신 함유 배지 및 항생제 무함유 배지 상에서 계대배양하였다. 카나마이신과 히그로마이신에 민감한 클론은 pOSV510을 상실하였다. pSAM2 요소의 상실은 하이브리드화 및 PCR에 의해 확인하였다. 목적하는 특징을 나타내는 클론을 선별하고 이를 OSC2로 명명하였다.

균주 OSC2 샘플은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-2908로 기탁되었다.

orf2 유전자의 불활성화는 절제 가능한 카세트 기술을 사용하여 수행하였다(상기 및 도 10 참조). 이를 위해, 1번에 위치한 EcoRI 부위에서 부터 출발하여 4521번(서열 번호 1)에 위치한 BamHI 부위 까지 서열의 4.5kb 삽입물을 코스미드 pSPM5로부터의 플라스미드 pUC19(젠뱅크 수탁 번호: M77789)의 EcoRI 및 BamHI 부위 내로 아클로닝시켰다. 이로써 수득된 플라스미드는 pOS49.99로 명명되었다.

이러한 플라스미드를, 플라스미드 pKOBEG를 이미 함유하고 있는 이. 콜라이 균주 KS272 내로 도입하였다(참조: Chaveroche et al., 2000)(도 12 참조).

이와 병행해서, att3Ωaac- 절제 가능한 카세트(서열 번호 92, 상기 참조)를, 매트릭스로서 플라스미드 pOSK1102[플라스미드 pOSK1102는 att3Ωaac- 카세트를 EcoRV 단편으로서, pGP704Not의 독특한 EcoRV 부위 내로 클로닝시킨 벡터 pGP704Not로부터 유도된 플라스미드이다(참조: Chaveroche et al., 2000 and V.L. Miller & J.J. Mekalanos, 1988)]를 사용하고, 다음 프라이머를 사용하여 PCR함으 로써 증폭시켰다:

이들 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한 40개 데옥시뉴클레오티드는 표적 유전자(본 경우에는 orf2) 내의 서열에 상응하는 서열을 포함하고, 3' 위치에 가장 근접하게 위치한 20개 데옥시뉴클레오티드(진하게 표시됨)는 att3Ωaac- 절제 가능한 카세트의 말단 중의 하나의 서열에 상응한다(도 11 참조).

이로써 수득된 PCR 생성물을 사용하여, 문헌(참조: Chaveroche et al., 2000)에 기재된 바와 같은 플라스미드 pKOBEG 및 pOS49.99를 함유하는 이. 콜라이 균주를 형질전환시킨다(도 12 참조). 이로써, 상기 세균을 전기천공시킴으로써 형질전환시키고, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 수득된 분해 프로필이, att3Ωaac- 카세트가 표적 유전자(orf2) 내로 삽입된 경우, 즉 PCR 생성물의 말단과 표적 유전자의 말단 간에 상동 재조합이 실제로 수행된 경우에 예상된 프로필에 상응하는지를 확인할 목적으로, 상기 수득된 클론의 플라스미드를 추출하고 여러 제한 효소로 분해하였다(참조: Chaveroche et al., 2000). 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 상기 작제물을 확인할 수도 있다. 플라스미드가 예상 프로필을 갖는 클론을 선별하고, 상응하는 플라스미드는 pSPM17로 명명하였다. 이러한 플라스미드는 orf2가 아프라마이신 카세트에 의해 개입중단된 pOS49.99로부 터 유도된 것이다(도 12 참조).

상기 카세트의 삽입은 orf2의 암호화 부분의 211번 뉴클레오티드와 492번 뉴클레오티드 사이의 orf2 결실을 수반한다.

플라스미드 pSPM17을 EcoRI 효소로 분해시킨 다음, 클레노우 효소로 처리함으로써 평활 말단화하고, 이러한 분해 생성물을 XbaI 효소로 분해시키고, 결실된 orf2 유전자를 함유하는 삽입물을 벡터 pOSK1205(상기 참조) 내로 클로닝시켰다. 이를 위해, 벡터 pOSK1205를 BamHI 효소로 분해시키고, 이의 말단을 클레노우 효소로 처리함으로써 평활 말단화한 다음, 이 생성물을 XbaI 효소로 분해시키고, 상기와 같이 pSPM17로부터 수득된 삽입물과의 연결에 사용하였다. 따라서, 이러한 조작으로 특정 배향의 연결을 획득할 수 있는데, 이는 상기 2개 단편 중의 하나를 한쪽에서 평활 말단시키고, 다른 쪽에는 XbaI를 평활 말단시키기 때문이다. 이로써 수득된 플라스미드는 pSPM21로 명명되었는데; 이는 히그로마이신 내성 유전자(벡터 부분)와, 결실된 orf2 유전자를 att3Ωaac- 카세트로 대체시킨 삽입물을 수반한다.

벡터 pSPM21을 원형질체 형질전환에 의해 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2(상기 참조) 내로 도입하였다(참조: T. Kieser et al., 2000). 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 아프라마이신-내성 클론을 각각, 아프라마이신(항생제 B) 함유 배지와 히그로마이신(항생제 A) 함유 배지 상에서 계대배양하였다(도 9 참조). 아프라마이신에 내성인 클론(ApraR)과 히그로마이신에 민감한 유전자(HygS)는 원칙적으로, 이중 유전자교환 사건이 발생하였으며 att3Ωaac- 카세트에 의해 개입중단된 orf2 유 전자를 함유하고 있는 것이다. 이들 클론을 선별하고, orf2의 야생형 복사물을 상기 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키는 것을 확인하였다. att3Ωaac- 카세트의 존재는 콜로니 PCR에 의해 확인하였다. 하이브리드화를 또한 수행하였다. 이를 위해, 수득된 클론의 총 DNA를 여러 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, 플라스미드 pOS49.99(상기 참조) 삽입물의 EcoRI-BamHI 단편에 상응하는 3kb 프로브와 하이브리드화하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 유전자형을 확인할 수 있다.

예상된 특징을 나타내는 클론을 선별하고, 이를 SPM21로 명명하였다. PCR 및 하이브리드화를 이용하여, att3Ωaac- 카세트가 상기 클론의 게놈 내에 실제로 존재한다는 사실과, 이러한 클론의 게놈 내에서 야생형 복사물을 att3Ωaac- 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키고, 연속해서 이중 재조합 사건을 수행한 경우에, 예상된 분해 프로필을 실제로 수득할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 클론은 유전자형: orf2::att3Ωaac-을 갖는다.

균주 SPM21 샘플은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-2914로 기탁되었다.

상기 카세트를 절제하기 위해, 균주 SPM21을 원형질체 형질전환에 의해 벡터 pOSV508로 형질전환시켰다(도 14 참조). 플라스미드 pOSV508는 ptrc 프로모터(참조: E. Amann et al., 1988)의 제어 하에 위치된, pSAM2의 xis 및 int 유전자(참 조: F. Boccard et al., 1989b)가 부가된 플라스미드 pWHM3(참조: J. Vara et al.,1989)(도 13 참조)으로부터 유도된 것이다. pSAM2의 xis 및 int 유전자를 수반하는 플라스미드 pOSV508을 상기 균주 SPM21 내로 도입하면, 절제 가능한 카세트를 플랭킹하는 attL 부위와 attR 부위 간의 부위-특이적 재조합에 의해 이러한 절제 가능한 카세트를 효과적으로 절제시켜 줄 것이다(참조: A. Raynal et al., 1998)(도 10). pOSV508에 의해 수반된 tsr 유전자에 기인하여 이들의 티오스트렙톤 내성에 대해 선별된 형질전환체 중에서, 아프라마이신에 대해 민감해진 형질전환체(이에 대한 내성 유전자는 att3Ωaac- 카세트에 의해 수반된다)를 선택하는데; 이러한 절제로 인해, 사실상 상기 내성 유전자가 상실된다(도 10 참조). 플라스미드 pOSV508은 불안정하기 때문에, 항생제 무함유 배지 상에서 2회 연속해서 계대접종한 후, 분리된 클론을 티오스트렙톤 함유 배지 및 티오스트렙톤 무함유 배지 상에서 계대배양하였다. 티오스트렙톤-민감성 클론은 pOSV508을 상실하였다. PCR하고 PCR 생성물을 서열 분석함으로써, 상기 카세트의 절제로 인해 orf2 유전자 내에서 동위상 결실이 실제로 일어났다는 사실을 확인하였고; 이러한 카세트의 절제는 사실상, 특징적인 "반흔성" att3 서열을 잔존시킨다(이는 attL 부위와 attR 부위 간의 재조합 후 기원의 attB 부위와 유사하다):

5'ATCGCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3'(서열 번호 95).

이로써 수득된, 목적하는 유전자형(orf2::att3)을 갖는 균주는 SPM22로 명명되었다.

균주 SPM22 샘플은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-2915로 기탁되었다.

실시예 11: orf12 유전자에서 녹아웃을 나타내는 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주의 작제

orf12, orf13c 및 orf14를 불활성화시키기 위해, 동일한 출발 플라스미드(pSPM504)를 사용하여, 각종 위치에 "절제 가능한 카세트"의 카세트를 도입하였다. 이러한 플라스미드는 orf7에서 부터 orf17까지의 영역에 상응하는 15.1kb 삽입물을 함유한다. 상기 플라스미드를 작제하기 위해, 코스미드 pSPM7(상기 참조)의 분해로부터 유래하는 15.1kb BglII 단편을, BamHI로 분해시킨 플라스미드 pMBL18(참조: Nakano et al., 1995) 내로 클로닝하였다. BamHI 말단과 BglII 말단은 호환성이기 때문에, 연결 후에 플라스미드 pSPM502를 수득한다. 이어서, pSPM502 완전한 삽입물을 (HindIII/NheI 단편 형태로) 플라스미드 pOSK1205(HindIII/NheI로 분해시킴) 내로 아클로닝시켜, 플라스미드 pSPM504를 수득할 수 있다.

이러한 플라스미드를, 플라스미드 pKOBEG를 이미 함유하고 있는 이. 콜라이 균주 KS272 내로 도입하였다(참조: Chaveroche et al., 2000)(도 12 참조).

이와 병행해서, att3Ωaac- 절제 가능한 카세트를, 매트릭스로서 플라스미드 pOSK1102[플라스미드 pOSK1102는 att3Ωaac- 카세트를 EcoRV 단편으로서, pGP704Not의 독특한 EcoRV 부위 내로 클로닝시킨 벡터 pGP704Not로부터 유도된 플라스미드이다(참조: Chaveroche et al., 2000 and V.L. Miller & J.J. Mekalanos, 1988)]를 사용하여 PCR함으로써 증폭시켰으며, 사용된 프라이머는 다음과 같다:

이들 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한 40개(EDR8의 경우에는 39개) 데옥시뉴클레오티드는 표적 유전자(본 경우에는 orf12) 내의 서열에 상응하는 서열을 포함하고, 3' 위치에 가장 근접하게 위치한 20개 데옥시뉴클레오티드(진하게 표시됨)는 att3Ωaac- 절제 가능한 카세트의 말단 중의 하나의 서열에 상응한다(도 11 참조).

이로써 수득된 PCR 생성물을 사용하여, 문헌(참조: Chaveroche et al., 2000)에 기재된 바와 같은 플라스미드 pKOBEG 및 pSPM504(상기 참조)를 함유하는 이. 콜라이 균주 KS272를 형질전환시킨다(도 12 참조; 원칙적으로 플라스미드 pOS49.99는 플라스미드 pSPM504로 대체되어야 하고, 수득된 플라스미드는 더 이상 pSPM17이 아니지만, pSPM507이다). 이로써, 상기 세균을 이러한 PCR 생성물로 전기천공시킴으로써 형질전환시키고, 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 수득된 분해 프로필이, att3Ωaac- 카세트가 표적 유전자(orf12) 내로 삽입된 경우, 즉 PCR 생성물의 말단과 표적 유전자의 말단 간에 상동 재조합이 실제로 수행된 경우에 예상된 프로필에 상응하는지를 확인할 목적으로, 상기 수득된 클론의 플라스미드를 추출하고 여러 제한 효소로 분해하였다(참조: Chaveroche et al., 2000). 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사 용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 상기 작제물을 확인할 수도 있다. 플라스미드가 예상 프로필을 갖는 클론을 선별하고, 상응하는 플라스미드는 pSPM507로 명명되었다. 이러한 플라스미드는 orf12가 att3Ωaac- 카세트에 의해 개입중단된 pSPM504로부터 유도된 것이다(도 12 참조). 상기 카세트의 삽입은 orf12 유전자에서의 결실을 수반하는데, 개입중단은 orf12의 30번째 코돈에서 시작한다. orf12의 마지막 46개 코돈은 카세트 다음에 존재한다.

벡터 pSPM507을 원형질체 형질전환에 의해 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2(상기 참조) 내로 도입하였다(참조: T. Kieser et al., 2000). 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 아프라마이신-내성 클론을 각각, 아프라마이신(항생제 B) 함유 배지와 히그로마이신(항생제 A) 함유 배지 상에서 계대배양하였다(도 9 참조). 아프라마이신에 내성인 클론(ApraR)과 히그로마이신에 민감한 유전자(HygS)는 원칙적으로, 이중 유전자교환 사건이 발생하였으며 att3Ωaac- 카세트에 의해 개입중단된 orf12 유전자를 함유하고 있는 것이다. 이들 클론을 보다 특별히 선별하고, orf12의 야생형 복사물을 상기 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키는 것을 하이브리드화에 의해 확인하였다. 따라서, 수득된 클론의 총 DNA를 여러 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, att3Ωaac- 카세트에 상응하는 프로브와 하이브리드화시켜, 수득된 클론의 게놈 DNA 내에 상기 카세트가 존재하는지를 확인하였다. 프로브로서, PCR에 의해 수득되고 orf12 유전자의 암호화 서열의 매우 큰 부분에 상응하는 DNA 단편을 사용하여 제2 하이브리드화를 수행 하였다.

당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 유전자형을 확인할 수 있다.

예상된 특징을 나타내는 클론(orf12::att3Ωaac-)을 보다 특별히 선별하고, 이를 SPM507로 명명하였다. 사실상, 2회 하이브리드화를 통하여, att3Ωaac- 카세트가 상기 클론의 게놈 내에 실제로 존재한다는 사실과, 이러한 클론의 게놈 내에서 야생형 유전자를 att3Ωaac- 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키고, 연속해서 이중 재조합 사건을 수행한 경우에 예상된 분해 프로필을 실제로 수득할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 클론은 유전자형: orf12::att3Ωaac-을 갖고 SPM507로 명명되었다. 유전자의 배향이 주어지면(도 3 참조), orf12의 불활성화 효과를 연구하기 위해 카세트를 절제할 필요가 없다. 구체적으로 언급하면, orf13c가 orf12와 반대 방향으로 배향된다는 사실은 이들 유전자가 동시에 전사되지 않는다는 것을 보여준다. 절제 가능한 카세트를 사용하면, 한편으론 선별 마커를 어떠한 순간에도, 특히 플라스미드 pOSV508로의 형질전환에 의해 제거할 수 있는 가능성이 생긴다. 균주 SPM507 샘플은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-2911로 기탁되었다.

실시예 12: orf13c 유전자에서 녹아웃을 나타내는 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주의 작제

att3Ωaac- 절제 가능한 카세트를, 매트릭스로서 플라스미드 pOSK1102(상기 참조)를 사용하고, 다음 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 증폭시켰다:

이들 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한 40개 데옥시뉴클레오티드는 표적 유전자(본 경우에는 orf13c) 내의 서열에 상응하는 서열을 포함하고, 3' 위치에 가장 근접하게 위치한 20개 데옥시뉴클레오티드(진하게 표시됨)는 att3Ωaac- 절제 가능한 카세트의 말단 중의 하나의 서열에 상응한다(도 11 참조).

이로써 수득된 PCR 생성물을 사용하여, 문헌(참조: Chaveroche et al., 2000)에 기재된 바와 같은 플라스미드 pKOBEG 및 pSPM504(상기 참조)를 함유하는 이. 콜라이 균주 KS272를 형질전환시킨다(도 12 참조; 원칙적으로 플라스미드 pOS49.99는 플라스미드 pSPM504로 대체되어야 하고, 수득된 플라스미드는 더 이상 pSPM17이 아니지만, pSPM508이다). 이로써, 상기 세균을 이러한 PCR 생성물로 전기천공시킴으로써 형질전환시키고, 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 수득된 분해 프로필이, att3Ωaac- 카세트가 표적 유전자(orf13c) 내로 삽입된 경우, 즉 PCR 생성물의 말단과 표적 유전자의 말단 간에 상동 재조합이 실제로 수행된 경우에 예상된 프로필에 상응하는지를 확인할 목적으로, 상기 수득된 클론의 플라스미드를 추출하고 여러 제한 효소로 분해하였다(참조: Chaveroche et al., 2000). 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리 고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 상기 작제물을 확인할 수도 있다. 플라스미드가 예상 프로필을 갖는 클론을 선별하고, 상응하는 플라스미드를 pSPM508로 명명하였다. 이러한 플라스미드는 orf13c가 아프라마이신 카세트에 의해 개입중단된 pSPM504로부터 유도된 것이다(도 12 참조). 상기 카세트의 삽입은 orf13c 유전자에서의 결실을 수반하는데, 개입중단은 orf13c의 6번째 코돈에서 시작한다. orf13c의 마지막 3개 코돈은 카세트 다음에 존재한다.

벡터 pSPM508을 원형질체 형질전환에 의해 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2(상기 참조) 내로 도입하였다(참조: T. Kieser et al., 2000). 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 아프라마이신-내성 클론을 각각, 아프라마이신(항생제 B) 함유 배지와 히그로마이신(항생제 A) 함유 배지 상에서 계대배양하였다(도 9 참조). 아프라마이신에 내성인 클론(ApraR)과 히그로마이신에 민감한 클론(HygS)은 원칙적으로, 이중 유전자교환 사건이 발생하였으며 att3Ωaac- 카세트에 의해 개입중단된 orf13c 유전자를 함유하고 있는 것이다. 이들 클론을 보다 특별히 선별하고, orf13c의 야생형 복사물을 상기 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키는 것을 하이브리드화에 의해 확인하였다. 따라서, 수득된 클론의 총 DNA를 여러 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, att3Ωaac- 카세트에 상응하는 프로브와 하이브리드화시켜, 수득된 클론의 게놈 DNA 내에 상기 카세트가 존재하는지를 확인하였다. 프로브로서, orf13c의 암호화 서열의 상류 및 하류에 대략 100개 염기쌍 정도로 연장된 서열에 상응하는 PCR 생성물을 사용하여 제2 하이브리드화를 수행하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 유전자형을 확인할 수 있다.

예상된 특징을 나타내는 클론(orf13c::att3Ωaac-)을 보다 특별히 선별하고, 이를 SPM508로 명명하였다. 사실상, 2회 하이브리드화를 통하여, att3Ωaac- 카세트가 상기 클론의 게놈 내에 실제로 존재한다는 사실과, 이러한 클론의 게놈 내에서 야생형 유전자를 att3Ωaac- 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키고, 연속해서 이중 재조합 사건을 수행한 경우에 예상된 분해 프로필을 실제로 수득할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 클론은 유전자형: orf13c::att3Ωaac-을 갖고 SPM508로 명명되었다. 유전자의 배향이 주어지면(도 3 참조), orf13c의 불활성화 효과를 연구하기 위해 카세트를 절제할 필요가 없다. orf14가 orf13c와 반대 방향으로 배향된다는 사실은 이들 유전자가 동시에 전사되지 않는다는 것을 보여준다. 절제 가능한 카세트를 사용하면, 한편으론 선별 마커를 어떠한 순간에도 제거할 수 있는 가능성이 생긴다. 균주 SPM508 샘플은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-2912로 기탁되었다.

실시예 13: orf14 유전자에서 녹아웃을 나타내는 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주의 작제

이들 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한 40개 데옥시뉴클레오티드는 표적 유전자(본 경우에는 orf14) 내의 서열에 상응하는 서열을 포함하고, 3' 위치에 가장 근접하게 위치한 20개 데옥시뉴클레오티드(진하게 표시됨)는 att3Ωaac- 절제 가능한 카세트의 말단 중의 하나의 서열에 상응한다(도 11 참조).

이로써 수득된 PCR 생성물을 사용하여, 문헌(참조: Chaveroche et al., 2000)에 기재된 바와 같은 플라스미드 pKOBEG 및 pSPM504(상기 참조)를 함유하는 이. 콜라이 균주 KS272를 형질전환시킨다(도 12 참조; 원칙적으로 플라스미드 pOS49.99는 플라스미드 pSPM504로 대체되어야 하고, 수득된 플라스미드는 더 이상 pSPM17이 아니지만, pSPM509이다). 이로써, 상기 세균을 이러한 PCR 생성물로 전기천공시킴으로써 형질전환시키고, 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 수득된 분해 프로필이, att3Ωaac- 카세트가 표적 유전자(orf14) 내로 삽입된 경우, 즉 PCR 생성물의 말단과 표적 유전자의 말단 간에 상동 재조합이 실제로 수행된 경우에 예상된 프로필에 상응하는지를 확인할 목적으로, 상기 수득된 클론의 플라스미드를 추출하고 여러 제한 효소로 분해하였다(참조: Chaveroche et al., 2000). 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 상기 작제물을 확인할 수도 있다. 플라스미드가 예상 프로필을 갖는 클론을 선별하고, 상응하는 플라스미드를 pSPM509로 명명하였다. 이러한 플라스미드는 orf14가 아프라마이신 카세트에 의해 개입중단된 pSPM504로부터 유도된 것이다(도 12 참조). 상기 카세트의 삽입은 orf14 유전자에서의 결실을 수반하는데, 개입중단은 orf14의 4번째 코돈에서 시작한다. orf14의 마지막 코돈은 카세트 다음에 존재한다.

