FR2845394A1 - Polypeptides impliques dans la biosynthese des spiramycines, sequences nucleotidiques codant ces polypeptides et leurs applications - Google Patents

Polypeptides impliques dans la biosynthese des spiramycines, sequences nucleotidiques codant ces polypeptides et leurs applications Download PDF

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Helene Dominguez
Rongere Emmanuelle Darbon
Claude Gerbaud
Anne Gondran
Fatma Karray
Patricia Lacroix
Mermet Bouvier Nat Oestreicher
Jean Luc Pernodet
Karine Tuphile
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Aventis Pharma SA
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Abstract

La présente invention concerne l'isolement et l'identification de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse. L'invention est également relative à un procédé de production de ces polypeptides. Elle est également relative à l'utilisation de ces gènes dans le but d'augmenter les taux de production et la pureté de la spiramycine produite. L'invention concerne notamment un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III et l'utilisation d'un tel micoorganisme. L'invention a également trait à l'utilisation des gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines pour la construction de mutants pouvant conduire à la synthèse de nouveaux antibiotiques ou à des formes dérivées de spiramycines. L'invention concerne encore les molécules produites grâce à l'expression de ces gènes et des compositions pharmacologiquement actives d'une molécule produite grâce à l'expression de tels gènes.

Description

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POLYPEPTIDES IMPLIQUES DANS LA BIOSYNTHESE DES SPIRAMYCINES. SEQUENCES NUCLEOTIDIOUES CODANT CES POLYPEPTIDES ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention concerne l'isolement et l'identification de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse. Elle est également relative à l'utilisation de ces gènes dans le but d'augmenter les taux de production et la pureté de la spiramycine produite.
L'invention a également trait à l'utilisation de ces gènes pour la construction de mutants pouvant conduire à la synthèse de nouveaux antibiotiques ou à des formes dérivées de spiramycines. L'invention concerne encore les molécules produites grâce à l'expression de ces gènes et enfin des compositions pharmacologiquement actives d'une molécule produite grâce à l'expression de tels gènes.
Les Streptomyces sont des bactéries filamenteuses Gram positif du sol. Elles jouent un rôle important dans la décomposition et la minéralisation des matières organiques grâce à la grande diversité des enzymes dégradatives qu'elles sécrètent. Elles présentent des phénomènes de différenciations morphologiques uniques chez les procaryotes s'accompagnant d'une différenciation métabolique caractérisée par la production de métabolites secondaires présentant une extraordinaire diversité de structures chimiques et d'activités biologiques. Parmi ces métabolites, on retrouve les spiramycines produites à l'état naturel par la bactérie Streptomyces ambofaciens.
La spiramycine est un antibiotique de la famille des macrolides utile aussi bien en médecine vétérinaire qu'en médecine humaine. Les macrolides sont caractérisés par la présence d'un cycle lactone sur lequel sont greffés un ou plusieurs sucres. Streptomyces ambofaciens produit à l'état naturel la spiramycine I, II et III (cf. Figure 1), cependant l'activité antibiotique de la spiramycine I est nettement supérieure à celle des
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spiramycines II et III (Liu et al., 1999). La molécule de spiramycine I est constituée d'un macro-cycle lactonique, appelle platénolide et de trois sucres : la forosamine, le mycaminose et le mycarose (cf. Figure 1). L'activité antibiotique des spiramycines est due à une inhibition de la synthèse protéique chez les procaryotes par un mécanisme impliquant la liaison de l'antibiotique au ribosome bactérien.
Certains composés membres de la famille des macrolides et possédant également un cycle lactone ont donné lieu à des utilisations hors du domaine des antibiotiques.
Ainsi le produit FK506 a des effets immunosuppresseurs et offre des perspectives d'application thérapeutique dans le domaine de la transplantation d'organe, de l'arthrite rhumatoïde et plus généralement dans des pathologies liées à des réactions autoimmunes. D'autres macrolides comme l'avermectine ont des activités insecticides et anti-helminthiques.
De nombreuses voies de biosynthèse, concernant des antibiotiques appartenant à des classes variées ainsi que d'autres métabolites secondaires (pour une revue, Chater K.
1990), ont à ce jour déjà été étudiées chez les Streptomycètes. Cependant, la connaissance des voies de biosynthèse des spiramycines n'est que très partielle à ce jour.
La biosynthèse des spiramycines est un processus complexe comportant de nombreuses étapes et impliquant de nombreuses enzymes (Omura et al., 1979a, Omura et al., 1979b). Les spiramycines appartiennent à la large classe des polyketides qui regroupe des molécules complexes particulièrement abondantes dans les microorganismes du sol. Ces molécules sont regroupées non pas par analogie de structure mais par une certaine similarité au niveau d'étapes de leur voie de biosynthèse.
En effet, les polyketides sont produits par une série complexe de réactions mais possèdent en commun d'avoir dans leur voie de biosynthèse une série de réactions catalysées par une ou des enzymes appelées polyketides synthases (PKS). Chez Streptomyces ambofaciens, la biosynthèse du macro-cycle lactonique des spiramycines (platénolide) est réalisée par une série de huit modules codés par cinq gènes PKS différents (Kuhstoss S., 1996, brevet US 5,945,320). Les spiramycines sont obtenues à partir de ce cycle lactone. Cependant, les diverses étapes et enzymes impliquées dans la
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synthèse des sucres, ainsi que leur liaison au cycle lactone et la modification de ce cycle pour l'obtention des spiramycines restent encore inconnues à ce jour.
Le brevet US 5,514,544 décrit le clonage d'une séquence appelée srmR chez Streptomyces ambofaciens. Il est fait l'hypothèse dans ce brevet que le gène srmR code une protéine régulatrice de la transcription des gènes impliqués dans la biosynthèse des macrolides.
En 1987, Richardson et collaborateurs (Richardson et al., 1987) ont montré que la résistance à la spiramycine de S. ambofaciens est conférée par au moins trois gènes, ces derniers ont été appelés srmA, srmB et srmC. Le brevet US 4,886,757 décrit plus particulièrement la caractérisation d'un fragment d'ADN de S. ambofaciens contenant le gène srmC. Cependant la séquence de ce gène n'a pas été divulguée. En 1990, Richardson et collaborateurs (Richardson et al., 1990) ont posé l'hypothèse de l'existence de trois gènes de biosynthèse de la spiramycine proche de srmB. Le brevet US 5,098,837 rapporte le clonage de cinq gènes potentiellement impliqués dans la
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biosynthèse de la spiramycine. Ces gènes ont été baptisés srd, some, sYmF, srmG et srmH.
Une des difficultés majeures dans la production de composés tels que les spiramycines réside dans le fait que de très grands volumes de fermentation sont nécessaires à la production d'une quantité relativement faible de produit. Il est donc souhaitable de pouvoir augmenter l'efficacité de production de telles molécules afin d'en diminuer les coûts de production.
La voie de biosynthèse des spiramycines est un processus complexe et il serait souhaitable d'identifier et de supprimer les réactions parasites qui pourraient exister au cours de ce processus. Le but d'une telle manipulation est d'obtenir un antibiotique plus pur et/ou une amélioration de la productivité. A ce sujet, Streptomyces ambofaciens produit à l'état naturel la spiramycine I, II et III (cf. Figure 1), cependant l'activité antibiotique de la spiramycine 1 est nettement supérieure à celle des spiramycines II et
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III (Liu et al., 1999). Il serait donc souhaitable de pouvoir disposer de souches ne produisant que de la spiramycine I.
En raison de l'intérêt commercial des antibiotiques macrolides, l'obtention de nouveaux dérivés, notamment d'analogues de spiramycines ayant des propriétés avantageuses est intensivement recherchée. Il serait souhaitable de pouvoir générer en quantité suffisante les intermédiaires de biosynthèse de la voie de biosynthèse des spiramycines ou des dérivés des spiramycines notamment dans le but de fabriquer des antibiotiques hybrides dérivés des spiramycines.
Description générale de l'invention
La présente invention résulte du clonage de gènes dont le produit intervient dans la biosynthèse des spiramycines. L'invention concerne tout d'abord de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse.
Les gènes de la voie de biosynthèse et les séquences codantes associées ont été clones et la séquence d'ADN de chacun a été déterminée. Les séquences codantes
Figure img00040001

clonées seront désignées par la suite ol fl *c, orf2*c, or/3*c, orf4*c, orf5*, or/6*, orf7*c, or/8*, or/9*, or/70* or/2, or/2, or/3, orf4, orf5, or/6, or/7, oie, orf9c, orflO, O1fJ1e, or/12, orf!3c, orj74, orfi5c, or/16, or/17, or/18, or/19, or/20, o1'j21e, or/22c, or/23c, orf24c et orf25c. La fonction des protéines codées par ces séquences dans la voie de biosynthèse des spiramycines est développée dans la discussion ci-après qui est illustrée par les figures 4,5, 6 et 8.
1) Un premier objet de l'invention concerne un polynucléotide codant un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisé en ce que la séquence dudit polynucléotide est :
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(a) l'une des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 28,
30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74,76, 78,80, 82 et 84 (b) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a), (c) l'une des séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.
2) La présente invention a également pour objet un polynucléotide s'hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence à au moins l'un des polynucléotides selon le paragraphe 1) ci-dessus.
3) L'invention concerne également un polynucléotide présentant au moins 70%,
80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide comprenant au moins 10,12, 15, 18, 20 à 25,30, 40,50, 60,70, 80,90, 100,150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050,
1100,1150, 1200,1250, 1300,1350, 1400,1450, 1500,1550, 1600,1650, 1700,1750,
1800,1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide selon le paragraphe 1) ci dessus.
4) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2) ou 3) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.
5) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2), 3) ou 4) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.
6) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2), 3) ou 4) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine ayant une activité similaire à la protéine codée par le polynucléotide avec lequel il s'hybride ou il présente l'identité.
7) L'invention concerne également un polypeptide résultant de l'expression d'un polynucléotide selon le pragraphe 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.
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8) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisée en ce que la séquence dudit polypeptide est : (a) l'une des séquences SEQ ID N 4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27,
29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54,55, 56,57, 58,59, 61,
63, 65, 67, 69, 71,73, 75,77, 79,81, 83 et 85, (b) l'une des séquences telles que définies en (a) excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles, (c) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a) et (b).
9) Un autre objet de l'invention concerne un polypeptide présentant au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en acides aminés avec un polypeptide comprenant au moins 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 60, 70, 80,90,100, 120,140, 160,180, 200, 220, 240,260, 280,300, 320,340, 360,380, 400,420, 440,460, 480,500, 520, 540,560, 580,600, 620 ou 640 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon le paragraphe 8) ci-dessus.
10) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le paragraphe 9) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.
11) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le paragraphe 9) ou 10) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.
12) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le pragraphe 9), 10) ou 11) ci-dessus caractérisé en ce qu'il a une activité similaire à celle du polypeptide avec lequel il partage l'identité.
13) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polynucléotide selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.
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14) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le pragraphe 13) ci-dessus caractérisé en ce que le dit ADN recombinant est compris dans un vecteur.
15) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le paragraphe 14) ci-dessus caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC ou les PAC.
16) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le pragraphe 15) ci-dessus caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi pOS49. 1, pOS49.11, pOSC49. 12, pOS49. 14, pOS49. 16, pOS49. 28, pOS44.1, pOS44. 2, pOS44. 4, pSPM5, pSPM7, pOS49. 67, pOS49. 88, pOS49. 106, pOS49. 120, pOS49.107, pOS49. 32, pOS49. 43, pOS49. 44, pOS49. 50, pOS49. 99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPMl, pBXLllll, pBXL1112 et pBXL1113.
17) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant un polypeptide selon le pragraphe 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) ci-dessus.
18) L'invention est également relative à un système d'expression comprenant un vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides selon le paragraphe 7), 8), 9), 10), Il) ou 12) ci-dessus.
19) L'invention est également relative à un système d'expression selon le paragraphe 18 ci-dessus caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression procaryotes ou les systèmes d'expression eucaryotes.
20) L'invention est également relative à un système d'expression selon le paragraphe 19) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression chez la bactérie E. coli, les sytèmes d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes, les sytèmes d'expression permettant une
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expression dans des cellules de levures, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de mammifères.
21)L'invention est également relative à une cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'un des pragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 13), 14),
15), 16) ou 17) ci-dessus.
22) L'invention est également relative à un procédé de production d'un polypeptide selon le paragraphe 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) ci-dessus caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a) insérer au moins un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
23) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme bloqué dans une étape de la voie de biosynthèse d'au moins un macrolide.
24) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est obtenu en inactivant la fonction d'au moins une protéine impliquée dans la biosynthèse de ce ou de ces macrolides dans un microorganisme producteur de ce ou de ces macrolide.
25) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 24) ci-dessus caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénèse dans le ou les gènes codant ladite ou lesdites protéines ou par expression d'un ou de plusieurs ARN anti-sens complémentaires de l'ARN ou des ARN messagers codant ladite ou lesdites protéines.
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26) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25) ci-dessus caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénèse par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée ou par remplacement de gène.
27) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25) ou 26) ci-dessus caractérisé en ce que la ou les mutagénèses sont effectuées in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés ou par inactivation génique.
28) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26) ou 27) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.
29) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27) ou 28) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.
30) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27), 28) ou 29) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souche de S. ambofaciens.
31) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29) ou 30) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.
32) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25), 26), 27), 28), 29), 30) ou 31) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13, 15,17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70,72, 74,76, 78,80, 82 et 84.
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33) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31) ou 32) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse consiste en l'inactivation génique d'un gène comprenant une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N 13.
34) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche choisie parmi l'une des souches déposées auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2909, 1-2911, 1-2912, I- 2913,1-2914,1-2915,1-2916 ou 1-2917.
35) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse de macrolide caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 22), 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31), 32), 33) ou 34) ci dessus, b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), ledit intermédiaire de biosynthèse.
36) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'une molécule dérivée d'un macrolide caractérisé en ce que l'on prépare un intermédiaire de biosynthèse selon le procédé du paragraphe 35) ci-dessus et que l'on modifie l'intermédiaire ainsi produit.
37) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36) ci-dessus caractérisé en ce que l'on modifie ledit intermédiaire par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.
38) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36) ou 37) ci-dessus caractérisé en ce que l'on introduit dans ledit
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microorganisme un ou plusieurs gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat.
39) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36), 37) ou 38) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.
40) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36), 37), 38) ou 39) ci-dessus caractérisé en ce que le microorganisme utilisé est une souche de S. ambofaciens.
41) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III
42) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41) ci-dessus caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de la spiramycine I mais que le gène comprenant la séquence SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants n'est pas exprimé ou a été rendu inactif.
43) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 42) ci-dessus caractérisé en ce que la dite inactivation est réalisée par mutagénèse dans le gène codant ladite protéine ou par l'expression d'un ARN anti-sens complémentaire de l'ARN messager codant ladite protéine.
44) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 43) ci-dessus caractérisé en ce que la dite mutagénèse est effectuée dans le promoteur de ce gène, dans la séquence codante ou dans une séquence non codante de manière à rendre inactive la protéine codée ou à en empêcher son expression ou sa traduction.
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45) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon la revendication 43) ou 44) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée ou par remplacement de gène.
46) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 43), 44) ou 45) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique.
47) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41) ou 42) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu en exprimant les gènes de la voie de biosynthèse de la spiramycine sans que ceux-ci ne comprennent le gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants.
48) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46) ou 47) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.
49) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47) ou 48) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de départ produisant les spiramycines I, II et III.
50) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48) ou 49) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est obtenu par mutagénèse dans un gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison
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de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID
N 14 ou l'un de ses variants ayant la même fonction.
51) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49) ou 50) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de S. ambofaciens produisant les spiramycines I, II et III, dans laquelle est effectuée une inactivation génique du gène comprenant la séquences correspondant à SEQ ID N 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
52) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de S. ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de
Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.
53) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de spiramycine I, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49), 50), 51) ou 52) ci-dessus, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), la spiramycine I.
54) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus pour améliorer la production en macrolides d'un microorganisme.
55) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant producteur de macrolide caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus et/ou qu'il surexprime au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.
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56) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55) ci-dessus caractérisé en ce que la modification génétique consiste en une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés dans le but d'exprimer une ou des protéines ayant une activité supérieure ou d'exprimer un niveau plus élevé de cette ou de ces protéines.
57) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55) ci-dessus caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en augmentant le nombre de copie de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage.
58) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55) ou 57) ci-dessus caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en transformant un microorganisme producteur de macrolide par une construction d'ADN recombinant selon le paragraphe 13,14 ou 17 ci-dessus, permettant la surexpression de ce gène.
59) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57) ou 58) ci-dessus caractérisé en ce que la modification génétique est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70,72, 74,76, 78,80, 82 et 84 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
60) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58) ou 59) ci-dessus caractérisé le microorganisme surexprime un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25,28, 30,34, 36, 40, 43,45, 47,49, 53,60, 62,64, 66,68, 70,72, 74,76, 78,80, 82 et 84 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
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61) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58), 59) ou 60) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactéries du genre Streptomyces.
62) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58), 59), 60) ou 61) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.
63) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61) ou 62) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souches de S. ambofaciens.
64) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de macrolides, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61), 62), 63) ou 64) ci-dessus, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), le ou lesdits macrolides produits.
65) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence et/ou d'un ADN recombinant et/ou d'un vecteur selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16) ou 17) ci-dessus pour la préparation d'antibiotiques hybrides.
66) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un polypeptide et/ou au moins une cellule hôte selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16), 17) ou 21) ci-dessus pour réaliser une ou plusieurs bioconversions.
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67) Un autre aspect de l'invention concerne un polynucléotide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide complémentaire de l'un des polynucléotides selon le paragraphe 1), 2), 3), 4), 5), ou 6) ci-dessus.
Défmitions générales
Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).
Par exemple un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présente invention le terme ORF ( Open Reading Frame , c'est à dire cadre ouvert de lecture) a été employé pour désigner en particulier la séquence codante d'un gène.
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Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique.
L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04 064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier polynucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G.
Le terme gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines comprend également les gènes régulateurs et les gènes conférant la résistance aux microorganismes producteurs.
On entendra par " fragment " d'un acide nucléique de référence selon l'invention, une séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à l'acide nucléique de référence.
Un tel " fragment " d'acide nucléique selon l'invention peut être le cas échéant, compris dans un polynucléotide plus grand duquel il est constitutif.
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De tels fragments comprennent ou alternativement consistent en, des polynucléotides de longueur allant de 8, 10, 12,15, 18,20 à 25, 30,40, 50,60, 70,80,
Figure img00180001

90, 100, 150, 200, 20, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 80, 900,
950,1000, 1050, 1100, 1150, 1200,1250, 1300,1350, 1400, 1450,1500, 1550,1600,
1650, 1700,1750, 1800, 1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Par " fragment " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est plus courte que celle du polypeptide de référence et qui comprend sur toute la partie commune avec ces polypeptides de référence, une séquence en acides aminés identique.
De tels fragments peuvent, le cas échéant, être compris au sein d'un polypeptide plus grand duquel ils font partie.
De tels fragments d'un polypeptide selon l'invention peuvent avoir une longueur de 10, 15, 20,30 à 40,50, 60,70, 80,90,100, 120,140, 160, 180,200, 220,240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 ou 640 acides aminés.
Par " conditions d'hybridation de forte stringence " au sens de la présente invention, on entendra des conditions d'hybridation défavorisant l'hybridation de brins d'acides nucléiques non homologues. Des conditions d'hybridations de forte stringence peuvent être par exemple décrites comme des conditions d'hybridation dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée la température d'hyridation est de 55 C, de manière encore plus préférée la températue d'hybridation est de 60 C et de manière tout à fait préférée la température d'hybridation est de 65 C, suivi d'un ou plusieurs lavages effectué en tampon 2X SSC (le tampon IX SSC correspond à une solution aqueuse 0,15M NaCI, 15 mM de citrate de sodium) à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C et de manière tout à fait préférée cette température
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est de 65 C, suivi d'un ou plusieurs lavages en tampon 0.5X SSC à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C et de manière tout à fait préférée cette température est de 65 C.
Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'ouvrage de F.Ausubel et al (2002).
Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entendra un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynucléotide de référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagénèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les séquences d'aminoacides codées par ledit acide nucléique variant.
Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant peuvent aussi résulter de substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nucléique variant par rapport aux peptides codés par l'acide nucléique de référence. En outre, des modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence d'aminoacides.
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De préférence, les acides nucléiques variants selon l'invention codent des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides codés par l'acide nucléique initial.
Certains acides nucléiques variants coderont ainsi des formes mutées des polypeptides dont l'étude systématique permettra de déduire des relations structure activité des protéines en question.
Par " variant " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra principalement un polypeptide dont la séquence d'acides aminés contient une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'aminoacides peuvent être indifféremment conservatives ou non conservatives.
De préférence, les polypeptides variants selon l'invention conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides initiaux.
Par polypeptide ayant " une activité similaire " à un polypeptide de référence au sens de l'invention, on entend un polypeptide ayant une activité biologique proche, mais pas nécessairement identique, de celle du polypeptide de référence tel que mesuré dans un essai biologique convenable à la mesure de l'activité biologique du polypeptide de référence.
Par " antibiotique hybride " au sens de l'invention on entend un composé, généré par la construction d'une voie de biosynthèse artificielle utilisant la technologie de l' ADN recombinant.
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Description détaillée de l'invention
La présente invention a plus particulièrement pour objet, de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse tels que présentés dans la description détaillée ci-dessous.
Les gènes de la voie de biosynthèse ont été clonés et la séquence d'ADN de ces gènes a été déterminée. Les séquences obtenues ont été analysées grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). On a identifié, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typiques de Streptomyces. Cette analyse a montré que cette région comporte 35 ORFs localisées de part et d'autre de cinq gènes codant l'enzyme polyketide synthase (PKS). De part et d'autre de ces cinq gènes codant des PKS, respectivement 10 et 25 ORFs ont été identifiées en aval et en amont (l'aval et l'amont étant définis par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 3). Ainsi, les 25 phases ouvertes de lecture de ce type, occupant une région d'environ 31 kb (SEQ ID N 1 et figure 3) ont été identifiées en amont des 5 gènes codant la PKS et 10 occupant une région d'environ Il,1kb (SEQ ID N 2 et figure 3), ont été identifiées en aval des gènes de la PKS. Les 10 gènes situés en aval des 5 gènes PKS ont ainsi été nommés orf1*c,
Figure img00210001

orf2*c, otf3*c, orf4*c, orf5*, or/6*, oif7*c, or/8*, or/9*, or/10* (SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13,15, 17,19 et 21). Le c ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N 2 pour ces gènes). En utilisant la même nomenclature, les 25 ORFs en amont des gènes de la PKS ont été
Figure img00210002

nommés orfl, or/2, or/3, orf4, orf5, or/6, orf7, or/8, of f9c, o f10, orfllc, or/12, orfl3c, orf!4, orfi5c, orfl6, os fl 7, orfl8, o f19, ot f20, orf21c, orj22c, orf23c, orf24c et orf25e (SEQ ID N 23,25, 28,30, 34,36, 40,43, 45,47, 49,53, 60,62, 64,66, 68,70, 72,74, 76,78, 80,82 et 84) (cf. figure 3).
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents
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programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups) (ces trois programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)), (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.
Gènes situés en aval des gènes codant les PKS
Une représentation schématique de l'organisation de la région est présentée en figure 3. Ainsi qu'il sera démontré ci-dessous, sur les 10 gènes identifiés en aval des gènes codant les PKS 9 semblent impliqués dans la biosynthèse ou la résistance aux
Figure img00220001