벡터 pSPM509를 원형질체 형질전환에 의해 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2(상기 참조) 내로 도입하였다(참조: T. Kieser et al., 2000). 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 아프라마이신-내성 클론을 각각, 아프라마이신(항생제 B) 함유 배지와 히그로마이신(항생제 A) 함유 배지 상에서 계대배양하였다(도 9 참조). 아프라마이신에 내성인 클론(ApraR)과 히그로마이신에 민감한 클론(HygS)은 원칙적으로, 이중 유전자교환 사건이 발생하였으며 att3Ωaac- 카세트에 의해 개입중단된 orf14 유전자를 함유하고 있는 것이다. 이들 클론을 보다 특별히 선별하고, orf14의 야생형 복사물을 상기 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키는 것을 하이브리드화에 의해 확인하였다. 따라서, 수득된 클론의 총 DNA를 여러 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, att3Ωaac- 카세트에 상응하는 프로브와 하이브리드화시켜, 수득된 클론의 게놈 DNA 내에 상기 카세트가 존재하는지를 확인하였다. 프로브로서, orf14의 암호화 서열의 상류 및 하류에 대략 100개 염기쌍 정도로 연장된 서열에 상응하는 PCR 생성물을 사용하여 제2 하이브리드화를 수행하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 유전자형을 확인할 수 있다.

예상된 특징을 나타내는 클론(orf14::att3Ωaac-)을 보다 특별히 선별하고, 이를 SPM509로 명명하였다. 사실상, 2회 하이브리드화를 통하여, att3Ωaac- 카세트가 상기 클론의 게놈 내에 실제로 존재한다는 사실과, 이러한 클론의 게놈 내에서 야생형 유전자를 att3Ωaac- 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키고, 연속해서 이중 재조합 사건을 수행한 경우에 예상된 분해 프로필을 실제로 수득할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 클론은 유전자형: orf14::att3Ωaac-을 갖고 SPM509로 명명되었다. 유전자의 배향이 주어지면(도 3 참조), orf14의 불활성화 효과를 연구하기 위해 카세트를 절제할 필요가 없다. orf15c가 orf14와 반대 방향으로 배향된다는 사실은 이들 유전자가 동시에 전사되지 않는다는 것을 보여준다. 절제 가능한 카세트를 사용하면, 한편으론 선별 마커를 어떠한 순간에도 제거할 수 있는 가능성이 생긴다. 균주 SPM509 샘플은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-2913으로 기탁되었다.

실시예 14: orf6* 유전자에서 녹아웃을 나타내는 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주의 작제

orf6* 유전자의 불활성화는 절제 가능한 카세트 기술을 사용하여 수행하였다(상기 및 도 10 참조). 이를 위해, 코스미드 pSPM7을 매트릭스로서 사용하고 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여, orf6* 유전자의 일정 단편을 증폭시켰다:

이들 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치한 20개 데옥시뉴클레오티드는 orf6* 유전자(서열 번호 13)의 암호화 부분에 위치한 서열에 상응하고, 5' 위치에 가장 근접하게 위치한 6개 데옥시뉴클레오티드는 후속 클로닝을 촉진시켜 주는 PstI 부위의 서열에 상응한다. 증폭된 DNA 단편은 크기가 대략 1.11kb이다. 이러한 PCR 생성물을 벡터 pGEM-T Easy(Promega (Madison, Wisconsin, USA) 회사에 의해 시판됨) 내로 클로닝시켜, pBXL1111로 명명된 플라스믿를 수득할 수 있다(도 16 참조).

이어서, att1Ωhyg+ 절제 가능한 카세트를 orf6* 유전자의 암호화 서열 내로 도입하였다. 이를 위해, 플라스미드 pBXL1111을 SmaI 및 Asp718I 제한 효소로 분해시키고, 분해 생성물을 클레노우 효소로 처리하였다. 이러한 조작으로 인해, orf6* 유전자의 암호화 서열 내에 120bp의 내부 결실을 유발시킬 수 있다(도 15 참조). 또한, 상기 제한 부위 중의 어느 한쪽에 orf6* 서열의 511bp와 485bp가 각각 잔존하는데, 이는 orf6* 유전자의 불활성화를 위한 상동 재조합을 허용해줄 것이 다. att1Ωhyg+ 절제 가능한 카세트는 플라스미드 patt1Ωhyg+(상기 참조)를 EcoRV로 분해시킴으로써 이러한 플라스미드로부터 제조하였다. 이어서, 후자를, 앞서 기재된 바와 같이 하여(SmaI 및 Asp718I 분해에 이어, 클레노우 효소로 처리함) 미리 제조한 벡터 pBXL1111 내로 아클로닝시킨다. 수득된 플라스미드는 pBXL1112로 명명하였다(도 17 참조). 이러한 작제물에서는 orf6* 유전자가 120bp 결실을 포함하고 att1Ωhyg+ 카세트에 의해 개입중단된다.

이어서, 플라스미드 pBXL1112를 PstI 효소(PCR 올리고뉴클레오티드 내에 존재하기 때문에 카세트를 둘러싸고 있는 부위)로 분해시키고, att1Ωhyg+ 카세트에 의해 개입중단된 orf6*의 일정 부분을 포함하는 3.7kb PstI 삽입물을 플라스미드pOJ260(상기 참조)의 PstI 부위 내로 클로닝시켰다. 이로써 수득된 플라스미드는 pBXL1113로 명명되었다.

벡터 pBXL1113을 원형질체 형질전환에 의해 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2(상기 참조) 내로 도입하였다(참조: T. Kieser et al., 2000). 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 히그로마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 히그로마이신-내성 클론을 각각, 히그로마이신(항생제 B) 함유 배지와 아프라마이신(항생제 A) 함유 배지 상에서 계대배양하였다(도 9 참조). 히그로마이신에 내성인 클론(HygR)과 아프라마이신에 민감한 클론(ApraS)은 원칙적으로, 이중 유전자교환 사건이 발생하였으며 att1Ωhyg+ 카세트에 의해 개입중단된 orf6* 유전자를 함유하고 있는 것이다. 이들 클론을 보다 특별히 선별하고, orf6*의 야생형 복사물을 상기 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키는 것을 서던 블롯팅 기술에 의해 확인하였다. 따라서, 수득된 클론의 총 DNA를 여러 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, hyg 유전자(PCR에 의해 수득됨)에 상응하는 프로브와 하이브리드화시켜, 수득된 클론의 게놈 DNA 내에 상기 카세트가 존재하는지를 확인하였다. 프로브로서, orf6* 유전자를 함유하는, 크기가 대략 1.1kb이고 플라스미드 pBXL1111(상기 및 도 16 참조)로부터 수득된 PstI-PstI 삽입물을 사용하여 제2 하이브리드화를 수행하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 유전자형을 확인할 수 있다.

예상된 특징을 나타내는 클론(orf6*::att1Ωhyg+)을 보다 특별히 선별하고, 이를 SPM501로 명명하였다. 사실상, 2회 하이브리드화를 통하여, att1Ωhyg+ 카세트가 상기 클론의 게놈 내에 실제로 존재한다는 사실과, 이러한 클론의 게놈 내에서 야생형 유전자를 att1Ωhyg+ 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키고, 연속해서 이중 재조합 사건을 수행한 경우에 예상된 분해 프로필을 실제로 수득할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 클론은 유전자형: orf6*::att1Ωhyg+을 갖고 SPM501로 명명되었다. 균주 SPM501 샘플은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-2909로 기탁되었다.

상기 카세트를 절제하기 위해, 균주 SPM501을 원형질체 형질전환에 의해 벡터 pOSV508로 형질전환시켰다(도 14 참조). 플라스미드 pOSV508는 ptrc 프로모터( 참조: E. Amann et al., 1988)의 제어 하에 위치된, pSAM2의 xis 및 int 유전자(참조: F. Boccard et al., 1989b)가 부가된 플라스미드 pWHM3(참조: J. Vara et al.,1989)(도 13 참조)으로부터 유도된 것이다. pSAM2의 xis 및 int 유전자를 수반하는 플라스미드 pOSV508을 상기 균주 SPM501 내로 도입하면, 절제 가능한 카세트를 플랭킹하는 attL 부위와 attR 부위 간의 부위-특이적 재조합에 의해 이러한 절제 가능한 카세트를 효과적으로 절제시켜 줄 것이다(참조: A. Raynal et al., 1998)(도 10). pOSV508에 의해 수반된 tsr 유전자에 기인하여 이들의 티오스트렙톤 내성에 대해 선별된 형질전환체 중에서, 히그로마이신에 대해 민감해진 형질전환체(이에 대한 내성 유전자는 att1Ωhyg+ 카세트에 의해 수반된다)를 선택하는데; 이러한 절제로 인해, 사실상 상기 내성 유전자가 상실된다(도 10 참조). 플라스미드 pOSV508은 불안정하기 때문에, 항생제 무함유 배지 상에서 2회 연속해서 계대접종한 후, 분리된 클론을 티오스트렙톤 함유 배지 및 티오스트렙톤 무함유 배지 상에서 계대배양하였다. 티오스트렙톤-민감성 클론은 pOSV508을 상실하였다. PCR하고 PCR 생성물을 서열 분석함으로써, 상기 카세트의 절제로 인해 orf6* 유전자 내에서 동위상 결실이 실제로 일어났다는 사실을 확인하였다. 개입중단은 158번째 코돈에서 시작하고, 40개 코돈이 결실되며(120bp), 이러한 카세트의 절제는 33bp의 특징적인 "반흔성" att1 서열을 잔존시킨다:

5'ATCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3'(서열 번호 104).

이로써 수득된, 목적하는 유전자형(orf6*::att1)을 갖는 균주는 SPM502로 명명되었다.

균주 SPM502 샘플은 2002년 7월 10일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-2910으로 기탁되었다.

실시예 15: orf2, orf3, orf8, orf10, orf12, orf13c, orf14 또는 orf6* 유전자에서 녹아웃을 나타내는 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주의 분석

수득된 각종 균주의 스피라마이신 생산을 시험하기 위해, 미크로코쿠스 루테우스 균주의 민감성에 근거한 미생물학적 시험을 개발하였다(참조: A. Gourmelen et al., 1998). 사용된 미크로코쿠스 루테우스 균주는 스피라마이신에 대해서는 천연적으로 민감한 균주 DSM1790[이러한 균주는 특히, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschweig, Germany)로부터 번호 DSM 1790으로 입수 가능하다]로부터 유래된 균주이며; 본 시험에 사용된 균주는 이것이 콘고시딘(congocidine)에 대해서 내성이라는 점에서 균주 DSM 1790과 상이하다. 이러한 균주는 증가 량의 콘고시딘을 함유하는 배지 상에서 선별함으로써 수득된 자연 돌연변이체이다. 상기 균주는 스트렙토마이세스 암보파시엔스가 스피라마이신과 콘고시딘을 둘 다 생산한다는 사실에 기인하여 선별하였다. 미크로코쿠스 루테우스 균주의 민감성에 근거한 미생물학적 시험을 이용하여 수득된 각종 균주의 스피라마이신 생산을 검정하고자 하는 것이 목적이기 때문에, 콘고시딘-내성 균주를 갖는 것이 필요하다.

시험하고자 하는 각종 스트렙토마이세스 균주를, 70ml의 MP5 배지를 함유하는 500ml용 에를렌마이어 플라스크에서 배양한다(참조: Pernodet et al., 1993). 차폐된(baffled) 에를렌마이어를 각종 에스. 암보파시엔스 균주의 2.5 x 10⁶개 포자/ml의 초기 농도로 접종하며, 250rpm으로 궤도 진탕시키면서 27℃ 하에 성장시킨다. 배양한지 48, 72 및 96시간 후에, 상청액 2ml 샘플을 취하고 이를 원심분리시킨다. 이어서, 각종 상청액을 -20℃에서 동결시킨다. 이들 상청액을 멸균용 배양 배지에서 10배 희석시킨 것을 본 시험에 사용한다(도 18 참조).

콘고시딘에 대해서는 내성이지만 스피라마이신에는 민감한 미크로코쿠스 루테우스 지시 균주를 37℃에서 48시간 동안 콘고시딘을 5㎍/ml로 함유하는 2TY 배지(참조: Sambrook et la., 1989)에서 배양하였다. 이러한 배양물의 광밀도(OD)를 측정하고, 이를 희석시켜 광밀도를 4로 조정한다. 상기 예비배양물 0.4ml를, 온도를 미리 약 45℃로 조정한 40ml의 DAM5 배지(Difco Antibiotic Medium 5, Difco 회사에 의해 시판됨)에서 희석시킨다. 이어서, 상기 배지를 12 x 12cm 사각형 디쉬에 따라 붓고, 주위 온도 하에 방치시켜 둔다.

상기 배지가 냉각되어 고형화되면, 직경이 12mm인 왓트만 AA 종이 디스크(참조: A. Gourmelen et al., 1998)를 각 상청액의 10배 희석물 70㎕에 침지시키고, 디쉬 표면 상에 놓아둔다. 각종 농도(MP5 배양 배지 중의 2-4-8㎍/ml)의 스피라마이신 용액에 침지시킨 디스크를 표준 범위로서 사용한다. 이러한 디쉬를 4℃에서 2시간 동안 정치시켜 상기 항생제가 한천 내로 확산되도록 한 다음, 37℃에서 24 내지 48시간 동안 항온 배양한다.

상기 디쉬가 스피라마이신을 함유하는 경우, 이는 한천 내로 확산되어, 미크로코쿠스 루테우스 지시 균주의 성장을 억제시킨다. 이와 같이 억제시키면, 디스크 주변에 "할로"가 창출되는데, 이러한 할로는 미크로코쿠스 루테우스 균주가 성장하지 않은 영역을 반영한 것이다. 따라서, 상기 할로가 존재하는 것은 스피라마이신의 존재를 지시해주며, 이로써 문제의 디스크에 상응하는 에스. 암보파시엔스 균주가 스피라마이신 생산자인지 아닌지를 결정할 수 있다. 표준 범위에 대해 수득된 억제 직경과 비교한 결과, 상기 균주에 의해 생산된 스피라마이신의 양에 관한 지표를 획득할 수 있다.

스피라마이신 생산을 탐지하기 위해, 앞서 실시예에 기재된 각종 균주를 본 시험에 사용하였다. 수득된 결과가 표 38에 함께 분류되었다:

이들 결과는 스피라마이신 생합성에 관여하는 각종 유전자의 기능에 관한 특정 수의 결론을 이끌어낼 수 있게 해준다. 따라서, orf3 유전자는 스피라마이신 생합성에 필수적이다. 구체적으로 언급하면, 상기 유전자를 동위상 불활성화시키면, 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는 균주(OS49.67(실시예 6 참조))가 야기된다. 이러한 동위상 불활성화는, 도입된 카세트가 orf3의 하류에 위치한 유전자의 발현에 영향을 미칠 것이라는 가설을 일축할 수 있게 해준다.

유사하게, orf8 및 orf10 유전자는 스피라마이신 생합성에 필수적인 단백질을 암호화하는데, 이는 균주 OS49.107과 OS49.50는 비-생산자 표현형을 지니기 때문이다. 또한, 이들 후자의 2개 균주에서는, 이러한 비-생산자 표현형에 대해 책임이 있는 상응하는 유전자의 불활성화가 명백한데, 이는 각종 orfs의 배양 측면에서(도 3 참조) 상기 도입된 작제물이 극성 효과를 지닐 수 없기 때문이다.

절제 가능한 카세트를 갖는 균주에 관한 연구는 개입중단된 유전자의 기능에 관한 특정 수의 결론을 이끌어낼 수 있게 해준다. 균주 SPM507은 유전자형: orf12::att3Ωaac-을 갖는다. 유전자의 배향 측면에서(도 3 참조), orf12의 불활성화 효과를 연구하기 위해 상기 카세트를 절제할 필요는 없다. orf13c가 orf12와 반대 방향으로 배향된다는 사실은 이들 유전자가 동시에 전사되지 않는다는 것을 보여준다. 절제 가능한 카세트를 사용하면, 한편으론 선별 마커를 어떠한 순간에도 제거할 수 있는 가능성이 생긴다. 균주 SPM507의 표현형은 비-생산자이므로; 이로부터, orf12 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자라고 결론지을 수 있다.

균주 SPM508은 유전자형: orf13c::att3Ωaac-을 갖는다. 유전자의 배향 측면에서(도 3 참조), orf13c의 불활성화 효과를 연구하기 위해 상기 카세트를 절제할 필요는 없다. orf14가 orf13c와 반대 방향으로 배향된다는 사실은 이들 유전자가 동시에 전사되지 않는다는 것을 보여준다. 절제 가능한 카세트를 사용하면, 한편으론 선별 마커를 어떠한 순간에도 제거할 수 있는 가능성이 생긴다. 균주 SPM508의 표현형은 비-생산자이므로; 이로부터, orf13c 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자가 아니라고 결론지을 수 있다.

균주 SPM509는 유전자형: orf14::att3Ωaac-을 갖는다. 유전자의 배향 측면에서(도 3 참조), orf14의 불활성화 효과를 연구하기 위해 상기 카세트를 절제할 필요는 없다. orf15c가 orf14와 반대 방향으로 배향된다는 사실은 이들 유전자가 동시에 전사되지 않는다는 것을 보여준다. 절제 가능한 카세트를 사용하면, 한편으론 선별 마커를 어떠한 순간에도 제거할 수 있는 가능성이 생긴다. 균주 SPM509의 표현형은 비-생산자이므로; 이로부터, orf14 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자라고 결론지을 수 있다.

균주 SPM21은 유전자형: orf2::att3Ωaac-을 갖는다. 이러한 균주는 스피라마이신 비-생산자 표현형을 갖는다. 그러나, 유전자 orf1 내지 orf8의 배향(도 3 참조)은 이들 유전자가 동시 전사된다는 사실을 암시한다. 관찰된 표현형은 도입된 카세트가 오페론의 하류에 위치한 유전자의 발현에 대해 극성 효과를 발휘하기 때문일 수 있다. 균주 SPM22는 유전자형 orf2::att3을 가지며, 이는 도입된 카세트의 동위상 절제 후에 수득하였다. 이러한 카세트를 절제하면, 특징적인 "반흔성" 서열(실시예 10 참조) 만이 잔존한다. 균주 SPM22는 비-생산자 표현형을 가지므로; 이로부터, orf2 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자라고 결론지을 수 있다. orf2의 불활성에 기인한 효과 만이 관찰된다.

균주 SPM501은 유전자형: orf6*::att1Ωhyg+을 갖는다. 이러한 균주는 스피라마이신 비-생산자 표현형을 갖는다. 그러나, orf5* 및 orf6* 유전자는 동일한 배향을 갖기 때문에(도 3 참조), 관찰된 표현형은 orf6* 내로 도입된 카세트가 orf5*의 발현에 대해 극성 효과를 발휘하기 때문일 수 있다. 이들 유전자의 배열은 이들이 동시 전사될 수 있다는 것을 암시한다. 이러한 문제에 답하기 위해, 도입된 카세트를 동위상 절제한 후에 균주 SPM502를 수득하였다. 이러한 균주에서는 orf6*의 불활성화 효과 만이 관찰된다. 이 균주는 유전자형 orf6*::att1(실시예 14 참조)을 갖는다. 이러한 카세트를 절제하면, 동위상 "반흔" 서열(실시예 14 참조) 만이 잔존한다. 균주 SPM502는 생산자 표현형을 갖는다(그러나, 이 균주는 스피라마이신 I 만을 생산한다(실시예 16 참조)). 따라서, orf5* 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자라고 결론지을 수 있는데, 이는 균주 SPM501에서의 이의 간접적인 불활성화로 인해 비-생산자 표현형이 유도되기 때문이다. 다른 한편으론, orf6* 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 I의 생합성에 필수적인 유전자가 아니다(한편으론, 스피라마이신 II 및 III의 생산에 필수적이다)(실시예 16 참조).

실시예 16: 수득된 돌연변이체 균주에서 스피라마이신 I, II 및 III의 생산 검정

시험하고자 하는 각종 균주를 각각, 70ml의 MP5 배지를 함유하는 500ml용 차폐된 에를렌마이어에서 배양한다(참조: Pernodet et al., 1993). 이러한 에를렌마이어를 각종 에스. 암보파시엔스 균주의 2.5 x 10⁶개 포자/ml의 초기 농도로 접종하며, 72시간 동안 250rpm으로 궤도 진탕시키면서 27℃ 하에 성장시킨다. 동일한 클론에 상응하는 배양물을 모으고, 주름진 필터 내로 임의 여과시킨 다음, 7000rpm으로 15분 동안 원심분리시킨다. 이어서, 각종 상청액을 -30℃ 하에 저장하였다.

이온-쌍 형성 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)함으로써 본 검정을 수행하였다. 배양 배지를 HPLC 분석하여, 3가지 형태의 스피라마이신 농도를 정확하게 결정할 수 있다. 사용된 칼럼(Macherey-Nagel)은 뉴클레오실(Nucleosil) 옥틸 그래프트된 실리카 상으로 채운다. 입자 크기는 5㎛이고 공극 크기는 100Å이다. 칼럼의 내부 직경은 4.6mm이고 길이는 25cm이다. 이동 상은 6.25g/L의 NaClO₄ 퍼클로레이트를 함유하는 H₃PO₄ 완충액(pH 2.2)과 아세토니트릴의 70/30(v/v) 혼합물이다. 1ml/min으로 고정된 유속을 이용하여 등용매 시스템에서 본 분석을 수행하였다. 칼럼은 23℃에서 열제어한다. 238nm에서 UV 분광측광함으로써 탐지하였다. 샘플을 +10℃ 하에 냉장시키고, 피크 면적으로부터 정량화를 결정한다(외부 교정에 의함). 이들 조건 하에, 스피라마이신 I, II 및 III에 대한 잔류 시간은 각각 17, 21 및 30분인데, 이는 3가지 형태의 스피라마이신을 포함하는 시판용 샘플을 사용하여 확인할 수 있었다.