spiramycines. Il s'agit des 9 gènes suivants : orf1*c, orf2*c, orj3*c, orf4*c, orf5*, or/6*, orf7*c, or/8* et or/9*.
Dans le tableau 1 suivant sont présentées les références à la séquence en ADN et en acides aminés des 10 gènes identifiés en aval des 5 gènes PKS.
Tableau 1
Figure img00220002
<tb>
<tb> Gène <SEP> Position <SEP> dans <SEP> la <SEP> Séquence <SEP> ADN <SEP> Séquences <SEP> polypeptidiques
<tb> séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 2
<tb> orfl <SEP> *c <SEP> 10882 <SEP> à <SEP> 10172 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 3 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 4
<tb> orf2*c <SEP> 10052 <SEP> à <SEP> 8781 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 5 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 6
<tb> orf3*c <SEP> 8741 <SEP> à <SEP> 7476 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 7 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 8
<tb> orf4*c <SEP> 7459 <SEP> à <SEP> 6100 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 9 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 10
<tb> or/5* <SEP> 5302 <SEP> à <SEP> 5976 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 11 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 12
<tb> or/6* <SEP> 4061 <SEP> à <SEP> 5305 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 13 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 14
<tb>
<Desc/Clms Page number 23>
Figure img00230001
<tb>
<tb> orf7*c <SEP> 3665 <SEP> à <SEP> 2817 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 15 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 16
<tb> orf8* <SEP> 1925 <SEP> à <SEP> 2755 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 17 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 18
<tb> orf9* <SEP> 1007 <SEP> à <SEP> 1888 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 19 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 20
<tb> orf10* <SEP> 710 <SEP> à <SEP> 937 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 21 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 22
<tb>
Le c ajouté dans le nom du gène indique que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N 2 pour ces gènes).
Dans le but de déterminer la fonction des polypeptides identifiés, trois types d'expériences ont été menés : la comparaison des séquences identifiées avec des séquences de fonctions connues, des expériences d'inactivation de gènes, conduisant à la construction de souches mutantes et des analyses de la production en spiramycines et en intermédiaires de biosynthèse des spiramycines par ces souches mutantes.
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont tout d'abord été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CDsearch, COGs (Cluster of Orthologous Groups), FASTA ((Pearson W. R & D. J.
Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycine. Le tableau 2 montre les protéines présentant une forte similitude avec les produits 10 gènes situés en aval des 5 gènes PKS.
<Desc/Clms Page number 24>
Figure img00240001
<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 2
<tb> Produit <SEP> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> Numéro <SEP> d'accès <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> de <SEP> gène <SEP> similitude <SEP> significative <SEP> GenBank <SEP> BLAST*
<tb> orfl <SEP> *c <SEP> TylMI(orf3*) <SEP> (S. <SEP> fradiae) <SEP> CAA57473 <SEP> 287 <SEP> Nméthyltransférase
<tb>
Figure img00240002

orf2*c dnrQ gene product AAD 15266 153 Inconnue
Figure img00240003
<tb>
<tb> (Streptomyces <SEP> peucetius)
<tb> orf3*c <SEP> TylMII(orf2*) <SEP> (S. <SEP> fradiae) <SEP> CAA57472 <SEP> 448 <SEP> Glycosyltransféras
<tb> e
<tb> orf4*c <SEP> Crotonyl-CoA <SEP> réductase <SEP> NP~630556 <SEP> 772 <SEP> Crotonyl-CoA
<tb> (S. <SEP> coelicolor) <SEP> réductase
<tb> or/5* <SEP> MdmC <SEP> (S. <SEP> mycarofaciens) <SEP> B42719 <SEP> 355 <SEP> Ométhyltransférase
<tb> or/6* <SEP> 3-O-acyltransférase <SEP> (S. <SEP> Q00718 <SEP> 494 <SEP> Acyltransférase
<tb> mycarofaciens)
<tb> orf7*c <SEP> MdmA <SEP> (S. <SEP> A60725 <SEP> 380 <SEP> Protéine <SEP> impliquée
<tb> mycarofaciens) <SEP> dans <SEP> la <SEP> résistance
<tb> à <SEP> la <SEP> midécamycine
<tb> orf8* <SEP> ABC-transporteur <SEP> (S. <SEP> CAC22119 <SEP> 191 <SEP> ABC-transporteur
<tb> griseus)
<tb> orf9* <SEP> ABC-transporteur <SEP> (S. <SEP> CAC22118 <SEP> 269 <SEP> ABC-transporteur
<tb> griseus)
<tb> orf10* <SEP> Putative <SEP> small <SEP> conserved <SEP> NP~627432 <SEP> 109 <SEP> Inconnue
<tb> hypothetical <SEP> protein <SEP> (S.
<tb> coelicolor)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Des expériences d'inactivation de gènes ont été réalisées pour confirmer ces résultats.
Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine, la généticine ou
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l'hygromycine). Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par des terminateurs de transcription actifs chez Streptomyces. L'insertion de la cassette dans le gène cible peut s'accompagner ou non d'une délétion dans ce gène cible. La taille des régions flanquant la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases. Un deuxième type de cassettes peut être utilisé pour l'inactivation de gènes : des cassettes dites cassettes excisables . Ces cassettes présentent l'avantage de pouvoir être excisées chez Streptomyces par un événement de recombinaison de site spécifique après avoir été introduites dans le génome de S. ambofaciens. Le but est d'inactiver certains gènes dans des souches de Streptomyces sans laisser dans la souche finale de marqueurs de sélection ou de grandes séquences d'ADN n'appartenant pas à la souche. Après excision il subsiste uniquement une courte séquence d'une trentaine de paires de bases (appelé site cicatriciel ) dans le génome de la souche (cf. figure 10). La mise en oeuvre de ce système consiste, dans un premier temps, au remplacement de la copie sauvage du gène cible (grâce à deux événements de recombinaison homologue, cf. figure 9) par une construction dans laquelle une cassette excisable a été insérée dans ce gène cible. L'insertion de cette cassette est accompagnée d'une délétion dans le gène cible (cf. figure 9). Dans un deuxième temps, l'excision de la cassette excisable du génome de la souche est provoquée. La cassette excisable fonctionne grâce à un système de recombinaison site spécifique et a pour avantage de permettre l'obtention de mutants de Streptomyces ne portant finalement pas de gène de résistance. On s'affranchit également d'éventuels effets polaires sur l'expression des gènes situés en aval du ou des gènes inactivés (cf. figure 10). Les souches ainsi construites ont été testées pour leur production en spiramycines.
Figure img00250001
L'inactivation des gènes o fl *c, orj2 *c, orj3 *c et orf4*c n'a pas été effectuée car les expériences de comparaison de séquence ont permis de déterminer que ces gènes avaient une similitude relativement importante avec des gènes impliqués dans la biosynthèse d'un antibiotique relativement proche. Ainsi, le gène orf1*c code une protéine présentant une identité de 66% (déterminée grâce au programme BLAST) avec la protéine codée par gène tylMI qui code une N-méthyltransférase impliquée dans la
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biosynthèse de tylosine et catalysant la 3 N-méthylation durant la production du mycaminose chez Streptomyces fradiae (Gandecha, A.R. et al., 1997 ; Numéro d'accès GenBank : CAA57473 ; Score BLAST : 287). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique relativement proche et plus particulièrement dans la biosynthèse du mycaminose suggère que le gène orfl*c code une N-methyltransférase responsable d'une N-méthylation lors de la biosynthèse de la forosamine ou du mycaminose (cf. figure 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf1*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 3).
Tableau 3
Figure img00260001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> méthyltransferase <SEP> (S. <SEP> antibioticus) <SEP> CAA05643 <SEP> 277 <SEP> méthyltransférase
<tb> N,N-diméthyltransferase <SEP> (S. <SEP> venezuelae) <SEP> AAC68678 <SEP> 268 <SEP> N,Ndiméthyltransférase
<tb> probable <SEP> N-méthylase <SEP> snogX <SEP> (S. <SEP> T46679 <SEP> 243 <SEP> N-méthyltransférase
<tb> nogalater)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf2*c code une protéine présentant une relative forte similitude (35% d'identité) avec une protéine codée par le gène tylMIII codant une NDP hexose 3,4 isomérase impliquée dans la biosynthèse de la tylosine chez Streptomyces fradiae (Gandecha, A.R., et al., 1997 ; Numéro d'accès GenBank : CAA57471 ; Score BMAST : 130). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche et plus particulièrement dans la biosynthèse du mycaminose
<Desc/Clms Page number 27>
suggère fortement que le gène orf*2c code une NDP hexose 3,4 isomérase responsable d'isomérisation lors de la biosynthèse du mycaminose (cf. figure 5).
Le gène orf3*c code une protéine présentant une relative forte similitude (59% d'identité) avec une protéine codée par le gène tylMII codant une glycosyltransférase impliquée dans la biosynthèse de la tylosine chez Streptomyces fradiae (Gandecha, A.R. et al., 1997; Numéro d"accès GenBank : CAA57472 ; Score BLAST : 448). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf*3c code une glycosyltransférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/3 *c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 4).
Tableau 4
Figure img00270001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Glycosyl <SEP> transférase <SEP> (S. <SEP> venezuelae) <SEP> AAC68677 <SEP> 426 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> Glycosyltransférase <SEP> (S. <SEP> antibioticus) <SEP> CAA05642 <SEP> 425 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> Glycosyltransférase <SEP> CAA74710 <SEP> 395 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> eiythraea)
<tb> Glycosyltransférase <SEP> (S. <SEP> antibioticus) <SEP> CAA05641 <SEP> 394 <SEP> Glycosyltransférase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf4*c code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs crotonyl-CoA réductases. Notamment, la protéine codée par orf4*c possède une similitude importante avec une crotonyl CoA réductase de chez Streptomyces coelicolor (Redenbach, M et al., 1996 ; Numéro d'accès GenBank : NP~630556 ; Score
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BLAST : 772). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf4*c code également une crotonyl-CoA réductase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf4*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 5).
Tableau 5
Figure img00280001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> trans-2-énoyl-CoA <SEP> réductase <SEP> S72400 <SEP> 764 <SEP> trans-2-énoyl-CoA
<tb> (EC1.3.1.38) <SEP> (S. <SEP> collinus) <SEP> réductase
<tb>
Figure img00280002

Crotonyl CoA réductase (S. fradiae) CAA57474 757 Crotonyl CoA réductase
Figure img00280003
<tb>
<tb> Crotonyl-CoA <SEP> réductase <SEP> (S. <SEP> AAD53915 <SEP> 747 <SEP> Crotonyl-CoA <SEP> réductase
<tb> cinnamonensis)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/0* présente une certaine similitude avec le gène mdmB présent chez Streptomyces mycarofaciens (Hara et Hutchisnson, 1992 ; numéro d'accès GenBank : A42719 ; Score BLAST : producteur d'antibiotique macrolide. Chez ce producteur, le gène est impliqué dans l'acylation du cycle lactone. Le gène orf6* coderait donc une acyltransférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/6* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 6).
<Desc/Clms Page number 29>
Tableau 6
Figure img00290001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> similitude <SEP> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> AcyA <SEP> (Streptomyces <SEP> J4001 <SEP> 450 <SEP> macrolide <SEP> 3-O-acyltransférase
<tb> thermotolerans)
<tb> Midécamycine <SEP> 4"-O- <SEP> BAA09815 <SEP> 234 <SEP> Midécamycine <SEP> 4"-O-propionyl
<tb> propionyl <SEP> transférase <SEP> (S. <SEP> transférase
<tb> mycarofaciens)
<tb> Mycarose <SEP> O-acyltransférase <SEP> AAG13909 <SEP> 189 <SEP> Mycarose <SEP> O-acyltransférase
<tb> (Micromonospora
<tb> megalomicea <SEP> subsp. <SEP> Nigra)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
L'inactivation du gène oif6* a été réalisée par une délétion/insertion en phase et il a été montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycine II et III mais uniquement de la spiramycine 1 (cf figure 1). Ceci confirme que le gène or/6* est bien impliqué dans la synthèse de spiramycine II et III. L'enzyme codée par ce gène est responsable de la formation de spiramycine II et III par fixation d'un groupement acétyl ou butyryl sur le carbone 3. Les souches n'exprimant plus la protéine codée par le gène or/6* sont particulièrement intéressantes puisqu'elles ne produisent plus de spiramycine II et III mais seulement de la spiramycine I. Comme il a été précisé ci-dessus, l'activité antibiotique de la spiramycine 1 est nettement supérieure à celle des spiramycines II et III (Liu et al., 1999).
Le gène or/?*code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs O-méthyltransférase. Notamment, la protéine codée par orf5* possède une similitude importante avec une 0-méthyltransférase (EC 2.1.1.-) MdmC de
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Streptomyces mycarofaciens (Hara & Hutchinson, 1992 ; Numéro d'accès GenBank :B42719; Score BLAST : 355). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique suggère fortement que le gène orf5* code également une O-méthyltransférase. Le gène orf5* serait impliqué dans la formation de précurseurs incorporés dans le cycle lactone. En effet, d'après les comparaisons de séquences, le produit du gène orf5* est également relativement proche de FkbG qui est responsable de la méthylation de l'hydroxymalonyl-ACP d'après (Wu et
Figure img00300001

al., 2000 ; Hoffineister et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86386 ; Score BLAST : 247) (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène oif5* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 7).
Tableau 7
Figure img00300002
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Probable <SEP> O-méthyltransferase <SEP> (EC <SEP> T18553 <SEP> 223 <SEP> O-méthyltransférase
<tb> 2.1.1.-) <SEP> safC <SEP> (Myxococcus <SEP> xanthus)
<tb> 4-0-méthyltransferase <SEP> (EC <SEP> 2.1.1.-) <SEP> - <SEP> JC4004 <SEP> 222 <SEP> O-méthyltransférase
<tb> (Streptomyces <SEP> sp.)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Grâce à l'effet polaire de l'insertion d'une cassette non excisée dans le gène orf 6*, il a pu être déterminé que le gène orf 5* est essentiel à la voie de biosynthèse des spiramycines. En effet, l'insertion de la cassette excisable dans la partie codante du gène orf 6* entraîne un arrêt total de la production en spiramycines. Cependant, une fois que la cassette insérée a été excisée (et donc lorsque seul le gène orf6* est inactivé, cf exemples 14 et 15), on retrouve une production en spiramycine I. Ceci montre que le
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gène orf 5*est essentiel à la voie de biosynthèse des spiramycines puisque son inactivation entraîne un arrêt total de la production en spiramycines.
Le gène orf7*c code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens, ce dernier codant une protéine impliquée dans la résistance à la midécamycine chez cet organisme producteur (Hara et al., 1990 ; Numéro d'accès GenBank : A60725 ; Score BLAST : 380). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique suggère fortement que le gène orf7*c code également une protéine impliquée dans la résistance à la spiramycine. Plus particulièrement, l'enzyme codée par le gène orj7*c possède une activité méthyltransférase et est impliquée dans la résistance à la spiramycine chez Streptomyces ambofaciens. Il a été démontré que ce gène confère une résistance de type MLS I, résistance dont on sait qu'elle est dûe à la monométhylation en position A2058 de l'ARN ribosomal 23S (Pernodet et al., 1996). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf7*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 8).
Tableau 8
Figure img00310001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> macrolide-lincosamide-streptograminB <SEP> JC5319 <SEP> 238 <SEP> 23S <SEP> rRNA
<tb> résistance <SEP> déterminant <SEP> (S. <SEP> fradiae) <SEP> méthyltransférase
<tb> 23S <SEP> ribosomal <SEP> RNA <SEP> methyltransferase <SEP> AAL68827 <SEP> 119 <SEP> 23S <SEP> rRNA
<tb> ErmML <SEP> (Micrococcus <SEP> luteus) <SEP> méthyltransférase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
<Desc/Clms Page number 32>
Le gène orj8* code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de type transporteur ABC chez Streptomyces griseus (Campelo, 2002, Numéro d'accés GenBank : CAC22119 ; Score BLAST : 191). Cette similitude avec une protéine de type transporteur ABC suggère fortement que le gène or/8* code également une protéine de type transporteur ABC pouvant être impliquée dans la résistance à la spiramycine. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/8* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 9).
Tableau 9
Figure img00320001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> d'accès <SEP> Score <SEP> Fonction
<tb> significative <SEP> GenBank <SEP> BLAST* <SEP> rapportée
<tb> AcrW <SEP> (Streptomyces <SEP> galilaeus) <SEP> BAB72060 <SEP> 94 <SEP> Transporteur
<tb> ABC
<tb> Daunorubicin <SEP> résistance <SEP> transmembrane <SEP> P32011 <SEP> 89 <SEP> Résistance <SEP> à <SEP> la
<tb> protéine <SEP> (Streptomyces <SEP> peucetius) <SEP> daunorubicine
<tb> Probable <SEP> ABC-transporter, <SEP> NP~626506 <SEP> 89 <SEP> Transporteur
<tb> transmembrane <SEP> component. <SEP> ABC
<tb> (Streptomyces <SEP> coelicolor)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/9* code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de type transporteur ABC chez Streptomyces griseus (Campelo, 2002, Numéro d'accés GenBank : CAC22118 ; Score BLAST : Cette similitude avec une protéine de type transporteur ABC suggère fortement que le gène or/9* code également une protéine de type transporteur ABC pouvant être impliquée dans la résistance à la spiramycine. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène
<Desc/Clms Page number 33>
or/8* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 10).
Tableau 10
Figure img00330001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> significative <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction
<tb> d'accès <SEP> BLAST* <SEP> rapportée
<tb> GenBank
<tb> Probable <SEP> ABC-type <SEP> transport <SEP> protein, <SEP> ATP- <SEP> NP~626505 <SEP> 231 <SEP> Transporteur
<tb> binding <SEP> component <SEP> (S. <SEP> coelicolor) <SEP> ABC
<tb> Putative <SEP> ABC <SEP> transporter <SEP> ATP-binding <SEP> NP~627624 <SEP> 228 <SEP> Transporteur
<tb> component <SEP> (Streptomyces <SEP> Coelicolor) <SEP> ABC
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/10* * code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de fonction inconnue. Cependant des gènes similaires à or/10* sont retrouvés au milieu de plusieurs groupes de gènes impliqués dans la biosynthèse d'antibiotiques.
Ainsi un gène proche de or/70* est retrouvé chez S. coelicolor (Redenbach et al., 1996, numéro d'accès GenBank : NP~627432, score BLAST : 109). Un gène proche (CouY) est également retrouvé chez S. rishiriensis (Wang et al., 2000, numéro d'accès GenBank : AAG29779, score BLAST 97).
Gènes situés en amont des gènes codant les PKS
Dans la séquence d'ADN située en amont des gènes codant les PKS (l'aval et l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 3), 25 ORFs ont été identifiées (cf. ci-dessus). Une représentation schématique de l'organisation de la région est présentée en figure 5. Les 25 gènes identifiés ont été nommés : or/1, or/2, or/9, orf4, or/?, or/6, or/7, or/8, orf9c, or/10,
Figure img00330002

or/1 le, or/12, or/1 Se, or/14, oifl5c, or/16, or/17, or/18, or/19, or/20, orj21c, orfZ2c, ofl3c, of24c et or/25 c.
<Desc/Clms Page number 34>
Dans le tableau 11suivant sont présentées les références à la séquence en ADN et en acides aminés des 25 gènes identifiés en amont des 5 gènes PKS.
Tableau 11
Figure img00340001
<tb>
<tb> Gène' <SEP> Position <SEP> dans <SEP> la <SEP> Séquence <SEP> ADN <SEP> Séquence(s) <SEP> polypeptidique(s)2
<tb> séquence <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 1
<tb> or/1 <SEP> 658 <SEP> à <SEP> 1869 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 23 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 24
<tb> or/2 <SEP> 1866 <SEP> à <SEP> 2405 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 25 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 26 <SEP> et <SEP> 27
<tb> or/3 <SEP> 2402 <SEP> à <SEP> 3568 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 28 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 29 <SEP>
<tb> orf4 <SEP> 3565 <SEP> à <SEP> 4473 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 30 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 31, <SEP> 32 <SEP> et <SEP> 33 <SEP>
<tb> or/3 <SEP> 4457 <SEP> à <SEP> 5494 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 34 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 35
<tb> or/6 <SEP> 5491 <SEP> à <SEP> 6294 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 36 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 37, <SEP> 38 <SEP> et <SEP> 39
<tb> or/7 <SEP> 6296 <SEP> à <SEP> 7705 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 40 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 41 <SEP> et <SEP> 42
<tb> or/8 <SEP> 8011 <SEP> à <SEP> 9258 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 43 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 44 <SEP>
<tb> orj9c <SEP> 10081 <SEP> à <SEP> 9362 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 45 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 46 <SEP>
<tb> or/10 <SEP> 10656 <SEP> à <SEP> 12623 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 47 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 48
<tb> orf11c <SEP> 14482 <SEP> à <SEP> 12734 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 49 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 50, <SEP> 51 <SEP> et <SEP> 52
<tb> orfl2 <SEP> 14601 <SEP> à <SEP> 16031 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 53 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 54,55, <SEP> 56,57, <SEP> 58 <SEP> et <SEP> 59
<tb> orf13c <SEP> 17489 <SEP> à <SEP> 16092 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 60 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 61
<tb> or/14 <SEP> 17809 <SEP> à <SEP> 18852 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 62 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 63
<tb> orf15c <SEP> 20001 <SEP> à <SEP> 18961 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 64 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 65 <SEP>
<tb> or/16 <SEP> 20314 <SEP> à <SEP> 21552 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 66 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 67
<tb> or/17 <SEP> 21609 <SEP> à <SEP> 22879 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 68 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 69
<tb> or/18 <SEP> 22997 <SEP> à <SEP> 24175 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 70 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 71
<tb> or/19 <SEP> 24177 <SEP> à <SEP> 25169 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 72 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 73
<tb>
<Desc/Clms Page number 35>
Figure img00350001
<tb>
<tb> or/20 <SEP> 25166 <SEP> à <SEP> 26173 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 74 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 75
<tb> orf21c <SEP> 27448 <SEP> à <SEP> 26216 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 76 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 77
<tb> orf22c <SEP> 28560 <SEP> à <SEP> 27445 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 78 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 79
<tb> or/23c <SEP> 29770 <SEP> à <SEP> 28649 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 80 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 81
<tb> orf24c <SEP> 30074 <SEP> à <SEP> 29763 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 82 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 83
<tb> orf25c <SEP> 30937 <SEP> à <SEP> 30071 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 84 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 85
<tb>
Le c ajouté dans le nom du gène indique que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N 1 pour ces gènes).
2 Lorsque plusieurs séquences protéiques sont indiquées pour une seule orf, les protéines correspondantes sont issues de plusieurs sites possibles de démarrage de la traduction.
Dans le but de déterminer la fonction des polypeptides identifiés dans le tableau 11 ci-dessus, trois types d'expériences ont été menées : la comparaison de l'identité des séquences identifiées avec des séquences de fonctions connues, des expériences d'inactivation de gènes et des analyses de la production en spiramycines de ces souches mutantes.
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont tout d'abord été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CDsearch, COGs (Cluster of Orthologous Groups), FASTA ((Pearson W. R & D. J.
Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)), (cf. cidessus). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycine. Le tableau 12 montre les protéines présentant une forte similitude avec les 25 gènes situés en amont des 5 gènes PKS.
<Desc/Clms Page number 36>
Tableau 12
Figure img00360001
<tb>
<tb> Gène <SEP> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST* <SEP> rapportée
<tb> GenBank
<tb> orf1 <SEP> Cytochrome <SEP> P450 <SEP> tyll <SEP> (Streptomyces <SEP> S49051 <SEP> 530 <SEP> Cytochrome
<tb> fradiae) <SEP> P450
<tb> orf2 <SEP> ORF15x4 <SEP> (Listonella <SEP> anguillarum) <SEP> AAB81630 <SEP> 113 <SEP> Inconnue
<tb> or/3 <SEP> aminotransferase-like <SEP> protein <SEP> AAF59939 <SEP> 431 <SEP> Amino-
<tb> (Streptomyces <SEP> antibioticus) <SEP> transférase
<tb> orf4 <SEP> alpha-D-glucose-1-phosphate <SEP> AAC68682 <SEP> 404 <SEP> alpha-D-glucosethymidylyltransferase <SEP> (Streptomyces <SEP> 1-phosphate
<tb> venezuelae) <SEP> thymidylyltransfé
<tb> rase
<tb> orf5 <SEP> AprE <SEP> (Streptomyces <SEP> tenebrarius) <SEP> AAGI8457 <SEP> 476 <SEP> dTDP-glucose
<tb> 4,6-déshydratase
<tb> or/6 <SEP> Thioesterase <SEP> (Streptomyces <SEP> avermitilis) <SEP> BAB69315 <SEP> 234 <SEP> Thioestérase
<tb> orf7 <SEP> TylCVI <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> AAF29379 <SEP> 461 <SEP> dNTP <SEP> hexose
<tb> 2,3-déshydratase
<tb> orf8 <SEP> probable <SEP> aminotransferase <SEP> AAG23279 <SEP> 465 <SEP> Aminotransférase
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> spinosa)
<tb> orf9c <SEP> SrmX <SEP> (Streptomyces <SEP> ambofaciens) <SEP> S25204 <SEP> 445 <SEP> Méthyltransféras
<tb> orf10 <SEP> SrmR <SEP> (Streptomyces <SEP> ambofaciens) <SEP> S25203 <SEP> 1074 <SEP> Protéine <SEP> de
<tb> régulation
<tb>
Figure img00360002