균주 OSC2는 스피라마이신 생산자 표현형을 갖는다. 이는 절제 가능한 카세트를 갖는 균주를 수득하기 위해 사용된 모 균주이다(실시예 15 참조). 따라서, 이 균주는 3가지 형태의 스피라마이신을 생산하기 위한 양성 대조군으로서 사용되었다. 상기 균주는 HPLC에 의해 확인된 바와 같이, 3가지 형태의 스피라마이신을 생산하는 것은 명백하다(도 19 참조).

절제 가능한 카세트를 갖는 균주에 관한 연구는 개입중단된 유전자의 기능에 관한 특정 수의 결론을 이끌어낼 수 있게 해준다. 균주 SPM507은 유전자형: orf12::att3Ωaac-을 갖는다. 균주 SPM507의 표현형은 비-생산자이므로(실시예 15 참조); 이로부터, orf12 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자라고 결론지을 수 있다. 상기 균주는 HPLC에 의해 확인된 바와 같이, 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다(도 22 참조). 이러한 결과는 orf12 유전자가 스피라마이신 생합성에 필수적인 특성을 확인시켜 준다.

균주 SPM508은 유전자형: orf13c::att3Ωaac-을 갖는다. 균주 SPM508은 스피라마이신 생산자 표현형을 가지므로(실시예 15 참조); 이로부터, orf13c 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자가 아니라고 결론지을 수 있다. 상기 균주는 HPLC에 의해 확인된 바와 같이, 스피라마이신 I, II 및 III을 생산한다(도 23 참조). 이러한 결과는 orf13c 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 I, II 및 III의 생합성에 필수적인 유전자가 아니라는 것을 확인시켜 준다.

균주 SPM509는 유전자형: orf14::att3Ωaac-을 갖는다. 균주 SPM509의 표현형은 비-생산자이므로; 이로부터, orf14 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자라고 결론지을 수 있다. 상기 균주는 HPLC에 의해 확인된 바와 같이, 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다(도 24 참조). 이러한 결과는 orf14 유전자가 스피라마이신 생합성에 필수적인 특성을 확인시켜 준다.

균주 SPM501은 유전자형: orf6*::att1Ωhyg+을 갖는다. 이러한 균주는 스피라마이신 비-생산자 표현형을 갖는다. 상기 균주는 HPLC에 의해 확인된 바와 같이, 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다(도 20 참조). 그러나, orf5* 및 orf6* 유전자는 동일한 배향을 갖기 때문에(도 3 참조), 관찰된 표현형은 orf6* 내로 도입된 카세트가 오페론에서 orf5*의 발현에 대해 극성 효과를 발휘하기 때문일 수 있다. 이는 이들 유전자가 동시 전사된는 것을 암시한다. 이러한 문제에 답하기 위해, 도입된 카세트를 절제한 후에 균주 SPM502를 수득하였는데, 이로써 orf6* 유전자의 동위상 결실이 생겼고 orf5*의 발현이 복원되었다. 이 균주는 유전자형 orf6*::att1(실시예 14 및 15 참조)을 갖는다. 이러한 카세트를 절제하면, 동위상 "반흔" att 서열(실시예 14 참조) 만이 잔존한다. 균주 SPM502는 스피라마이신 생산자 표현형을 갖는다. 그러나, HPLC에 의해 입증된 바와 같이, 상기 균주는 스피라마이신 I 만을 생산하고, 스피라마이신 II와 III은 생산하지 못한다(도 21 참조)). 따라서, 이들 결과로부터, orf5* 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자라고 결론지을 수 있는데, 이는 균주 SPM501에서의 이의 간접적인 불활성화로 인해 스피라마이신 비-생산자 표현형이 유도되기 때문이다(도 20 참조). 다른 한편으론, orf6* 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 I의 생합성에 필수적인 유전자가 아닌데, 이는 이러한 유전자의 불활성화로 인해 스피로마이신 I 생산자 표현형이 유도되었기 때문이다(도 21 참조). 그러나, orf6*은 스피라마이신 II와 III의 생산에는 필수적이다(실시예 16 참조). 따라서, orf6* 유전자는 위치 3에서 플라테놀리드의 변형에 책임이 있는 아실트랜스퍼라제를 암호화하는 것이 명백하다(도 1 참조).

실시예 17: orf10 의 해독 개시점 결정 및 스피라마이신 생산 향상

17.1 플라스미드 pSPM523, pSPM524 및 pSPM525의 작제:

orf10 유전자를 스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 동정하고, 이를 srmR으로 명명하였다(참조: M. Geistlich et al., 1992). orf10 유전자의 불활성화를 수행하였다(실시예 8 참조). 이로써, 생성된 균주가 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다는 사실을 나타낼 수 있었다(실시예 15 참조). 이는 orf10 유전자가 스피라마이신 생합성에 명백히 관여한다는 것을 확인시켜 준다. 따라서, 이러한 유전자에 의해 암호화된 단백질이 스피라마이신 생합성에 필수적이란 것은 명백하다. 그러나, 서열 분석 결과, 동일한 판독 프레임에 위치한 2개의 ATG 코돈이 orf10의 해독을 위해 사용될 수 있는 것으로 나타났다(도 28 참조). 2개의 가능한 코돈 중의 하나(가장 상류 코돈)이 서열 번호 1에 제시된 서열의 10656번에서 시작하는 반면, 보다 하류에 위치한 기타 가능한 코돈은 10809번(서열 번호 1)에서 시작한다. 스피라마이신 생산에 대한 srmR 의 가능한 발현 효과를 시험하기 전에, 해독 개시점을 먼저 결정하는 것이 중요하다.

해독 개시 부위를 결정할 목적으로, 3가지 형태의 orf10을 포함하는 3가지 작제물을 생성하였다. 이들 형태는 HindIII 제한 부위 또는 BamHI 제한 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR함으로써 수득하였다.

증폭에 사용된 제1 쌍은 다음 올리고뉴클레오티드에 상응한다:

EDR39:

5'CCCAAGCTTGAGAAGGGAGCGGACATTCATGGCCCGCGCCGAACGC3'(서열 번호 122) (HindIII 부위가 진하게 표시되어 있다)

EDR42:

5'CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3'(서열 번호 123) (BamHI 부위가 진하게 표시되어 있다)

프라이머 쌍 EDR39-EDR42는 3' 위치에 가장 근접하게 위치한(서열 번호 1에 제시된 서열에서 10809번 위치) ATG를 포함하는 orf10의 단편을 증폭시켜 준다(도 28 참조). 수득된 단편은 크기가 대략 2kb이고, "짧은 orf10"로 후술될 것이며; 이는 orf10 프로모터를 함유하지 않는다. 이러한 2kb 단편을 벡터 pGEM-T easy 내로 클로닝하여 플라스미드 pSPM520을 수득하였다.

증폭에 사용된 제2 쌍은 다음 올리고뉴클레오티드에 상응한다:

EDR40:

5'CCCAAGCTTGAGAAGGGAGCGGACATTCAATGCTTTGGTAAAGCAC3'(서열 번호 124) (HindIII 부위가 진하게 표시되어 있다)

EDR42:

프라이머 쌍 EDR40-EDR42는 5' 위치에 가장 근접하게 위치한(서열 번호 1에 제시된 서열에서 10656번 위치) ATG를 포함하는 orf10의 단편을 증폭시켜 준다(도 28 참조). 이러한 2kb 단편("짧은 orf10"로 후술됨)을 벡터 pGEM-T easy 내로 클로닝하여 플라스미드 pSPM521을 수득하였는데; 상기 플라스미드는 orf10 프로모터를 함유하지 않는다.

증폭에 사용된 제3 쌍은 다음 올리고뉴클레오티드에 상응한다:

EDR41:

5'-CCCAAGCTTTCAAGGAACGACGGGGTGGTCAGTCAAGT-3'

(서열 번호 125) (HindIII 부위가 진하게 표시되어 있다)

EDR42:

5'CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3'

(서열 번호 123) (BamHI 부위가 진하게 표시되어 있다)

프라이머 쌍 EDR41-EDR42는 2개의 ATG와 자신의 프로모터를 포함하는 orf10 유전자를 증폭시켜 준다(도 28 참조). 이러한 2.8kb 단편("프로(pro) orf10"로 후술됨)을 벡터 pGEM-T easy 내로 클로닝하여 플라스미드 pSPM52를 수득하였다.

"프로 orf10" 단편은 매트릭스로서, 균주 OSC2의 염색체 DNA를 사용하여 수득하였다. "짧은 orf10" 및 "긴 orf10" 단편은 매트릭스로서, 앞서 정제된 "프로 orf10" 단편의 DNA를 사용하여 온전히 수득하였다.

이어서, 플라스미드 pSPM520, pSPM521 및 pSPM522의 HindIII-BamHI 삽입물을, HindIII-BamHI 효소로 예비분해시킨 벡터 pUWL201[프로모터(ermE* promoter)(참조: Bibb et al., 1994)의 세기를 증가시키는 돌연변이를 수반하는 ermE 프로모터(참조: Bibb et al., 1985, 특히 도 2) 영역의 KpnI-BamHI 단편을 도입한(참조: Doumith et al., 2000) 플라스미드 pUWL199(참조: U.F. Wehmeier, 1995)로부터 유도된 플라스미드] 내로 아클로닝시켰다. 이로써, 3가지 플라스미드를 수득하였다: pSPM523(삽입물로서 "짧은 orf10" 형태를 갖는 pUWL201로부터 유도됨), pSPM524(삽입물로서 "긴 orf10" 형태를 갖는 pUWL201로부터 유도됨) 및 pSPM525("프로 orf10" 형태를 갖는 pUWL201로부터 유도됨)(도 28).

17.2 균주 OS49.50을 작제물 pSPM523, pSPM524 및 pSPM525로 형질전환시킴:

균주 OS49.50(orf10 유전자에서 녹아웃을 나타내는 균주, 실시예 8 참조)를, 각각의 플라스미드 pSPM523, pSPM524 및 pSPM525로 원형질체 형질전환(참조: T. Kieser et al., 2000)시킴으로써 독립적으로 형질전환시켰다. 균주 OS49.50를, 삽입물을 갖지 않는 플라스미드 pUWL201로 형질전환시킴으로써 음성 대조군을 또한 제조하였다. 원형질체 형질전환 후, 이들 클론을 대상으로 하여, 이들의 티오스트렙톤 내성에 대해 선별하였다. 이들 클론을 각 플라스미드로 형질전환시키는 것은 이들 플라스미드를 추출함으로써 확인하였다. 이로써 4개의 신규한 균주가 수득되었다: 균주 OSC49.50 pUWL201(삽입물을 갖지 않는 플라스미드 pUWL201로 형질전환시킴으로써 유도됨); 균주 OSC49.50 pSPM523(플라스미드 pSPM523으로 형질전환시킴으로써 유도됨); 균주 OSC49.50 pSPM524(플라스미드 pSPM524로 형질전환시킴으로써 유도됨); 및 최종적으로 균주 OS49.50 pSPM525(플라스미드 pSPM525로 형질전환시킴으로써 유도됨).

이들 4가지 균주 각각의 스피라마이신 생산을 HPLC로써 시험하였다. 이를 위해, 시험하고자 하는 각종 스트렙토마이세스 균주를, 70ml의 MP5 배지를 함유하는, 차폐기가 장착된 500ml용 에를렌마이어(차폐된 에를렌마이어)에서 배양한다(참조: Pernodet et al., 1993). 상기 균주가 플라스미드 pUWL201 또는 이의 유도체 중의 하나를 함유하는 경우, 5㎍/ml의 티오스트렙톤을 가한다. 차폐된 에를렌마이어를 각종 에스. 암보파시엔스 균주의 2.5 x 10⁶개 포자/ml의 초기 농도로 접종하며, 배양물을 96시간 동안 250rpm으로 궤도 진탕시키면서 27℃ 하에 항온 배양하였다. 이어서, 세포를 원심분리시킴으로써 상기 배지로부터 분리시키고, 상청액을 HPLC함으로써 분석하여(실시예 16 참조), 생산된 스피라마이신의 양을 결정하였다. 표준 샘플과 피크 면적 측정을 통하여, 이들 균주에 의해 생산된 스피라마이신 각각의 양을 결정할 수 있었다. 이러한 분석 결과가 표 39에 제시되어 있으며, 데이터는 상청액 리터당 mg으로 표현된다. 이 결과는 스피라마이신 총 생산량에 상응한다(스피라마이신 I, II 및 III 생산량을 부가함으로써 수득됨).

표 39에 제시된 결과에 의해 밝혀진 바와 같이, 음성 대조군(플라스미드 pUWL201로 형질전환시킨 균주 OS49.50)은 스피라마이신을 생산하지 않는다. 플라스미드 pSPM523("짧은 orf10" 형태 함유)를 균주 OS49.50 내로 도입한 경우에는, 스피라마이신 생산이 전혀 관찰되지 않는다. 한편, 플라스미드 pSPM524("긴 orf10" 형태 함유)와 플라스미드 pSPM525("프로 orf10" 형태 함유)의 존재로 인해, 숙주 균주 OS49.50에서의 스피라마이신 생산이 복원된다. 이로써, 가장 상류의 ATG를 함유하는 orf10 단편 만이 스피라마이신 합성을 복원시킬 수 있다.

이러한 결과를 확인할 목적으로, 플라스미드 pSPM521("긴 orf10" 형태를 함유하는 플라스미드 pGEM-T easy)를 XhoI 제한 효소(이 효소는 2개의 ATG 사이에 위치한, 상기 플라스미드 내의 독특한 부위를 갖는다(도 28 참조))로 분해시킨다. 이어서, 클레노우 효소로 처리함으로써 XhoI 말단을 평활 말단화시킨다. 이어서, 상기 플라스미드를 T4 DNA 리가제 작용에 의해 스스로에 대해 폐쇄 보완하여 플라스미드 pSPM527을 제공한다. 가장 상류의 ATG(서열 번호 1에 제시된 서열에서 10656번 위치)가 실제로 해독 개시 부위로서 사용된 경우에는, 이러한 처리로 인해, XhoI 부위에서 판독 프레임의 이동이 유발되어 활성화 활성을 전혀 나타내지 않는 단백질을 생산하는 효과가 나타날 것이다. 한편, 해독 개시가 가장 하류의 ATG(서열 번호 1에 제시된 서열에서 10809번 위치)에서 일어나는 경우에는, 이러한 처리가 Orf10(전사 개시점의 위치가 제공된 경우)의 발현에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않아야 하고 생성되는 단백질에 대해 전혀 영향을 미치지 말아야 한다.

이어서, pSPM527의 BamHI-HindIII 삽입물을 벡터 pUWL201 내로 아클로닝시켜, 플라스미드 pSPM528을 수득하였다. 이러한 플라스미드를 균주 OS49.50 내로 도입하고, 목적하는 플라스미드를 갖는 클론을 보다 특별히 선별하였다. 이어서, 이로써 생성된 균주의 스피라마이신 생산을 HPLC에 의해 시험하였다(실시예 16 및 상기 참조). 플라스미드 pSPM524(표 39 참조)의 경우에 관찰된 것과는 다르게, 균주 OS49.50 내에 플라스미드 pSPM528이 존재하는 것이 스피라마이신 생산을 재정립하지는 못하였다. 이는 orf10 유전자의 해독 개시 부위가 가장 하류 위치에 위치한 ATG(ATG 1, 도 28 참조)라는 것을 확인시켜 준다.

17.3 에스. 암보파시엔스 균주 OSC2의 스피라마이신 생산 향상

스피라마이신 생산에 대한 orf10 유전자의 과발현 효과를 시험하기 위해, 플라스미드 pSPM523, pSPM524, pSPM525 및 pSPM528을 균주 OSC2 내로 도입하였다. 이를 위해, 균주 OSC2의 원형질체를, 각각의 플라스미드 pSPM523, pSPM524, pSPM525 및 pSPM528로 독립적으로 형질전환시켰다(참조: T. Kieser et al., 2000). 균주 OSC2를, 삽입물을 갖지 않는 플라스미드 pUWL201로 형질전환시킴으로써 음성 대조군을 또한 제조하였다. 원형질체 형질전환 후, 이들 클론을 대상으로 하여, 이들의 티오스트렙톤 내성에 대해 선별하였다. 이로써 5개의 신규한 균주가 수득되었다: 균주 OSC2 pUWL201(삽입물을 갖지 않는 플라스미드 pUWL201로 형질전환시킴으로써 유도됨); 균주 OSC2 pSPM523(플라스미드 pSPM523으로 형질전환시킴으로써 유도됨); 균주 OSC2 pSPM524(플라스미드 pSPM524로 형질전환시킴으로써 유도됨); 균주 OSC2 pSPM525(플라스미드 pSPM525로 형질전환시킴으로써 유도됨); 및 최종적으로, 균주 OSC2 pSPM528(플라스미드 pSPM525로 형질전환시킴으로써 유도됨). 이어서, 이들 균주의 스피라마이신 생산을 HPLC에 의해 분석하였다(실시예 17.2에서와 동일한 방식으로 수행함). 균주 OSC2의 스피라마이신 생산에 관해 분석은 비교를 위해 동시에 수행하였다. 이러한 분석 결과가 표 40에 제시되어 있으며, 데이터는 상청액 리터당 mg으로 표현된다. 이 결과는 스피라마이신 총 생산량에 상응한다(스피라마이신 I, II 및 III 생산량을 부가함으로써 수득됨).

따라서, 플라스미드 pSPM524가 존재하거나 또는 플라스미드 pSPM525이 존재하는 것이 균주 OSC2의 스피라마이신 생산량을 상당히 증가시키는 것으로 관찰된다. 이는 Orf10의 과발현이 스피라마이신 생산에 긍정적인 효과를 나타낸다는 것을 명백히 입증해준다. 한편, 플라스미드 pSPM528은 스피라마이신 생산에 전혀 영향을 미치지 않는다.

동일한 방식으로, 플라스미드 pSPM525 및 pUWL201을 균주 SPM502 내로 도입하였다(실시예 14 참조). 이로써 2가지 신규한 균주를 수득하였다: 균주 SPM502 pUWL201(삽입물을 갖지 않는 플라스미드 pUWL201로 형질전환시킴으로써 유도됨); 및 균주 SPM502 pSPM525(플라스미드 pSPM525로 형질전환시킴으로써 유도됨).

균주 SPM502 pSPM525(이러한 균주는 플라스미드 pSPM525을 함유한다, 상기 참조) 샘플은 2003년 2월 26일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-2977로 기탁되었다.

균주 SPM502 pUWL201 및 SPM502 pSPM525의 스피라마이신 생산을 HPLC에 의해 분석하였다(실시예 17.2에서와 동일한 방식으로 수행함). 균주 SPM502의 스피라마이신 생산에 관해 분석은 비교를 위해 동시에 수행하였다. 이러한 분석 결과가 표 41에 제시되어 있으며, 데이터는 상청액 리터당 mg으로 표현된다. 이 결과는 스피라마이신 I 생산량에 상응한다. 사실상, 이들 균주는 스피라마이신 II와 III을 전혀 생산하지 않는다.

따라서, 균주 SPM502에서의 orf10 유전자의 과발현이 스피라마이신 I의 생산을 상당히 증가시키는 것으로 관찰되었다.

실시예 18: 코스미드 pWED2에서 이. 콜라이에서 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2의 게놈 DNA 라이브러리의 작제

18.1 코스미드 pWED2의 작제

스트렙토마이세스에서 유전자의 불활성화를 촉진시킬 목적으로, (적합한 이. 콜라이 균주로부터 스트렙토마이세스 내로 접합시킴으로써 이의 도입을 허용해 주는) 플라스미드 RK2의 oriT 서열을 수반하고 스트렙토마이세스에서 탐지 가능한 표현형을 부여해 주는 항생제에 대해 내성인 유전자를 또한 수반하는 코스미드를 작제하였다. 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 게놈 DNA의 큰 삽입물을 함유하는 상기 코스미드를 유전자 불활성화 실험에 사용할 수 있다.

상기 벡터를 작제하기 위해, pac-oriT 카세트(EcoRV 단편)을, 독특한 HpaI 부위에서 코스미드 pWED15(참조: Wahl et al., 1987)로부터 유도된 코스미드 pWED1(참조: Gourmelen et al., 1998) 내로 도입하였다. pac-oriT 카세트는 PCR함으로써 수득하였다. 이를 위해, 제1 프라이머로서, 프라이머 A[이의 서열은 5'-CCAGTAGATATC CCGCCAACCCGGAGCTGCAC-3'(서열 번호 126)이고, EcoRV 제한 부위가 밑줄쳐져 있으며, 진하게 표시된 20개 뉴클레오티드 서열은 pac 유전자의 프로모터의 상류 영역에 상응한다]를 사용하고, 제2 프라이머로서, 프라이머 B[이의 서열은 5'-GAAAAGATCCGT CATGGGGTCGTGCGCTCCTT-3'(서열 번호 127)인데, 이는 이의 5' 말단에, oriT 서열 출발부에 상응하는 12개 뉴클레오티드 서열(이탤릭체로 표시되어 있음)을 포함하고 pac 유전자의 말단에 상응하는 20개 뉴클레오티드 서열(진하게 표시됨)을 포함한다]를 사용하여 플라스미드 pVF 10.4(참조: Vara et al., 1985; Lacalle et al., 1989)로부터 PCR함으로써, 상기 pac 유전자를 증폭시켰다(참조: 도 29, 1st PCR).

oriT 유전자에 관해서는, 제1 프라이머로서, 프라이머 C[이의 서열은 5'-CACGACCCCATG ACGGATCTTTTCCGCTGCAT-3'(서열 번호 128)인데, 이는 이의 5' 말단에, pac 유전자의 암호화 서열의 하류 서열에 상응하는 12개의 뉴클레오티드 서열(진하게 표시됨)과, oriT 서열 출발부에 상응하는 20개 뉴클레오티드 서열을 포함한다]를 사용하고, 제2 프라이머로서, 프라이머 D[이의 서열은 5'-GAGCCGGATATC ATCGGTCTTGCCTTGCTCGT-3'(서열 번호　129)인데, 이는 EcoRV 제한 부위(한줄로 밑줄쳐져 있음)와 oriT 서열의 말단에 상응하는 20개 뉴클레오티드 서열(이탤릭체로 표시되어 있음)을 포함한다]를 사용하여, 플라스미드 pPM803(참조: P. Mazodier et al., 1989)로부터 PCR함으로써 증폭시켰다(참조: 도 29, 2nd PCR).