O7fl] c SmiB(c'cea<3/c) S25202 955 Résistance à la spiramycine orfl2 UrdQ (Streptomycesfradiae) AAF72550 634 NDP-hexose 3,4-
Figure img00360003
<tb>
<tb> déshydratase
<tb> orf13c <SEP> SC4H2.17 <SEP> (Streptomyces <SEP> coelicolor) <SEP> T35116 <SEP> 619 <SEP> Inconnue
<tb> orfl4 <SEP> putative <SEP> reductase <SEP> (Streptomyces <SEP> CAB90862 <SEP> 147 <SEP> Réductase
<tb> coelicolor)
<tb>
<Desc/Clms Page number 37>
Figure img00370001
<tb>
<tb> orf15c <SEP> Probable <SEP> 3-ketoreductase <SEP> (Streptomyces <SEP> T51102 <SEP> 285 <SEP> 3-cétoréductase
<tb> antibioticus)
<tb> or/16 <SEP> Hypothetical <SEP> NDP <SEP> hexose <SEP> 3,4 <SEP> CAA57471 <SEP> 209 <SEP> NDP <SEP> hexose <SEP> 3,4 <SEP>
<tb> isomerase <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> isomérase
<tb> orf17 <SEP> Glycosyl <SEP> transférase <SEP> (Streptomyces <SEP> AAC68677 <SEP> 400 <SEP> Glycosyl
<tb> venezuelae) <SEP> transférase
<tb> orfl8 <SEP> Glycosyl <SEP> transférase <SEP> (Streptomyces <SEP> AAG29785 <SEP> 185 <SEP> Glycosyl
<tb> rishiriensis) <SEP> transférase
<tb> or/19 <SEP> NDP-hexose <SEP> 4-cétoreductase <SEP> TylCIV <SEP> AAD41822 <SEP> 266 <SEP> NDP-hexose <SEP> 4-
<tb> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> cétoréductase
<tb> or/20 <SEP> EryBII <SEP> (Saccharopolyspora <SEP> erythraea) <SEP> AAB84068 <SEP> 491 <SEP> aldocéto
<tb> réductase
<tb> orf21c <SEP> TylCIII <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> AAD41823 <SEP> 669 <SEP> NDP-hexose <SEP> 3-Cméthyltransférase
<tb> orf22c <SEP> FkbH <SEP> (Streptomyces <SEP> hygroscopicus) <SEP> AAF86387 <SEP> 463 <SEP> Impliqué <SEP> dans <SEP> la
<tb> biosynthèse <SEP> du
<tb> méthoxymalonyl
<tb> orf23c <SEP> FkbI <SEP> (Streptomyces <SEP> hygroscopicus) <SEP> AAF86388 <SEP> 387 <SEP> Acyl <SEP> CoA
<tb> déshydrogénase
<tb> orf24c <SEP> FkbJ <SEP> (Streptomyces <SEP> hygroscopicus) <SEP> AAF86389 <SEP> 87 <SEP> Impliqué <SEP> dans <SEP> la
<tb> biosynthèse <SEP> du
<tb> méthoxymalonyl
<tb> orf25c <SEP> FkbK <SEP> (Streptomyces <SEP> hygroscopicus) <SEP> AAF86390 <SEP> 268 <SEP> Acyl <SEP> CoA
<tb> déshydrogénase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Des expériences d'inactivation de gènes ont été réalisées pour confirmer ces résultats. Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine ou l'hygromycine). Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de
<Desc/Clms Page number 38>
terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par des terminateurs de transcription actifs chez Streptomyces. L'insertion de la cassette dans le gène cible peut s'accompagner ou non d'une délétion dans ce gène cible. La taille des régions flanquant la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases. Un deuxième type de cassettes peut être utilisé pour l'inactivation de gènes : des cassettes dites cassettes excisables (cf. ci dessus). Les souches ainsi construites ont été testées pour leur production en spiramycines.
Le gène orfl code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs cytochrome P450. Notamment, la protéine codée par orf1 possède une similitude importante avec la protéine codée par le gène tyll impliquée dans la biosynthèse de tylosine chez Streptomyces fradiae (Merson-Davies, L.A. et al., 1994 ; Numéro d'accès GenBank : S49051 ; Score BLAST : 530). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orfl code également une cytochrome P450. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf1 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 13).
Tableau 13
Figure img00380001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Putative <SEP> cytochrome <SEP> P450 <SEP> YJIB <SEP> 034374 <SEP> 248 <SEP> Cytochrome <SEP> P450
<tb> (Bacillus <SEP> subtilis)
<tb> Cytochrome <SEP> P450 <SEP> 113A1 <SEP> P48635 <SEP> 237 <SEP> Cytochrome <SEP> P450 <SEP>
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> erythraea)
<tb> Cytochrome <SEP> P-450 <SEP> hydroxylase <SEP> AAC46023 <SEP> 208 <SEP> Cytochrome <SEP> P-450
<tb> homolog <SEP> (Streptomyces <SEP> caelestis) <SEP> hydroxylase
<tb>
<Desc/Clms Page number 39>
Figure img00390001
<tb>
<tb> Cytochrome <SEP> P450 <SEP> monooxygénase <SEP> AAC64105 <SEP> 206 <SEP> Cytochrome <SEP> P450
<tb> (Streptomyces <SEP> venezuelae) <SEP> monooxygénase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/2 code une protéine présentant une similitude avec plusieurs protéines de fonctions inconnues (cf. Tableau 14). Notamment, la protéine codée par or/2 possède une similitude relativement importante avec la protéine codée par le gène ORF15x4 de Listonella anguillarum (numéro d'accès GenBank : AAB81630 ; Score BLAST : 113) de fonction inconnue.
Tableau 14
Figure img00390002
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> unknown <SEP> (Campylobacter <SEP> jejuni) <SEP> AAK12959 <SEP> 106 <SEP> Inconnue
<tb> WcgF <SEP> (Bacteroides <SEP> fragilis) <SEP> AAD56738 <SEP> 105 <SEP> Inconnue
<tb> unknown <SEP> (Leptospira <SEP> borgpetersenii) <SEP> AAD <SEP> 12964 <SEP> 96 <SEP> Inconnue
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/2 n'ayant pas d'homologue de fonction connue, son inactivation a été réalisée. Il a pu être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines.
Ceci confirme que le gène or/2 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines.
La protéine codée par ce gène régule ou est responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines.
<Desc/Clms Page number 40>
Le gène orf3 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs aminotransférases. Notamment, la protéine codée par or/3 possède une similitude importante avec une aminotransférase de Streptomyces antibioticus impliquée dans la biosynthèse de l'oléandomycine (Draeger,G., et al.,1999 ; Numéro d'accès GenBank : AAF59939 ; Score BLAST : 431). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf3 code une 3 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse du mycaminose (cf. figure 5). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf3 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 15).
Tableau 15
Figure img00400001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Aminotransférase <SEP> (Streptomyces <SEP> T51111 <SEP> 429 <SEP> Aminotransférase
<tb> antibioticus)
<tb> Transaminase <SEP> (Streptomyces <SEP> AAC68680 <SEP> 419 <SEP> Transaminase
<tb> venezuelae)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
L'inactivation du gène orf3 a été réalisée. Il a ainsi pu être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orf3 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines.
<Desc/Clms Page number 41>
Le gène orf4 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs NDP-glucose synthétases. Notamment, la protéine codée par orf4 possède une similitude importante avec une alpha-D-glucose-1-phosphate thymidylyltransférase de Streptomyces venezuelae (Xue Y et al.,1998 ; Numéro d'accès GenBank : AAC68682 ; Score BLAST 404). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf4 code une NDP-glucose syntéthase responsable de la synthèse du NDP-glucose nécessaire à la biosynthèse des trois sucres atypiques incorporés dans la molécule de spiramycine (cf. figure 4,5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf4 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 16).
Tableau 16
Figure img00410001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Glucose-1-phosphate <SEP> BAA84594 <SEP> 402 <SEP> Glucose-1-phosphate
<tb> thymidyltransférase <SEP> (Streptomyces <SEP> thymidyltransférase
<tb> avermitilis)
<tb> AclY <SEP> (Streptomyces <SEP> galilaeus) <SEP> BAB72036 <SEP> 400 <SEP> dTDP-1-glucose
<tb> synthétase
<tb> Putative <SEP> glucose-1-phosphate <SEP> AAK83289 <SEP> 399 <SEP> glucose-1-phosphate
<tb> thymidyltransférase <SEP> thymidyltransférase
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> spinosa)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf5 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glucose déshydratases. Notamment, la protéine codée par or/? possède une
<Desc/Clms Page number 42>
similitude importante avec une dTDP-glucose 4,6-déshydratase de Streptomyces tenebrarius (Li,T.B. et al., 2001; Numéro d'accès GenBank : AAG 18457, Score BLAST : 476). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène or/5 code une NDP glucose déshydratase nécessaire à la biosynthèse des trois sucres atypiques incorporés dans la molécule de spiramycine (cf. figure 4,5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/3' présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 17).
Tableau 17
Figure img00420001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> DTDP-glucose <SEP> 4,6-déshydratase <SEP> AAK83290 <SEP> 464 <SEP> DTDP-glucose <SEP> 4,6-
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> spinosa) <SEP> déshydratase
<tb> thymidine <SEP> diphosphoglucose <SEP> 4,6- <SEP> AAA68211 <SEP> 445 <SEP> thymidine
<tb> déshydratase <SEP> (Saccharopolyspora <SEP> diphosphoglucose
<tb> eiythraea) <SEP> 4,6-déshydratase
<tb> dTDPglucose <SEP> 4,6-déshydratase <SEP> (EC <SEP> S49054 <SEP> 443 <SEP> dTDPglucose <SEP> 4,6-
<tb> 4.2.1.46) <SEP> - <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> déshydratase
<tb> TDP-glucose-4,6-déshydratase <SEP> AAC68681 <SEP> 421 <SEP> TDP-glucose-4,6-
<tb> (Streptomyces <SEP> venezuelae) <SEP> déshydratase
<tb> SgcA <SEP> (Streptomyces <SEP> globisporus) <SEP> AAF13998 <SEP> 418 <SEP> dNDP-glucose-4,6déshydratase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
<Desc/Clms Page number 43>
Le gène or/6 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs thioestérases. Notamment, la protéine codée par or/0 possède une similitude importante avec une thioestérase de Streptomyces avermitilis (Omura, S. et al., 2001 ; Numéro d'accès GenBank : BAB69315 ; Score BLAST : 234). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène or/6 code également une thioestérase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/6 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 18).
Tableau 18
Figure img00430001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> RifR <SEP> (Amycolatopsis <SEP> mediterranei) <SEP> AAG52991 <SEP> 216 <SEP> Thioestérase
<tb> Thioestérase <SEP> - <SEP> (Streptomyces <SEP> fradiae) <SEP> S49055 <SEP> 215 <SEP> Thioestérase
<tb> Thioestérase <SEP> (Streptomyces <SEP> BAB69188 <SEP> 213 <SEP> Thioestérase
<tb> avermitilis)
<tb> Thioestérase <SEP> II <SEP> (EC <SEP> 3.1.2.-) <SEP> - <SEP> T17413 <SEP> 203 <SEP> Thioestérase
<tb> (Streptomyces <SEP> venezuelae)
<tb> PimI <SEP> protein <SEP> (Streptomyces <SEP> natalensis) <SEP> CAC20922 <SEP> 201 <SEP> Thioestérase
<tb> Thioestérase <SEP> (Streptomyces <SEP> griseus) <SEP> CAC22116 <SEP> 200 <SEP> Thioestérase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/7 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose déshydratases. Notamment, la protéine codée par orf6 possède une similitude importante avec une dNTP hexose 2,3-déshydratase (codée par lé gène
<Desc/Clms Page number 44>
TylCVI) de Streptomycesfradiae impliquée dans la biosynthèse de la tylosine (Merson- Davies,L.A. et al., 1994 ; Numéro d'accès GenBank : AAF29379 ; Score BLAST : 461). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf7 code également une hexose 2-3 déshydratase nécessaire à la biosynthèse de deux sucres atypiques incorporés dans la molécule de spiramycine (cf. figure 4 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf7 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similairechez d'autres organismes (cf. tableau 19).
Tableau 19
Figure img00440001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Rifl8 <SEP> (Amycolatopsis <SEP> mediterranei) <SEP> AAG52988 <SEP> 459 <SEP> Hexose
<tb> déshydratase
<tb> SimB3 <SEP> (Streptomyces <SEP> antibioticus) <SEP> AAK06810 <SEP> 444 <SEP> dNDP-4-keto-6déoxy-glucose-2,3déshydratase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/8 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs aminotransférases. Notamment, la protéine codée par orf8 possède une similitude importante avec une aminotransférase probablement impliquée dans la biosynthèse de la forosamine chez Saccharopolyspora spinosa (Waldron,C. et al., 2001 ; Numéro d'accès GenBank : AAG23279 ; score BLAST : 465). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène or/8 code une 4 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/5' présente une forte
<Desc/Clms Page number 45>
similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 20).
Tableau 20
Figure img00450001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numér <SEP> Score <SEP> Fonction
<tb> significative <SEP> o <SEP> d'accès <SEP> BLAST* <SEP> rapportée
<tb> GenBank
<tb> Putative <SEP> amino-sugar <SEP> biosynthesis <SEP> CAA07666 <SEP> 213 <SEP> Proteine <SEP> impliquée
<tb> protein <SEP> (Bordetella <SEP> bronchiseptica) <SEP> dans <SEP> la <SEP> biosynthèse
<tb> d'amino-sucre
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
L'inactivation du gène orf8 a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène or/8 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines.
Le gène orf9c a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné srmX par Geistlich et al. (Geistlich, M., et al., 1992). La similitude de la protéine codée par ce gène avec plusieurs méthyltransférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que le gène or9c code une méthyltransférase responsable de la réaction de méthylation nécessaire à la biosynthèse du mycaminose ou de la forosamine (cf. figure 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf9c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 21).
<Desc/Clms Page number 46>
Tableau 21
Figure img00460001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> N,N-diméthyltransférase <SEP> AAC68678 <SEP> 240 <SEP> N,N-
<tb> (Streptomyces <SEP> venezuelae) <SEP> diméthyltr <SEP> ansférase <SEP>
<tb>
Figure img00460002

Méthyltransférase (Streptomyces CAA05643 232 Viéthyltransférase
Figure img00460003
<tb>
<tb> antibioticus)
<tb> Putative <SEP> amino <SEP> methylase <SEP> AAFOI819 <SEP> 219 <SEP> Aminométhylase
<tb> (Streptomyces <SEP> nogalater)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf10 a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné srmR par Geistlich et al. (Geistlich,M., et al., 1992). La protéine codée par ce gène est impliquée dans la régulation de la voie de biosynthèse des spiramycines chez Streptomyces ambofaciens. L'inactivation du gène orf10 a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène or/70 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. La protéine codée par ce gène est donc bien essentielle à la biosynthèse des spiramycines.
Le gène orfllc a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné srmB par Geistlich et al. (Geistlich, M. et al., 1992) et Schoner et al. (Schoner B et al., 1992). La protéine codée par ce gène est impliquée dans la résistance à la spiramycine chez Streptomyces ambofaciens et est un transporteur de type ABC.
Le gène orf12 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose déshydratases. Notamment, la protéine codée par or/72 possède une similitude importante avec une NDP-hexose 3,4-déshydratase codée par le gène UrdQ
Figure img00460004

de Streptomyces fi-adiae et impliquée dans la biosynthèse de la tylosine (Hoîfrneister,D.
<Desc/Clms Page number 47>
et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF72550; Score BLAST : 634). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orf12 code une 3,4 déshydratase responsable de la réaction de déshydratation nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/72 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 22).
Tableau 22
Figure img00470001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> AknP <SEP> (Streptomyces <SEP> galilaeus) <SEP> AAF73452 <SEP> 625 <SEP> 3-déshydratase
<tb> NDP-hexose3,4-dehydratasehomolog <SEP> AAD13547 <SEP> 624 <SEP> NDP-hexose <SEP> 3,4-
<tb> (Streptomyces <SEP> cyanogenus) <SEP> déshydratase
<tb> RdmI <SEP> (Streptomyces <SEP> purpurascens) <SEP> AAL24451 <SEP> 608 <SEP> hexose-C-3déshydratase
<tb> Probable <SEP> CDP-4-keto-6-deoxyglucose- <SEP> T46528 <SEP> 602 <SEP> CDP-4-céto-6-
<tb> 3-dehydratase <SEP> (El) <SEP> (Streptomyces <SEP> déoxyglucose-3violaceoruber) <SEP> déshydratase
<tb> Probable <SEP> NDP-hexose-3,4-dehydratase <SEP> AAG23278 <SEP> 582 <SEP> NDP-hexose-3,4-
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> spinosa) <SEP> déshydratase
<tb> dNTP-hexose <SEP> déshydratase <SEP> AAC01730 <SEP> 576 <SEP> dNTP-hexose
<tb> (Amycolatopsis <SEP> mediterranei) <SEP> déshydratase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
<Desc/Clms Page number 48>
5
10 15
L'inactivation du gène or/72 a été réalisée. Il a pu être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène or/72 est bien impliqué dans la biosynthèse de la spiramycine. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse de la spiramycine.
Le gène orf13c code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de fonction inconnue chez Streptomyces coelicolor. Cette protéine a été nommée SC4H2.17 (numéro d'accès GeneBank : T35116; Score BLAST : 619). La protéine codée par le gène orf13c présente également une forte similitude avec d'autres protéines d'autres organismes (cf. tableau 23).
Tableau 23
Figure img00480001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb>
Figure img00480002

hflX protein (Mycobacterium leprae) S72938 473 Inconnue
Figure img00480003
<tb>
<tb> Possible <SEP> ATP/GTP-binding <SEP> protein <SEP> NP~301739 <SEP> 470 <SEP> Protéine <SEP> fixant
<tb> (Mycobacterium <SEP> leprae) <SEP> l'ATP/GTP
<tb> GTP-binding <SEP> protein <SEP> (Mycobacterium <SEP> AAK47114 <SEP> 468 <SEP> Protéine <SEP> fixant <SEP> le
<tb> tuberculosis <SEP> CDC1551) <SEP> GTP
<tb> ATP/GTP-binding <SEP> protein <SEP> T44592 <SEP> 388 <SEP> Protéine <SEP> fixant
<tb>
Figure img00480004

(Streptomyces fradiae) l'ATP/GTP * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Aucune fonction précise n'a été assignée aux protéines proches de celle codée par orf13c. L'inactivation du gène orf13c a été réalisée dans le but d'étudier la fonction de ce gène dans la voie de biosynthèse des spiramycines chez Streptomyces
<Desc/Clms Page number 49>
ambofaciens. Il a pu être montré que la souche résultante produit des spiramycines. Ceci indique que le gène orf13c n'est pas essentiel à la biosynthèse des spiramycines et qu'il n'est pas essentiel à la survie de la bactérie. L'enzyme codée par ce gène n'est donc pas responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines.
Le gène or/14 code une protéine présentant une relative forte similitude avec une réductase putative (Redenbach,M., et al., 1996 ; numéro d'accès GenBank :
Score BLAST : 147). Une analyse des séquences proches obtenues grâce au programme BLAST par le programme COG (cf. ci-dessus) suggère fortement que le gène orfl4 code une 5 épimérase responsable de la réaction d'épimérisation nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4).
L'inactivation du gène or/14 a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène or/14 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines.
Le gène orf15c code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs cétoréductases. Notamment, la protéine codée par orf15c possède une similitude importante avec une 3-cétoréductase chez Streptomyces antibioticus (Numéro d'accès GenBak : T51102, Score BLAST : 285). Cette similitude suggère fortement que le gène orf15c code une 3 céto-réductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf15c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 24).
<Desc/Clms Page number 50>
Figure img00500001
<tb>
<tb> Tableau <SEP> 24
<tb>
Figure img00500002

####-################## 1 ############
Figure img00500003
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> oxidoreductase <SEP> homolog <SEP> (Streptomyces <SEP> AAD13550 <SEP> 272 <SEP> Oxidoréductase
<tb> cyanogenus)
<tb> D-oliose <SEP> 4-cétoreductase <SEP> CAB96550 <SEP> 265 <SEP> D-oliose <SEP> 4-
<tb> (Streptomyces <SEP> argillaceus) <SEP> cétoréductase
<tb> AknQ <SEP> (Streptomyces <SEP> galilaeus) <SEP> AAF73453 <SEP> 263 <SEP> putative <SEP> 3cétoréductase
<tb> Probable <SEP> NDP-hexose-3-ketoreductase <SEP> AAG23275 <SEP> 253 <SEP> NDP-hexose-3-
<tb> (Saccharopolyspora <SEP> spinosa) <SEP> cétoréductase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/16 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs isomérases. Notamment, la protéine codée par or/16 possède une similitude
Figure img00500004

importante avec une NDP hexose 3,4 isomérase chez Streptomyces fradiae (Gandecha et al., 1997 ; Numéro d'accès GenBak : CAA57471, Score BLAST : 209). Cette similitude suggère fortement que le gène or/16 code une NDP hexose 3,4 isomérase responsable de la réaction d'isomérisation nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 5). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf16 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 25).
<Desc/Clms Page number 51>
Tableau 25
Figure img00510001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Putative <SEP> tautomerase <SEP> (Streptomyces <SEP> AAC68676 <SEP> 145 <SEP> Tautomérase
<tb> venezuelae)
<tb> TDP-4-céto-6-déoxyhexose <SEP> 3,4- <SEP> AAG13907 <SEP> 1 <SEP> 112 <SEP> TDP-4-céto-6isomérase <SEP> (Micromonospora <SEP> déoxyhexose <SEP> 3,4megalomicea <SEP> subsp. <SEP> nigra) <SEP> isomérase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/77 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glycosyl transférases. Notamment, la protéine codée par or/77 possède une similitude importante avec une glycosyl transférase de Streptomyces venezuelae (Xue, Y. et al.,1998 ; Numéro d'accès GenBank : AAC68677 ; score BLAST : 400). La similitude de la protéine codée par le gène or/77 avec plusieurs glycosyl transférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code également une glycosyl transférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/1 7 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 26).
Tableau 26
Figure img00510002
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Glycosyltransférase <SEP> (Streptomyces <SEP> CAA57472 <SEP> 399 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> fradiae)
<tb>
<Desc/Clms Page number 52>
Figure img00520001
<tb>
<tb> Glycosyltransférase <SEP> (Streptomyces <SEP> CAA05642 <SEP> 378 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> antibioticus)
<tb> Glycosyltransférase <SEP> (Streptomyces <SEP> CAA05641 <SEP> 360 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> antibioticus)
<tb> Glycosyltransférase <SEP> CAA74710 <SEP> 344 <SEP> Glycosyltransférase
<tb>
Figure img00520002

(Saccharopolyspora erythraea) * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orfl8 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glycosyl transférases. Notamment, la protéine codée par orfl8 possède une similitude importante avec une glycosyl transférase de Streptomyces rishiriensis (Wang et al.,2000; Numéro d'accès GenBank : AAG29785 ; score BLAST: 185). La similitude de la protéine codée par le gène orfl8 avec plusieurs glycosyl transférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code également une glycosyl transférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/78 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 27).
Tableau 27
Figure img00520003
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenB <SEP> ank <SEP>
<tb> NovM <SEP> (Streptomyces <SEP> sphéroïdes) <SEP> AAF67506 <SEP> 184 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> probable <SEP> glycosyl <SEP> transferase <SEP> T46519 <SEP> 169 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> (Streptomyces <SEP> violaceoruber)
<tb>
<Desc/Clms Page number 53>
Figure img00530001

Glycosyl transferase homolog Aad3 167 Glycosylzransférase
Figure img00530002
<tb>
<tb> (Streptomyces <SEP> cyanogenus)
<tb> Glycosyl <SEP> transferase <SEP> homolog <SEP> AAD13555 <SEP> 163 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> (Streptomyces <SEP> cyanogenus)
<tb> dNTP-hexose <SEP> glycosyl <SEP> transférase <SEP> AAC01731 <SEP> 160 <SEP> Glycosyltransférase
<tb> (Amycolatopsis <SEP> mediterranei)
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/7.9 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs cétoréductases. Notamment, la protéine codée par orf19 possède une similitude importante avec une NDP-hexose 4-cétoréductase (TylCIV) de Streptomyces fradiae (Bate et al.,2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAD41822 ; score BLAST : 266). La similitude de la protéine codée par le gène orf19 avec cette cétoréductase impliquée dans la voie de biosynthèse d'un antibiotique proche suggère fortement que ce gène code également une 4-cétoréductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf19 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 28).
Tableau 28
Figure img00530003
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> NDP-4-céto-6-déoxyhexose <SEP> 4- <SEP> AAL14256 <SEP> 251 <SEP> NDP-4-céto-6cétoreductase <SEP> (Streptomyces <SEP> venezuelae) <SEP> déoxyhexose <SEP> 4cétoréductase
<tb>
<Desc/Clms Page number 54>
Figure img00540001

EryBIV (Sacchar-opolyspor-a erythraea) AAB84071 249 oxidoréductase TDP-4-céto-b-déoxyhexose 4- AAG13916 218 TDP-4-céto-6-
Figure img00540002
<tb>
<tb> cétoreductase <SEP> (Micromonospora <SEP> déoxyhexose <SEP> 4megalomicea <SEP> subsp. <SEP> Nigra) <SEP> cétoréductase
<tb> dTDP-4-céto-6-déoxy-L-hexose <SEP> 4- <SEP> BAA84595 <SEP> 212 <SEP> d <SEP> T <SEP> DP-4-céto-6- <SEP>
<tb> réductase <SEP> (Streptomyces <SEP> avermitilis) <SEP> déoxy-L-hexose <SEP> 4réductase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/20 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose réductases. Notamment, la protéine codée par orf20 possède une similitude importante avec le gène EryBII de Saccharopolyspora erythraea qui code une dTDP-4-céto-L-6-déoxy-hexose 2,3-réductase (Summers,R.G., et al., 1997), Numéro d'accès GenBank : AAB84068 ; Score BLAST :491). La similitude de la protéine codée par le gène orf20 avec plusieurs hexose réductases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une 2-3 réductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf20 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 29).
Tableau 29
Figure img00540003
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb>
Figure img00540004

TylCII (Strepto711ycesp-adiae) AAD41821 464 NDP-hexose 2,3-
Figure img00540005
<tb>
<tb> énoyl <SEP> réductase
<tb>
<Desc/Clms Page number 55>
Figure img00550001
<tb>
<tb> TDP-4-céto-6-deoxyhexose <SEP> 2,3- <SEP> AAG13914 <SEP> 446 <SEP> TDP-4-céto-6réductase <SEP> (Micromonospora <SEP> déoxyhexose <SEP> 2,3megalomicea <SEP> subsp. <SEP> Nigra) <SEP> réductase
<tb> dTDP-4-céto-6-déoxy-L-hexose <SEP> 2,3- <SEP> BAA84599 <SEP> 377 <SEP> dTDP-4-céto-6réductase <SEP> (Streptomyces <SEP> avermitilis) <SEP> déoxy-L-hexose
<tb> 2,3-réductase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène or/2 le code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose méthyltransférases. Notamment, la protéine codée par or/2 le possède une similitude importante avec le gène TylCIII de Streptomyces fradiae qui code une NDP-hexose 3-C-méthyltransférase (Bate,N et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAD41823 ;Score BLAST : 669). La similitude de la protéine codée par le gène orf21c avec plusieurs hexose méthyltransférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une hexose méthyltransférase responsable de la réaction de méthylation nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/2 le présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 30).
Tableau 30
Figure img00550002
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> eryH <SEP> (Saccharopolyspora <SEP> erythraea) <SEP> 228448 <SEP> 592 <SEP> Gène <SEP> de
<tb> biosynthèse <SEP> de
<tb> rérythromycine
<tb>
<Desc/Clms Page number 56>
Figure img00560001
<tb>
<tb> S-adenosyl-dependent <SEP> methyl <SEP> AAK71270 <SEP> 358 <SEP> Méthyltransferase
<tb>
Figure img00560002

transferase (CoxieZZa burnetii) i NovU (Streptomyces spheroides) AAF67514 184 C-méthyltransférase * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf22c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gènefkbH de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui code une enzyme impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu, K. et al.,2000; Numéro d'accès GenBank : AAF86387 ; Score BLAST : 463). La similitude de la protéine codée par le gène orf22c avec cette protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre macrolide proche suggère fortement que ce gène code également une enzyme impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl chez Streptomyces ambofaciens (cf. figure 8).
Le gène orf23c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gène fkbI de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K. et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86388 ; Score BLAST 387). La similitude de la protéine codée par le gène orf23c avec plusieurs acyl CoA déshydrogénases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orf23c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 31).
<Desc/Clms Page number 57>
Tableau 31
Figure img00570001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Acyl-CoA <SEP> déshydrogénase <SEP> AAK19892 <SEP> 171 <SEP> Acyl-CoA
<tb> (Polyangium <SEP> cellulosum) <SEP> déshydrogénase
<tb> Probable <SEP> acyl-CoA <SEP> dehydrogenase- <SEP> T36802 <SEP> 160 <SEP> acyl-CoA
<tb> (Streptomyces <SEP> coelicolor) <SEP> déshydrogénase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orf24c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gène fkbJ de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui coderait la protéine de liaison du groupement acyl (Acyl Carrier Protein (ACP)) impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu, K., et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86389 ; Score BLAST : 87). La similitude de la protéine codée par le gène orf24c avec cette protéine impliquées dans la voie de biosynthèse d'un autre macrolide proche suggère fortement que ce gène code une protéine impliquée dansla biosynthèse du méthoxymalonyl chez Streptomyces ambofaciens (cf. figure 8).
Le gène orf25c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gène fkbK de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K., et al., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86390 ; score BLAST : 268). La similitude de la protéine codée par le gène orf25c avec plusieurs acyl CoA déshydrogénases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que
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la protéine codée par le gène orf25c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 32).
Tableau 32
Figure img00580001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> présentant <SEP> une <SEP> similitude <SEP> Numéro <SEP> Score <SEP> Fonction <SEP> rapportée
<tb> significative <SEP> d'accès <SEP> BLAST*
<tb> GenBank
<tb> Probable <SEP> 3-Hydroxybutyryl-CoA <SEP> P45856 <SEP> 177 <SEP> 3-HydroxybutyrylDehydrogenase <SEP> (Bacillus <SEP> subtilis) <SEP> CoA <SEP> déshydrogénase
<tb> 3-hydroxybutyryl-CoA <SEP> dehydrogenase <SEP> AAL32270 <SEP> 174 <SEP> 3-hydroxybutyrylprotein <SEP> (Bacillus <SEP> thuringiensis <SEP> serovar <SEP> CoA <SEP> déshydrogénase
<tb> kurstaki)
<tb>
Figure img00580002

3-hydroxybutyryl-CaA dehydrogenase NP~294792 167 3-hydroxybutyryl-
Figure img00580003
<tb>
<tb> (Deinococcus <SEP> radiodurans) <SEP> CoA <SEP> déshydrogénase
<tb>
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
* La présente invention a également pour objet des polynucéotides s'hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence à au moins l'un des polynucléotides de séquence SEQ ID N 3,5, 7,9, Il, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53,60, 62,64, 66,68, 70,72, 74,76, 78,80, 82 et 84 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. Préférentiellement, cesdit polynucléotides sont isolés à partir d'une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines impliquées dans la biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces polynucléotides codent une protéine ayant une activité similaire à la protéine codée par les polynucléotides avec lesquels ils s'hybrident. Les conditions d'hybridation de forte stringence peuvent être définies comme des conditions d'hybridation défavorisant l'hybridation de brins d'acides nucléiques non homologues.
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Des conditions d'hybridations de forte stringence peuvent être par exemple décrites comme des conditions d'hybridation dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée la température d'hyridation est de 55 C, de manière encore plus préférée la températue d'hybridation est de 60 C et de manière tout à fait préférée la température d'hybridation est de 65 C, suivi d'un ou plusieurs lavages effectué en tampon 2X SSC à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C et de manière tout à fait préférée cette température est de 65 C, suivi d'un ou plusieurs lavages en tampon 0.5X SSC à une température comprise entre 55 C et 65 C, de manière préférée cette température est de 55 C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60 C et de manière tout à fait préférée cette température est de 65 C. Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'ouvrage de F.Ausubel et al., 2002.
L'invention concerne également un polynucléotide ayant au moins 70%, de façon plus préférée 80%, de façon plus préférée 85%, de façon encore plus préférée 90%, de façon encore plus préférée 95% et de manière tout à fait préférée 98% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide comprenant au moins 10,12, 15,18, 20 à 25,30,
Figure img00590001

40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700, 750,800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100,1150, 1200,1250, 1300, 1350, 1400, 1450,
1500, 1550,1600, 1650, 1700,1750, 1800, 1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66,68, 70, 72, 74,76, 78,80, 82 et 84 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique, ou un polynucléotide de séquence complémentaire. Préférentieilement, ces dits polynucléotides sont isolés à partir d'une bactérie du genre Streptomyces, plus
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préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines impliquées dans la biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines ayant des activités similaires aux protéines codées par les polynucléotides avec lesquels ils présentent l'identité. De façon tout à fait préférée, un polynucléotide selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N 3,5, 7,9, 11,13, 15,17, 19, 21,23, 25, 28,30, 34, 36,40, 43, 45,47, 49, 53, 60,62, 64,66, 68, 70,72, 74,76, 78,80, 82 et 84 ou un polynucléotide de séquence complémentaire.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus, par exemple ceux du package FASTA (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être déterminé à l'aide du logiciel LFASTA (Chao K.-M. et al., 1992) ou LALIGN (Huang X. et Miller W., 1991). Les programmes LFASTA et LALIGN font partie du package FASTA. LALIGN retourne les alignements locaux optimaux : ce programme est plus rigoureux, mais aussi plus lent que LFASTA.
Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide résultant de l'expression d'une séquence d'acide nucléique telle que définie ci-dessus. Préferentiellement, les polypeptides selon l'invention présentent au moins 70%, de façon plus préférée 80%, de façon plus préférée 85%, de façon encore plus préférée 90%, de façon encore plus préférée 95% et de manière tout à fait préférée 98% d'identité en acides aminés avec un polypeptide comprenant au moins 10, 15, 20, 30 à 40,50, 60,70, 80, 90,100, 120,140, 160, 180, 200, 220,240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400,420, 440, 460, 480, 500,520, 540,560, 580,600, 620 ou 640 acides aminés consécutifs d'un polypeptide choisi parmi SEQ ID N 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20, 22,24, 26,27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50,51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75,77, 79, 81, 83 et 85 ou l'une de ces séquences excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en
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affecter les propriétés fonctionnelles ou l'un des variant de ces séquences.
Préferentiellement les polypeptides selon l'invention sont exprimés à l'état naturel par une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polypeptides sont impliquées dans la biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces polypeptides ont une activité similaire à celle du polypeptide avec lequel il partage l'identité. De façon préférée, un polypeptide selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des séquences polypeptidiques SEQ ID N 4,6, 8, 10, 12, 14,16, 18,20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41,42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59,61, 63, 65,67, 69,71, 73,75, 77,79, 81, 83 et 85 ou l'une de ces séquences excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles ou l'un des variant de ces séquences. De façon tout à fait préférée, un polypeptide selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des séquences polypeptidiques SEQ ID N 4,6, 8,
Figure img00610001

10,12,14,16,18,20,22,24,26,27,29,31,32,33,35,37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50,51,52,54,55,56,57,58,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,79,81,83 et 85.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus, par exemple ceux du package FASTA (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être déterminé à l'aide du logiciel LFASTA (Chao K.-M. et al., 1992) ou LALIGN (Huang X. et Miller W., 1991), en utilisant les paramètres par défaut tel que défini par le centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. Les programmes LFASTA et LALIGN font partie du package FAST A. LALIGN retourne les alignements locaux optimaux : ce programme est plus rigoureux, mais aussi plus lent que LFASTA.
Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant comprenant au moins un polynucléotide tel que décrit ci-dessus. Préférentiellement ; cet ADN
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recombinant est compris dans un vecteur. Encore plus préféreritiellement, le vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs,
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les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC (Bacterial Artificial
Chromosome) ou les PAC (Pl-derived Artificial Chromosome). A titre illustratif on peut citer comme bactériophages le phage lambda et le phage M13. Comme plasmides on peut citer les plasmides se répliquant chez E. coli par exemple pBR322 et ses dérivés, pUC18 et ses dérivés, pUC19 et ses dérivés, pGB2 et ses dérivés (Churchward
G. et al., 1984), pACYC177 (numéro d'accès GenBank : X06402) et ses dérivés, pACYC184 (numéro d'accès GenBank : X06403) et ses dérivés. On peut également citer les plasmides se répliquant chez Streptomyces comme par exemple pIJlOl et ses dérivés, pSG5 et ses dérivés, SLP1 et ses dérivés, SCP2* et ses dérivés (Kieser et al.
2000). Comme phagemides on peut citer à titre illustratif pBluescript II et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), pGEM-T et ses dérivés (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)), #ZAPII et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)). Comme vecteurs intégratifs on peut citer à titre illustratif, les vecteurs intégratifs chez Streptomyces comme par exemple ceux dérivés de SLP1 (Kieser et al, 2000), ceux dérivés de pSAM2 (Kieser et al, 2000), les vecteurs utilisant les systèmes d'intégration des phages PhiC31 (Kieser et al, 2000) (par exemple pSET152 (Bierman et al., 1992)) ou de VWB (Van Mellaert L, et al. 1998), ainsi que les vecteurs utilisant le système d'intégration de IS117 (Kieser et al. 2000). Comme fosmides on peut citer à titre illustratif le fosmide pFOS1 (commercialisé par la société New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) et ses dérivés. Comme cosmides on peut citer à titre illustratif le cosmide SuperCos et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), le cosmide pWED15 (Wahl et al., 1987) et ses dérivés. Comme vecteurs navettes on peut citer à titre illustratif les plasmides navettes E. coli / Streptomyces comme par exemple pIJ903 et ses dérivés, la série des plasmides pUWL, pCA0106, pWHM3, pOJ446 et leurs dérivés (Kieser et al. 2000), les BAC navettes E. coli / Streptomyces comme par exemple ceux décrits dans la demande de brevet WO 01/40497. Comme BAC (Bacterial Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le BAC pBeloBACll (numéro d'accès GenBank :U51113). Comme PAC (Pl-derived Artificial
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Chromosome) on peut citer à titre illustratif le vecteur pCYPAC6 (numéro d'accès
GenBank : AF133437). De façon tout à fait préférée, un vecteur selon l'invention est choisi parmi pOS49.1, pOS49.11, pOSC49. 12, pOS49. 14, pOS49.16, pOS49. 28, pOS44.1, pOS44. 2, pOS44. 4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, pOS49.88, pOS49.106, pOS49. 120, pOS49. 107, pOS49.32, pOS49. 43, pOS49. 44, pOS49.50, pOS49. 99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPMl, pBXLllll,pBXL1112,pBXL1113.
Un autre aspect de l'invention concerne un système d'expression comprenant un vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides tels que décrits ci-dessus dans un système biologique. Les vecteurs d'expression selon l'invention comprennent une séquence d'acide nucléique codant un ou plusieurs polypeptides tels que décrits ci-dessus et peuvent être destinés à l'expression des différents polypeptides selon l'invention dans diverses cellules hôtes bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer les systèmes d'expression procaryote comme les systèmes d'expression chez la bactérie E. coli, les sytèmes d'expression eucaryotes, comme le système d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de levures, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de mammifères, notamment des cellules humaines. Les vecteurs d'expression utilisables dans de tels systèmes sont bien connus de l'homme du métier, en ce qui concerne les cellules procaryotes, on peut citer à titre illustratif les vecteurs d'expression chez E. coli par exemple, de la famille pET commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), les vecteurs de la famille GATEWAY commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pBAD commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pMAL commercialisés par la société New England Bioloabs Inc. (Beverly, Massachussetts, USA), les vecteurs d'expression inductibles par le rhamnose cités dans la publication Wilms B et al., 2001 et leurs dérivés, on peut également citer les vecteurs d'expression chez Streptomyces comme par exemple les vecteurs pIJ4123, pIJ6021, pPM927, pANT849, pANT 850,
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pANT 851, pANT1200, pANT1201, pANT1202 et leurs dérivés (Kieser et al., 2000).
En ce qui concerne les cellules de levures, on peut citer à titre illustratif le vecteur pESC commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). En ce qui concerne le système d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes on peut citer à titre illustratif le vecteur BacPAK6 commercialisé par la société BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, Californie, USA). En ce qui concerne les cellules de mammifères, on peut citer à titre illustratif des vecteurs comprenant le promoteur des gènes précoces du virus CMV (Cytomegalovirus) (par exemple le vecteur pCMV et ses dérivés commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), ou le promoteur des gènes immédiats (SV40 early promoter) du virus simien vacuolisant SV40 (par exemple le vecteur pSG5 commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA).
L'invention est également relative à un procédé de production d'un polypeptide tel que décrit ci-dessus ledit procédé comprenant les étapes suivantes: a) insérer un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (2002). On peut citer à
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titre illustratif la technique du Tag-Histidine , qui consiste à ajouter une courte séquence poly-histidine au polypeptide à produire, ce dernier pouvant ensuite être purifié sur colonne de nickel. Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques de synthèse in vitro. A titre illustratif de telles techniques, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé grâce au système rapid translation system (RTS) , commercialisé notamment par la société Roche Diagnostics France
S.A, Meylan, France.
Un autre aspect de l'invention concerne des cellules hôtes dans laquelle a été introduit au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'invention.
Un autre aspect de l'invention concerne des microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse d'au moins un macrolide. L'intérêt réside d'une part dans l'étude de la fonction des protéines mutées et d'autre part dans la réalisation de microorganismes produisant des intermédiaires de biosynthèse. Ces intermédiaires peuvent être modifiés, éventuellement après séparation, soit par ajout de composants particuliers dans les milieux de production, soit par introduction dans les microorganismes ainsi mutés d'autres gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat. Ces intermédiaires peuvent ainsi être modifiés par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.
Les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides peuvent être obtenus en inactivant la fonction d'une ou plusieurs protéines impliquées dans la biosynthèse de ce ou de ces macrolides dans des microorganismes producteurs de ce ou de ces macrolide. Selon la ou les protéines inactivées, on pourra ainsi obtenir des microorganismes bloqués dans les différentes étapes de la voie de biosynthèse de ce ou de ces macrolides. L'inactivation de cette ou de ces protéines peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par mutagénèse dans le ou les gènes codant ladite ou lesdites protéines ou par l'expression d'un ou de plusieurs ARN anti-sens complémentaires de l'ARN ou des ARN messagers codant ladite ou lesdites protéines. La mutagénèse peut, par exemple, être effectuée par irradiation, par
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action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée, par remplacement de gène ou toute autre méthode connue de l'homme du métier. Les conditions convenables d'une telle mutagénèse peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans les ouvrages de Kieser, T et al (2000) et Ausubel et al., (2002). La mutagénèse peut être effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique.
Cette mutagénèse peut être effectuée dans un gène comprenant une séquence telle que décrite ci-dessus. Préférentiellement, les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides sont des bactéries du genre Streptomyces. Plus préférentiellement, l'inactivation de la fonction d'une ou plusieurs protéines impliquées dans la biosynthèse du ou des macrolides en question est effectuée par mutagénèse.
Encore plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches de S. ambofaciens. Plus préférentiellement, la mutagénèse est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23,25, 28,30, 34, 36, 40,43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64,66, 68,70, 72,74, 76,78, 80,82 et 84. De façon préférée, la ou les mutagénèses sont effectuées par inactivation génique. De façon tout à fait préférée, la mutagénèse consiste en l'inactivation génique d'un gène comprenant une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N 13.
A titre illustratif, les microorganismes suivants peuvent être cités à titre d'exemple
Figure img00660001

de tels microorganismes : OS49.16 (or/3:: ,2hyg, cf. exemple 2), OS49.67 (orf3délétion en phase, cf exemple 6), OS49. 107 (or/8;: #hyg, cf. exemple 7), OS49.50
Figure img00660002

(or/10:: Qhyg, cf. exemple 8), SPM21 (orf2::att3Qaac-, cf. exemple 10), SPM22 (or,1'2::att3 délétion en phase, cf. exemple 10), SPM501 (orf6*::attlQhyg+, cf. exemple 14), SPM502 (orf6*::attl délétion en phase, cf. exemple 14), SPM507 (orfl2::att3.aac-, cf. exemple 11), SPM508 (orfl3c::att3Qaac-, cf. exemple 12), SPM509 (orf14::att3#acc-, cf. exemple 13).
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Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse de macrolide utilisant les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides, tels que décrits ci-dessus. Le procédé consiste à cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme bloqué dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides, tels que décrits ci-dessus, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, par exemple par sonication ou par choc osmotique, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente, ledit intermédiaire de biosynthèse.
Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. (2000) en ce qui concerne la culture des Streptomyces. L'intermédiaire produit peut être récupéré par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une molécule dérivée d'un macrolide utilisant les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de ce macrolide, tels que décrits ci-dessus. Le procédé consiste à obtenir un intermédiaire de biosynthèse selon le procédé ci-dessus et à modifier l'intermédiaire ainsi produit, éventuellement après séparation du milieu de culture. Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. Les intermédiaires produits peuvent être modifiés, éventuellement après séparation, soit par ajout de composants appropriés dans les milieux de production, soit par introduction dans les microorganismes d'autres gènes codant des protéines susceptibles de modifier
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l'intermédiaire en s'en servant comme substrat. Ces intermédiaires peuvent ainsi être modifiés par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique. Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches de S. ambofaciens.
L'invention est également relative à un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III. Ce microorgani sme comprend l'ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de la spiramycine I mais ne produit pas de spiramycine II et III car le gène comprenant la séquence correspondant à
SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence
SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants n'est pas exprimé ou a été rendu inactif.
L'inactivation de cette protéine peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par mutagénèse dans le gène codant ladite protéine ou par l'expression d'un ARN anti-sens complémentaire de l'ARN messager codant ladite protéine, étant entendu que si l'expression de or/?* est affectée par cette manipulation, il sera nécessaire de procéder à une autre modification pour que le gène or/3* soit correctement exprimé. La mutagénèse peut être effectuée dans la séquence codante ou dans une séquence non codante de manière à rendre inactive la protéine codée ou à en empêcher son expression ou sa traduction. La mutagénèse peut être effectuée par mutagénèse dirigée, par remplacement de gène ou toute autre méthode connue de l'homme du métier. Les conditions convenables d'une telle mutagénèse peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans les ouvrages de Kieser, T et al (2000) et Ausubel et al., 2002. La mutagénèse peut être effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique. Le microorganisme peut être également obtenu en exprimant les gènes de la voie de biosynthèse de la spiramycine sans que ceux-ci ne comprennent le gène comprenant la séquence SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses
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variants. Préférentiellement, le microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.
Plus préférentiellement, le microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III est obtenu à partir d'un microorganisme de départ produisant les spiramycines I, II et III. Encore plus préférentiellement, le microorganisme est obtenu par mutagénèse dans un gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants ayant la même fonction. Encore plus préférentiellement, cette mutagénèse est effectuée par inactivation génique. De manière préférée le microorganisme est obtenu à partir d'une souche de S. ambofaciens produisant les spiramycines I, II et III dans laquelle est effectuée une inactivation génique du gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. A titre illustratif, la souche SPM502 (orf6*::att1, cf. exemple 14) peut être citée comme un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III.
L'invention est également relative à un procédé de production de spiramycine I, le procédé consiste à cultiver dans un milieu de culture approprié un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III tel que décrit ci-dessus, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente la spiramycine I. Les conditions de culture de tel microorganisme pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. La spiramycine I produite peut être récupérée par toutes techniques connues de l'homme du métier.
L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le
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brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'invention pour améliorer la production en macrolides d'un microorganisme. Ainsi, l'invention concerne un microorganisme mutant producteur de macrolide caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique dans au moins un gène comprenant une séquence telle que définie ci-dessus et/ou qu'elle surexprime au moins un gène comprenant une séquence telle que définie ci-dessus. La modification génétique peut consister en une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés dans le but d'exprimer une ou des protéines ayant une activité supérieure ou d'exprimer un niveau plus élevé de cette ou de ces protéines. La surexpression du gène considéré peut être obtenue en augmentant le nombre de copies de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. On peut citer à titre d'illustration le promoteur ptrc actif chez Streptomyces ambofaciens (Amann, E. et al., 1988) ainsi que le promoteur ermE* (Bibb et al., 1985), (Bibb et al., 1994). Ainsi la surexpression du gène considéré peut être obtenue en apportant dans un microorganisme producteur du macrolide considéré une construction d'ADN recombinant selon l'invention, permettant la surexpression de ce gène. En effet, certaines étapes de la biosynthèse des macrolides sont limitantes et si l'on exprime une ou plusieurs protéines plus actives ou un niveau d'expression plus important de la ou des protéines sauvages impliquées dans ces étapes limitantes, on peut améliorer la production du ou des macrolides concernés. Une augmentation du taux de production de la tylosine a par exemple été obtenue chez Streptomyces fradiae par duplication du gène codant une methyl transférase limitante convertissant la macrocine en tylosine (Baltz R, 1997). L'obtention de l'expression d'une protéine plus active peut être obtenue notamment par mutagénèse, l'homme du métier pourra par exemple se référer à ce sujet à l'ouvrage de F.Ausubel et al (2002). Préférentiellement, ces microorganismes mutants améliorés pour leur production en macrolides sont des bactéries du genre Streptomyces.
Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches
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de S. ambofaciens. Plus préférentiellement, la modification génétique est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3, 5, 7, 9,11,13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60,62, 64,66, 68,70, 72,74, 76, 78,80, 82 et 84 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. De façon préférée, le microorganisme surexprime un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID
Figure img00710001