프라이머 A와 B를 사용하여 수득된 증폭 생성물과, 프라이머 C와 D를 사용하여 수득된 증폭 생성물은 이들의 말단 중 하나에, 24개 뉴클레오티드 공통 서열을 갖는다. 앞서 수득된 2가지 증폭 생성물을 혼합하고, 프라이머로서 프라이머 A와 D를 사용함으로써 제3의 PCR을 수행하였다(참조: 도 29, 3rd PCR). 이로써, 조합물 pac+oriT에 상응하는 증폭 생성물을 수득할 수 있다. 이어서, 이러한 pac-oriT 단편을 벡터 pGEM-T Easy(Promega (Madison, Wisconsin, USA) 회사에 의해 시판됨) 내로 클로닝시켜, 플라스미드 pGEM-T-pac-oriT를 수득할 수 있다. 이어서, 이러한 플라스미드의 삽입물을 코스미드 pWED1 내로 아클로닝시켰다. 이를 위해, 플라스미드 pGEM-pac-oriT를 EcoRV 효소로 분해시키고, 조합물 pac+oriT을 함유하는 EcoRV 삽입물을, HpaI 효소로 미리 개방시킨 코스미드 pWED1 내로 삽입하였다. 이로써 수득된 코스미드를 pWED2로 명명하였다(도 30 참조).

상기 코스미드는 스트렙토마이세스에서 유전자의 불활성화를 촉진시킬 수 있다. 구체적으로 언급하면, 이는 적합한 이. 콜라이 균주로부터 스트렙토마이세스 내로 접합시킴으로써 이의 도입을 허용해 주는 oriT 서열을 수반할 뿐만 아니라, 스트렙토마이세스에서 탐지 가능한 표현형을 부여해 주는 항생제에 대해 내성인 유전자를 수반한다. 스트렙토마이세스 암보파시엔스의 게놈 DNA의 큰 삽입물을 함유하는 상기 코스미드를 유전자 불활성화 실험에 사용할 수 있다.

이로써, 표적 유전자를 함유하는 pWED2로부터 유도된 코스미드를, 플라스미드 pKOBEG(참조: Chaveroche et al. 2000)를 함유하는 이. 콜라이 균주 KS272 내로 도입할 수 있고, 특정 카세트를 문헌(참조: Chaveroche et al. 2000)에 기재된 기술에 따라서 표적 유전자 내로 도입할 것이다. 이어서, 이러한 기술에 의해 수득된 코스미드(표적 유전자를 불활성화시킨 코스미드)를 이. 콜라이 균주, 예를 들면, S17.1 균주, 또는 oriT 서열을 함유하는 플라스미드를 접합에 의해 스트렙토마이세스로 전이시켜 줄 수 있는 기타 모든 균주 내로 도입할 수 있다.

이. 콜라이와 스트렙토마이세스 간의 접합 후, 표적 유전자의 야생형 복사물을 개입중단된 복사물로 대체시킬 스트렙토마이세스의 클론을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다.

상기 신규한 코스미드 상에 존재하는, 스트렙토마이세스에서 발현된 내성 유전자는 스트렙토마이세스 알보니거(Streptomyces alboniger)(참조: J. Vara et al., 1985; Lacalle et al., 1989)의 pac 유전자인데, 이는 푸로마이신(puromycin) N-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하고 푸로마이신 내성을 제공해준다. 유전자 불활성화 실험에서는, 이중 재조합 사건이 발생한 클론을 찾아낼 것이다. 이들 클론으로부터 플라스미드 pWED2를 제거할 것이므로, 이는 푸로마이신에 대해 다시 민감해질 것이다.

18.2 코스미드 pWED2에서 이. 콜라이에서 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2의 게놈 DNA 라이브러리의 작제

스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2의 게놈 DNA를 BamHI 제한 효소로 부분적으로 분해시켜, 크기가 대략 35 내지 45 kb인 DNA 단편을 수득한다. 이어서, 이들 단편을, BamHI으로 미리 분해시킨 코스미드 pWED2 내로 클로닝시킨 다음, 알칼리성 포스파타제로 처리하였다. 이어서, 이러한 연결 혼합물을 시험관내에서, 프로메가(Promega; Madison, Wisconsin, USA) 회사에 의해 시판되고 있는 "Packagene®람다 DNA 패키징 시스템"을 제조업자의 권고 사항에 따라서 사용하여 람다 파아지 입자 내에서 단백질 막으로 싼다. 수득된 파아지 입자를 사용하여, 공급원[Stratagene(LaJolla, California, USA)]에 의해 시판되고 있는 이. 콜라이 SURE® 균주를 감염시킨다. 코스미드 pWED2는 앰피실린 내성을 제공해주기 때문에, 상기 클론을 LB 배지 + 앰피실린(50㎍/ml) 상에서 선별하였다.

실시예 19: 스피라마이신에 대한 생합성 경로 영역을 포괄하는 신규한 라이브러리의 코스미드 분리. 이들 코스미드의 단편의 아클로닝 및 서열 분석

19.1 스트렙토마이세스 암보파시엔스 OSC2의 게놈 라이브러리의 콜로니 상에서의 하이브리드화

orf1* 내지 orf10*, 또는 orf1 내지 orf25c의 일부 또는 전부, 또는 orf25c의 보다 상류 영역을 포괄하는 스트렙토마이세스 암보파시엔스 OSC2(실시예 18 참조)의 신규한 라이브러리의 코스미드를 분리하였다. 이를 위해, 다음 3가지 프로브를 사용하여, 실시예 18에 따라서 수득된 이. 콜라이 콜로니 상에서 연속적인 하이브리드화를 수행하였다(도 31 참조):

- 사용된 제1 프로브는 매트릭스로서, pSPM5를 사용하고 다음 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 증폭시킨 대략 0.8kb의 DNA 단편에 상응한다:

ORF23c: 5'-ACGTGCGCGGTGAGTTCGCCGTTGC-3'(서열 번호 130) 및

ORF25c: 5'-CTGAACGACGCCATCGCGGTGGTGC-3'(서열 번호 131).

이로써 수득된 PCR 생성물은 orf23c의 출발부, 이의 원형 상태의 orf24c 및 orf25c의 말단의 단편을 함유한다(참조: 도 31, 프로브 I).

- 사용된 제2 프로브는 매트릭스로서, 에스. 암보파시엔스 균주 ATCC23877의 총 DNA를 사용하고, 다음 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 증폭시킨 대략 0.7kb의 DNA 단편에 상응한다:

ORF1*c: 5'-GACCACCTCGAACCGTCCGGCGTCA-3'(서열 번호 132) 및

ORF2*c: 5'-GGCCCGGTCCAGCGTGCCGAAGC-3'(서열 번호 133).

이로써 수득된 PCR 생성물은 orf1*c의 말단과 orf2*c의 출발부의 단편을 함유한다(참조: 도 31, 프로브 II).

- 사용된 제3 프로브는 orf1, orf2 및 orf3을 함유하고 플라스미드 pOS49.99를 분해시킴으로써 수득된, 대략 3kb의 EcoRI-BamHI 단편에 상응한다(참조: 도 31, 프로브 III).

실시예 18.2에서 수득된 라이브러리의 대략 2,000개 클론을 통상적인 기술에 따라서[참조: Sambrook et al., 1989] 콜로니 하이브리드화하기 위해 필터 상으로 옮겼다.

제1 프로브(참조: 도 31, 프로브 I)를 무작위 프라이밍 기술 (Roche에 의해 시판되고 있는 키트)을 이용하여 ³²P로 표지시키고, 이를 사용하여, 필터 상으로 옮긴 상기 라이브러리의 2,000개 클론 상에서 하이브리드화를 수행하였다. 하이브리드화는 문헌[참조: Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984)]에 기재된 완충액 중에서 65℃ 하에 수행한다. 65℃ 하에 2X SSC, 0.1% SDS에서 처음에는 10분 동안 수행한 다음, 두 번째는 20분 동안 2회 세척을 수행하고, 30분 동안 지속되는 제3 세척은 65℃ 하에 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 수행하였다. 이러한 하이브리드화 및 세척 조건 하에서, 하이브리드화된 2,000개 중에서 20개 클론이 제1 프로브와 강력한 하이브리드화 시그널을 나타내었다. 이들 20개 클론을 LB 배지 + 앰피실린(50㎍/ml)에서 배양하고, 상응하는 20개 코스미드를 알칼리성 분해(참조: Sambrook et al., 1989)함으로써 추출한 다음, BamHI 제한 효소로 분해시켰다. 이어서, 이러한 분해 생성물을 아가로스 겔 상에서 분리시키고, 나일론 막 상으로 옮긴 다음, 상기와 동일한 조건 하에 제1 프로브(상기 참조: PCR 생성물 ORF23c-ORF25c, 프로브 I)와 하이브리드화하였다. 12개 코스미드가, 사용된 프로브와 강력하게 하이브리드화된 BamHI 단편을 함유하였다. 이들 12개 코스미드는 pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44 및 pSPM45로 명명되었다. BamHI로 분해시킨 후의 이들 12개 코스미드의 프로필을 서로 비교하고 또한 코스미드 pSPM5의 프로필과 비교하였다. 또한, orf1-orf25c 영역에서 이미 동정된 각종 유전자에 상응하는 각종 프라이머를 사용하여 PCR 증폭 실험함으로써, 이들 코스미드 몇몇의 삽입물을 서로에 대해 위치 설정할 수 있었으며 또한, 이미 공지된 orf1-orf25c 영역에서의 이들 삽입물의 위치를 결정할 수 있었다(도 32 참조). 코스미드 pSPM36을 보다 특별히 선택하였는데, 이는 이것이 orf25c의 상류에 큰 영역을 함유하기 쉽기 때문이다(도 31 및 32 참조).

이어서, 상기 언급된 바와 동일한 조건을 이용하여, 스트렙토마이세스 암보파시엔스 OSC2의 라이브러리의 2000개 클론을 PCR 생성물: ORF1*c-ORF2*c(참조: 도 31, 프로브 II)에 상응하는 제2 프로브와 하이브리드화하였다. 이러한 하이브리드화로 인해, 이의 삽입물이 orf1*c에서 부터 orf10*c까지의 영역에 위치한 코스미드를 분리하는 것이 가능해졌다. 사용된 하이브리드화 조건 하에서, 하이브리드화된 2,000개 중에서 16개 클론이 상기 제2 프로브와 강력한 하이브리드화 시그널을 나타내었다. 이들 16개 클론을 LB 배지 + 앰피실린(50㎍/ml)에서 배양하고, 상응하는 16개 코스미드를 알칼리성 분해(참조: Sambrook et al., 1989)함으로써 추출한 다음, BamHI 제한 효소로 분해시켰다. BamHI로 분해시킨 후 이들 16개 코스미드의 분해 프로필을 서로 비교하고 또한 코스미드 pSPM7의 분해 프로필과 비교하였다. 프라이머 ORF1*c 및 ORF2*c을 사용한 PCR 증폭 실험으로, orf1*c 및 orf2*c 유전자를 명백히 함유하고 있고 이의 프로필이 공통의 밴드 뿐만 아니라 상이한 밴드를 갖고 있는 2개의 코스미드를 선백하는 것이 가능해졌다. 또한, orf1*c 내지 orf10*c 영역에서 이미 동정된 각종 유전자에 상응하는 각종 프라이머를 사용하여 기타 PCR 증폭 실험함으로써, 이들 코스미드의 삽입물을 서로에 대해 위치 설정할 수 있었으며 또한, 이미 공지된 orf1*c 내지 orf10*c 영역에서의 이들 삽입물의 위치를 결정할 수 있었다(도 32 참조). 2개의 코스미드를 보다 특별히 선별하고 이를 pSPM47 및 pSPM48로 명명하였다(도 32 참조).

상기 언급된 바와 동일한 조건을 이용하여, 스트렙토마이세스 암보파시엔스 OSC2의 라이브러리의 2000개 클론을 플라스미드 pOS49.99의 EcoRI-BamHI 단편(참조: 도 31, 프로브 III)에 상응하는 제3 프로브와 또한 하이브리드화하였다. 이러한 하이브리드화로 인해, orf1에서 부터 orf3까지의 영역을 함유하고, PKS 유전자의 큰 부분을 함유하거나 또는 스피라마이신에 대한 생합성 경로의 유전자 orf1 내지 orf25c의 큰 부분을 함유하기 쉬운 코스미드를 분리하는 것이 가능해졌다. 이들 하이브리드화 조건 하에서, 하이브리드화된 2,000개 중에서 35개 클론이 상기 제3 프로브와 강력한 하이브리드화 시그널을 나타내었다. 이들 35개 클론을 LB 배지 + 앰피실린(50㎍/ml)에서 배양하고, 상응하는 35개 코스미드를 알칼리성 분해(참조: Sambrook et al., 1989)함으로써 추출한 다음, BamHI 제한 효소로 분해시켰다. BamHI로 분해시킨 후 이들 35개 코스미드의 프로필을 서로 비교하고 또한 코스미드 pSPM5의 프로필과 비교하였다. 또한, orf1 내지 orf25c 영역에서 이미 동정된 각종 유전자에 상응하는 각종 프라이머를 사용하여 PCR 증폭 실험함으로써, 이들 코스미드가 orf1 내지 orf25c 영역으로부터 유래하는 삽입물을 명백히 함유하고 있다는 것을 확인할 수 있었고, 이들 코스미드의 삽입물을 서로에 대해 위치 설정할 수 있었으며 또한, 이미 공지된 orf1 내지 orf25c 영역에 대해 위치 설정할 수 있었다(도 32 참조). 5개 코스미드를 보다 특별히 선별하고 이들을 pSPM50, pSPM51, pSPM53, pSPM55 및 pSPM56로 명명하였다(도 32 참조).

19.2 코스미드 pSPM36의 삽입물 일부의 아클로닝 및 서열 분석

프라이머 ORF23c 및 ORF25c를 사용하여 PCR함으로써 수득된 대략 0.8kb의 프로브(참조: 상기 및 도 31, 프로브 I)를, PstI 효소로 분해시킨 에스. 암보파시엔스 OSC2의 총 DNA 상에서 서던 블롯팅 실험하는데 또한 사용하였다. 상기 언급된 하이브리드화 조건 하에서, 상기 프로브는 PstI 효소로 분해시킨 에스. 암보파시엔스 OSC2의 총 DNA 상에서 하이브리드화된 경우에 대략 6kb의 단일 PstI 단편을 나타낸다. PstI 부위는 orf23c 영역 내에 존재하지만(참조: 서열 번호 80), 공지된 서열(서열 번호 1 참조)의 말단(BamHI 부위) 까지 존재하는 PstI 부위는 전혀 없다. 이러한 PstI-BamHI 단편은 크기가 대략 1.4kb이다. 따라서, PstI 효소로 분해시킨 에스. 암보파시엔스의 총 DNA 상에서 하이브리드화된 6kb PstI 단편은 orf25c의 상류에 위치한 대략 4.6kb의 영역을 함유한다. 이러한 영역은 기타 유전자(이의 생성물은 스피라마이신 I에 대한 생합성 과정에 관여한다)를 함유하기 쉽다. 분해시킴으로써, 코스미드 pSPM36이 이러한 6kb PstI 단편을 실제로 함유하고 있다는 것을 확인하였다. orf25c의 추가 상류 서열을 결정할 목적으로, 상기 단편을 pSPM36으로부터 분리하였다. 이를 위해, 코스미드 pSPM36을 PstI 제한 효소로 분해시켰다. 크기가 대략 6kb인 PstI-PstI 단편을 0.8% 아가로스 겔로부터 전기용출시킴으로써 분리한 다음, 이를 벡터 pBK-CMV(4512bp)(Stratagene (La Jolla, California, USA)에 의해 시판됨) 내로 클로닝하였다. 이로써 수득된 플라스미드를 pSPM58로 명명하고(도 33 참조), 이의 삽입물 서열을 결정하였다. 이러한 삽입물 서열이 서열 번호 134에 제시되어 있다. 그러나, 모든 서열이 결정된 것은 아니며, 대략 450개 뉴클레오티드 갭이 존재하며, 결정되지 않은 서열의 일부는 상응하는 서열 내에 일련의 "N"로써 표시된다.

19.3 신규한 뉴클레오티드 서열의 분석, 개방 판독 프레임의 결정, 및 스피라마이신 생합성에 관여하는 유전자의 성상 확인

수득된 코스미드 pSPM58의 삽입물 서열은 프레임플롯 프로그램[참조: J. Ishikawa & K. Hotta, 1999]을 사용하여 분석하였다. 이로써, 개방 판독 프레임 중에서, 스트렙토마이세스 특유의 코돈 활용을 나타내는 개방 판독 프레임을 동정하는 것이 가능하였다. 이러한 분석 결과, 상기 삽입물이 orf25c의 상류에 4개의 신규한 ORF를 포함하고 있다는 것을 결정할 수 있었다(도 34 참조). 이들 유전자는 orf26(서열 번호 107), orf27(서열 번호 109), orf28c(서열 번호 111, 이러한 orf의 서열은 완전히 결정되지 않았는데, 이는 pSPM58의 삽입물 서열 분석시 대략 450개의 뉴클레오티드 갭이 존재하기 때문이며, 이들 450개 뉴클레오티드는 서열 번호 111에서 일련의 "N" 형태로 나타내었다) 및 orf29(후자 orf의 서열은 본 삽입물에서 불완전하다)로 명명되었다. 유전자 명칭에 부가된 "c"는 문제의 ORF에 대해, 암호화 서열이 역배향으로 존재한다는 것을 의미한다(도 34 참조).

이들 개방 판독 프레임으로부터 추론된 단백질 서열을 다음과 같은 각종 프로그램을 사용하여 각종 데이터베이스에 존재하는 것과 비교하였다: BLAST[참조: Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997), CD-서치(이들 2가지 프로그램은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)(Bethesda, Maryland, USA)로부터 특히 입수 가능하다), FASTA [참조: W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988; and W.R. Pearson, 1990](이러한 프로그램은 INFOBIOGEN resource center, Evry, France로부터 특히 입수 가능하다). 이들 비교를 통해, 이들 유전자 생성물의 기능에 관한 가설을 공식화하고, 스피라마이신 생합성에 관여하기 쉬운 것을 동정할 수 있게 되었다.

19.4 코스미드 pSPM36의 삽입물의 또 다른 일부의 아클로닝 및 서열 분석

프라이머 ORF23c 및 ORF25c를 사용하여 PCR함으로써 수득된 대략 0.8kb의 프로브(참조: 상기 및 도 31, 프로브 I)를, StuI 효소로 분해시킨 균주 OSC2의 총 DNA 상에서 서던 블롯팅 실험하는데 또한 사용하였다. 이러한 프로브에 대해 상기 언급된 하이브리드화 조건 하에서, 상기 프로브는 StuI 효소로 분해시킨 균주 OSC2의 총 DNA 상에서 하이브리드화된 경우에 대략 10kb의 단일 StuI 단편을 나타낸다. orf23c에 StuI 부위가 존재하고(서열 번호 80 참조), 이러한 부위가 PstI 부위에 대해 상대적으로 위치하는 경우에는, 상기 10kb 단편이 앞서 연구된 PstI 단편(pSPM58의 삽입물) 모두를 포함하고, 아직까지 연구되지 않은 대략 4kb 영역을 획득할 수 있게 해준다(도 33 참조). 분해시킴으로써, 코스미드 pSPM36이 이러한 10kb StuI 단편을 실제로 함유하고 있다는 것을 확인하였다. orf29의 말단 서열과 orf29의 추가 상류의 기타 유전자 서열을 결정할 목적으로, 상기 단편을 pSPM36으로부터 분리하였다. 이를 위해, 코스미드 pSPM36을 StuI 제한 효소로 분해시켰다. 크기가 대략 10kb인 StuI-StuI 단편을 0.8% 아가로스 겔로부터 전기용출시킴으로써 분리한 다음, 이를 벡터 pBK-CMV(4512bp)(Stratagene (La Jolla, California, USA)에 의해 시판됨) 내로 클로닝하였다. 이로써 수득된 플라스미드를 pSPM72로 명명하였다(도 33 참조). 후자를 EcoRI(pSPM58의 삽입물 내의 EcoRI 부위) 및 HindIII(상기 삽입물 말단의 StuI 부위 바로 다음에 위치한, 상기 벡터의 다중 클로닝 부위 중의 HindIII 부위)로 분해시켰다(도 33 참조). 이로써 수득된 EcoRI-HindIII DNA 단편은 플라스미드 pSPM72의 삽입물의 단편에 상응하고(도 33 참조), 이를 EcoRI 및 HindIII로 미리 분해시킨 벡터 pBC-SK+(Stratagene (La Jolla, California, USA)에 의해 시판됨) 내로 아클로닝시켰다. 이로써 수득된 플라스미드를 pSPM73으로 명명하였으며, 이의 삽입물 서열을 결정하였다. 이러한 삽입물 서열이 서열 번호 135에 제시되어 있다.

pSPM58 및 pSPM73의 삽입물 서열의 어셈블리가 서열 번호 106에 제시되어 있다. 이러한 서열은 orf23c(서열 번호 80 참조) 내의 PstI 부위로부터 출발하여 orf32c(도 34 참조) 내의 StuI 부위까지 지속된다. orf28c(서열 번호 111)의 서열은 완성되지 않았기 때문에(실시예 19.3 참조), 대략 450개 뉴클레오티드 영역이 서열 분석되지 않았고, 이들 450개 뉴클레오티드는 서열 번호 106의 서열 내에 일련의 "N" 형태로 표시된다.

19.5 신규한 뉴클레오티드 서열 분석, 개방 판독 프레임의 결정, 및 스피라마이신 생합성에 관여하는 유전자의 성상 확인

수득된 코스미드 pSPM73의 삽입물의 부분 서열은 프레임플롯 프로그램[참조: J. Ishikawa & K. Hotta, 1999]을 사용하여 분석하였다. 이로써, 개방 판독 프레임 중에서, 스트렙토마이세스 특유의 코돈 활용을 나타내는 개방 판독 프레임을 동정하는 것이 가능하였다. 이러한 분석 결과, 상기 삽입물이 4개 ORF, 즉 1개는 불완전하고 3개는 완전한 ORF를 포함하고 있다는 것을 결정할 수 있었다(도 34 참조). 불완전한 ORF는 orf29의 암호화 서열의 3' 위치에 상응한데, 이로써 플라스미드 pSPM58의 삽입물을 서열 분석하는 동안 수득된 상기 동일한 orf의 부분 서열을 통하여 상기 유전자의 서열을 완성시킬 수 있었다(실시예 19.2 및 19.3 참조). 이와 같이 2개 서열을 조합함으로써, orf29의 완전한 서열을 수득할 수 있었다. 이로써 수득된 4개 유전자는 orf29(서열 번호 113), orf30c(서열 번호 115), orf31(서열 번호 118) 및 orf32c(서열 번호 120)로 명명되었다. 유전자 명칭에 부가된 "c"는 문제의 ORF에 대해, 암호화 서열이 역배향으로 존재한다는 것을 의미한다(도 34 참조).

이들 개방 판독 프레임으로부터 추론된 단백질 서열(orf29에 대해서는 서열 번호 114, orf30c에 대해서는 서열 번호 116 및 117, orf31에 대해서는 서열 번호 119 및 orf32c에 대해서는 서열 번호 121)을 다음과 같은 각종 프로그램을 사용하여 각종 데이터베이스에 존재하는 것과 비교하였다: BLAST[참조: Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997), CD-서치(이들 2가지 프로그램은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)(Bethesda, Maryland, USA)로부터 특히 입수 가능하다), FASTA [참조: W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988; and W.R. Pearson, 1990](이러한 프로그램은 INFOBIOGEN resource center, Evry, France로부터 특히 입수 가능하다). 이들 비교를 통해, 이들 유전자 생성물의 기능에 관한 가설을 공식화하고, 스피라마이신 생합성에 관여하기 쉬운 것을 동정할 수 있게 되었다.

19.6 코스미드 pSPM36의 삽입물의 제3 부분의 아클로닝 및 서열 분석

orf32c에 대한 내부 서열에 상응하는 프로브(0.8kb DNA 단편)를, 매트릭스로서 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주의 총 DNA를 사용하고 다음 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 수득하였다:

KF36: 5'- TTGCCGTAGCCGAGGACCAGCG-3' (서열 번호 151) 및

KF37: 5'- CACATGGCCCTGGAGGACCCTG-3' (서열 번호 152).

이로써 수득된 PCR 생성물은 orf32c의 내부 서열을 나타낸다. 이러한 프로브는 PstI 효소로 분해시킨, 균주 OSC2의 염색체 DNA와 코스미드 pSPM36의 DNA 상에서 서던 블롯팅 실험하는데 사용하였다. 상기 언급된 바와 동일한 하이브리드화 조건 하에서(실시예 19.1 참조), 이러한 프로브는 PstI 효소로 분해시킨, 균주 OSC2의 총 DNA와 코스미드 pSPM36의 DNA 상에서 하이브리드화되는 경우에 대략 3.4kb 및 2.5kb의 2개의 PstI 단편을 나타낸다. 사용된 프로브 내에 PstI 부위가 존재한다면, 이러한 결과를 설명할 수 있다. 크기가 대략 3.4kb인 제1 DNA 단편은 이의 서열이 이미 전적으로 공지되어 있는 단편이다. 2.5kb 단편의 서열은 700bp 영역에 걸쳐 단지 부분적으로만 공지되어 있다. orf32c의 말단 서열과 이의 상류의 기타 유전자 서열을 결정할 목적으로, 상기 단편을 pSPM36으로부터 분리하였다. 이를 위해, 코스미드 pSPM36을 PstI 제한 효소로 분해시켰다. 크기가 대략 2.5kb인 PstI-PstI 단편을 0.8% 아가로스 겔로부터 정제시킴으로써 분리한 다음, 이를 벡터 pBK-CMV(4518bp)(Stratagene (La Jolla, California, USA)에 의해 시판됨) 내로 클로닝하였다. 이로써 수득된 플라스미드를 pSPM79로 명명하고(도 41 참조), 이의 삽입물 서열을 결정하였다.

orf28c의 서열(서열 번호 111)은 완성되지 않았다(실시예 19.3 참조). 구체적으로 언급하면, 대략 450개 뉴클레오티드 영역을 결정하는 것이 가능하지 않았기 때문에, 이들 450개 뉴클레오티드는 서열 번호 106의 서열 내에 일련의 "N" 형태로 표시된다. 생략된 영역 전체 서열은 이 영역을 재서열 분석함으로써 결정하였다. 따라서, pSPM58 및 pSPM73의 삽입물 서열을 완전히 결정하였다. orf28c의 암호화 부분의 완전한 서열이 서열 번호 141에 제시되어 있고, 이러한 서열로부터 추론되는 단백질이 서열 번호 142에 제시되어 있다. 플라스미드 pSPM79의 삽입물 서열이 서열 번호 161에 제시되어 있다.

pSPM58, pSPM73 및 pSPM79의 삽입물 서열의 어셈블리가 서열 번호 140에 제시되어 있다(도 41 참조). 이러한 서열은 orf23c(서열 번호 80 참조)에서 PstI 부위로부터 출발하여 orf34c(도 41 참조)에서 PstI 부위까지 지속된다.

19.7 신규한 뉴클레오티드 서열 분석, 개방 판독 프레임의 결정, 및 스피라마이신 생합성에 관여하는 유전자의 성상 확인

수득된 코스미드 pSPM79의 삽입물 서열은 프레임플롯 프로그램[참조: Ishikawa J & Hotta K. 1999]을 사용하여 분석하였다. 이로써, 개방 판독 프레임 중에서, 스트렙토마이세스 특유의 코돈 활용을 나타내는 개방 판독 프레임을 동정하는 것이 가능하였다. 이러한 분석 결과, 상기 삽입물이 3개의 ORF, 즉 2개는 불완전한 ORF(orf32c 및 orf34c)이고 1개는 완전한 ORF(orf33)를 포함하고 있다는 것을 결정할 수 있었다(도 41 참조).

불완전한 제1 ORF는 orf32c의 암호화 서열의 5' 위치에 상응한다. 이로써 플라스미드 pSPM73의 삽입물을 서열 분석하는 동안 수득된 상기 동일한 orf의 부분 서열을 통하여 상기 유전자의 서열을 완성시킬 수 있었다(실시예 19.2 및 19.3 참조). 이와 같이 2개 서열을 조합함으로써, orf32c(서열 번호 145)의 완전한 서열을 수득할 수 있었다. 유전자 명칭에 부가된 "c"는 문제의 ORF에 대해, 암호화 서열이 역배향으로 존재한다는 것을 의미한다(도 41 참조). 완전한 orf는 orf33(서열 번호 147)로 명명되었다. 제3의 ORF는 orf34c(서열 번호 149)로 명명되었다. 유전자 명칭에 부가된 "c"는 문제의 ORF에 대해, 암호화 서열이 역배향으로 존재한다는 것을 의미한다(도 37 참조). 이러한 orf 생성물과 데이터뱅크 간에 수행된 비교 결과는, 상기 단백질의 C-말단부가 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 생성물 내에 존재하지 않으므로, 이러한 orf가 서열 분석된 영역 보다 더 길고 이러한 영역을 벗어나서 지속된다는 사실을 제안하고 있다.

실시예 20: 스피라마이신 생합성 중간체 생성에 관한 분석

20.1 샘플 제조:

시험하고자 하는 각종 균주를 각각, 70ml의 MP5 배지를 함유하는 7개의 500ml용 차폐된 에를렌마이어에서 배양한다(참조: Pernodet et al., 1993). 이러한 에를렌마이어를 각종 에스. 암보파시엔스 균주의 2.5 x 10⁶개 포자/ml의 농도로 접종하며, 96시간 동안 250rpm으로 궤도 진탕시키면서 27℃ 하에 성장시킨다. 동일한 클론에 상응하는 배양물을 모으고, 주름진 필터 내로 임의 여과시킨 다음, 7000rpm으로 15분 동안 원심분리시킨다.

이어서, 수산화나트륨을 이용하여 과실즙의 pH를 9로 조정하고, 메틸 이소부티릴 케톤(MIBK)을 사용하여 상청액을 추출한다. 이어서, 유기 상(MIBK)을 회수하고 증발시킨다. 이어서, 건조 추출물을 1ml의 아세토니트릴에 흡수시킨 다음, 1/10로 희석(물을 이용하여 100㎕ 대 1ml)시킨 후에, 이를 액체 크로마토그래피/질량 분광법(LC/MS) 분석에 사용하였다.

20.2 LC/MS에 의한 샘플 분석:

시험하고자 하는 균주에 의해 합성된 각종 생성물의 질량을 측정할 목적으로, 상기 샘플을 LC/MS함으로써 분석하였다.

사용된 고 성능 액체 크로마토그래피 칼럼은 크로마실(Kromasil) C8 150* 4.6mmm, 5mmm, 100Å 칼럼이다.

이동 상은 아세토니트릴과 수성 0.05% 트리플루오로아세트산 용액의 혼합물로 이루어진 구배이고, 유속은 1ml/min으로 설정된다. 칼럼 오븐의 온도는 30℃로 유지시킨다.

칼럼 배출구에서의 UV 탐지는 2가지 상이한 파장, 즉 238nm 및 280nm에서 수행하였다.

크로마토그래피 칼럼과 커플링된 질량 분광계는 30 및 70V 하의 원추 전압을 갖는, 단일 사극(Quadripole) 장치[Agilent에 의해 시판됨]이다.

20.3 균주 OS49.67에 의해 생산된 생합성 중간체의 분석

orf3 유전자를 동위상 결실시킴으로써 불활성화시킨 균주 OS49.67은 스피라마이신을 생산하지 않는다(실시예 6 및 15 참조).

샘플을 상기 언급된 방법(단락 20.1 참조)에 따라서 제조하고, 상기 언급된 바와 같이(단락 20.2 참조) LC/MS에 의해 분석하였다. 보다 특히, 크로마토그래피에 의한 분석은 이동 상으로서 20%의 아세토니트릴을 T=O에서 부터 T=5분까지 사용한 다음, T=35분에서 30%로 선형 증가시킨 후, T=50분까지 안정 수준에 달하는 용매 구배로 수행하였다.

이들 조건 하에서, 2가지 생성물이 보다 특별히 관찰되었다: 238nm에서 흡수되는 생성물(잔류 시간 33.4분) 및 280nm에서 흡수되는 생성물(잔류 시간 44.8분)(도 35 참조). 도 35에는 238nm 및 280nm 하에 생성된 HPLC 크로마토그램(상류)과, 33.4분 및 44.8분에 용출된 분자의 UV 스펙트럼(하류)의 중첩이 도시되어 있다.

커플된 질량 분광 분석 조건은 다음과 같다: 스캐닝은 100 내지 1000 Da 범위의 질량을 포괄하는 스캔 모드로 수행한다. 전기증배기 획득량은 1V이다. 전기분무 공급원에 관해서 언급하면, 분무화 기체 압력은 35psig이고, 건조화 기체의 유속은 12.0 ℓ/min이며, 건조화 기체의 온도는 350℃이고 모세관 전압은 +/- 3000V이다. 이들 실험으로, 분리된 두 생성물의 질량을 측정할 수 있었다. 이들 질량은 각각, 먼저 용출된 생성물([M-H₂O]⁺=353 주 생성물)에 대해서는 370g/mol이고 제2 생성물([M-H₂O]⁺=351 주 생성물)에 대해서는 368g/mol이다.

구조를 획득하기 위해, 상기 언급된 생성물을 다음 조건 하에 분리 및 정제하였다: 이동 상은 수성 0.5% 트리플루오로아세트산 용액과 아세토니트릴의 70/30(v/v) 혼합물이다. 크로마토그래피는 고정된 유속 1ml/min을 이용하는 등용매 시스템으로 수행한다. 이들 조건 하에, 상기 2가지 생성물의 잔류 시간은 각각 8분 및 13.3분이다. 또한, 이러한 경우, 제조된 샘플(단락 20.1 참조)은 10㎕을 주입하기 전에는 물에서 희석시키지 않는다.

상기 2가지 생성물을 크로마토그래피 칼럼 배출구에서 회수하고 다음 조건 하에 분리하였다: Oasis HLB 1cc 30mg 카트릿지(Waters)를 1ml의 아세토니트릴에 이어, 1ml의 물/아세토니트릴(20v/80v) 및 1ml의 80/20 물/아세토니트릴로 순차적으로 조건화시킨다. 이어서, 상기 샘플을 도입하고, 카트릿지를 1ml의 물/아세토니트릴(95/5) 및 1ml의 물/중수소화 아세토니트릴(95/5)로 연속해서 세척한 다음, 600㎕의 40/60 물/중수소화 아세토니트릴로 용출시킨다. 이어서, 회수한 용액을 NMR에 의해 직접 분석한다.

이들 두 화합물에 대해 수득된 NMR 스펙트럼은 다음과 같다:

- 용출된 제1 생성물: 플라테놀리드 A: (스펙트럼 9646V)

CD3CN 중의 1H 스펙트럼(화학적 이동, ppm): 0.90 (3H, t, J=6Hz), 0.93 (3H, d, J=5Hz), 1.27 (3H, d, J=5Hz), 1.27 내지 1.40 (3H, m), 1.51 (1H, m), 1.95 (1H, m), 2.12 (1H, m), 2.30 (1H, d, J=12Hz), 2.50 (1H, d, J=11Hz), 2.58 (1H, dd, J=9 및 12 Hz), 2.96 (1H, d, J=7Hz), 3.43 (3H, s), 3.70 (1H, d, J=9Hz), 3.86 (1H, d, J=7Hz), 4.10 (1H, m), 5.08 (1H, m), 5.58 (1H, dt, J=3 및 12Hz), 5.70 (1H, dd, J=8 및 12 Hz), 6.05 (1H, dd, J=9 및 12 Hz), 6.24 (1H, dd, J=9 및 12Hz).

- 용출된 제2 생성물: 플라테놀리드 B: (스펙트럼 9647V)

CD3CN 중의 1H 스펙트럼(화학적 이동, ppm): 0.81 (3H, t, J=6Hz), 0.89 (1H, m), 1.17 (3H, d, J=5Hz), 1.30 (4H, m), 1.47 (2H, m), 1.61 (1H, t, J=10Hz), 2.20 (1H, m), 2.38 (1H, d, J=13Hz), 2.52 (1H, m), 2.58 (1H, m), 2.68 (1H, dd, J=8 및 13Hz), 3.10 (1H, d, J=7Hz), 3.50 (3H, s), 3.61 (1H, d, J=8Hz), 3.82 (1H, d, J=7Hz), 5.09 (1H, m), 6,20 (1H, m), 6.25 (1H, dd, J=9 및 12 Hz), 6.58 (1H, d, J=12 Hz), 7.19 (1H, dd, J=9 및 12Hz).

이들 실험으로써, 이들 2가지 화합물의 구조를 결정할 수 있었다. 용출된 제1 생성물은 플라테놀리드 A이고, 제2 생성물은 플라테놀리드 B이며; 이들 2가지 분자의 추론된 구조가 도 36에 제시되어 있다.

상기 언급된 바와 약간은 상이하지만, 이의 설정 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있는 조건 하에서 LC/MS 기술을 NMR과 조합하여 사용하여, 균주 OS49.67이 플라테놀리드 A 및 B 이외에도 이들 2가지 화합물의 유도체를 생산한다는 사실을 결정할 수 있었다. 이들은 플라테놀리드 A + 미카로스와 플라테놀리드 B + 미카로스이다(이들 2가지 화합물의 구조가 도 40에 제시되어 있다). 균주 OS49.67의 과실즙의 분석 결과가 표 42에 제시되어 있다.

20.4 균주 SPM509에 의해 생산된 생합성 중간체의 분석

orf14 유전자를 불활성화시킨 균주 SPM509(arf14::att3Ωaac-)은 스피라마이신을 생산하지 않는다(실시예 13, 15 및 16 참조). 샘플을 상기 언급된 방법(단락 20.1 참조)에 따라서 제조하고, 상기 언급된 바와 같이(단락 20.2 및 20.3 참조) LC/MS에 의해 분석하였다. MP5 배지에서 배양된 균주 SPM509의 배양 상청액에 존재하는 생합성 중간체의 분석 결과, 이러한 균주가 단지 형태 B의 플라테놀리드("플라테놀리드 B", 도 36 참조) 만을 생산하고 형태 A("플라테놀리드 A, 도 36 참조)는 생산하지 않은 것으로 나타났다.

실시예 21: orf3 유전자에서 녹아웃을 나타내는 균주(OS49.67)에서 orf14 유전자의 개입중단

orf14 유전자는 스피라마이신 생합성에 필수적이다(실시예 13, 15 및 16 참조: 상기 유전자가 개입중단된 균주 SPM509는 더 이상 스피라마이신을 생산하지 않는다). MP5 배지에서 배양된 균주 SPM509의 배양 상청액에 존재하는 생합성 중간체의 분석 결과, 이러한 균주가 단지 형태 B의 플라테놀리드 만을 생산하고 형태 A는 생산하지 않은 것으로 나타났다(실시예 20 참조). 이러한 관찰 결과를 설명할 수 있는 가설들 중의 하나는 orf14의 생성물이 효소적 환원 단계를 통하여 형태 B의 플라테놀리드를 형태 A로 전환시키는데 관여한다는 것이다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 스피라마이신은 더 이상 생산하지 않지만 형태 A와 B의 플라테놀리드를 생산하는 돌연변이체에서 orf14 유전자를 불활성화시킨다. 이는 orf3 유전자를 동위상 결실에 의해 불활성화시킨(△orf3) 균주 OS49.67(실시예 6 및 20 참조)의 경우에 해당된다. 이러한 균주에서 orf14 유전자를 불활성화시키기 위해, 균주 OS49.67을 원형질체 형질전환시킴으로서 플라스미드 pSPM509를 도입하였다(참조: T. Kieser et al., 2000). orf14 유전자의 불활성화는 균주 OSC2의 경우에 이미 언급되었고(실시예 13 참조), 이와 동일한 과정을 균주 OS49.67에서 orf14 유전자의 불활성화를 위해 사용하였다. 플라스미드 pSPM509로 형질전환시킨 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 아프라마이신-내성 클론을 각각, 아프라마이신 함유 배지와 히그로마이신 함유 배지 상에서 계대배양하였다. 아프라마이신에 내성인 클론(ApraR)과 히그로마이신에 민감한 클론(HygS)은 원칙적으로, 이중 유전자교환 사건이 발생하였으며 상기 orf14 유전자가 att3Ωaac- 카세트에 의해 개입중단된 orf14의 복사물로 대체된 것이다. 이들 클론을 보다 특별히 선별하고, orf14의 야생형 복사물을 상기 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키는 것을 하이브리드화에 의해 확인하였다. 따라서, 수득된 클론의 총 DNA를 여러 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, att3Ωaac- 카세트에 상응하는 프로브와 하이브리드화시켜, 유전자 대체가 실제로 수행되었는지를 확인하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 유전자형을 확인할 수 있다.

예상된 특징을 나타내는 클론(△orf3, orf14::att3Ωaac-)을 보다 특별히 선별하고, 이를 SPM510으로 명명하였다. 사실상, 2회 하이브리드화를 통하여, att3Ωaac- 카세트가 상기 클론의 게놈 내에 실제로 존재한다는 사실과, 이러한 클론의 게놈 내에서 야생형 orf14 유전자를 att3Ωaac- 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키고, 연속해서 이중 재조합 사건을 수행한 경우에 예상된 분해 프로필을 실제로 수득할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 22: orf14 유전자의 개입중단의 기능적 상보성

22.1 플라스미드 pSPM519의 작제:

orf14 유전자를 다음 쌍의 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 매트릭스로서 균주 OSC2의 염색체 DNA를 사용하여 PCR함으로써 증폭시켰다: EDR31: 5'CCCAAGCTCTGCGCCCGCGGGCGTGAA 3'(서열 번호 136) 및 EDR37: 5'GCTCTAGAACCGTGTAGCCGCGCCCCGG 3'(서열 번호 137). 올리고뉴클레오티드 EDR31 및 EDR37은 각각 HindIII 및 XbaI 제한 부위(진하게 표시된 서열)를 수반한다. 이로써 수득된 1.2kb 단편을 벡터 pGEM-T easy(Promega (Madison, Wisconsin, USA))에 의해 시판됨) 내로 클로닝시켜, 플라스미드 pSPM515를 수득하였다. 이어서, 이러한 플라스미드를 HindIII 및 XbaI 제한 효소로 분해시켰다. 수득된 1.2kb HindIII/XbaI 삽입물을, 상기와 동일한 효소로 미리 분해시킨 벡터 pUWL201(실시예 17.1 참조)내로 클로닝하였다. 이로써 수득된 플라스미드는 pSPM519로 명명되었다.