? 3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,28,30,34,36,40,43,45,47,49,53,60,62, 64,66, 68,70, 72,74, 76,78, 80,82 et 84 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de macrolides utilisant les microorganismes décrits au paragraphe précédent. Ce procédé consiste à cultiver dans un milieu de culture approprié un microorganisme défini dans le paragraphe précédent, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente le ou les macrolides produits. Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. Le ou les macrolides produits peuvent être récupérés par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet. Préférentiellement, les microorganismes utilisés dans un tel procédé sont des bactéries du genre Streptomyces. Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes mutants améliorés pour leur production en spiramycines sont des souches de S. ambofaciens.
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Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence et/ou d'un vecteur selon l'invention pour la préparation d'antibiotiques hybrides. En effet, les polynucléotides selon l'invention peuvent servir à l'obtention de microorganismes exprimant une ou plusieurs protéines mutantes donnant lieu à une modification dans la spécificité du substrat ou encore être exprimés dans de multiples microorganismes producteurs d'antibiotiques dans le but de générer des antibiotiques hybrides. Ainsi les polynucléotides selon l'invention peuvent permettre, par transfert des gènes entre microorganismes producteurs, de fabriquer des antibiotiques hybrides ayant des propriétés pharmacologiquement intéressantes (Hopwood et al.,1985a, Hopwood et al.,1985b, Hutchinson et al.,1989). Le principe par lequel l'ingénierie génétique peut conduire à la production d'antibiotiques hybrides a été tout d'abord proposé par Hopwood (Hopwood 1981). Il a ainsi été proposé que les enzymes participant à la biosynthèse d'antibiotiques acceptent souvent des substrats reliés structurellement, mais différents de leur substrat naturel. Il est généralement admis (Hopwood 1981, Hutchinson 1988, Robinson 1988) que les enzymes codées par les gènes de la voie de biosynthèse d'antibiotiques ont une spécificité de substrat moins stricte que les enzymes du métabolisme primaire. Il a ainsi pu être montré qu'un grand nombre de substrats nonnaturels sont transformés par des microorganismes producteurs d'antibiotique, leur mutants ou des enzymes purifiées de la voie de biosynthèse de ces antibiotiques (Hutchinson 1988). En utilisant cet enseignement, l'homme du métier pourra construire des microorganismes exprimant une ou plusieurs protéines mutantes donnant lieu à une modification dans la spécificité du substrat dans le but de générer des antibiotiques hybrides.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un polypeptide et/ou au moins une cellule hôte selon l'invention pour réaliser une ou plusieurs bioconversions. Ainsi l'invention permet de construire des souches bactériennes ou fongiques dans lesquelles on exprime, sous le contrôle de signaux d'expression appropriés, une ou plusieurs protéines selon l'invention. De telles souches peuvent alors être utilisées pour réaliser une ou des bioconversions. Ces bioconversions
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peuvent se faire soit à l'aide de cellules entières, soit à l'aide d'extraits acellulaires des dites cellules. Ces bioconversions peuvent permettre de transformer une molécule en une forme dérivée, avec une enzyme d'une voie de biosynthèse. Par exemple, Carreras et al. décrit l'utilisation de souche de Saccharopolyspora erythraea et de Streptomyces coelicolor pour la production de nouveau dérivés d'érithromycines (Carreras et al.,
2002). Walczar et al. décrit l'utilisation d'une P450 mono-oxygénase de Streptomyces pour la bioconversion de désacétyladriamycine (un analogue de l'anthracycline) en de nouvelles anthracyclines (Walczar et al., 2001). Olonao et al. décrit l'utilisation d'une souche de Streptomyces lividans modifiée pour la bioconversion de rhodomycinone- epsilon en rhodomycine D (Olonao et al., 1999). L'homme du métier pourra appliquer ce principe à tout intermédiaire de biosynthèse.
LISTE DES FIGURES Figure 1 : Structure chimique des spiramycines I, II et III.
Figure 2 : Cosmides utilisés pour le séquençage de la région.
Figure 3 : Organisation du groupe de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des spiramycines.
Figure 4 : Voie de biosynthèse proposée du mycarose.
Figure 5 : Voie de biosynthèse proposée du mycaminose.
Figure 6 : Voie de biosynthèse proposée de la forosamine.
Figure 7 : Ordre préférentiel d'ajout des sucres dans la molécule de spiramycine et intermédiaires.
Figure 8 : Voie de biosynthèse proposée du méthoxymalonyl chez S. ambofaciens. Cette voie est proposée par analogie avec la biosynthèse du méthoxymalonyl chez Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (Wu,K. et al.,2000).
Figure 9 : Etapes conduisant à l'inactivation d'un gène:
A) Clonage du gène cible dans un vecteur se répliquant chez E. coli et pas chez
Streptomyces ;
B) Insertion de la cassette dans le gène cible (par clonage ou recombinaison entrecourtes séquences identiques);
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C) Introduction du plasmide chez Streptomyces ambofaciens (par transformation ou conjugaison) et sélection des clones ayant intégré la cassette puis criblage de clones ayant perdu la partie vecteur pour avoir un remplacement de gène;
D) Souche mutante dans laquelle le gène cible est inactivé.
Figure 10 : Etapes optionnelles suivant l'inactivation d'un gène selon la méthode décrite en figure 9, pouvant être conduites si une cassette excisable a été employée pour interrompre le gène cible :
E) Introduction dans la souche mutante du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 dont les produits vont permettre l'excision efficace par recombinaison spécifique de site de la cassette;
F) Obtention de clones ayant perdu la cassette excisable et sensibles à l'antibiotique à laquelle la cassette donnait la résistance;
G) Après croissance et sporulation sur milieu solide sans antibiotique le plasmide pOSV508 est perdu à haute fréquence. On peut obtenir des clones sensibles au thiostrepton dans lesquels le gène cible contient une délétion en phase. La séquence du gène cible délété peut être contrôlée par PCR et séquençage du produit PCR.
Figure 11 : Amplification de la cassette excisable dans le but de l'utiliser pour une expérience de recombinaison homologue. La technique de recombinaison homologue grâce à de courtes séquences homologues a été décrite par (Chaveroche et al., 2000). Les 39 ou 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence du gène à inactiver et les 20 déoxynucléotides situés le plus en 3' correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable.
Figure 12 : Obtention d'une construction pour l'inactivation d'un gène cible grâce à la technique décrite par (Chaveroche et al., 2000).
Figure 13 : Carte du plasmide pWHM3. Strepto ori : origine de réplication Streptomyces.
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Figure 14 : Carte du plasmide pOSV508.
Figure 15 : Exemple de structure d'une cassette excisable. Celle-ci est constituée de la cassette #hyg (Blondelet-Rouault et al., 1997) bordée des sites attR et attL (Raynal et al., 1998), entre lesquels un événement de recombinaison permettra l'excision de la cassette, grâce à l'expression des gènes xis et int.
Figure 16 : Carte du plasmide pBXLl 111.
Figure 17 : Carte du plasmide pBXLl 112.
Figure 18 : Test microbiologique de production en spiramycine, basé sur la sensibilité d'une souche de Micrococcus luteus à la spiramycine. La souche de Micrococcus luteus utilisée est une souche naturellement sensible à la spiramycine mais résistante à la congocidine. Les différentes souches de Streptomyces à tester ont été cultivées en erlenmeyers de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5, inoculés à une concentration initiale de 2.5 106spores/ml et mises à pousser à 27 C sous agitation orbitale de 250 rpm. Des prélèvements de moûts de fermentation ont été réalisés après 48,72 et 96 heures de culture et centrifugés. Une dilution au dixième de ces surnageants dans du milieu de culture stérile est utilisée pour le test. La souche indicatrice de Micrococcus luteus résistante à la congocidine mais sensible à la spiramycine (Gourmelen et al., 1998) a été cultivée dans une boîte carrée de 12x12 cm. Des disques en papier Whatman AA ont été imbibés de 70 l de la dilution au dixième de chaque surnageant et déposés sur la surface de la boîte. Des disques imbibés d'une solution de spiramycine de différentes concentrations (2-4-8 g/ml dans du milieu de culture MP5) sont utilisés comme gamme étalon. Les boîtes sont incubées à 37 C pendant 24 à 48h. Si le disque contient de la spiramycine, celle-ci diffuse dans l'agar et inhibe la croissance de la souche indicatrice de Micrococcus luteus. Cette inhibition crée un halo autour du disque, ce halo reflétant la zone où la souche de Micrococcus luteus n'a pas poussé. La présence de ce halo est donc une indication de la présence de spiramycine et permet de déterminer si la souche de S. ambofaciens correspondant au disque en question est productrice ou non productrice de spiramycine. Une comparaison avec les diamètres d'inhibition obtenus pour la gamme étalon permet d'obtenir une indication de la quantité de spiramycine produite par cette souche.
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Figure 19: Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche OSC2.
Figure 20 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM501.
Figure 21 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM502.
Figure 22 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM507.
Figure 23 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM508.
Figure 24 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM509.
Figure 25 : Alignement de la protéine Orf3 (SEQ ID N 29) avec la protéine TylB (SEQ ID N 87) de S. fradiae réalisé grâce au programme FASTA.
Figure 26 : Alignement de la protéine MdmA de S. mycarofaciens (SEQ ID N 88) avec la protéine SrmD (SEQ ID N 16) réalisé grâce au programme FASTA.
Figure 27 : Exemple de séquences des sites résiduels après excision de la cassette excisable. En gras est indiqué le site att26 minimum tel que défini dans Raynal et al., 1998. La séquence de la phase 1 (attl) de 33 nucléotides est présentée en SEQ ID N 104, la séquence de la phase 2 (att2) de 34 nucléotides est présentée en SEQ ID N 105, la séquence de la phase 3 (att3) de 35 nucléotides est présentée en SEQ ID N 95.
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La présente invention est illustrée à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
En résumé, les gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines ont été isolés à partir d'une banque d'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens. Cette banque a été obtenue par digestion partielle de l'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens, par l'enzyme de restriction BamHI. De larges fragments d'ADN, de 35 à 45 kb en moyenne, ont été clonés dans le cosmide pWED1 (Gourmelen et al., 1998) dérivé du cosmide pWED15 (Wahl et al., 1987). Ces cosmides ont été introduits chez E. coli grâce à des particules phagiques. La banque ainsi obtenue a été hybridée avec une sonde (de séquence SEQ ID N 86) correspondant à une partie du gène tylB de S. fradiae (MersonDavies & Cundliffe, 1994, numéro d'accès GenBank : U08223). Après hybridation, un cosmide sur les 4 s'hybridant avec la sonde a été plus particulièrement sélectionné. Ce cosmide nommé pOS49. 1 a ensuite été digéré par SacI et un fragment de 3,3 kb contenant la région s'hybridant avec la sonde a été sous cloné dans le vecteur pUC19 et séquence. Quatre phases ouvertes de lectures ont été identifiées et l'une d'entre elles code une protéine (SEQ ID N 29) présentant de fortes similitudes de séquence avec la protéine TylB de S. fradiae (SEQ ID N 87) (cf. figure 25). Ce gène a été nommé or/3 (SEQ ID N 28) et a été inactivé chez S. ambofaciens. Il a pu être démontré que les clones inactivés dans le gène or/3 ne produisent plus de spiramycines. Ceci montre l'implication du gène orf3 ou de gènes situés en aval dans la biosynthèse des spiramycines.
Une fois cette confirmation obtenue, une plus grande région du cosmide pOS49.1 a été séquencée, de part et d'autre du fragment SacI précédemment étudié. Ainsi, à partir du cosmide pOS49. 1, la séquence d'une région comportant sept phases ouvertes de lecture entières et deux autres incomplètes, situées de part et d'autre de ces sept phases ouvertes complètes, a pu être obtenue. Grâce à une recherche dans les bases de données, il a pu être montré que l'une des phases ouvertes de lecture incomplète correspondait au locus srmG (région codant une enzyme appelée polyketide synthase (?KS)). Les gènes correspondants ont été clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US
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5,945,320). Par ailleurs, les autres phases ouvertes de lecture, les sept ORFs entières
Figure img00780001

nommées : or/7, or/2, or/3, or f4, O1f5, or/6, oif7 (SEQ ID 1T 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40) et le début de la huitième ORF nommé orf8 (séquence SEQ ID N 43.) n'ont pas été retrouvées dans les bases de données.
Dans un deuxième temps et dans le but de cloner d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, d'autres cosmides comportant des fragments du génome de S. ambofaciens dans cette même région ont été isolés. Pour cela une nouvelle série d'hybridations sur colonies a été effectuée en utilisant trois sondes. La première sonde correspond à un fragment d'ADN de 3,7kb contenant orf1, or/2 et le début de or/3, sous cloné à partir de pOS49.1. La deuxième sonde correspond à un fragment de 2 kb d'ADN contenant une partie de or/7 et une partie de orf8 et sous cloné à partir de pOS49.1. Une troisième sonde a également été utilisée. Cette dernière correspond à un fragment d'ADN de 1.8 kb contenant le gène srmD. Le gène srmD est un gène isolé de S. ambofaciens capable de conférer la résistance à la spiramycine. En effet, des travaux antérieurs avaient permis le clonage de plusieurs déterminants de résistance de S. ambofaciens, conférant la résistance à la spiramycine à une souche de S. griseofuscus (souche sensible à la spiramycine) (Pernodet et al., 1993) (Pernodet et al., 1999). Pour l'isolement de gènes de résistances, une banque cosmidique de l'ADN génomique de la souche S. ambofaciens avait été réalisée dans le cosmide pKC505 (Richardson MA et al., 1987). Ce pool de cosmides avait été introduit chez S. griseofuscus, naturellement sensible à la spiramycine. Cinq cosmides capables de conférer la résistance à l'apramycine et la spiramycine chez S. griseofuscus avaient ainsi été obtenus. Parmi ces 5 cosmides, un cosmide nommé pOS44. 1 possède dans son insert le gène srmD qui code une protéine présentant une certaine similitude avec la protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens et impliquée dans la résistance à la midécamycine chez cet organisme producteur (Hara et al., 1990, numéro d'accès Genbank : A60725) (figure 26). La troisième sonde utilisée pour localiser les gènes de biosynthèse de spiramycine a été un insert d'environ 1.8kb comprenant le gène srmD.
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Ces trois sondes ont été utilisées pour hybrider la banque d'ADN génomique décrite ci-dessus et ont permis de choisir deux cosmides (pSPM7 et pSPM5) susceptibles de contenir les inserts les plus longs et n'ayant pas de bandes communes.
Le cosmide pSMP5 hybridait avec la première et la deuxième sonde, mais n'hybridait pas avec la troisième sonde, alors que le cosmide pSPM7 hybridait avec la troisième sonde seulement. Ces deux cosmides ont été séquences en totalité par la technique du séquençage en aveugle ( shotgun sequencing ). Les séquences des inserts de ces deux cosmides : pSPM7 et pSPM5 ont pu être assemblées car bien que ne se chevauchant pas, chacun des inserts comprenait une séquence connue à l'une de ses extrémités. En effet, chacun de ces inserts comportait un fragment de la séquence d'un des gènes codant une enzyme appelée polyketide synthase (PKS). Ces 5 gènes ont été clonés par Burgett
S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320) (cf. figure 2). Ainsi, il a pu être déterminé une séquence unique d'ADN génomique de S. ambofaciens. Une séquence de 30943 nucléotides partant, en 5', d'un site EcoRI situé dans le premier gène PKS et allant jusqu'à un site BamHI en 3' est présentée en SEQ ID N 1. Cette séquence correspond à la région amont des gènes de la PKS (cf. figure 2 et 3). Une deuxième région de 11171 nucléotides, partant d'un site PstI en 5' et allant jusqu'à un site BstEII en 3' situé dans le cinquième gène de la PKS est présentée en SEQ ID N 2. Cette région est la région aval des gènes de la PKS (l'aval et l'amont étant définis par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figures 2 et 3).
EXEMPLE 1 : Construction d'une banque d'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens chez E. coli 1.1. Extraction de l'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens.
La souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens (accessible notamment auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginie, USA), sous le numéro 23877) a été cultivée en milieu YEME (Yeast Extract-Malt Extract) ((Kieser,
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T, et al.,2000) et l'ADN génomique de cette souche a été extrait et purifié selon les techniques standards de lyse et précipitation (Kieser T. et al., 2000).
1.2. Construction de la banque d'ADN génomique
L'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens tel qu'isolé ci-dessus a été digéré partiellement par l'enzyme de restriction BamHI de manière à obtenir des fragments d'ADN de taille comprise entre environ 35 et 45 kb. Ces fragments ont été clonés dans le cosmide pWED1 (Gourmelen et al., 1998) digéré au préalable par BamHl. Le cosmide pWEDl est dérivé du cosmide pWE15 (Wahl, et al., 1987) par délétion du fragment HpaI-HpaI de 4. 1 kb contenant le module d'expression actif chez les mammifères (Gourmelen et al., 1998). Le mélange de ligation a ensuite été encapsidé in vitro dans des particules de phages lambda grâce au système Packagene# Lambda DNA packaging system commercialisé par la société Promega en suivant les recommandations du fabriquant. Les particules phagiques obtenues ont été utilisées pour infecter la souche SURE d'E. coli commercialisée par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). La sélection des clones a été effectuée sur milieu LB + ampicilline (50 g/ml) puisque le cosmide pWEDl confère la résistance à l'ampicilline.
EXEMPLE 2 : Isolement et caractérisation de gènes impliqués dans la biosynthèse de spiramycines chez Streptomyces ambofaciens 2. 1 Hybridation sur colonie des clones d'E. coli de la banque génomique de Streptomyces ambofaciens ATCC23877
Environ 2000 clones d'E. coli de la banque obtenue ci-dessus, ont été transférés sur filtre pour hybridation sur colonies. La sonde utilisée pour l'hybridation est un fragment NaeI-NaeI d'ADN (SEQ ID N 86) comportant une partie du gène tylB de
Figure img00800001

Streptomyces fradiae. Ce fragment correspond aux nucléotides 2663 à 3702 du fragment d'ADN décrit par Merson-Davies, L. A. & Cundliffe E. (Merson-Davies, L. A. &
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Cundliffe E., 1994, numéro d'accès GenBank : U08223), dans lequel la séquence codante du gène tylB correspond aux nucléotides 2677 à 3843.
Le fragment NaeI-NaeI d'ADN portant une partie du gène tylB de Streptomyces fi-adiae (SEQ ID N 86) a été marquée au 32P par la technique du random priming (Kit commercialisé par la société Roche) et utilisé comme sonde pour l'hybridation des 2000 clones de la banque, transférés sur filtre. Les membranes utilisées sont des membranes nylon Hybond N commercialisées par la société Amersham (Amersham Biosciences, Orsay, France) et l'hybridation a été effectuée à 55 C dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Un lavage a été effectué en 2X SSC à 55 C pendant 15 minutes et deux lavages successifs en 0.5X SSC ont ensuite été effectués à 55 C, d'une durée de 15 minutes chacun. Dans ces conditions d'hybridation et de lavage, 4 clones parmi les 2000 hybridés présentaient un fort signal d'hybridation.
Ces 4 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 g/ml) et les 4 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline standard (Sambrook et al., 1989). Il a ensuite été vérifié que l'hybridation était bien due à un fragment d'ADN présent dans l'insert de ces quatre cosmides. Pour cela, les cosmides ont été digérés indépendamment par plusieurs enzymes (BamHI, PstI et SacI). Les produits de digestions ont été séparés sur gel d'agarose, transférés sur membrane Nylon et hybridés par le fragment Nael-NaeI
Figure img00810001

d'ADN comportant une partie du gène tylB de Streptomycesfi-adiae (cf. ci-dessus) dans les mêmes conditions que ci-dessus. Les quatres cosmides ont pu être validés et un de ces cosmides a été plus particulièrement retenu et a été nommé pOS49.1.
2. 2 Vérification de l'implication de la région identifiée et séquencage de l'insert du cosmide pOS49.1
Le cosmide pOS49. 1 a été digéré par l'enzyme SacI et il a été montré par Southem blot, dans les conditions décrites précédemment, qu'un fragment de 3,3 kb contient la région s'hybridant avec la sonde tylB. Ce fragment de 3,3 kb a été isolé par électroélution à partir d'un gel d'agarose 0. 8% puis cloné dans le vecteur pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) et séquence. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé
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pOS49.11. Quatre phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces ont pu être identifiées dans ce fragment (deux complètes et deux tronquées), grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Des comparaisons de séquences grâce au programme FASTA (cf.. (Pearson W. R & D. J.
Lipman, 198S) et (Pearson W. R., 1990), accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France) ont permis de montrer que la protéine déduite de l'une de ces 4 phases ouvertes de lecture présente de fortes similitudes de séquence avec la protéine TylB (SEQ ID N 87 ; Numéro d'accès GenBank : U08223) de S. fradiae (cf. figure25). Cette protéine a été nommée Orf3 (SEQ ID N 29).
Dans le but de tester si le gène correspondant (le gène orf3 (SEQ ID N 28)) était impliqué dans la biosynthèse des spiramycines chez S. ambofaciens, ce gène a été interrompu par une cassette #hyg (Blondelet-Rouault M-H. et al., 1997, numéro d'accès GenBank : X99315). Pour cela, le plasmide pOS49.11a été digéré par l'enzyme XhoI et le fragment contenant les quatre phases ouvertes de lecture (deux complètes et deux tronquées, dont or/3 en entier) a été sous-cloné au niveau du site Xhol du vecteur pBC SK+ commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Califormie, USA). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49. 12. Dans le but d'inactiver or/3, un fragment PmlI- BstEII interne à or/3 a été remplacé par la cassette #hyg par clonage bout franc dans ce dernier plasmide. Pour cela, le plasmide pOS49. 12 a été digéré par les enzymes PmlI et BstEII dont le site unique se trouve dans la séquence codante du gène or/3. Les extrémités du fragment correspondant au vecteur ont été rendues bouts francs par un traitement par l'enzyme de Klenow (grand fragment de la DNA polymerase I). La cassette #hyg a été obtenue par digestion par l'enzyme BamHI du plasmide pHP45 #hyg (Blondelet-Rouault et al., 1997, numéro d'accès GenBank : X99315). Le fragment correspondant à la cassette #hyg a été récupéré sur gel d'agarose et ses extrémités ont été rendues bouts francs par un traitement par l'enzyme de Klenow. Les deux fragments bouts francs ainsi obtenus (la cassette #hyg et le plasmide pOS49. 12) ont été ligués et le produit de ligation a été utilisé pour la transformation de bactéries E. coli. Le plasmide
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ainsi obtenu a été nommé pOS49. 14 et contient le gène orf3 interrompu par la cassette #hyg.
L'insert du plasmide pOS49. 14, sous la forme d'un fragment XhoI-XhoI dont les extrémités ont été rendues non cohésives par un traitement par l'enzyme de Klenow, a été cloné au niveau du site EcoRV du plasmide pOJ260 (le plasmide pOJ260 est un plasmide conjugatif capable de se répliquer chez E. coli mais incapable de se répliquer chez S. ambofaciens (Bierman M et al., 1992). Ce plasmide confère la résistance à l'apramycine chez E. coli et Streptomyces). Le plasmide obtenu (insert du plasmide pOS49. 14 cloné dans le plasmide pOJ260) a été nommé pOS49.16. Ce dernier a été transféré dans la souche ATCC23877 de S. ambofaciens par conjugaison à l'aide de la souche conjugative E. coli S 17-1, comme décrit par Mazodier et al. (Mazodier et al.,
1989). La souche E. coli S17-1 est dérivée de la souche E. coli 294 (Simon et al., 1983) (Simon, et al., 1986). Des clones transconjugants possédant le marqueur de résistance à l'hygromycine porté par la cassette #hyg et ayant perdu le marqueur de résistance à l'apramycine porté par le vecteur pOJ260 ont pu être obtenus. Pour cela, après conjugaison, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de recombinaison s'est produit et qui possèdent donc le gène or/3 interrompu par la cassette #hyg. Le remplacement de la copie sauvage de or/3 par la copie interrompue a été vérifié par deux hybridations successives. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par différentes enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybride avec une sonde correspondant à la cassette #hyg (cf. ci-dessus)) pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde l'insert XhoI-XhoI du plasmide pOS49.11 1 contenant les quatre phases ouvertes de lecture (deux complètes et deux tronquées, dont or/3 en entier). La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de
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l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un des clones or/3:: #hyg ainsi obtenu et dont le génotype a été vérifié, a été choisi et a été appelé OS49.16.
La production en spiramycine du clone OS49.16 ainsi obtenu a été testée grâce au test de production décrit plus bas (cf. exemple 15). Il a ainsi pu être démontré que cette souche ne produit plus de spiramycine, confirmant l'implication de or/3 et/ou des gènes situés en aval comme par exemple or/4 dans la biosynthèse des spiramycines.
Une fois cette confirmation obtenue, une plus grande région du cosmide pOS49.1 a été séquencée, de part et d'autre du fragment SacI précédemment étudié. Ainsi, à partir du cosmide pOS49.1, la séquence d'une région comportant sept phases ouvertes de lecture entières et deux autres incomplètes, situées de part et d'autre de ces sept phases ouvertes complètes, a pu être obtenue. Grâce à une recherche dans les bases de données, il a pu être montré que l'une des phases ouvertes de lecture incomplète correspondait au locus srmG (région codant une enzyme appelée polyketide synthase (PKS)). Les gènes correspondants ont été clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320). Par ailleurs, les autres phases ouvertes de lecture : sept ORFs entières nommées : orf1, or/2, or/3, or/4, orf5, or/6, or/7 (SEQ ID N 23,25, 28,30, 34,36 et 40) et le début de la huitième ORF nommée or/8 (la séquence entière de cette orf est donnée en SEQ ID N 43) n'ont pas été retrouvées dans les bases de données.
EXEMPLE 3 : Isolement et caractérisation d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse de spiramycines chez Streptomyces ambofaciens
Dans un deuxième temps et dans le but de cloner d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, d'autres cosmides comportant des fragments du génome de S. ambofaciens dans cette même région ont été isolés. Pour cela il a été procédé à une nouvelle série d'hybridations sur colonies en utilisant trois sondes :
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- La première sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN BamHI-PstI de 3,7kb contenant un fragment du gène de la PKS (Les gènes correspondant à la PKS ont été clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320)), orf1, or/2 et le début de or/3, sous cloné à partir de pOS49. 1 et allant d'un site BamHI situé 1300 paires de bases en amont du site EcoRI définissant la position 1 de SEQ ID N 1, jusqu'au site PstI situé en position 2472 (SEQ ID N 1). Ce fragment BamHI-PstI a été sous cloné à partir de pOS49.1 dans le plasmide pBC SK+, ce qui a permis d'obtenir le plasmide pOS49. 28.
- La deuxième sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN Pstl-BamHI d'environ 2kb contenant un fragment d'or/7 et d'orf8, sous cloné à partir de pOS49. 1 et allant d'un site PstI situé en position 6693 de SEQ ID N 1 jusqu'au site BamHI situé en position 8714 de SEQ ID N 1. Ce fragment Pstl-BamHI a été sous cloné à partir de pOS49.1 dans le plamside pBC SK+, ce qui a permis d'obtenir le plasmide pOS49.76.
- Une troisième sonde a également été utilisée. Cette dernière correspond à un
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fragment d'ADN de 1.8kb EcoRI-HindIII contenant le gène srd. Le gène srd est un gène isolé de S. ambofaciens capable de conférer la résistance à la spiramycine. En effet, des travaux antérieurs avaient permis le clonage de plusieurs déterminants de résistance de S. ambofaciens, conférant la résistance à la spiramycine à une souche de S. griseofuscus (souche sensible à la spiramycine) (Pernodet et al., 1993) (Pemodet et al.,
1999). Pour isoler des gènes de résistance, une banque cosmidique de l'ADN génomique de la souche S. ambofaciens ATCC23877 avait été réalisée dans le cosmide pKC505 (Richardson MA et al., 1987). Pour cela l'ADN génomique de la souche S. ambofaciens ATCC23877 avait été digéré partiellement par Sau3AI de manière à obtenir des fragments de taille comprise entre environ 30 et 40 kb. L'ADN génomique ainsi digéré (3ug) avait été ligué avec 1 g du pKC505 préalablement digéré par l'enzyme BamHI (Pernodet et al., 1999). Le mélange de ligation avait ensuite été encapsidé in vitro dans des particules phagiques. Les particules phagiques obtenues avaient été utilisées pour infecter la souche d'E. coli HB101 (accessible notamment auprès de l'American Type
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Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginie, USA), sous le numéro 33694). Environ
20 000 clones d'E. coli résistant à l'apramycine avaient été poolés et les cosmides de ces clones avaient été extraits. Ce pool de cosmides avait été introduit par transformation de protoplastes dans la souche DSM 10191 de S. griseofuscus (Cox KL & Baltz RH. 1984), naturellement sensible à la spiramycine (Rao RN et al., 1987, cette souche est disponible notamment auprès de la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschweig, Allamagne), sous le numéro DSM 10191). Les transformants avaient été sélectionnés sur un milieu contenant de l'apramycine. 1300 des clones poussant sur milieu contenant de l'apramycine avaient été transférés sur milieu contenant 5 g/ml de spiramycine. Plusieurs clones résistants à l'apramycine avaient également poussé sur milieu contenant de la spiramycine et les cosmides de ces colonies avaient été extraits et utilisés pour transformer E. coli et S. griseofuscus (Pernodet et al., 1999). Cinq cosmides capables de conférer la résistance à l'apramycine à E. coli et la co-résistance à l'apramycine et la spiramycine chez S. griseofuscus avaient ainsi été obtenus. Parmi ces 5 cosmides, il a été déterminé qu'un cosmide nommé pOS44. 1 possède dans son insert un gène (SEQ ID N 15) qui code une protéine (SEQ ID N 16) présentant une certaine similitude avec une protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens (SEQ ID N 88), ce gène a été nommé srmD (cf. alignement présenté en figure 26 réalisé grâce au programme FASTA (cf.. (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France).
Pour isoler le déterminant de résistance contenu dans le plasmide pOS44. 1, celuici a été digéré partiellement par l'enzyme de restriction Sau3AI de manière à obtenir des fragments de taille d'environ 1,5 à 3 kb, ces fragments ont été ligués dans le vecteur pIJ486 linéarisé par l'enzyme BamHI (\'Yard et al., 1986). Un plasmide a été sélectionné pour sa capacité à conférer la résistance à la spiramycine chez la souche DSM 10191 de S. griseofuscus (Rao RN et al., 1987), naturellement sensible à la spiramycine (cf. cidessus). Pour cela, le pool de plasmides correspondant aux fragment Sau3AI de pOS44.1
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ligués dans le vecteur pIJ486 (cf. ci-dessus), a été introduit par transformation de protoplastes dans la souche DSM 10191 et les transformants ont été sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton (due au gène tsr porté par pIJ486). Les clones poussant sur milieu contenant du thiostrepton ont été transférés sur milieu contenant de la spiramycine. Plusieurs clones résistants au thiostrepton ont également poussé sur milieu contenant de la spiramycine et les plasmides de ces colonies ont été extraits. Un plasmide conférant la résistance et contenant un insert d'environ 1.8kb a été sélectionné et nommé pOS44. 2. Cet insert de 1. 8kb peut être sorti facilement grâce à un site HindIII et un site EcoRI présents dans le vecteur de part et d'autre de l'insert. Cet insert de 1.8kb HindIII-EcoRI a été séquence et le gène de résistance qu'il renferme a été nommé srmD.
Ce fragment contenant le gène srmD a ainsi pu être facilement sous-cloné dans le vecteur pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) ouvert par EcoRI-HindIII, le plasmide obtenu a été nommé pOS44. 4. L'insert de 1.8kb HindIII-EcoRI, contenant le gène srmD, de ce plasmide a été utilisé comme sonde pour localiser les gènes de biosynthèse de spiramycine (cf. ci-dessous).
Un échantillon d'une souche Escherichia Coli DH5a contenant le plasmide pOS44. 4 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2918.
Environ 2000 clones de la banque, obtenus ci-dessus (cf. exemple 1), ont été transférés sur filtre pour hybridation sur colonies selon les techniques classiques (Sambrook et al., 1989).
Les trois sondes décrites ci-dessus ont été marquées au 32P par la technique du random priming (Kit commercialisé par Roche) et utilisées pour l'hybridation des 2000 clones de la banque, transférés sur filtre. L'hybridation a été effectuée à 65 C dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Un lavage a été effectué en 2X SSC à 65 C pendant 15 minutes et deux lavages successifs ont ensuite été effectués en 0.5X SSC à 65 C, d'une durée de 15 minutes chacun. Dans ces
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conditions d'hybridation et de lavage, 16 clones parmi les 2000 hybridés présentaient un fort signal d'hybridation avec au moins une des sondes. Cependant, aucun cosmide n'hybridait avec les trois sondes. Les 16 cosmides ont été extraits et digérés par l'enzyme de restriction BamHI. La comparaison des profils de restriction de ces différents cosmides entre eux, a conduit à choisir deux cosmides susceptibles de contenir les inserts les plus longs de la région et n'ayant pas de bandes communes. Ainsi deux cosmides l'un nommé pSPM5 et l'autre pSPM7 ont été choisis. Le cosmide pSPM5 hybridait avec les sondes orf1 à orf4 et la sonde orf8, mais n'hybridait pas avec la sonde srmD. pSPM7 hybridait seulement avec la sonde srmD et pas avec les deux autres sondes.
Ces deux cosmides ont été séquences en totalité par la technique du séquençage en aveugle ( shotgun sequencing ). Les séquences des inserts de ces deux cosmides : pSPM7 et pSPM5 ont pu être assemblées car bien que ne se chevauchant pas, chacun des inserts comprenait une séquence connue à l'une de ses extrémités. En effet, chacun de ces inserts comportait un fragment de la séquence d'un des gènes codant une enzyme appelée polyketide synthase (PKS). Ces 5 gènes ont été clonés par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320) (cf. figure 2). Ainsi, il a pu être déterminé une séquence unique d'ADN génomique de S. ambofaciens. Une séquence de 30943 nucléotides partant en 5' d'un site EcoRI situé dans le premier gène PKS et allant jusqu'à un site BamHI en 3' est présentée en SEQ ID N 1. Cette séquence correspond à la région amont des gènes de la PKS (cf. figure 2 et 3). Une deuxième région de 11171 nucléotides, partant d'un site PstI en 5' et allant jusqu'à un site NcoI en 3' situé dans le cinquième gène de la PKS est présentée en SEQ ID N 2. Cette deuxième région est la région aval des gènes de la PKS (l'aval et l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 2 et 3).
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EXEMPLE 4 : Analyse des séquences nucléotidiques, détermination des phases ouvertes de lecture et caractérisation des gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.
Les séquences obtenues ont été analysées grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cette région comporte 35 ORFs localisées de part et d'autre de cinq gènes codant l'enzyme polyketide synthase (PKS). Respectivement 10 et 25 ORFs ont été identifiées en aval et en amont de ces gènes (l'aval et l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 3). Ainsi, les 25 phases ouvertes de lecture de ce type, occupant une région d'environ 31 kb (SEQ ID N 1 et figure 3) ont été identifiées en amont des 5 gènes codant la PKS et 10 occupant une région d'environ Il,1 kb (SEQ ID N 2 et figure 3), ont été identifiées en aval des gènes de la PKS. Les gènes de la région amont ont été nommés or/7, or/2, or/3, orf4, orf5, or/6, or/7, or/8, orf9c, or/70, or/1 le,
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orj72, oi73c, orfl4, orp5c, OlfI6, or/17, or/18, orfl9, or/20, o1'f21 c, o1'f22c, orf23c, orf24c et orf25c (SEQ ID N 23, 25, 28,30, 34, 36, 40,43, 45,47, 49, 53, 60,62, 64, 66,68, 70,72, 74,76, 78,80, 82 et 84). Les gènes de la région aval ont été nommés
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or/7*c, or/2*c, orf3*c, oif4*c, or/?*, or/6*, or/7*c, or/8*, or/9* or/70* (SEQ ID N 3, 5,7, 9, 11, 13, 15,17, 19 et 21). Le c ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2 pour ces gènes) (cf. figure 3).
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups) (ces trois programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990),
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BEAUTY (Worley K. C.. et al., 1995)), (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycine.
EXEMPLE 5 : Inactivation de gène : principe de la construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue
Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine ou l'hygromycine), comme l'illustre la figure 9. Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par des terminateurs de transcription actifs chez Streptomyces.
L'insertion de la cassette dans le gène cible peut s'accompagner ou non d'une délétion dans ce gène cible. La taille des régions flanquant la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases.
Les constructions nécessaires à l'inactivation du gène par la cassette ont été obtenues chez E. coli, organisme de référence pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant. Le gène interrompu a été obtenu dans un plasmide se répliquant chez E. coli mais ne pouvant pas se répliquer chez Streptomyces.
Les constructions ont ensuite été sous-clonées dans des vecteurs pour permettre la transformation et l'inactivation du gène voulu chez S. ambofaciens. Pour cela, deux plasmides ont été utilisés : - pOJ260 (Bierman M. et al., 1992) (cf. exemple 2) qui confère la résistance à l'apramycine chez E. coli et Streptomyces et qui a été employé quand le gène cible a été interrompu par une cassette conférant la résistance à l'hygromycine.
- pOSK1205 (4726pb). Ce plasmide dérive du plasmide pBK-CMV (commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)) dans lequel un fragment
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Avril contenant la séquence codant la résistance à la Néomycine/Kanamycine a été remplacé par une séquence codant la résistance à l'hygromycine, tout en conservant le promoteur P SV40. Pour cela, le plasmide pHP45-Qhyg (Blondelet-
Rouault et al., 1997) a été digéré par les enzymes NotI et PflmI et le fragment conférant la résistance à l'hygromycine a été sous-cloné au niveau du site Avril du vecteur pBK-CMV après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow. Dans pOSK1205, la cassette qui confère la résistance à l'hygromycine est précédée du promoteur pSV40. Ce plasmide confère la résistance à l'hygromycine chez E. coli et Streptomyces et a été employé quand le gène cible a été interrompu par une cassette conférant la résistance à l'apramycine.
Les cassettes ont été introduites dans le gène cible soit par clonage en utilisant des sites de restriction présents dans le gène cible, soit par recombinaison entre de courtes séquences identiques comme décrit par exemple par Chaveroche et al (Chaveroche MK et al., 2000).
Le plasmide portant le gène interrompu par la cassette peut ensuite être introduit chez Streptomyces ambofaciens, par exemple par conjugaison entre E coli et Streptomyces (Mazodier P, et al., 1989). Cette technique a été utilisée dans le cas où le vecteur de base est le vecteur pOJ260. Une deuxième technique peut être utilisée : la technique de la transformation de protoplastes après dénaturation par traitement alcalin de l'ADN (Kieser, T et al., 2000), pour augmenter la fréquence de recombinaison comme décrit par exemple par Oh & Chater (Oh & Chater, 1997). Cette technique a été utilisée dans le cas où le vecteur de base est pOJ260 ou pOSK1205 (cf. ci-dessous). Les transformants sont ensuite sélectionnés avec l'antibiotique correspondant à la cassette présente dans le gène cible (cf. figure 9, antibiotique B). On sélectionne ainsi un mélange de clones parmi lesquels il y a eu intégration par un seul ou par deux événements de recombinaison. Dans un deuxième temps on recherche les clones sensibles à l'antibiotique pour lequel le gène de résistance est présent dans le vecteur (hors de la cassette de recombinaison) (cf. figure 9, antibiotique A). On peut ainsi sélectionner les
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clones pour lesquels il y a eu en principe deux événements de recombinaison aboutissant au remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette. Ces étapes sont schématisées figure 9.
Plusieurs cassettes peuvent être utilisées pour l'interruption des gènes cibles. On peut par exemple utiliser la cassette #hyg qui confère la résistance à l'hygromycine (Blondelet-Rouault et al., 1997, numéro d'accès GenBank : X99315).
EXEMPLE 6: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue en phase dans le gène orf3
Le gène orf 3 avait été interrompu par la cassette #hyg (cf. exemple 2. 2) et il a pu être démontré qu'une souche or/3:: #hyg ne produit plus de spiramycine, confirmant l'implication d'un ou plusieurs gènes de la région clonée dans la biosynthèse des spiramycines (cf. exemple 2. 2). Au vu de leur orientation, une cotranscription des ORFs
1 à 7 est probable (cf. figure 3) et le phénotype observé (non producteur de spiramycines) peut être dû à l'inactivation d'un ou plusieurs des gènes co-transcrits avec orf3. Pour confirmer l'implication de or/9 dans la biosynthèse de spiramycines, une nouvelle inactivation du gène orf3 a été effectuée, cette dernière étant réalisée en phase.
Pour cela, un fragment DraIII interne à or/3 de 504 paires de bases a été délété. Un fragment d'ADN obtenu à partir de pOS49. 1, allant du site EcoRI situé en position 1 (SEQ ID N 1) jusqu'au site SacI situé en position 5274 (SEQ ID N 1) et qui comporte une délétion entre les deux sites DraIII aux positions 2563 et 3067 (504 nucléotides retirés) a été cloné dans le plasmide pOJ260 (Bierman M. et al., 1992). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.67.
L'insert de pOS49. 67 est donc constitué par un fragment d'ADN de S. ambofaciens contenant les gènes orf1, or/2, orf3 avec la délétion en phase, orf4 et une partie de orf5.
Le vecteur dans lequel cet insert a été sous-cloné est pOJ260, le plasmide pOS49.67 confère donc la résistance à l'apramycine et a été introduit par transformation de protoplastes dans la souche OS49. 16 (cf. exemple 2). La souche OS49.16 étant résistante
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à l'hygromycine, des transformants hygR et apraR ont été obtenus. Après deux passages de tels clones sur milieu non sélectif, les clones sensibles à l'apramycine et à l'hygromycine (apraS et hygS) ont été recherchés. Dans certains de ces clones, on s'attend en effet à ce qu'un événement de recombinaison entre séquences homologues conduise au remplacement de la copie de or/3 interrompue par la cassette Qhyg (contenu dans le génome de la souche OS49. 16) par la copie de or/3 avec la délétion en phase présente sur le vecteur. Les clones résultant de cette recombinaison sont attendus comme apraS et hygS après l'élimination des séquences du vecteur. Le génotype des souches ainsi obtenues peut être vérifié par hybridation ou par PCR et séquençage du produit de
PCR (pour vérifier que seule une copie de orf3 délétée en phase est présente dans le génome des clones obtenus). Des clones n'ayant que la copie de or/3 avec une délétion en phase ont ainsi été obtenus et leur génotype a été vérifié. Un clone présentant les caractéristiques recherchées a été plus particulièrement sélectionné et a été nommé
OS49.67.
Un échantillon de la souche OS49. 67 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2916.
EXEMPLE 7: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orf8
Pour réaliser l'inactivation du gène orf8, une construction dans laquelle la cassette #hyg a été introduite dans la séquence codante de or/8 a été obtenue. Pour cela, le plasmide pOS49. 88 a tout d'abord été construit. Le plasmide pOS49.88 est dérivé du plasmide pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) par insertion d'un fragment de 3.7 kb (fragment PstI-EcoRI obtenu à partir du cosmide pSPM5), contenant la fin de orf7, or/8 et le début de or/9, cloné dans les sites PstI-EcoRI de pUC19. La cassette #hyg (sous forme d'un fragment BamHI, rendu bout franc par traitement à l'enzyme de
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Klenow) a été clonée au niveau du site unique Sali de pOS49.88 situé dans or/8 après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de
Klenow.
Le clonage étant bout franc, deux types de plasmides ont été obtenus selon le sens d'insertion de la cassette : pOS49.106 dans lequel les gènes hyg et or/8 sont dans la même orientation et pOS49. 120 dans lequel les gènes hyg et or/8 sont dans des orientations opposées. L'insert du plasmide pOS49.106 a ensuite été sous-cloné dans le plasmide pOJ260 pour donner pOS49.107. Pour cela, le plasmide pOS49.106 a été digéré par l'enzyme Asp718I et les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow, ce produit de digestion a été redigéré par l'enzyme PstI et le fragment contenant le gène or/8 dans lequel la cassette #hyg a été insérée, a été cloné dans le vecteur pOJ260 (cf. ci dessus). Pour cela, le vecteur pOJ260 a été digéré par les enzymes EcoRV et PstI et utilisé pour la ligation. Cette manipulation permet donc d'obtenir une ligation orientée puisque chacun des deux fragments est bout franc d'un côté et PstI de l'autre. Le plasmide obtenu a été nommé pOS49.107.
Le plasmide pOS49. 107 a été introduit dans la souche ATCC23877 de S. ambofaciens par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orf8 interrompu par la cassette #hyg.
Le remplacement de la copie sauvage de orf8 par la copie interrompue par la cassette Qhyg a été vérifié par Southern Blot. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette #hyg pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en
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utilisant comme sonde l'insert PstI-EcoRI contenant la fin de or/7, or/8 et le début de or/9 d'une taille d'environ 3,7 kb du plasmide pOS49. 88. La vérification du génotype peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par
PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone orf8::#hyg a été choisi et nommé OS49.107. Un échantillon de la souche
OS49. 107 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex
15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2917.
EXEMPLE 8: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orf10
Un fragment d'ADN de 1,5 kb interne au gène or/70 a été obtenu par PCR en utilisant comme matrice, l'ADN génomique de S. ambofaciens et les amorces suivantes : SRMRl : 5' CTGCCAGTCCTCTCCCAGCAGTACG 3' (SEQ ID N 89) SRMR2 : 5' TGAAGCTGGACGTCTCCTACGTCGG 3' (SEQ ID N 90) Ce fragment d'ADN issu de la PCR a été cloné dans le vecteur pCR2.1 commercialisé par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49. 32. La cassette Qhyg (sous forme d'un fragment BamHI, cf. ci-dessus) a été clonée au niveau du site unique BstEII interne au fragment du gène orf10, après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow.
Le clonage étant bout franc, deux types de plasmides ont été obtenus selon le sens d'insertion de la cassette : pOS49. 43 dans lequel les gènes hyg et or/70 sont dans la même orientation et pOS49. 44 dans lequel les gènes hyg et or/70 sont dans des orientations opposées. L'insert du plasmide pOS49. 43 a été transféré (sous forme d'un fragment Asp718I-Xbal dont les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow) dans le site EcoRV du plasmide pOJ260 ce qui a permis d'obtenir le plasmide pOS49.50. Le plasmide pOS49. 50 contenant le fragment du gène or/70
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interrompu par la cassette Qhyg a été introduit dans la souche ATCC23877 de
Streptomyces ambofaciens. Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de crossingover s'est produit et qui possèdent le gène or/70 interrompu par la cassette Qhyg. Des clones qui possédaient le marqueur de résistance à l'hygromycine porté par la cassette et qui avaient perdu le marqueur de résistance à l'apramycine porté par le vecteur pOJ260 ont ainsi été obtenus. L'événement de remplacement de la copie sauvage de or/70 par la copie interrompue orf10::#hyg a été vérifié par Southern Blot. Ainsi, l'ADN génomique total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette Qhyg pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde le produit PCR de 1,5 kb interne au gène or/70 (cf. ci-dessus).
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf10::#hyg) a été plus particulièrement sélectionné et nommé OS49.50. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette #hyg était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette #hyg dans le génome de ce clone. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
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EXEMPLE 9 : Inactivation de gènes : principe de la construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue selon la technique des cassettes excisables (cf. Figure 9 et 10)
Un deuxième type de cassettes peut être utilisé pour l'inactivation de gènes : les cassettes dites cassettes excisables . Ces cassettes présentent l'avantage de pouvoir être excisées chez Streptomyces par un événement de recombinaison spécifique de site après avoir été introduites dans le génome de S. ambofaciens. Le but est d'inactiver certains gènes dans des souches de Streptomyces sans laisser dans la souche finale de marqueurs de sélection ou de grandes séquences d'ADN n'appartenant pas à la souche. Après excision il subsiste uniquement une courte séquence d'environ une trentaine de paires de bases (appelé site cicatriciel ) dans le génome de la souche (cf. figure 10).
La mise en oeuvre de ce système consiste, dans un premier temps, au remplacement de la copie sauvage du gène cible (grâce à deux événements de recombinaison homologue, cf. figure 9) par une construction dans laquelle une cassette excisable a été insérée dans ce gène cible. L'insertion de cette cassette est accompagnée d'une délétion dans le gène cible (cf. figure 9). Dans un deuxième temps, l'excision de la cassette excisable du génome de la souche est provoquée. La cassette excisable fonctionne grâce à un système de recombinaison spécifique de site et a pour avantage de permettre l'obtention de mutants de Streptomyces ne portant finalement pas de gène de résistance.
On s'affranchit également d'éventuels effets polaires sur l'expression des gènes situés en aval du ou des gènes inactivés (cf. figure 10).
L'emploi de cassettes excisables a été décrit et utilisé chez de nombreux organismes dont les cellules de mammifère, de levures et chez E. coli (Bayley et al., 1992 ; Brunelli et Pall, 1993 ; Camilli et al., 1994 ; Dale et Ow, 1991 ; Russell et al., 1992 ; Lakso et al., 1992). Ces cassettes excisables utilisent toutes la recombinase spécifique de site Cre agissant sur les sites lox. Ce système de recombinaison provient du bactériophage PI.
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Pour la construction d'un système de type cassette excisable chez Streptomyces, il a été tiré partie du système de recombinaison spécifique de site décrit pour l'élément génétique mobile pSAM2 de Streptomyces ambofaciens (Boccard et al., 1989a et b). Le système mis en place consiste dans un premier temps à construire un vecteur recombinant comportant le gène à interrompre dans lequel est insérée une cassette excisable. L'insertion dans le gène cible de la cassette excisable s'accompagne d'une délétion dans le gène cible. Elle peut être réalisée par clonage en utilisant des sites de restriction présents dans le gène cible ou par recombinaison entre de courtes séquences identiques comme décrit par exemple par Chaveroche et al (Chaveroche MK et al.,
2000). La cassette excisable peut être construite en utilisant par exemple la cassette #hyg (Blondelet Rouault et al.,1997). Cette cassette a été bordée par des séquences attR et attL qui flanquent normalement la copie intégrée de pSAM2 (cf. figure 15). Les séquences attL et attR contiennent tous les sites nécessaires à la recombinaison site- spécifique permettant l'excision de pSAM2 ou de tout fragment d'ADN situé entre ces deux régions (Sezonov et al., 1997, Raynal et al., 1998). La construction d'une telle cassette n'est évidemment pas limitée à l'utilisation d'une cassette #hyg, mais d'autres cassettes de résistances peuvent servir de base à la construction de cette cassettte (par exemple la cassette Qaac ou #vph (Blondelet Rouault et al., 1997)).
Après l'obtention de cette construction, la souche de Streptomyces est transformée avec le plasmide recombinant. Les transformants sont ensuite sélectionnés avec l'antibiotique correspondant à la cassette présente dans le gène cible (cf. figure 9, antibiotique B, il s'agit par exemple d'une sélection par l'hygromycine si la cassette excisable dérive de la cassette Qhyg). On sélectionne ainsi un mélange de clones parmi lesquels il y a eu intégration par un seul ou par deux événements de recombinaison.
Dans un deuxième temps on recherche les clones sensibles à l'antibiotique pour lesquels le gène de résistance est présent dans le vecteur (hors de la cassette de recombinaison) (cf. figure 9, antibiotique A). On peut ainsi sélectionner les clones pour lesquel il y a eu en principe deux événements de recombinaison aboutissant au remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette. Ces étapes sont schématisées figure 9, le génotype des clones ainsi obtenus est vérifié par Southem blot et une souche
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présentant les caractéristiques voulues (le remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette excisable) est sélectionnée.
Dans un deuxième temps, la souche sélectionnée ci-dessus, est transformée par un plasmide permettant l'expression des gènes xis et int qui sont tous deux nécessaires à la recombinaison spécifique de site entre les sites attR et attL. Cette recombinaison entraîne le départ de la cassette excisable du génome de la souche, grâce à un événement de recombinaison (cf. figure 10) (Raynal et al., 1998). Il est intéressant de choisir le vecteur portant les gènes xis et int parmi les vecteurs relativement instables chez Streptomyces (par exemple dérivé du vecteur Streptomyces pWHM3, (Vara et al.,
1989)), ceci permet d'obtenir une souche ayant perdu ce dernier vecteur après quelques cycles de sporulation en absence de pression de sélection.
Pour exciser la cassette, on peut par exemple utiliser le plasmide pOSV508 (cf. figure
14) qui est introduit par transformation de protoplastes dans la souche de S. ambofaciens contenant un gène interrompu par la cassette excisable. Le plasmide pOSV508 est dérivé du plasmide pWHM3 (Vara J et al.,1989) (cf. figure 13) dans lequel ont été ajoutés les gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) placés sous le contrôle du promoteur ptrc (Amann, E. et al., 1988). Les gènes xis et int placés sous le contrôle du promoteur ptrc ont été sous clonés dans le plasmide pWHM3 à partir du plasmide pOSint3 (Raynal et al., 1998) (cf. figure 14). L'introduction dans la souche mutante du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 va permettre l'excision efficace par recombinaison spécifique de site de la cassette excisable entre les sites attL et attR flanquant cette cassette (Raynal A. et al., 1998) (figure 10). Parmi les transformants, sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'antibiotique auquel la présence de la cassette confère la résistance (cf. figure 10). L'excision est efficace et il a été observé que plus de 90% des transformants sont de ce type. Après un ou plusieurs cycles de croissance et sporulation sur un milieu solide dépourvu de thiostrepton, on obtient des clones ayant perdu le plasmide pOSV508. Ces clones sont repérables par leur sensibilité
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au thiostrepton. La séquence du gène cible délété peut être vérifiée par PCR et séquençage du produit PCR.
Finalement, la souche résultante porte au niveau du gène inactivé (délétion interne par exemple) un site att cicatriciel correspondant au site attB minimal (Raynal et al.,
1998), issu de la recombinaison entre les sites attR et attL. Ce site attB minimal qui subsiste est semblable à celui présent naturellement dans les souches de Streptomyces ambofaciens, Streptomyces pristinaespiralis et Streptomyces lividans (Sezonov et al.,
1997).
Le gène que l'on veut inactiver peut être cotranscrit avec d'autres gènes situés en aval. Pour éviter que l'inactivation d'un des gènes ait un effet polaire sur l'expression des gènes en aval dans l'opéron, il est important d'obtenir une délétion en phase après excision de la cassette. Le système des cassettes excisables tel que décrit ci-dessus permet de répondre à une telle exigence. L'homme du métier pourra, en effet, aisément construire trois cassettes excisables distinctes, celles-ci laissant après excision une séquence de 33, 34 ou 35 nucléotides respectivement, sans codon stop quelle que soit la phase de lecture. Connaissant la séquence du gène cible et la taille de la délétion associée à l'insertion de la cassette, il est possible de choisir entre ces trois cassettes excisables de façon à ce que l'excision conduise à une délétion en phase. Sur les 33,34 ou 35 nucléotides rajoutés, 26 correspondent à la séquence attB minimale (cf. figure 27).
Dans le cas de la présente demande, deux cassettes excisables ont été utilisées. Ces deux cassettes sont les suivantes : attlQhyg+ (SEQ ID N 91) et att3Qaac- (SEQ ID N 92), ces cassette laissent respectivement 33 et 35 nucléotides après excision. Elles comportent respectivement la cassette Qhyg ou la cassette Qaac, les signes + et correspondant à l'orientation de la cassette de résistance. Ces deux cassettes ont été construites et clonées au niveau du site EcoRV du vecteur pBC SK+ dont le site HindIII a été suprimé au préalable. Les plasmides obtenus ont été nommés patt1#hyg+ et patt3Qaac- respectivement. Les cassettes excisables peuvent être facilement sorties par une digestion du plasmide par EcoRV.
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EXEMPLE 10 : Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orf2
L'inactivation du gène orf2 a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus). La souche de départ utilisée est la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 qui dérive de la souche ATCC23877. Cependant, la souche OSC2 diffère de la souche ATCC23877 en ce qu'elle a perdu l'élément génétique mobile pSAM2 (Boccard et al., 1989a et b). Cet élément mobile peut être perdu de manière spontanée au cours de la protoplastisation (action du lysozyme pour digérer la paroi bactérienne et fragmenter le mycélium (Kieser et al., 2000)) et de la régénération des protoplastes de la souche ATCC23877. Pour sélectionner les clones ayant perdu l'élément pSAM2, il a été mis en place un crible, basé sur la répression du gène pra par le répresseur de transcription KorSA (Sezonov et al., 1995) (Sezonov G. et al., 2000).
Pour cela, un fragment d'ADN contenant le promoteur du gène pra placé en amont du gène aph (conférant la résistance à la kanamycine et dépourvu de son propre promoteur) a été cloné dans le vecteur instable pWHM3Hyg, ce dernier dérivant du plasmide pWHM3 (Vara et al., 1989) dans lequel le gène tsr a été remplacé par le gène hyg (conférant la résistance à l'hygromycine). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOSV510. La souche ATCC23877 a été transformée après protoplastisation par le plasmide pOSV510. Le promoteur Pra est un promoteur réprimé par le répresseur KorSA, le gène codant ce dernier étant situé au sein de l'élément mobile pSAM2 (Sezonov G. et al., 2000). Après transformation par le plasmide pOSV510, les bactéries transformées sont sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine (due au gène aph porté par pOSV510). Les clones ayant perdu l'élément intégratif pSAM2 ont perdu le répresseur KorSA et le promoteur Pra n'est donc plus réprimé et permet l'expression du gène de résistance à la kanamycine aph. Une sélection par la kanamycine après transformation par le plasmide pOSV510 permet donc de sélectionner les clones ayant perdu l'élément intégratif pSAM2 (et donc KorSA) et possédant le plasmide pOSV510.
Le plasmide pOSV510 étant instable, après quelques cycles de sporulation sans antibiotique, des clones isolés sont repiqués sur milieu avec kanamycine, sur milieu avec hygromycine et sur milieu sans antibiotique. Les clones sensibles à la kanamycine et à
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l'hygromycine ont perdu pOSV510. La perte de l'élément pSAM2 a été vérifiée par hybridation et PCR. Un clone présentant les caractéristiques souhaitées a été sélectionné et a été nommé OSC2.
Un échantillon de la souche OSC2 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I- 2908.
L'inactivation du gène or/2 a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus et figure 10). Pour cela, un insert de 4,5 kb dont la séquence part du site EcoRI situé en position 1 jusqu'au site BamHI situé en position 4521 (SEQ ID N 1) a été sous-cloné au niveau des sites EcoRI et BamHI du plasmide pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) à partir du cosmide pSPM5. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.99.
Ce plasmide a été introduit dans la souche E. coli KS272 qui contenait déjà le plasmide pKOBEG (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12).
En parallèle, la cassette excisable att3Qaac- (SEQ ID N 92, cf. ci dessus) a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (Le plasmide pOSK1102 est un plasmide dérivé du vecteur pGP704Not (Chaveroche et al., 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) dans lequel la cassette att3Qaac- a été clonée comme un fragment EcoRV dans le site unique EcoRV de pGP704Not) et à l'aide des amorces suivantes : ORF2A
Figure img01020001