22.1 균주 SPM509 및 SPM510을 플라스미드 pSPM519로 형질전환시킴:

플라스미드 pSPM519를 원형질체 형질전환에 의해 균주 SPM509(실시예 13 참조) 및 SPM510(실시예 17 참조) 내로 도입하였다(참조: T. Kieser et al., 2000). 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 티오스트렙톤 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 상기 클론을 티오스트렙톤 함유 배지 상에서 계대배양하였다.

균주 SPM509는 스피라마이신 비-생산자 균주이다(실시예 13, 15 및 16, 및 도 24 참조). 벡터 pSPM519로 형질전환시킨 균주 SPM509(SPM509 pSPM519로 명명된 균주)의 스피라마이신 생산은, 상기 균주를 티오스트렙톤의 존재 하에 MP5 배지에서 배양함으로써 분석하였다. 이어서, 배양 상청액을 HPLC에 의해 분석하였다(실시예 16 및 17 참조). 이러한 분석 결과가 표 43에 제시되어 있고, 데이터는 상청액 리터당 mg으로 표현된다. 이 결과는 스피라마이신 총 생산량에 상응한다(스피라마이신 I, II 및 III 생산량을 부가함으로써 수득됨). 균주 SPM509 내에 벡터 pSPM519가 존재하는 것이 스피라마이신 생산을 복원시키는 것으로 관찰되었다(표 43 참조).

플라스미드 pSPM519로 형질전환시킨 균주 SPM510은 SPM510 pSPM519로 명명되었다.

실시예 23: 에스. 프라디애의 tylB 유전자에 의한 orf3 유전자의 개입중단의 기능적 상보성

23.1 플라스미드 pOS49.52의 작제:

플라스미드 pOS49.52는 에스. 암보파시엔스의 TylB 단백질의 발현을 허용해 주는 플라스미드에 상응한다. 이를 작제하기 위해, 에스. 프라디애의 tylB 유전자의 암호화 서열[참조: Merson-Davies & Cundliffe, 1994, 젠뱅크 수탁 번호: U08223(상기 영역 서열), SFU08223(DNA 서열) 및 AAA21342(단백질 서열)]을 플라스미드 pKC1218(참조: Bierman et al., 1992, Kieser et al., 2000; 상기 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 균주는 특히 ARS (NRRL) Agricultural Research Service Culture Collection) (Peoria, Illinois, USA)로부터 번호 B-14790로 입수 가능하다) 내로 도입하였다. 또한, 상기 암호화 서열을 ermE* 프로모터의 제어 하에 위치시켰다(참조: 상기, 특히 실시예 17.1, Bibb et al., 1985, Bibb et al., 1994).

23.1 균주 OS49.67을 플라스미드 pOS49.52로 형질전환시킴:

orf3 유전자를 동위상 결실에 의해 불활성화시킨 균주 OS49.67은 스피라마이신을 생산하지 않는다(실시예 6 및 15 참조). 플라스미드 pOS49.52를 원형질체 형질전환에 의해 균주 OS49.67 내로 도입하였다(참조: T. Kieser et al., 2000). 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 상기 클론을 아프라마이신 함유 배지 상에서 계대배양하였다. 이 클론을 보다 특별히 선별하고 OS49.67 pOS49.52로 명명하였다.

상기 입증된 바와 같이, 균주 OS49.67은 스피라마이신을 생산하지 않는다(실시예 6 및 15 참조). 벡터 pOS49.52로 형질전환시킨 균주 OS49.67의 스피라마이신 생산은 실시예 15에 기재된 기술에 의해 분석하였다. 이로써, 상기 균주가 스피라마이신 생산자 표현형을 지니고 있다는 것을 입증할 수 있었다. 따라서, TylB 단백질은 orf3 유전자의 개입중단의 기능적 상보성을 허용해 준다.

실시예 24: orf28c 유전자의 과발현에 의한 스피라마이신 생산 향상

24.1 플라스미드 pSPM75의 작제:

orf28c 유전자는 HindIII 제한 부위 또는 BamHI 제한 부위를 포함하는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR함으로써 증폭시켰다. 이들 프라이머는 다음 서열을 갖는다:

KF30: 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3'(서열 번호 138)

[HindIII 제한 부위(진하게 표시됨)를 갖는다]

KF31: 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3'(서열 번호 139)

[BamHI 제한 부위(진하게 표시됨)를 갖는다].

프라이머 KF30 및 KF31은 각각 HindIII 및 BamHI 제한 부위(진하게 표시된 서열)을 수반한다. 프라이머 KF30와 KF31 쌍은 매트릭스로서 플라스미드 pSPM36(상기 참조)을 사용하여, orf28c 유전자를 함유하는 크기가 대략 1.5kb인 DNA 단편을 증폭시킬 수 있게 해준다. 이로써 수득된 1.5kb 단편을 벡터 pGEM-T easy(Promega (Madison, Wisconsin, USA)에 의해 시판됨) 내로 클로닝시켜, 플라스미드 pSPM74를 수득하였다. 이어서, 플라스미드 pSPM74를 HindIII 및 BamHI 제한 효소로 분해시키고, 수득된 대략 1.5kb HindIII/BamHI 삽입물을, 상기와 동일한 효소로 미리 분해시킨 벡터 pUWL201(실시예 17.1 참조) 내로 아클로닝시켰다. 이로써 수득된 플라스미드를 pSPM75로 명명하였는데, 이는 ermE* 프로모터의 제어 하에 위치된 orf28c의 암호화 서열을 모두 함유한다.

24.2 균주 OSC2를 플라스미드 pSPM75로 형질전환시킴:

플라스미드 pSPM75를 원형질체 형질전환에 의해 균주 OSC2 내로 도입하였다(참조: T. Kieser et al., 2000). 원형질체 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 티오스트렙톤 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 상기 클론을 티오스트렙톤 함유 배지 상에서 계대배양하고, 상기 플라스미드로의 형질전환을 플라스미드 추출에 의해 확인하였다. 2개 클론을 보다 특별히 선별하고, 이를 OSC2/pSPM75(1) 및 OSC2/pSPM75(2)로 명명하였다.

균주 OSC2/pSPM75(2) 샘플은 2003년 10월 6일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 등록 번호 I-3101로 기탁되었다.

스피라마이신 생산에 대한 orf28c 유전자의 과발현 효과를 시험하기 위해, OSC2/pSPM75(1) 및 OSC2/pSPM75(2) 클론의 스피라마이신 생산을 실시예 15에 기재된 기술에 의해 시험하였다. 이와 병행해서, 비교를 위해, 균주 OSC2의 스피라마이신 생산에 관한 분석을 또한 수행하였다. 이로써, 플라스미드 pSPM75의 존재가 균주 OSC2의 스피라마이신 생산을 상당히 증가시킨다는 사실을 관찰할 수 있었다. 이로써, orf28c의 과발현이 스피라마이신 생산 증가를 가져다 주는 것으로 입증되었으며, 이것이 조절인자로서 역할을 한다는 사실을 확인시켜 준다.

OSC2/pSPM75(1) 및 OSC2/pSPM75(2) 클론의 스피라마이신 생산을 또한, HPLC에 의해 분석하였다(실시예 17.2에서와 동일한 방식으로 수행됨). 이와 병행해서, 비교를 위해, 균주 OSC2의 스피라마이신 생산에 관한 분석을 또한 수행하였다. 이러한 분석 결과가 표 44에 제시되어 있고, 데이터는 상청액 리터당 mg으로 표현된다. 이 결과는 스피라마이신 총 생산량에 상응한다(스피라마이신 I, II 및 III 생산량을 부가함으로써 수득됨).

따라서, 플라스미드 pSPM75가 존재하는 것이 균주 OSC2의 스피라마이신 생산량을 상당히 증가시키는 것으로 관찰된다. 이는 orf28c의 과발현이 스피라마이신 생산에 긍정적인 효과를 나타낸다는 것을 명백히 입증해준다.

실시예 25: orf8 유전자에서 불활성화시킨 균주에 의한 스피라마이신 생합성 중간체의 생산 분석

orf8 유전자를 Ωhyg 카세트의 삽입에 의해 불활성화시킨 균주 OS49.107은 스피라마이신을 생산하지 않는다(실시예 7 및 15 참조). orf8 유전자는 몇 가지 아미노트랜스퍼라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화하고, orf8 유전자가 포로사민 생합성에 필요한 아민기 전이 반응에 대해 책임이 있는 4-아미노트랜스퍼라제를 암호화한다는 사실을 강력히 제시해준다(도 6 참조). 따라서, 스피라마이신 생합성은 포로시딘 단계에서 차단될 것으로 예상된다(도 7 참조). 따라서, 스피라마이신 비-생산자인 균주 OS49.107은 포로시딘을 생산해야 한다.

균주 OS49.107의 상청액 샘플을 상기 언급된 방법(MIBK 추출을 수반하지 않는 실시예 16 참조)에 따라서 제조하고, 상기 언급된 바와 같이(단락 20.2 및 20.3 참조) LC/MS에 의해 분석하였다. SIM 모드에서는, 포로시딘의 분자 이온에 관한 질량 558을 선별하고 몇 가지 피크를 탐지하였다. 질량 558의 화합물이 존재하는 것은 orf8이 포로사민 합성에 일정 역할을 한다는 가설에 부합된다.

실시예 26: orf12 유전자에서 불활성화시킨 균주에 의한 스피라마이신 생합성 중간체의 생산 분석

orf12 유전자를 불활성화시킨 균주 SPM507은 스피라마이신을 생산하지 않는다(실시예 11 및 15 참조). orf12 유전자는 포로사민 생합성에 필요한 탈수 반응에 대해 책임이 있는 3,4-데하이드라타제를 암호화하는 것으로 여겨진다(도 6 참조). 따라서, 스피라마이신 생합성은 포로시딘 단계에서 차단될 것으로 예상된다(도 7 참조). 따라서, 스피라마이신 비-생산성 균주인 균주 SPM507은 포로시딘을 생산해야 한다.

균주 SPM507의 상청액 샘플을 상기 언급된 방법(MIBK 추출을 수반하지 않는 실시예 16 참조)에 따라서 제조하고, 상기 언급된 바와 같이(단락 20.2 및 20.3 참조) LC/MS에 의해 분석하였다. 이들 조건 하에서, 포로시딘 잔류 시간은 대략 12.9분이다. SIM 모드에서는, 포로시딘의 분자 이온 [M+H]⁺에 관한 질량 558을 선별하고 특정 피크를 탐지하였다. 질량 558의 화합물이 존재하는 것은 orf12의 생성물이 스피라마이신 생합성에 일정 역할을 한다는 가설을 실증시켜 준다.

그러나, 포로시딘은 비교적 적은 양으로 존재하고, 이들 조건 하에서는 238nm에서 흡수되는 생성물이 보다 특별히 관찰되었다(잔류 시간 17.1분). LC/MS 분석 결과, 상기 화합물의 질량이 744.3g/mol인 것으로 결정되었다([M+H]⁺=744.3 주 생성물).

구조를 획득하기 위해, 상기 언급된 생성물을 상기 언급된 조건 하에 분리 및 정제하였다(단락 20.1 참조). 이어서, 유기 상(MIBK)을 회수하고 증발시킨다. 건조 추출물을 물에 흡수시키고 헵탄으로 추출한다. 이어서, 수용액을 Oasis HLB 1g 카트릿지(Waters SAS, St-Quentin en-Yvelines, France)에 결합시킴으로써 이를 추출한다. 이 화합물을 30/70 물/아세토니트릴 혼합물로 용출시킴으로써 회수한다. 이어서, 이 용액을 분석용 칼럼 상으로 주사하고(100㎕), 분획을 Oasis HLB 1cc 30mg 카트릿지(Waters) 상에서 회수한다. 사용하기 전에, 이러한 Oasis HLB 1cc 30mg 카트릿지(Waters)를 아세토니트릴에 이어, 물/아세토니트릴 혼합물(20v/80v) 및 80/20 물/아세토니트릴 혼합물로 순차적으로 조건화시킨다.

이어서, Oasis HLB 1cc 30mg 카트릿지(Waters)를 1ml의 물/아세토니트릴(95/5) 및 1ml의 물/중수소화 아세토니트릴(95/5)로 연속해서 세척한 다음, 600㎕의 40/60 물/중수소화 아세토니트릴로 용출시킨다. 이어서, 회수한 용액을 NMR에 의해 직접 분석한다.

상기 화합물에 대해 수득된 NMR 스펙트럼은 다음과 같다(19312V NMR 스펙트럼):

CD3CN/D2O 중의 1H 스펙트럼(화학적 이동, ppm): 0.92 (3H, d, J=6Hz), 1.10 (1H, 분해되지 않은 피크), 1.14 (3H, s), 1.17 (3H, d, J=6Hz), 1.22 (3H, d, J=6Hz), 1.25 (3H, d, J=6Hz), 1.40 (1H, 분해되지 않은 피크), 1.75 (1H, dd, J=12 및 2Hz), 1.81 (1H, 분해되지 않은 피크), 1.90 (1H, d, J=12Hz), 2.05 (1H, 분해되지 않은 피크), 2.12 (3H, s), 2.15 (1H, 분해되지 않은 피크), 2.35 (2H, 분해되지 않은 피크), 2.45 (6H, 넓은 s), 2.53 (1H, 분해되지 않은 피크), 2.64 (1H, dd, J=12 및 9Hz), 2.80 (1H, dd, J=9 및 16Hz), 2.95 (1H, d, J=8Hz), 3.23 (2H, 분해되지 않은 피크), 3.34 (1H, d, J=7Hz), 3.45 (3H, s), 3.49 (1H, 분해되지 않은 피크), 3.93 (1H, dd, J=7 및 3Hz), 4.08 (1H, 분해되지 않은 피크), 4.37 (1H, d, J=6Hz), 4.88 (1H, 분해되지 않은 피크), 5.05 (2H, 분해되지 않은 피크), 5.65 (2H, 분해되지 않은 피크), 6.08 (1H, dd, J=8 및 12Hz), 6.40 (1H, dd, J=12 및 9Hz), 9.60 (1H, s).

이들 실험으로써, 상기 화합물의 구조를 결정할 수 있었으며, 이러한 구조가 도 38에 제시되어 있다.

실시예 27: orf5* 유전자에서 불활성화시킨 균주에 의한 스피라마이신 생합성 중간체의 생산 분석

균주 SPM501은 유전자형 orf6*::att1Ωhyg+을 갖는다. att1Ωhyg+ 카세트를 orf6* 유전자 내로 삽입시킨 극성 효과를 통하여, orf5* 유전자가 스피라마이신 생합성 경로에 필수적이란 사실을 결정할 수 있었다. 구체적으로 언급하면, 상기 절제 가능한 카세트를 orf6* 유전자 내로 삽입시키면, orf5* 유전자의 발현에 대한 극성 효과를 통하여 스피라마이신 생산을 완전히 억제시킨다. 그러나, 상기와 같이 삽입된 카세트를 일단 절단시키면(그리고, 이에 따라 orf6* 유전자 만이 불활성화되는 경우; 실시예 14 및 15 참조), 스피라마이신 I의 생산이 복원된다. 이는 orf5* 유전자가 스피라마이신 생합성에 필수적이란 사실을 입증해주는데, 이는 이를 불활성화시키면, 스피라마이신 생산이 완전히 억제되기 때문이다.

orf5* 유전자는 몇 가지 O-메틸트랜스퍼라제와 비교적 강력한 유사성을 나타내는 단백질을 암호화한다. orf5* 유전자는 플라테놀리드의 생합성에 관여하는 O-메틸트랜스퍼라제인 것으로 여겨진다. 이러한 가설을 입증하기 위해, LC/MS 및 NMR 분석 실험을, 스피라마이신을 과생산하는 균주로부터 수득된 유전자형: orf6*::att1Ωhyg+의 에스. 암보파시엔스 균주 상에서 수행하였다.

상기 균주의 상청액 샘플을 상기 언급된 방법(MIBK 추출을 수반하지 않는 실시예 16 참조)에 따라서 제조하고, 상기 언급된 바와 같이(단락 20.2 및 20.3 참조) LC/MS에 의해 분석하였다. 그러나 사용된 칼럼은 X-Terra 칼럼(Waters SAS, St-Quentin en-Yvelines, France)이고, 분광계의 원추 전압은 380V로 설정되어, 분석된 화합물의 발효를 획득한다. 이들 조건 하에서, 잔류 시간이 대략 13.1분인 생성물이 관찰된다. 상기 화합물의 질량 스펙트럼은 스피라마이신 I과 유사한 외관을 나타내지만, 분자 이온은 829이다. 스피라마이신의 질량과 비교한 14 질량 상의 차이점은 락톤 환(이러한 화합물의 구조는 도 39에 제시되어 있다)의 탄소 번호 4에 의해 생성된 산소 상의 메틸 그룹 부재로써 설명할 수 있다. 829 하의 특정 화합물이 존재하면, orf5*이 스피라마이신 생합성에 있어 일정 역할을 한다는 가설을 실증할 수 있다. 민감한 엠. 루테우스(M. luteus) 균주 상에서 수행된 미생물학적 시험을 이용하여(실시예 15 및 도 18 참조), 균주 orf6*::Ωatthyg+에 의해 생산된 중간체 분자(메틸 그룹이 부재하는 스피라마이신, 이의 구조는 도 39에 제시되어 있다)가 위치 4에 메틸 그룹을 갖는 기원 스피라마이신 보다 훨씬 활성이 덜하다(10 인자 정도)란 사실을 입증해주었다.

실시예 28: 신규한 "절제 가능한 카세트"의 작제:

신규한 절제 가능한 카세트를 작제하였다. 이들 카세트는 실시예 9에서 이미 기재된 바와 같은 절제 가능한 카세트와 매우 유사하다. 전자 카세트와 본 실시예의 신규한 카세트 간의 주요 차이점은 후자 카세트에서는, Ω 인터포손(interposon)의 말단에 상응하는 서열(이러한 서열은 T4 파아지로부터 유래하는 전사 종결인자를 함유한다)이 부재한다는 것이다.

종결인자를 갖지 않는 카세트에서는, 특정 항생제에 대한 내성을 부여해 주는 유전자를, 절제를 허용해 주는 attR 및 attL 서열에 의해 플랭킹시킨다. 이러한 내성 유전자는 아프라마이신 내성을 부여해 주는 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 aac(3)IV 유전자이다. 이러한 유전자는 Ωaac 카세트(젠뱅크 수탁 번호: X99313, Blondelet-Rouault, M.H. et al., 1997)에 존재하고, 이는 매트릭스로서, 플라스미드 pOSK1102(상기 참조)를 사용하고, 프라이머로서, 5' 위치에 HindIII 제한 부위(진하게 표시됨)(AAGCTT)를 각각 함유하는 올리고뉴클레오티드 KF42 및 KF43를 사용하여 PCR함으로써 증폭시켰다:

KF42: 5'-AAGCTTGTACGGCCCACAGAATGATGTCAC-3'

(서열 번호 153) 및

KF43: 5'-AAGCTTCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTT-3'

(서열 번호 154).

이와 같이 하여 수득된 대략 1kb의 PCR 생성물을 이. 콜라이 벡터 pGEMT Easy 내로 클로닝하여, 플라스미드 pSPM83을 생성시킨다.

벡터 pSPM83을 HindIII 제한 효소로 분해시켰다. 이러한 삽입물의 HindIII-HindIII 단편을 0.8% 아가로스 겔로부터 정제함으로써 분리시킨 다음, 가능한 각종 절제 가능한 캇세트를 수반하는 각종 플라스미드의 attL 서열과 attR 서열 사이에 위치한 HindIII 부위 내로 클로닝하여(실시예 9 및 27 참조), Ωacc에 상응하는 HindIII 단편을 aac 유전자 단독에 상응하는 HindIII 단편으로 대체시킨다. 이로써, att1aac, att2aac 및 att3aac 카세트를 수득할 수 있었다(목적하는 상에 따름; 실시예 9 참조). attL 서열과 attR 서열에 대한 aac 유전자의 배향에 따라서, att1aac+, att1aac-, att2aac+, att2aac-, att3aac+ 및 att3aac-를 구별한다(실시예 9에서 적응된 것과 동일한 규정에 따름).

실시예 29: orf28c 유전자에서 녹아웃을 나타내는 에스. 암보파시엔스 균주의 작제

orf28c 유전자는 절제 가능한 카세트 기술을 사용하여 불활성화시켰다. 절제 가능한 카세트 att3aac+(실시예 28 참조)를, 매트릭스로서 플라스미드 pSPM101[플라스미드 pSPM101은 att3aac+ 카세트를 EcoRV 단편으로서, pGP704Not의 독특한 EcoRV 부위 내로 클로닝시킨 벡터 pGP704Not로부터 유도된 플라스미드이다(참조: Chaveroche et al., 2000 and V.L. Miller & J.J. Mekalanos, 1988)]를 사용하고, 다음 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 증폭시켰다:

KF32:

5' CAACCGCTTGAGCTGCTCCATCAACTGCTGGGCCGAGGT ATCGCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAA 3' (서열 번호 155) 및

KF33:

5' TGGGTCCCGCCGCGCGGCACGACTTCGACTCGCTCGTCT ATCTGCCTCTTCGTCCCGAAGCAACT 3' (서열 번호 156).