5' CCCGCGCGGCAGCCTCTCCGTGATCGAGTCCGGCGTGACCATCGCGCGCGCTTCGTTCG-3' (SEQ ID N 93) ORF2B 5' GCTCCGTGCGTCATGCAGGAAGGTGTCGTAGTCGCGGTAGATCTGCCTCTTCGTCCCGAA-3 ' (SEQ ID N 94)
Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (or/2 dans le
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cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3#aac- (cf. figure 11).
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli contenant les plasmides pKOBEG et pOS49. 99 comme décrit (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure
12). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation et sélectionnées pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène cible (orf2), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été sélectionné et le plasmide correspondant a été nommé pSPM17. Ce plasmide dérive de pOS49. 99 dans lequel orf2 est interrompue par la cassette apramycine (cf. figure 12).
L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans or/2, entre les nucléotides 211et 492 de la partie codante de or/2.
Le plasmide pSPM17 a été digéré par l'enzyme EcoRI puis les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow, ce produit de digestion a été ensuite digéré par l'enzyme XbaI et l'insert contenant le gène or/2 délété a été cloné dans le vecteur pOSK1205 (cf. ci dessus). Pour cela, le vecteur pOSK1205 a été digéré par l'enzyme BamHI puis les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow, ce produit a été ensuite digéré par l'enzyme XbaI, et utilisé pour la ligation avec l'insert obtenu à partir de pSPM17 comme ci-dessus. Cette manipulation permet donc d'obtenir une ligation orientée puisque chacun des deux fragments est bout franc d'un côté et XbaI de l'autre. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM21, il porte un gène de résistance à l'hygromycine (partie vecteur) et un insert dans lequel le gène or/2 délété est remplacé par la cassette att3Qaac-.
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Le vecteur pSPM21 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure
9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène or/2 interrompu par la cassette att3Qaac-. Ces clones ont été sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de or/2 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié. La présence de la cassette att3Qaac- a été vérifiée par PCR sur colonie. Une hybridation a également été effectuée. Pour cela, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde de 3 kb correspondant à un fragment EcoRIBamHI de l'insert du plasmide pOS49. 99 (cf. ci-dessus). La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues a été sélectionné et nommé SPM21. Il a pu être vérifié grâce à la PCR et à l'hybridation que la cassette att3#aac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3#aac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orf2::att3#aac-.
Un échantillon de la souche SPM21 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I- 2914.
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La souche SPM21 a été transformée par le vecteur pOSV508 par transformation de protoplastes pour provoquer l'excision de la cassette (cf. figure 14). Le plasmide pOSV508 est dérivé du plasmide pWHM3 (Vara J et al.,1989) (cf. figure 13) dans lequel il a été ajouté les gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) placé sous le contrôle du promoteur ptrc (Amann, E. et al., 1988) (cf. figure 14). L'introduction dans la souche SPM21 du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 permet l'excision efficace par recombinaison spécifique de site de la cassette excisable entre les sites attL et attR flanquant cette cassette (Raynal A. et al., 1998) (figure 10). Parmi les transformants sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'apramycine dont le gène de résistance est porté par la cassette att3#aac-, l'excision entraîne en effet la perte de ce gène de résistance (cf. figure 10). Le plasmide pOSV508 est instable et après deux passages successifs sur milieu sans antibiotique des clones isolés sont repiqués sur milieu avec thiostrepton et sur milieu sans thiostrepton. Les clones sensibles au thiostrepton ont perdu pOSV508. Il a été vérifié que l'excision de la cassette aboutit bien à une délétion en phase dans le gène or/2 par PCR et séquençage du produit PCR, l'excision de la cassette laisse en effet une séquence cicatricielle att3 caractéristique (qui est similaire au site attB d'origine après recombinaison entre les sites attL et attR) : 5' ATCGCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAAGAGGCAGAT 3' (SEQ ID N 95).
La souche ainsi obtenue et possédant le génotype voulu (orf2::att3) a été nommée SPM22.
Un échantillon de la souche SPM22 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I- 2915.
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EXEMPLE 11 : Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfl2
Pour l'inactivation de orf12, orf13c et orf14 un même plasmide de départ (pSPM504) a été employé pour introduire à différentes positions une cassette de type cassette excisable . Ce plasmide possède un insert de 15,1 kb qui correspond à la région de orf7 à orf17. Pour construire ce plasmide un fragment BglII de 15,1 kb provenant de la digestion du cosmide pSPM7 (cf. ci-dessus) a été cloné dans le plasmide pMBL18 (Nakano et al., 1995) digéré par BamHI. Les extrémités BamHI et BglII étant compatibles, on obtient après ligation, le plasmide pSPM502. La totalité de l'insert de pSPM502 a ensuite été sous-cloné (sous forme d'un fragment HindIII/NheI) dans le plasmide pOSK1205 (digéré par HindIII/NheI) ce qui a permis d'obtenir le plasmide pSPM504.
Ce plasmide a été introduit dans la souche E. coli KS272 qui contenait déjà le plasmide pKOBEG (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12).
En parallèle, la cassette excisable att3Qaac- a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (le plasmide pOSK1102 est un plasmide dérivé du vecteur pGP704Not (Chaveroche et al., 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) dans lequel la cassette att3Qaac- a été clonée comme un fragment EcoRV dans le site unique EcoRV de pGP704Not), les amorces utilisées sont les suivantes : EDR8:5' CGGGATGATCGCTTGTCCGGCGGCCGGATGCCTAGCCTCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' (SEQ ID N 96)
Figure img01060001

EDR9:5' CCCGATCCAGAACGTCTGCTCGGTGATCAGGTCGCTGTTCATCTG,^CTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ ID N 97)
Les 40 (seulement 39 pour EDR8) déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le
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gène cible (or/72 dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3#aac- (cf. figure 11).
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli
KS272 contenant les plasmides pKOBEG et pSPM504 (cf. ci-dessus), comme décrit par
Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49. 99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM507). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par ce produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profilattendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène cible (or/72), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été sélectionné et le plasmide correspondant a été nommé pSPM507. Ce plasmide dérive de pSPM504 dans lequel or/12 est interrompue par la cassette att3Qaac- (cf. figure 12). L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène or/12, l'interruption commence au niveau du trentième codon de orf12. Il reste après la cassette les 46 derniers codons de or/72.
Le vecteur pSPM507 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène or/72 interrompu par la cassette att3Qaac-. Ces clones ont été plus
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particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de or/72 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3#aac- pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un fragment d'ADN obtenu par PCR et correspondant à une très large partie de la séquence codante du gène orf12.
La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf12::att3#aac-) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM507. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3Qaac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Qaac- dans le génome de ce clone. Ce clone
Figure img01080001

possède donc le génotype : or f12: : att3.i2aac- et a été nommé SPM507. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de or/72, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). En effet, le fait que orf13c soit orienté en sens opposé à or/72 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment, notamment par transformation par le plasmide pOSV508. Un échantillon de la souche SPM507 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2911.
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EXEMPLE 12 : Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfl3c
La cassette excisable att3Qaac- a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSKl 102 (cf. ci-dessus) à l'aide des amorces suivantes :
EDR3:5' ACCGGGGCGGTCCTCCCCTCCGGGGCGTCACGGCCGCGGAATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ ID N 98)
EDR4:5' CACGCAGCGAGCCGACGCACTGATGGACGACACGATGGCCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' (SEQ ID N 99)
Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (orf13c dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3#aac- (cf. figure 11).
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli KS272 contenant les plasmides pKOBEG et pSPM504 (cf. ci-dessus), comme décrit par Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49. 99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM508). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par le produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène cible (orf13c), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été sélectionné et le plasmide correspondant a été nommé pSPM508. Ce plasmide dérive de pSPM504
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dans lequel orfl3c est interrompue par la cassette apramycine (cf. figure 12). L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orf13c, l'interruption commence au niveau du sixième codon de orf13c. Il reste après la cassette les 3 derniers codons de orf13c.
Le vecteur pSPM508 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orf13c interrompu par la cassette att3Qaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf13c par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3Qaac- pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un produit de PCR correspondant à une séquence débordant d'une centaine de paires de base en amont et en aval de la séquence codante de orfl3c. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Figure img01100001
Un clone présentant les caractéristiques attendues (oi73c::att3f2aac-) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM508. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3Qaac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Qaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orf13c::att3#aac- et a été nommé SPM508. Il est inutile de
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procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orf13c, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que or/74 soit orienté en sens opposé à orf13c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Un échantillon de la souche SPM508 a été déposé auprès de la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2912.
EXEMPLE 13 Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfl4
La cassette excisable att3Qaac- a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (cf. ci-dessus) à l'aide des amorces suivantes :
EDR5: 5'GGGCGTGAAGCGGGCGAGTGTGGATGTCATGCGAGTACTCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' (SEQ ID N 100) EDR6: 5'CGGGAAACGGCGTCGCACTCCTCGGGGGCCGCGTCAGCCCATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ ID N 101)
Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (orfl4 dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Qaac- (cf. figure 11).
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli KS272 contenant les plasmides pKOBEG et pSPM504 (cf. ci-dessus), comme décrit par Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide
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pOS49. 99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM509). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par le produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Qaac-) dans le gène cible (orf14), c' est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al., 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été sélectionné et le plasmide correspondant a été nommé pSPM509. Ce plasmide dérive de pSPM504 dans lequel orfl4 est interrompu par la cassette apramycine (cf. figure 12). L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène or/14, l'interruption commence au niveau du quatrième codon de or/14. Il reste après la cassette le dernier codon de or/14.
* Le vecteur pSPM509 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens
OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène or/14 interrompu par la cassette att3Qaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de or/14 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant à la cassette att3Qaac- pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un produit de PCR correspondant à une séquence débordant d'une centaine de paires de base en amont et en
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aval de la séquence codante de orfl4. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf14::att3#aac-) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM509. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3Qaac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Qaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orf14::att3#aac- et a été nommé SPM509. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de or/14, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que orflSc soit orienté en sens opposé à orfl4 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Un échantillon de la souche SPM509 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2913.
EXEMPLE 14: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène or/6*
L'inactivation du gène or/6* a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus et figure 10). Pour cela, le cosmide pSPM7 a été utilisé comme matrice pour amplifier un fragment du gène or/6* grâce aux oligonucléotides suivants : C9583 : 5' CTGCAGGTGCTCCAGCGCGTCGATCT 3' (oligo sens) (SEQ ID N 102)
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C9584 : 5' CTGCAGACGGAGGCGGACCTGCGGCT 3' (oligo antisens) (SEQ ID N 103)
Les 20 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 3' de ces oligonucléotides correspondent à une séquence située dans la partie codante du gène or/6* (SEQ ID N 13) et les 6 déoxy-nucléotides situés les plus en 5' correspondent à la séquence d'un site PstI permettant de faciliter le clonage par la suite. Le fragment d'ADN amplifié fait une taille d'environ 1,11 kb. Ce produit de PCR est cloné dans le vecteur pGEM-T Easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)) ce qui a permis d'obtenir le plasmide nommé pBXLl 111 (cf. figure 16).
La cassette excisable att1#hyg+ a ensuite été introduite dans la séquence codante du gène or/6*. Pour cela, le plasmide pBXLllll a été digéré par les enzymes de restriction SmaI et Asp718I et le produit de digestion a été traité par l'enzyme de Klenow. Cette manipulation permet de réaliser une délétion interne de 120 pb dans la séquence codante du gène orf6* (cf. figure 15). De plus, de part et d'autre des sites de restrictions, il reste respectivement 511 pb et 485 pb de la séquence de orf6* qui permettront la recombinaison homologue pour l'inactivation du gène orf6*. La cassette
Figure img01140001