이들 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한 39개 뉴클레오티드는 orf28c 유전자 내의 서열에 상응하는 서열을 포함하고, 3' 위치에 가장 근접하게 위치한 26개 뉴클레오티드(진하게 표시되고 밑줄쳐져 있음)는 절제 가능한 카세트 att3aac+의 말단 중의 하나의 서열에 상응한다.

이로써 수득된 PCR 생성물을 사용하여, 코스미드 pSPM36을 함유하는 하이퍼-재조합 이. 콜라이 균주 DY330[이러한 균주는 이의 염색체 내로 통합된 람다 파아지의 exo, bet 및 gam 유전자를 함유하고, 이들 유전자를 42℃에서 발현시키며, 이를 이. 콜라이 균주 KS272 대신 사용하였다(참조: Chaveroche et al., 2000)]를 형질전환시킨다. 이로써, 상기 세균을 상기 PCR 생성물로 전기천공시킴으로써 형질전환시키고, 이들 클론을 대상으로 하여 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 수득된 분해 프로필이, att3aac+ 카세트가 orf28c 유전자 내로 삽입된 경우, 즉 PCR 생성물의 말단과 표적 유전자의 말단 간에 상동 재조합이 실제로 수행된 경우에 예상된 프로필에 상응하는지를 확인할 목적으로, 상기 수득된 클론의 코스미드를 추출하고 BamHI 제한 효소로 분해하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 상기 작제물을 확인할 수도 있다. 코스미드가 예상 프로필을 갖는 클론을 선별하고, 상응하는 코스미드는 pSPM107로 명명하였다. 이러한 코스미드는 orf28c가 att3aac+ 카세트에 의해 개입중단된 pSPM36의 유도체이다. 상기 카세트의 삽입은 orf28c에서의 결실을 수반하는데, 개입중단은 orf28c의 28번 코돈에서 시작한다. 카세트 다음에, orf28c의 마지막 137 코돈이 존재한다.

코스미드 pSPM107을 제1 단계에서 이. 콜라이 균주 DH5α 내로 도입한 다음, 원형질체 형질전환에 의해 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2 내로 도입하였다. 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 아프라마이신-내성 클론을 각각, 아프라마이신(항생제 B) 함유 배지와 푸로마이신(항생제 A) 함유 배지 상에서 계대배양하였다(도 9 참조). 아프라마이신에 내성인 클론(ApraR)과 푸로마이신에 민감한 클론(PuroS)은 원칙적으로, 이중 유전자교환 사건이 발생하였으며 att3aac+ 카세트에 의해 개입중단된 orf28c 유전자를 함유하고 있는 것이다. 이들 클론을 보다 특별히 선별하고, orf28c의 야생형 복사물을 상기 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키는 것을 하이브리드화에 의해 확인하였다. 따라서, 수득된 클론의 총 DNA를 여러 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, att3aac+ 카세트에 상응하는 프로브와 하이브리드화시켜, 수득된 클론의 게놈 DNA 내의 예상된 유전자 자리에 상기 카세트가 존재하는지를 확인하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 유전자형을 확인할 수 있다.

예상된 특징을 나타내는 클론(orf28c::att3aac+)을 보다 특별히 선별하고, 이를 SPM107로 명명하였다. 따라서, 이 클론은 유전자형: orf28c::att3aac+을 가지며 SPM107로 명명되었다. 유전자의 배향 측면에서(도 3 참조), orf28c의 불활성화 효과를 연구하기 위해 상기 카세트를 절제할 필요는 없다. orf29가 orf28c와 반대 방향으로 배향된다는 사실은 이들 유전자가 동시에 전사되지 않는다는 것을 보여준다. 절제 가능한 카세트를 사용하면, 한편으론 선별 마커를 어떠한 순간에도, 특히 플라스미드 pOSV508로의 형질전환에 의해 제거할 수 있는 가능성이 생긴다.

스피라마이신 생산에 대한 orf28c 유전자의 활동 중지 효과를 시험하기 위해, 균주 SPM107의 스피라마이신 생산을 실시예 15에 기재된 기술에 의해 시험하였다. 이로써, 상기 균주는 스피라마이신 비-생산자 표현형을 가진다는 사실을 입증할 수 있었다. 이는 orf28c 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자라는 것을 입증해 준다.

실시예 30: orf31 유전자에서 녹아웃을 나타내는 에스. 암보파시엔스 균주의 작제

orf31 유전자는 절제 가능한 카세트 기술을 사용하여 불활성화시켰다. 절제 가능한 카세트 att3aac+는, 매트릭스로서 플라스미드 pSPM101을 사용하고, 올리고뉴클레오티드 EDR71 및 EDR72를 사용하여 PCR함으로써 증폭시켰다:

EDR71:

5'CGTCATCGACGTGCGGGGAAGACAGAGGTGATACCGATG ATCGCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAA 3'(서열 번호 157)

EDR72:

5'GCCAGCACCTCGTCCAGCTGCTCGACGGAACTCACCCCC ATCTGCCTCTTCGTCCCGAAGCAACT 3'(서열 번호 158).

이들 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한 39개 뉴클레오티드는 orf31 유전자 내의 서열에 상응하는 서열을 포함하고, 3' 위치에 가장 근접하게 위치한 26개 뉴클레오티드(진하게 표시되고 밑줄쳐져 있음)는 절제 가능한 카세트 att3aac+의 말단 중의 하나의 서열에 상응한다.

이로써 수득된 PCR 생성물을 사용하여, 문헌(참조: Chaveroche et al., 2000)에 기재된 바와 같은 플라스미드 pKOBEG 및 코스미드 pSPM36을 함유하는 이. 콜라이 균주 KS272를 형질전환시킨다(도 12 참조; 원칙적으로 플라스미드 pOS49.99는 코스미드 pSPM36으로 대체되어야 하고, 수득된 플라스미드는 더 이상 pSPM17이 아니지만, pSPM543이다). 이로써, 상기 세균을 이러한 PCR 생성물로 전기천공시킴으로써 형질전환시키고, 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 수득된 분해 프로필이, att3aac+ 카세트가 orf31 유전자 내로 삽입된 경우, 즉 PCR 생성물의 말단과 표적 유전자의 말단 간에 상동 재조합이 실제로 수행된 경우에 예상된 프로필에 상응하는지를 확인할 목적으로, 상기 수득된 클론의 코스미드를 추출하고 여러 제한 효소로 분해하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 상기 작제물을 확인할 수도 있다. 코스미드가 예상 프로필을 갖는 클론을 선별하고, 상응하는 코스미드는 pSPM543으로 명명하였다. 이러한 코스미드는 orf31가 att3aac+ 카세트에 의해 개입중단된 pSPM36의 유도체이다(도 12 참조). 상기 카세트의 삽입은 orf31에서의 결실을 수반하는데, 개입중단은 orf31의 36번 코돈에서 시작한다. 카세트 다음에, orf31의 마지막 33 코돈이 존재한다.

코스미드 pSPM543을 원형질체 형질전환에 의해 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2(상기 참조) 내로 도입하였다(참조: Kieser, T et al., 2000). 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 아프라마이신-내성 클론을 각각, 아프라마이신(항생제 B) 함유 배지와 푸로마이신(항생제 A) 함유 배지 상에서 계대배양하였다(도 9 참조). 아프라마이신에 내성인 클론(ApraR)과 푸로마이신에 민감한 클론(PuroS)은 원칙적으로, 이중 유전자교환 사건이 발생하였으며 att3aac+ 카세트에 의해 개입중단된 orf31 유전자를 함유하고 있는 것이다. 이들 클론을 보다 특별히 선별하고, orf31의 야생형 복사물을 상기 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키는 것을 하이브리드화에 의해 확인하였다. 따라서, 수득된 클론의 총 DNA를 여러 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, att3aac+ 카세트에 상응하는 프로브와 하이브리드화시켜, 수득된 클론의 게놈 DNA 내의 예상된 유전자 자리에 상기 카세트가 존재하는지를 확인하였다. 프로브로서, PCR에 의해 수득되고 orf31 유전자의 암호화 서열의 매우 큰 부분에 상응하는 DNA 단편을 사용하여 제2 하이브리드화를 수행하였다.

예상된 특징을 나타내는 클론(orf31::att3aac+)을 보다 특별히 선별하고, 이를 SPM543으로 명명하였다. 사실상, 2회 하이브리드화를 통하여, att3aac+ 카세트가 상기 클론의 게놈 내에 실제로 존재한다는 사실과, 이러한 클론의 게놈 내에서 야생형 유전자를 att3aac+ 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키고, 연속해서 이중 재조합 사건을 수행한 경우에 예상된 분해 프로필을 실제로 수득할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 클론은 유전자형: orf31::att3aac+을 갖고 SPM543으로 명명되었다. 유전자의 배향이 주어지면(도 3 참조), orf31의 불활성화 효과를 연구하기 위해 카세트를 절제할 필요가 없다. orf32c가 orf31와 반대 방향으로 배향된다는 사실은 이들 유전자가 동시에 전사되지 않는다는 것을 보여준다. 절제 가능한 카세트를 사용하면, 한편으론 선별 마커를 어떠한 순간에도, 특히 플라스미드 pOSV508으로의 형질전환에 의해 제거할 수 있는 가능성이 생긴다.

스피라마이신 생산에 대한 orf31 유전자의 활동 중지 효과를 시험하기 위해, 균주 SPM543의 스피라마이신 생산을 실시예 15에 기재된 기술에 의해 시험하였다. 이로써, 상기 균주는 스피라마이신 비-생산성 표현형을 가진다는 사실을 입증할 수 있었다. 이는 orf31 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자라는 것을 입증해 준다.

실시예 31: orf32c 유전자에서 녹아웃을 나타내는 에스. 암보파시엔스 균주의 작제

orf32c 유전자는 절제 가능한 카세트 기술을 사용하여 불활성화시켰다. 절제 가능한 카세트 att3aac+를, 매트릭스로서 플라스미드 pSPM101를 사용하고, 다음 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 증폭시켰다:

KF52:

5' GATCCGCCAGCCTCACGTCACGCCGCGCCGCCTCCCTGAC ATCGCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAA 3' (서열 번호 159) 및

KF53:

5' GAGGCGGACGTCGGTACGCGGTGGGAGCCGGAGTTCGACA ATCTGCCTCTTCGTCCCGAAGCAACT 3' (서열 번호 160).

이들 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한 40개 뉴클레오티드는 orf32c 유전자 내의 서열에 상응하는 서열을 포함하고, 3' 위치에 가장 근접하게 위치한 26개 뉴클레오티드(진하게 표시되고 밑줄쳐져 있음)는 절제 가능한 카세트 att3aac+의 말단 중의 하나의 서열에 상응한다.

이로써 수득된 PCR 생성물을 사용하여, 코스미드 pSPM36을 함유하는 하이퍼-재조합 이. 콜라이 균주 DY330(참조: Yu et al., 2000)를 형질전환시킨다. 이로써, 상기 세균을 전기천공시킴으로써 상기 PCR 생성물로 형질전환시키고, 이들 클론을 대상으로 하여 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 수득된 분해 프로필이, att3aac+ 카세트가 orf32c 유전자 내로 삽입된 경우, 즉 PCR 생성물의 말단과 표적 유전자의 말단 간에 상동 재조합이 실제로 수행된 경우에 예상된 프로필에 상응하는지를 확인할 목적으로, 상기 수득된 클론의 코스미드를 추출하고 BamHI 제한 효소로 분해하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 상기 작제물을 확인할 수도 있다. 코스미드가 예상 프로필을 갖는 클론을 선별하고, 상응하는 코스미드는 pSPM106으로 명명하였다. 이러한 코스미드는 orf32c가 att3aac+ 카세트에 의해 개입중단된 pSPM36의 유도체이다. 상기 카세트의 삽입은 orf32c에서의 결실을 수반하는데, 개입중단은 orf32c의 112번 코돈에서 시작한다. 카세트 다음에, orf32c의 마지막 91 코돈이 존재한다.

코스미드 pSPM106을 제1 단계에서 이. 콜라이 균주 DH5α 내로 도입한 다음, 형질전환에 의해 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주 OSC2 내로 도입하였다. 형질전환 후, 상기 클론을 대상으로 하여, 이들의 아프라마이신 내성에 대해 선별하였다. 이어서, 아프라마이신-내성 클론을 각각, 아프라마이신(항생제 B) 함유 배지와 푸로마이신(항생제 A) 함유 배지 상에서 계대배양하였다(도 9 참조). 아프라마이신에 내성인 클론(ApraR)과 푸로마이신에 민감한 클론(PuroS)은 원칙적으로, 이중 유전자교환 사건이 발생하였으며 att3aac+ 카세트에 의해 개입중단된 orf32c 유전자를 함유하고 있는 것이다. 이들 클론을 보다 특별히 선별하고, orf32c의 야생형 복사물을 상기 카세트에 의해 개입중단된 복사물로 대체시키는 것을 하이브리드화에 의해 확인하였다. 따라서, 수득된 클론의 총 DNA를 여러 효소로 분해시키고, 아가로스 겔 상에서 분리시키며, 막 위로 옮긴 다음, att3aac+ 카세트에 상응하는 프로브와 하이브리드화시켜, 수득된 클론의 게놈 DNA 내에 상기 카세트가 존재하는지를 확인하였다. 당업자에게 공지된 모든 방법, 특히 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR한 다음 PCR 생성물을 서열 분석하는 방법에 의해 유전자형을 확인할 수 있다.

예상된 특징을 나타내는 클론(orf32c::att3aac+)을 보다 특별히 선별하였다. 따라서, 이 클론은 유전자형: orf32c::att3aac+을 가지며 SPM106으로 명명되었다. 유전자의 배향 측면에서(도 3 참조), orf32c의 불활성화 효과를 연구하기 위해 상기 카세트를 절제할 필요는 없다. orf33이 orf32c와 반대 방향으로 배향된다는 사실은 이들 유전자가 동시에 전사되지 않는다는 것을 보여준다. 절제 가능한 카세트를 사용하면, 한편으론 선별 마커를 어떠한 순간에도, 특히 플라스미드 pOSV508로의 형질전환에 의해 제거할 수 있는 가능성이 생긴다.

스피라마이신 생산에 대한 orf32c 유전자의 활동 중지 효과를 시험하기 위해, 균주 SPM106의 스피라마이신 생산을 실시예 15에 기재된 기술에 의해 시험하였다. 이로써, 상기 균주는 스피라마이신-생산성 표현형을 가진다는 사실을 입증할 수 있었다. 이는 orf32c 유전자가 에스. 암보파시엔스에서 스피라마이신 생합성에 필수적인 유전자가 아니라는 것을 입증해 준다.

본원에 기재된 작제물 목록

약어 목록: Am: 앰피실린; Hyg: 히그로마이신; Sp: 스피라마이신; Ts: 티오스트렙톤; Cm: 클로람페니콜; Kn: 카나마이신; Apra: 아프라마이신.

생물학적 물질 기탁

다음 유기체들은 부다페스트 조약의 규정에 따라서, 2002년 7월 10일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(National Collection of Cultures and Microorganisms) (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France]에 기탁되었다.

- 균주 OSC2는 등록 번호 I-2908로 기탁되었다.

- 균주 SPM501은 등록 번호 I-2909로 기탁되었다.

- 균주 SPM502는 등록 번호 I-2910으로 기탁되었다.

- 균주 SPM507은 등록 번호 I-2911로 기탁되었다.

- 균주 SPM508은 등록 번호 I-2912로 기탁되었다.

- 균주 SPM509는 등록 번호 I-2913으로 기탁되었다.

- 균주 SPM21은 등록 번호 I-2914로 기탁되었다.

- 균주 SPM22는 등록 번호 I-2915로 기탁되었다.

- 균주 OS49.67은 등록 번호 I-2916으로 기탁되었다.

- 균주 OS49.107은 등록 번호 I-2917로 기탁되었다.

- 플라스미드 pOS44.4를 함유하는 에스케리챠 콜라이 균주 DH5α는 등록 번호 I-2918로 기탁되었다.

다음 유기체는 부다페스트 조약의 규정에 따라서, 2003년 2월 26일자로 기탁 기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France]에 기탁되었다.

- 균주 SPM502 pSPM525는 등록 번호 I-2977로 기탁되었다.

다음 유기체는 부다페스트 조약의 규정에 따라서, 2003년 10월 6일자로 기탁기관[Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM), Pasteur Institute, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France]에 기탁되었다.

- 균주 OSC2/pSPM75(2)는 등록 번호 I-3101로 기탁되었다.

인용된 모든 공개 공보 및 특허는 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다.

관계 서적 목록:

<110> Aventis Pharma SA; CNRS <120> Polypeptides involved in spiramycin biosynthesis, nucleotide sequences encoding said polypeptides and uses thereof <130> Spiramycin biosynthesis (2) <150> FR 0212489 <151> 2002-10-08 <150> FR 0302439 <151> 2003-02-27 <150> US 60/493,490 <151> 2003-08-07 <160> 161 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30943 <212> DNA <213> Streptomyces ambofaciens <400> 1 gaattcggca attcccgggg cgccgggaaa ccggcacgcc attccgacca cggcaacggc 60 gtcggaccgg tcgtcactgc gggaaatcgc gagttctcca gacacctgca tccctcatat 120 gttcgccgta ccacgccgtg gcttttctgc cttttcttga tcttcccgag cgtacagcgg 180 gcgaactgcc gggcgacagg aacggccggt gaacgacaat caattgtgtc aagttcggag 240 attgtccacc gattctcgtc accggagacg gcgcgggatc atgcgggacc acacggcatc 300 gcaccaggtc cgcagggtcg gcgctccgac gtcccggccg gtcgcgcact ccggtgacct 360 gcacgcggag tcctgggcga gcggagaaga tttcagtacc tcgcggcgcg ggacaaccac 420 ttcgcgacga atatgtcagg tctccccgag cggtccgtgc cgccccgccc tgacccgtcc 480 gcgcccgtcc cgctccgccc cggtcgtcat ctcggccgga 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Glu His Val Gly Gly Val Pro Pro Pro Val Ile Asp Gln Glu Ala Phe 340 345 350 Ala Arg Phe Leu Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Arg Tyr Leu Arg Ala Ala 355 360 365 Arg Leu Arg Tyr Lys Arg Arg Arg Asp His Leu Met Gly Glu Leu Ala 370 375 380 Ala Ser Leu Pro Gly Phe Gln Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Phe His 385 390 395 400 Leu Leu Leu Ser Leu Thr Asp Cys Ser Ala Pro Thr Val Val Arg Glu 405 410 415 Ala Ala Arg Arg Asp Val Arg Leu Ala Asp Leu Asp Ala Tyr Arg Met 420 425 430 Ala Arg Ala Glu His His Pro Thr Ala Arg Ala Gly Asp Ser Gly Gly 435 440 445 Ala Arg Ala Val Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Val Leu Gly Tyr Gly 450 455 460 Asn Leu Ala Asp His Ala Val Pro Gly Ala Val Arg Arg Leu Ala Gln 465 470 475 480 Ala Ile Asp Ala Ala Arg Arg His Asp Arg Arg His Val Asp Ala Gly 485 490 495 Arg Ala Gly Glu Arg Ala Asp 500 <210> 147 <211> 276 <212> DNA <213> Streptomyces ambofaciens <220> <221> CDS <222> (1)..(276) <400> 147 gtg gcg gag acg gac cgg cat ctc gac cag cgg ctg gag cag gcc atc 48 Val Ala Glu Thr Asp Arg His Leu Asp Gln Arg Leu Glu Gln Ala Ile 1 5 10 15 atg gac ctg ctg gag cga cgg gcg gcc act gcc tcg atc tgt ccg tcc 96 Met Asp Leu Leu Glu Arg Arg Ala Ala Thr Ala Ser Ile Cys Pro Ser 20 25 30 gac gcc gcg cgt cgg gtc cac gag ggt gac gac gag ggc tgg cga gcc 144 Asp Ala Ala Arg Arg Val His Glu Gly Asp Asp Glu Gly Trp Arg Ala 35 40 45 ctg ctg gaa ccc gcg cgc cga gcg gcc tgg cgt ctg gtg ggg tcc ggc 192 Leu Leu Glu Pro Ala Arg Arg Ala Ala Trp Arg Leu Val Gly Ser Gly 50 55 60 gag gtc gag gtg acc cag gcc ggc cgg ccc gtc acg cag gcc gag gcc 240 Glu Val Glu Val Thr Gln Ala Gly Arg Pro Val Thr Gln Ala Glu Ala 65 70 75 80 cgc ggg ccc gtc cgc att cgt cgg gcg ggt tcc tga 276 Arg Gly Pro Val Arg Ile Arg Arg Ala Gly Ser 85 90 <210> 148 <211> 91 <212> PRT <213> Streptomyces ambofaciens <400> 148 Val Ala Glu Thr Asp Arg His Leu Asp Gln Arg Leu Glu Gln Ala Ile 1 5 10 15 Met Asp Leu Leu Glu Arg Arg Ala Ala Thr Ala Ser Ile Cys Pro Ser 20 25 30 Asp Ala Ala Arg Arg Val His Glu Gly Asp Asp Glu Gly Trp Arg Ala 35 40 45 Leu Leu Glu Pro Ala Arg Arg Ala Ala Trp Arg Leu Val Gly Ser Gly 50 55 60 Glu Val Glu Val Thr Gln Ala Gly Arg Pro Val Thr Gln Ala Glu Ala 65 70 75 80 Arg Gly Pro Val Arg Ile Arg Arg Ala Gly Ser 85 90 <210> 149 <211> 1236 <212> DNA <213> Streptomyces ambofaciens <220> <221> CDS <222> (1)..(1236) <400> 149 ctg cag ata tac gac tgc tgg ggc ggg agc aat cag cag tgg acg ttg 48 Leu Gln Ile Tyr Asp Cys Trp Gly Gly Ser Asn Gln Gln Trp Thr Leu 1 5 10 15 acg gac gac cgt cgg ctg acc gtg tac ggc aac aag tgc ctg gac gtt 96 Thr Asp Asp Arg Arg Leu Thr Val Tyr Gly Asn Lys Cys Leu Asp Val 20 25 30 ccg ggt cac gcc acc aca ccc ggg acg cgg gtg cag atc tgg agc tgt 144 Pro Gly His Ala Thr Thr Pro Gly Thr Arg Val Gln Ile Trp Ser Cys 35 40 45 tcc ggc ggt gcg aac cag cag tgg cgg gtg aac tcc gac ggc acg gtc 192 Ser Gly Gly Ala Asn Gln Gln Trp Arg Val Asn Ser Asp Gly Thr Val 50 55 60 gtc ggc gtg gag tcc ggg ctg tgc ctg gag gcc gcg ggc gcc ggt acg 240 Val Gly Val Glu Ser Gly Leu Cys Leu Glu Ala Ala Gly Ala Gly Thr 65 70 75 80 gcc aac ggc acg gcg gtg cag atc ggg acg tgc gtc ggt ggc agc ggg 288 Ala Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Gly Thr Cys Val Gly Gly Ser Gly 85 90 95 cag aag tgg tcc ggc ctg acc ggg acg ccc ccg acg gac ggg gcg tgt 336 Gln Lys Trp Ser Gly Leu Thr Gly Thr Pro Pro Thr Asp Gly Ala Cys 100 105 110 gcc ctt ccg tcg gcg tac cgg tgg tcg tcg acg ggt gtg ctg gcg cag 384 Ala Leu Pro Ser Ala Tyr Arg Trp Ser Ser Thr Gly Val Leu Ala Gln 115 120 125 ccg gcg aac ggg tgg gcg gcg gtc aag gac ttc acc acc gtg acc cac 432 Pro Ala Asn Gly Trp Ala Ala Val Lys Asp Phe Thr Thr Val Thr His 130 135 140 aac ggc aag cac ctg gtc tac gcg tcg aac gtg tcg ggg tcg tcc tac 480 Asn Gly Lys His Leu Val Tyr Ala Ser Asn Val Ser Gly Ser Ser Tyr 145 150 155 160 ggc tcg atg atg ttc agc ccc ttc acg aac tgg tcg gac atg gcg tcg 528 Gly Ser Met Met Phe Ser Pro Phe Thr Asn Trp Ser Asp Met Ala Ser 165 170 175 gcc ggc cag acc ggg atg agt cag gcg gcg gtg gcg ccc acc ctg ttc 576 Ala Gly Gln Thr Gly Met Ser Gln Ala Ala Val Ala Pro Thr Leu Phe 180 185 190 tac ttc gcg ccc aag aac gtc tgg gtg ctg gcg tac cag tgg ggc gcg 624 Tyr Phe Ala Pro Lys Asn Val Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ala 195 200 205 tgg ccc ttc gtc tac cgc acg tcc agc gac ccg gcc aac ccc aac ggc 672 Trp Pro Phe Val Tyr Arg Thr Ser Ser Asp Pro Ala Asn Pro Asn Gly 210 215 220 tgg tcg gct ccg cag ccg ttg ttc acc ggg agc atc tca gga tcc gac 720 Trp Ser Ala Pro Gln Pro Leu Phe Thr Gly Ser Ile Ser Gly Ser Asp 225 230 235 240 acc ggc ccg atc gac cag acc ctg atc gcc gac gga cag aac atg tac 768 Thr Gly Pro Ile Asp Gln Thr Leu Ile Ala Asp Gly Gln Asn Met Tyr 245 250 255 ctg ttc ttc gcc ggt gac aac ggc aag atc tac cgg gcg agc atg ccg 816 Leu Phe Phe Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg Ala Ser Met Pro 260 265 270 atc ggg aac ttc ccg ggc agc ttc ggc tcg tcg tac acg acg atc atg 864 Ile Gly Asn Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Ser Tyr Thr Thr Ile Met 275 280 285 agc gac acg aag gcc aac ctg ttc gag ggc gtg cag gtc tac aag gtt 912 Ser Asp Thr Lys Ala Asn Leu Phe Glu Gly Val Gln Val Tyr Lys Val 290 295 300 cag ggc cag aac cag tac ctg atg atc gtc gag gcg atg ggc gcg aac 960 Gln Gly Gln Asn Gln Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Met Gly Ala Asn 305 310 315 320 gga cgc tac ttc cgt tcc ttc acg gcc tcc agc ctg agc ggc tcg tgg 1008 Gly Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Ser Gly Ser Trp 325 330 335 acc ccg cag gcc gcg agc gag agc aac ccc ttc gcg ggc aag gcc aac 1056 Thr Pro Gln Ala Ala Ser Glu Ser Asn Pro Phe Ala Gly Lys Ala Asn 340 345 350 agc ggg gcc acc tgg acc aac gac atc agc cac ggt gac ctg gtc cgc 1104 Ser Gly Ala Thr Trp Thr Asn Asp Ile Ser His Gly Asp Leu Val Arg 355 360 365 gac aac ccc gac cag acc atg acc gtc gac ccc tgc aac ctg cgg ttc 1152 Asp Asn Pro Asp Gln Thr Met Thr Val Asp Pro Cys Asn Leu Arg Phe 370 375 380 ctc tac cag ggc aag tca ccc acc gcg ggc ggc ccc tac gac cag ctg 1200 Leu Tyr Gln Gly Lys Ser Pro Thr Ala Gly Gly Pro Tyr Asp Gln Leu 385 390 395 400 ccg tgg cgg ccg ggt gtg ctc acc ctg cgg cgc tga 1236 Pro Trp Arg Pro Gly Val Leu Thr Leu Arg Arg 405 410 <210> 150 <211> 411 <212> PRT <213> Streptomyces ambofaciens <400> 150 Leu Gln Ile Tyr Asp Cys Trp Gly Gly Ser Asn Gln Gln Trp Thr Leu 1 5 10 15 Thr Asp Asp Arg Arg Leu Thr Val Tyr Gly Asn Lys Cys Leu Asp Val 20 25 30 Pro Gly His Ala Thr Thr Pro Gly Thr Arg Val Gln Ile Trp Ser Cys 35 40 45 Ser Gly Gly Ala Asn Gln Gln Trp Arg Val Asn Ser Asp Gly Thr Val 50 55 60 Val Gly Val Glu Ser Gly Leu Cys Leu Glu Ala Ala Gly Ala Gly Thr 65 70 75 80 Ala Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Gly Thr Cys Val Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gln Lys Trp Ser Gly Leu Thr Gly Thr Pro Pro Thr Asp Gly Ala Cys 100 105 110 Ala Leu Pro Ser Ala Tyr Arg Trp Ser Ser Thr Gly Val Leu Ala Gln 115 120 125 Pro Ala Asn Gly Trp Ala Ala Val Lys Asp Phe Thr Thr Val Thr His 130 135 140 Asn Gly Lys His Leu Val Tyr Ala Ser Asn Val Ser Gly Ser Ser Tyr 145 150 155 160 Gly Ser Met Met Phe Ser Pro Phe Thr Asn Trp Ser Asp Met Ala Ser 165 170 175 Ala Gly Gln Thr Gly Met Ser Gln Ala Ala Val Ala Pro Thr Leu Phe 180 185 190 Tyr Phe Ala Pro Lys Asn Val Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ala 195 200 205 Trp Pro Phe Val Tyr Arg Thr Ser Ser Asp Pro Ala Asn Pro Asn Gly 210 215 220 Trp Ser Ala Pro Gln Pro Leu Phe Thr Gly Ser Ile Ser Gly Ser Asp 225 230 235 240 Thr Gly Pro Ile Asp Gln Thr Leu Ile Ala Asp Gly Gln Asn Met Tyr 245 250 255 Leu Phe Phe Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg Ala Ser Met Pro 260 265 270 Ile Gly Asn Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Ser Tyr Thr Thr Ile Met 275 280 285 Ser Asp Thr Lys Ala Asn Leu Phe Glu Gly Val Gln Val Tyr Lys Val 290 295 300 Gln Gly Gln Asn Gln Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Met Gly Ala Asn 305 310 315 320 Gly Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Ser Gly Ser Trp 325 330 335 Thr Pro Gln Ala Ala Ser Glu Ser Asn Pro Phe Ala Gly Lys Ala Asn 340 345 350 Ser Gly Ala Thr Trp Thr Asn Asp Ile Ser His Gly Asp Leu Val Arg 355 360 365 Asp Asn Pro Asp Gln Thr Met Thr Val Asp Pro Cys Asn Leu Arg Phe 370 375 380 Leu Tyr Gln Gly Lys Ser Pro Thr Ala Gly Gly Pro Tyr Asp Gln Leu 385 390 395 400 Pro Trp Arg Pro Gly Val Leu Thr Leu Arg Arg 405 410 <210> 151 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description: Oligonucleotide KF36 <400> 151 ttgccgtagc cgaggaccag cg 22 <210> 152 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description: Oligonucleotide KF37 <400> 152 cacatggccc tggaggaccc tg 22 <210> 153 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description: Oligonucleotide KF42 <400> 153 aagcttgtac ggcccacaga atgatgtcac 30 <210> 154 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description: Oligonucleotide KF43 <400> 154 aagcttcgac taccttggtg atctcgcctt 30 <210> 155 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description: Oligonucleotide KF32 <400> 155 caaccgcttg agctgctcca tcaactgctg ggccgaggta tcgcgcgcgc ttcgttcggg 60 acgaa 65 <210> 156 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description: Oligonucleotide KF33 <400> 156 tgggtcccgc cgcgcggcac gacttcgact cgctcgtcta tctgcctctt cgtcccgaag 60 caact 65 <210> 157 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description: Oligonucleotide EDR71 <400> 157 cgtcatcgac gtgcggggaa gacagaggtg ataccgatga tcgcgcgcgc ttcgttcggg 60 acgaa 65 <210> 158 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description: Oligonucleotide EDR72 <400> 158 gccagcacct cgtccagctg ctcgacggaa ctcaccccca tctgcctctt cgtcccgaag 60 caact 65 <210> 159 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description: Oligonucleotide KF52 <400> 159 gatccgccag cctcacgtca cgccgcgccg cctccctgac atcgcgcgcg cttcgttcgg 60 gacgaa 66 <210> 160 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequnce <220> <223> Artificial sequence description: Oligonucleotide KF53 <400> 160 gaggcggacg tcggtacgcg gtgggagccg gagttcgaca atctgcctct tcgtcccgaa 60 gcaact 66 <210> 161 <211> 2540 <212> DNA <213> Streptomyces ambofaciens <400> 161 ctgcagggcg cccacggggt ggcggtcgta tcggaactcg gcgtcgtagt cgtcctccag 60 caccaggccg tcgacctcgc gggcccaggc gaccagctcg ccgcgacggg ccggggcgag 120 gaccacaccg gtcgggaact ggtgggcggg agcgacgatc accgaccgga cctgaggcgc 180 gcgccgcagc aggtcgaccc gcaggccgtc gccgtccacg ggaaccggga cgggcaccag 240 cccctccgcc ccgaccgtgg cgctcagccg cgaccagcca gggtcctcca gggccatgtg 300 ggtgtggccc tcggtccgca ggacccggca cagcctgcgc accgcgtcca gcgtgcccgc 360 gcagacgacg agctgccggg cttccagcga cgcgccgcgt ccccgcacga ggtaggccgc 420 gagccgctgc cggagccggg cgagaccggc cggatcgggg tagccgagct cgccccaggt 480 cagtgcgccg gtggcctccc gcaccgcgtc cgcccaccgt ccgcggggaa aggcccgcag 540 gtcgggtatg ccgggcagca tgtcgaactc cggctcccac cgcgtaccga cgtccgcctc 600 gggcgtcacc ggagcgggga cggcctgcgc cctgacccgg gtggccgagc cgctgcgcgc 660 ctccaggtac ccctccgcga cgagctgcgc gtaggcctcc gtcaccaccc accgcgagca 720 gcccaggtcc gccgccagcg ccctgctcgg cggcagcgcg ctgccggagg cgatccgccc 780 accggtcacc gccgcccgca gggcacggct cagccggacg tgcagcgggc cgtccgccgg 840 cccgcccagt tcgagaaagg ttccccatgc cgggtcggtc cggtcgtcgc ccacggcagc 900 cgatgctacc caccgccccg cgacggccgg gcggcggcgt ccacgggccc ggtgcacact 960 ggatggcgtg gcggagacgg accggcatct cgaccagcgg ctggagcagg ccatcatgga 1020 cctgctggag cgacgggcgg ccactgcctc gatctgtccg tccgacgccg cgcgtcgggt 1080 ccacgagggt gacgacgagg gctggcgagc cctgctggaa cccgcgcgcc gagcggcctg 1140 gcgtctggtg gggtccggcg aggtcgaggt gacccaggcc ggccggcccg tcacgcaggc 1200 cgaggcccgc gggcccgtcc gcattcgtcg ggcgggttcc tgacggctcg atccgaaggc 1260 ggaactcccg tgccccggcg gcacgggagc tcgacgccgg gaggtcagcg ccgcagggtg 1320 agcacacccg gccgccacgg cagctggtcg taggggccgc ccgcggtggg tgacttgccc 1380 tggtagagga accgcaggtt gcaggggtcg acggtcatgg tctggtcggg gttgtcgcgg 1440 accaggtcac cgtggctgat gtcgttggtc caggtggccc cgctgttggc cttgcccgcg 1500 aaggggttgc tctcgctcgc ggcctgcggg gtccacgagc cgctcaggct ggaggccgtg 1560 aaggaacgga agtagcgtcc gttcgcgccc atcgcctcga cgatcatcag gtactggttc 1620 tggccctgaa ccttgtagac ctgcacgccc tcgaacaggt tggccttcgt gtcgctcatg 1680 atcgtcgtgt acgacgagcc gaagctgccc gggaagttcc cgatcggcat gctcgcccgg 1740 tagatcttgc cgttgtcacc ggcgaagaac aggtacatgt tctgtccgtc ggcgatcagg 1800 gtctggtcga tcgggccggt gtcggatcct gagatgctcc cggtgaacaa cggctgcgga 1860 gccgaccagc cgttggggtt ggccgggtcg ctggacgtgc ggtagacgaa gggccacgcg 1920 ccccactggt acgccagcac ccagacgttc ttgggcgcga agtagaacag ggtgggcgcc 1980 accgccgcct gactcatccc ggtctggccg gccgacgcca tgtccgacca gttcgtgaag 2040 gggctgaaca tcatcgagcc gtaggacgac cccgacacgt tcgacgcgta gaccaggtgc 2100 ttgccgttgt gggtcacggt ggtgaagtcc ttgaccgccg cccacccgtt cgccggctgc 2160 gccagcacac ccgtcgacga ccaccggtac gccgacggaa gggcacacgc cccgtccgtc 2220 gggggcgtcc cggtcaggcc ggaccacttc tgcccgctgc caccgacgca cgtcccgatc 2280 tgcaccgccg tgccgttggc cgtaccggcg cccgcggcct ccaggcacag cccggactcc 2340 acgccgacga ccgtgccgtc ggagttcacc cgccactgct ggttcgcacc gccggaacag 2400 ctccagatct gcacccgcgt cccgggtgtg gtggcgtgac ccggaacgtc caggcacttg 2460 ttgccgtaca cggtcagccg acggtcgtcc gtcaacgtcc actgctgatt gctcccgccc 2520 cagcagtcgt atatctgcag 2540

Claims

폴리뉴클레오티드의 서열이

(a) 서열 번호 111 또는 141의 서열 중의 하나, 또는

(b) 유전 암호 축퇴성으로 인해 서열 (a)로부터 수득되는 서열들 중의 하나인, 스피라마이신 생합성에 관여하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
삭제
제1항에 있어서, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 세균으로부터 분리되는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 청구된 바와 같은 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 생성된 폴리펩티드.
제1항에 청구된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA.
제5항에 있어서, 박테리오파아지, 플라스미드, 파아지미드, 통합(integrative) 벡터, 포스미드, 코스미드, 셔틀 벡터, BAC 및 PAC 중에서 선택되는 벡터 내에 포함되어 있는 재조합 DNA.
제6항에 있어서, pSPM36, pSPM58, pSPM74, pSPM75, 및 pSPM107 중에서 선택되는 재조합 DNA.
제4항에 청구된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
적합한 발현 벡터와, 제4항에 청구된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 허용하는 숙주 세포를 포함하는 조합물.
제9항에 있어서, 이. 콜라이(E. coli) 세균에서의 발현 시스템, 곤충 세포에서의 발현을 허용하는 바쿨로바이러스 발현 시스템, 효모 세포에서의 발현을 허용하는 발현 시스템, 및 포유류 세포에서의 발현을 허용하는 발현 시스템 중에서 선택되는 조합물.
제1항, 제5항, 제6항, 제7항 및 제8항 중의 어느 한 항에 청구된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 재조합 DNA 또는 하나 이상의 발현 벡터가 도입된 숙주 세포.
a) 제4항에 청구된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 적합한 벡터 내로 삽입하는 단계;

b) 단계 a)의 벡터로 미리 형질전환 또는 형질감염시킨 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;

c) 이와 같이 조건화된 배양 배지 또는 세포 추출물을 회수하는 단계; 및

d) 단계 c)에서 수득된 세포 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 폴리펩티드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 제4항에 청구된 바와 같은 폴리펩티드의 생성 방법.
하나 이상의 매크롤리드를 생산하는 미생물에서, 상기 매크롤리드의 생합성에 관여하는 하나 이상의 단백질의 기능을 제1항에 청구된 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자에서 수행되는 돌연변이 유발에 의해 불활성화시킴으로써 수득되는, 하나 이상의 매크롤리드에 대한 생합성 경로의 특정 단계에서 차단된 미생물.
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제13항에 있어서, 돌연변이 유발이 서열 번호 111 또는 141의 서열 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 유전자에서 수행되는 미생물.
a) 제13항에 청구된 바와 같은 미생물을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;

b) 이와 같이 조건화된 배양 배지 또는 세포 추출물을 회수하는 단계; 및

c) 단계 b)에서 수득된 세포 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 매크롤리드 생합성 중간체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 상기 매크롤리드 생합성 중간체의 제조 방법.
생합성 중간체를 제20항의 방법에 따라서 제조하고, 이로써 제조된 중간체를 변형시키는, 매크롤리드로부터 유도된 분자의 제조 방법.
제21항에 있어서, 중간체를 기질로서 사용함으로써 이러한 중간체를 변형시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 상기 미생물 내로 도입하는 제조 방법.
제21항에 있어서, 매크롤리드가 스피라마이신인 제조 방법.
제21항에 있어서, 사용된 미생물이 에스. 암보파시엔스의 균주인 제조 방법.
제1항에 청구된 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자에서 유전자 변형을 지니고 있거나, 제1항에 청구된 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자를 과발현하거나, 제1항에 청구된 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자에서 유전자 변형을 지니고 있고 제1항에 청구된 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자를 과발현하는, 매크롤리드-생산 돌연변이체 미생물.
제25항에 있어서, 고려 중인 유전자의 과발현이, 매크롤리드-생산 미생물을 제5항 또는 제8항에 청구된 바와 같은 재조합 DNA 작제물로 형질전환시켜 상기 유전자의 과발현을 허용함으로써 획득되는, 돌연변이체 미생물.
제25항에 있어서, 유전자 변형이, 서열 번호 111 또는 141 중 하나 이상의 서열 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 수득되는 서열 중의 하나를 포함하는 하나 이상의 유전자에서 수행되는, 돌연변이체 미생물.
제25항에 있어서, 서열 번호 111 또는 141 중 하나 이상의 서열 또는 유전 암호 축퇴성으로 인해 이로부터 수득되는 서열 중의 하나를 포함하는 하나 이상의 유전자를 과발현하는 돌연변이체 미생물.
제25항에 있어서, 스트렙토마이세스 속 세균인 돌연변이체 미생물.
제25항에 있어서, 매크롤리드가 스피라마이신인 돌연변이체 미생물.
제25항에 있어서, 에스. 암보파시엔스 균주인 돌연변이체 미생물.
a) 제25항에 청구된 바와 같은 미생물을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;

b) 이와 같이 조건화된 배양 배지 또는 세포 추출물을 회수하는 단계; 및

c) 단계 b)에서 수득된 세포 추출물로부터 또는 상기 배양 배지로부터 생성된 매크롤리드(들)를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 매크롤리드의 생성 방법.
제1항에 청구된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 중의 하나에 상보적인 폴리뉴클레오티드.
2003년 10월 6일자로 기탁 기관{Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)[National Collection of Cultures and Microorganisms] Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France}에 등록 번호 I-3101로 기탁된 균주 OSC2/pSPM75(1) 또는 균주 OSC2/pSPM75(2)인, 스트렙토마이세스 암보파시엔스 균주.
서열 번호 112 또는 서열 번호 142의 서열로 이루어진 폴리펩티드.
서열 번호 142의 서열로 이루어진 폴리펩티드.
스트렙토마이세스 암보파시엔스에서 제35항 또는 제36항에 청구된 바와 같은 폴리펩티드의 발현을 허용하는 발현 벡터.
제37항에 있어서, 플라스미드 pSPM75인 발현 벡터.
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