excisable attls2hyg+ a été préparée à partir du plasmide pattlS2hyg+ (cf. ci-dessus) par digestion de ce plasmide par EcoRV. Cette dernière a ensuite été sous-clonée dans le vecteur pBXLl 111 préalablement préparé comme décrit ci-dessus (digestion SmaI et Asp718I puis traitement à l'enzyme de Klenow). Le plasmide obtenu a été nommé pBXL1112 (cf. figure 17). Dans cette construction, le gène orf6* comporte une délétion de 120pb et est interrompu par la cassette att1#hyg+.
Le plasmide pBXL1112 a été ensuite digéré par l'enzyme PstI (site bordant la cassette puisque présent dans les oligonucléotides PCR) et l'insert PstI de 3. 7 kb comprenant une partie de orf6* interrompu par la cassette att1#hyg+ a ensuite été cloné au niveau du site PstI du plasmide pOJ260 (cf. ci-dessus). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pBXLl 113.
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Le vecteur pBXL1113 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens
OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al., 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure
9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène or/6* interrompu par la cassette att1#hyg+. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orf6* par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par la technique du Southem blot. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybridé avec une sonde correspondant au gène hyg (obtenu par PCR) pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde l'insert PstI-PstI contenant le gène or/6*, d'une taille d'environ 1,1 kb et obtenu à partir du plasmide pBXLl lll (cf. ci-dessus et figure 16). La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orf6*::att1#hyg+) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM501. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette attl2hyg+ était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att1#hyg+ dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orf6*::att1#hyg+ et a été nommé SPM501. Un échantillon de la souche SPM501 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2909.
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La souche SPM501 a été transformée par le vecteur pOSV508 par transformation de protoplastes pour provoquer l'excision de la cassette (cf. figure 14). Le plasmide pOSV508 est dérivé du plasmide pWHM3 (Vara J et al.,1989) (cf. figure 13) dans lequel les gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) placés sous le contrôle du promoteur ptrc (Amann, E. et al., 1988) ont été ajoutés (cf. figure 14). L'introduction dans la souche SPM501 du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 permet l'excision efficace par recombinaison site spécifique de la cassette excisable entre les sites attL et attR flanquant cette cassette (Raynal A. et al., 1998) (figure 10). Parmi les transformants, sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'hygromycine dont le gène de résistance est porté par la cassette att1#hyg+, l'excision entraîne en effet la perte de ce gène de résistance (cf. figure 10). Le plasmide pOSV508 est instable et après deux passages successifs sur milieu sans antibiotique des clones isolés sont repiqués sur milieu avec thiostrepton et sur milieu sans thiostrepton. Les clones sensibles au thiostrepton ont perdu pOSV508. Il a été vérifié que l'excision de la cassette a bien eu lieu en phase dans le gène or/6* par PCR et séquençage du produit PCR. L'interruption commence au 1581ème codon, 40 codons sont délétés (120pb) et l'excision de la cassette laisse une séquence cicatricielle attl caractéristique de 33pb : 5' ATCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3' (SEQ ID N 104).
La souche ainsi obtenue et possédant le génotype voulu (orf6*::att1) a été nommée SPM502.
Un échantillon de la souche SPM502 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.
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EXEMPLE 15 : Analyse des souches de Streptomyces ambofaciens interrompue dans les gènes orf2, orf3, orf8, orflO, orfl2, orfl3c, orfl4, orf6*
Pour tester la production en spiramycine des diverses souches obtenues, un test microbiologique basé sur la sensibilité d'une souche de Micrococcus luteus a été mis au point (cf. (Gourmelen A. et al., 1998)). La souche de Micrococcus luteus utilisée est une souche dérivée de la souche DSM1790 naturellement sensible à la spiramycine (cette souche est disponible notamment auprès de la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschweig, Allamagne), sous le numéro DSM1790), la souche utilisée dans le présent test diffère de la souche DSM1790 en ce qu'elle est résistante à la congocidine. Cette souche est un mutant spontané obtenu par sélection sur milieu contenant des doses croissantes de congocidine. Une telle souche a été sélectionnée du fait que Streptomyces ambofaciens produit à la fois de la spiramycine et de la congocidine. Le but étant de doser la production en spiramycine des diverses souches obtenues grâce à un test microbiologique basé sur la sensibilité d'une souche de Micrococcus luteus, il est nécessaire de disposer d'une souche résistante à la congocidine.
Les différentes souches de Streptomyces à tester ont été cultivées dans des erlenmeyers à baffles (erlenmeyers chicanés) de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al., 1993). Les erlenmeyers chicanés ont été inoculés à une concentration initiale de 2.5 106spores/ml des différentes souches de S. ambofaciens et mises à pousser à 27 C sous agitation orbitale de 250 rpm. Des prélèvements de 2 ml de suspensions ont été réalisés après 48,72 et 96 heures de culture et centrifugés. Les différents surnageants ont ensuite été congelés à -20 C. Une dilution au dixième de ces surnageants dans du milieu de culture stérile est utilisée pour le test (cf. figure 18).
La souche indicatrice de Micrococcus luteus résistante à la congocidine mais sensible à la spiramycine a été cultivée dans du milieu 2TY (Sambrook et al., 1989) contenant de la congocidine à 5 g/ml pendant 48h à 37 C. La densité optique (DO) de
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la culture est mesurée et cette culture est diluée de façon à ajuster la densité optique à 4.
0,4 ml de cette pré-culture est dilué dans 40 ml de milieu DAMS (Difco Antibiotic
Medium 5, commercialisé par la société Difco), préalablement porté à une température d'environ 45 C. Ce milieu est ensuite coulé dans une boîte carrée de 12x12 cm et laissé à reposer à température ambiante.
Une fois le milieu refroidi et solidifié, des disques en papier Whatman AA (cf.
Gourmelen A. et al., 1998) de 12 mm de diamètre ont été imbibés de 70 1 de la dilution au dixième de chaque surnageant et déposés sur la surface de la boîte. Des disques imbibés d'une solution de spiramycine de différentes concentrations (2-4-8 g/ml dans du milieu de culture MP5) sont utilisés comme gamme étalon. Les boîtes sont laissées à 4 C pendant 2 h de façon à permettre la diffusion des antibiotiques dans l'agar puis sont incubées à 37 C pendant 24 à 48h.
Si le disque contient de la spiramycine, celle-ci diffuse dans l'agar et inhibe la croissance de la souche indicatrice de Micrococcus luteus. Cette inhibition crée un halo autour du disque, ce halo reflétant la zone où la souche de Micrococcus luteus n'a pas poussé. La présence de ce halo est donc une indication de la présence de spiramycine et permet de déterminer si la souche de S. ambofaciens correspondant au disque en question est productrice ou non productrice de spiramycine. Une comparaison avec les diamètres d'inhibition obtenus pour la gamme étalon permet d'obtenir une indication de la quantité de spiramycine produite par cette souche.
Les différentes souches décrites dans les exemples précédents ont été utilisées dans ce test pour détecter leur production en spiramycine. Les résultats obtenus ont été regroupés dans le Tableau 33.
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Tableau 33
Figure img01190001
<tb>
<tb> Souche <SEP> Gène <SEP> inactivé <SEP> Exemple <SEP> dans <SEP> Phénotype <SEP> : <SEP>
<tb> lequel <SEP> la <SEP> Producteur <SEP> (+) <SEP> ou
<tb> souche <SEP> est <SEP> non-producteur <SEP> (-) <SEP> de
<tb> décrite <SEP> spiramycine
<tb> ATCC23877 <SEP> Aucun <SEP> 1 <SEP> (+)
<tb> OS49. <SEP> 16 <SEP> orf3::#hyg <SEP> 2 <SEP> (-)
<tb> OS49. <SEP> 67 <SEP> or/3 <SEP> délation <SEP> en <SEP> phase <SEP> 6 <SEP> (-)
<tb> OS49.107 <SEP> orf8::#hyg <SEP> 7 <SEP> (-)
<tb> OS49. <SEP> 50 <SEP> orf10::#hyg <SEP> 8 <SEP> (-)
<tb> OSC2 <SEP> Aucun <SEP> 10 <SEP> (+)
<tb> SPM21 <SEP> orf2::att3#aac- <SEP> 10 <SEP> (-)
<tb> SPM22 <SEP> orf2::att3 <SEP> délétion <SEP> en <SEP> phase <SEP> 10 <SEP> (-)
<tb> SPM501 <SEP> orf6*::att1#hyg+ <SEP> 14 <SEP> (-)
<tb> SPM502 <SEP> orf6*::att1 <SEP> délétion <SEP> en <SEP> phase <SEP> 14 <SEP> (+)
<tb> SPM507 <SEP> orf12::att3#aac- <SEP> 11 <SEP> (-)
<tb> SPM508 <SEP> orf13c::att3#aac- <SEP> 12 <SEP> (+)
<tb> SPM509 <SEP> orf14::att3#aac- <SEP> 13 <SEP> (-)
<tb>
Ces résultats permettent de tirer un certain nombre de conclusions en ce qui concerne la fonction des différents gènes impliqués dans la biosynthèse de la
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spiramycine. Ainsi le gène or/3 est essentiel à la biosynthèse de la spiramycine. En effet une inactivation en phase dans ce gène conduit à une souche (OS49.67, (cf. exemple 6)) ne produisant plus de spiramycine. L'inactivation en phase permet d'écarter l'hypothèse d'une éventuelle influence de la cassette introduite sur l'expression des gènes situés en aval de orf3.
De même, les gènes orf8 et or/70 codent des protéines essentielles à la biosynthèse de la spiramycine puisque les souches OS49.107 et OS49. 50 ont un phénotype non producteur. De plus, dans ces deux dernières souches, c'est bien l'inactivation du gène correspondant qui est responsable de ce phénotype non producteur, puisqu'au vu de l'orientation des différentes orfs (cf. figure 3), la construction introduite ne peut avoir d'effet polaire.
L'étude des souches possédant une cassette excisable permet également de tirer un certain nombre de conclusion en ce qui concerne la fonction des gènes interrompus. La souche SPM507 possède le génotype : orf12::att3#aac-. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orf12, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). Le fait que orf13c soit orienté en sens opposé à orfl2 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM507 est non producteur, on peut donc en conclure que le gène orf12 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.
Figure img01200001
La souche SPM508 possède le génotype : ofl3c: : att3.lczac-. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl3c, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). Le fait que orf14 soit orienté en sens opposé à orf13c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d 'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM508 est producteur, on peut
<Desc/Clms Page number 121>
donc en conclure que le gène orfl3c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.
Figure img01210001

La souche SPM509 possède le génotype : or f14: : att32aac-. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl4; au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que orfl5c soit orienté en sens opposé à orfl4 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de selection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM509 est non producteur, on peut donc en conclure que le gène orfl4 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.
La souche SPM21 possède le génotype : orf2::att3#aac-. Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cependant, l'orientation des gènes orf1 à orf8 (cf. figure 3) laisse penser que ces gènes sont cotranscrits. Aussi, le phénotype observé peut être dû à un effet polaire de la cassette introduite dans orf2 sur l'expression de gènes situés en aval dans l'opéron. La souche SPM22 possède le génotype orf2::att3 et a été obtenue après excision en phase de la cassette introduite. L'excision de la cassette laisse seulement une séquence cicatricielle caractéristique (cf. exemple 10).
La souche SPM22 étant également de phénotype non producteur, on peut en conclure que le gène or/2 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. On observe ici uniquement l'effet dû à l'inactivation de orf2.
La souche SPM501 possède le génotype : orf6*::att1#hyg+. Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cependant, les gènes orf5* et orf6* (cf. figure 3) ayant la même orientation, le phénotype observé peut être dû à un effet polaire de la cassette introduite dans orf6* sur l'expression de or/?*. La disposition de ces gènes laisse penser qu'ils peuvent être cotranscrits. Pour répondre à cette question, la souche SPM502 a été obtenue après excision en phase de la cassette introduite. Dans cette souche, on observe uniquement l'effet de l'inactivation de orf6*. Cette souche
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possède le génotype orf6*::att1 (cf. exemple 14). L'excision de la cassette laisse seulement une séquence cicatricielle en phase (cf. exemple 14). La souche SPM502 possède un phénotype producteur (cette souche ne produit cependant que de la spiramycine I (cf*. exemple 16)). On peut donc conclure que le gène orf5* est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens, puisque son inactivation indirecte dans la souche SPM501 conduit à un phénotype non producteur.
Par contre ; le gène or/6* n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine I chez S. ambofaciens (par contre il est essentiel à la production de spiramycine II et III (cf. exemple 16)).
EXEMPLE 16. Dosage de la production des spiramycines I, II et III dans les souches mutantes obtenues
Les différentes souches à tester ont été cultivées chacune dans 7 erlensmeyers chicanés de 500 mL contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al., 1993). Les erlens ont été inoculés par 2.5 106 spores/ml des différentes souches de S. ambofaciens et mises à pousser à 27 C sous agitation orbitale de 250 rpm pendant 72 heures. Les cultures correspondant au même clone sont rassemblées, éventuellement filtrées sur filtre plissé, et centrifugées 15 min à 7000 tr/min. Les différents surnageants ont ensuite été stockés à -30 C.
Les dosages ont été effectués par Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) par appariement d'ions. L'analyse CLHP du milieu de culture permet de déterminer précisément la concentration des trois formes de spiramycine. La colonne utilisée (Macherey-Nagel) est remplie avec une phase Nucleosil de silice greffée octyle.
La granulométrie est de 5 m et la taille des pores 100 . Le diamètre interne de la colonne est de 4,6mm et sa longueur 25cm. La phase mobile est un mélange de tampon H3PO4 (pH2,2) et d'acétonitrile 70/30 (v/v) contenant 6,25g/L de perchlorate de NaC104. L'analyse est réalisée en régime isocratique avec un débit fixé à 1 mL/min. La
<Desc/Clms Page number 123>
colonne est thermorégulée à 23 C. La détection est assurée par spectrophotométrie UV à 238nm. L'échantillon est réfrigéré à +10 C et la quantification est déterminée à partir de l'aire des pics (par étalonnage externe). Dans ces conditions, les temps de rétention de la spiramycine I, II et III sont respectivement d'environ 17; 21 et 30 minutes, comme il a pu être vérifié grâce à un échantillon commercial comprenant les trois formes de spiramycine.
La souche OSC2 possède un phénotype producteur de spiramycine. C'est la souche parentale utilisée pour l'obtention des souches possédant une cassette excisable (cf. exemple 15). Cette souche a donc été utilisée comme témoin positif de production des trois formes de spiramycine. Cette souche produit bien les trois formes de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 19).
L'étude des souches possédant une cassette excisable permet de tirer un certain nombre de conclusions en ce qui concerne la fonction des gènes interrompus. La souche SPM507 possède le génotype : orf12::att3#aac-. Le phénotype de la souche SPM507 est non producteur (cf. exemple 15), on peut donc en conclure que le gène or/72 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche ne produit plus de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 22). Ce résultat confirme le caractère essentiel du gène orf12 dans la biosynthèse de la spiramycine.
La souche SPM508 possède le génotype : orf13c::att3#aac-. Le phénotype de la souche SPM508 est producteur de spiramycine (cf. exemple 15), on peut donc en conclure que le gène orf13c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche produit de la spiramycine I, II et III comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 23). Ce résultat confirme que le gène orf13c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse des spiramycines I, II et III ches S. ambofaciens.
Figure img01230001
La souche SPM509 possède le génotype : o f14.: att3.aac-. Le phénotype de la souche SPM509 est non producteur, on peut donc en conclure que le gène orf14 est un
<Desc/Clms Page number 124>
gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche ne produit plus de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 24). Ce résultat confirme l'essentialité du gène orf14 dans la biosynthèse de la spiramycine.
Figure img01240001
La souche SPM501 possède le génotype : o f6 *: : attl S2hyg=. Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cette souche ne produit plus de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 20). Cependant, les gènes or/5* et or/6* (cf. figure 3) ayant la même orientation, le phénotype observé peut être dû à un effet polaire de la cassette introduite dans or/6* sur l'expression de orf5*dans l'opéron. Ceci laisse penser que ces gènes sont cotranscrits. Pour répondre à cette question, la souche SPM502 a été obtenue par excision de la cassette introduite, produisant une délétion en phase dans le gène or 6* et restaurant l'expression de orf5*. Cette souche possède le génotype orf6*::attl (cf. exemple 14 et 15). L'excision de la cassette laisse seulement une séquence att cicatricielle en phase (cf. exemple 14). La souche SPM502 possède un phénotype producteur de spiramycine. Cependant, comme il a été prouvé par CLHP, cette souche ne produit que de la spiramycine I et ne produit pas de spiramycine II et III (cf. figure 21). On peut donc conclure de ces résultats que le gène orf5*est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens, puisque son inactivation indirecte dans la souche SPM501 conduit à un phénotype non producteur de spiramycine (cf. figure 20). Par contre ; le gène or/6* n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine I chez S. ambofaciens, puisque l'inactivation de ce gène conduit à un phénotype producteur de spiramycine I (cf. figure 21).
Cependant, orf6* est essentiel à la production de spiramycine II et III (cf. exemple 16)).
Le gène oif6* code donc bien une acyl-transférase responsable de la modification du platénolide à la position 3 (cf. figure 1).
<Desc/Clms Page number 125>
Liste des constructions décrites dans la présente demande Liste des abréviations : Am : Ampicilline ; Hyg : Hygromycine ;Sp : Spiramycine ; Ts : Thiostrepton ; Cm : Chloramphénicol. Kn : Kanamycine, Apra : apramycine.
Figure img01250001
<tb>
<tb>
Nom <SEP> de <SEP> la <SEP> Marqueur <SEP> Principales <SEP> caractéristiques <SEP> Référence
<tb> construction <SEP> de <SEP> sélection
<tb> pWE15 <SEP> Am <SEP> (Wahl, <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1987)
<tb> pWED1 <SEP> Am <SEP> pWE15 <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> un <SEP> (Gourmelen <SEP> et <SEP> al.,
<tb> fragment <SEP> Hpal-Hpal <SEP> de <SEP> 4. <SEP> 1 <SEP> kb <SEP> 1998)
<tb> a <SEP> été <SEP> délété
<tb> pOJ260 <SEP> Apra <SEP> Conjugatif, <SEP> non <SEP> réplicatif <SEP> chez <SEP> (Bierman <SEP> et <SEP> al.,
<tb> Streptomyces <SEP> 1992)
<tb> pHP45 <SEP> Qhyg <SEP> Hyg <SEP> Cassette <SEP> #hyg <SEP> dans <SEP> pHP45. <SEP> (Blondelet-Rouault
<tb> et <SEP> al., <SEP> 1997)
<tb> pKC505 <SEP> Apra <SEP> Cosmide <SEP> (Richardson <SEP> MA <SEP> et <SEP>
<tb> al., <SEP> 1987)
<tb> pIJ486 <SEP> Ts <SEP> Plasmide <SEP> réplicatif <SEP> (Ward <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1986)
<tb> multicopies <SEP> Streptomyces
<tb> pOSint3 <SEP> Am <SEP> ptrc-xis-int <SEP> dans <SEP> pTrc99A <SEP> (Raynal <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1998)
<tb> pWHM3 <SEP> Am, <SEP> Ts <SEP> Vecteur <SEP> navette <SEP> réplicatif <SEP> E. <SEP> (Vara <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1989)
<tb> coli/Streptomyces.
<tb> pKOBEG <SEP> Cm <SEP> (Chaveroche <SEP> et <SEP> al.,
<tb> 2000)
<tb> pGP704Not <SEP> Am <SEP> (Chaveroche <SEP> et <SEP> al.,
<tb> 2000)
<tb> pMBL18 <SEP> Am <SEP> (Nakano <SEP> et <SEP> al.,
<tb> 1995)
<tb> pGEM-T <SEP> Easy <SEP> Am <SEP> vecteur <SEP> E. <SEP> coli <SEP> pour <SEP> clonage <SEP> Mezei <SEP> et <SEP> al., <SEP> 1994
<tb> de <SEP> produits <SEP> PCR
<tb>
<Desc/Clms Page number 126>
Figure img01260001
<tb>
<tb> pOS49.1 <SEP> Am <SEP> pWEDl <SEP> avec <SEP> insert <SEP> au <SEP> niveau <SEP> Exemple <SEP> 2
<tb> du <SEP> site <SEP> BamHI
<tb> pOS49.11 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> SacI <SEP> de <SEP> pOS49. <SEP> 1 <SEP> Exemple <SEP> 2
<tb> danspUC19.
<tb> pOSC49. <SEP> 12 <SEP> Ch <SEP> Fragment <SEP> XhoI <SEP> de <SEP> pOS49.11 <SEP> Exemple <SEP> 2
<tb> dans <SEP> pBC <SEP> SK+
<tb> pOS49. <SEP> 14 <SEP> Cm,Hyg <SEP> pOSC49.12 <SEP> avec <SEP> le <SEP> gène <SEP> orf3 <SEP> Exemple <SEP> 2
<tb> interrompu <SEP> par <SEP> la <SEP> cassette
<tb> #hyg
<tb> pOS49.16 <SEP> Apra, <SEP> Hyg <SEP> Insert <SEP> de <SEP> pOS49.14 <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 2
<tb> pOJ260
<tb> Cm <SEP> Fragment <SEP> BamHI-PstI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 3
<tb> pOS49. <SEP> 28 <SEP> 3,7kb <SEP> de <SEP> pOS49. <SEP> 1 <SEP> dans <SEP> pBC
<tb> SK+
<tb> pOS44. <SEP> 1 <SEP> Apra, <SEP> Sp <SEP> pKC505 <SEP> contenant <SEP> un <SEP> insert <SEP> (Pernodet <SEP> et <SEP> al.,
<tb> conférant <SEP> la <SEP> résistance <SEP> la <SEP> 1999)
<tb> spiramycine <SEP> chez <SEP> S.
<tb> griseofuscus
<tb> pOS44. <SEP> 2 <SEP> Ts, <SEP> Sp <SEP> Fragment <SEP> Sau3AI <SEP> de <SEP> 1,8 <SEP> kb <SEP> Exemple <SEP> 3
<tb> pOS44.1 <SEP> dans <SEP> pIJ486 <SEP>
<tb> pOS44. <SEP> 4. <SEP> Am <SEP> Insert <SEP> de <SEP> pOS44. <SEP> 2 <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 3
<tb> pUC19
<tb> pSPM5 <SEP> Am <SEP> pWEDl <SEP> avec <SEP> insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 3
<tb> S. <SEP> ambofaciens <SEP> au <SEP> niveau <SEP> du
<tb> site <SEP> BamHI
<tb> pSPM7 <SEP> Am <SEP> pWED1 <SEP> avec <SEP> insert <SEP> d'ADN <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 3
<tb> S. <SEP> ambofaciens <SEP> au <SEP> niveau <SEP> du
<tb> site <SEP> BamHI
<tb>
<Desc/Clms Page number 127>
Figure img01270001
<tb>
<tb> pOSK1205 <SEP> Hyg <SEP> pBK-CMV <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> hyg <SEP> Exemple <SEP> 5
<tb> remplace <SEP> neo
<tb> pOS49. <SEP> 67 <SEP> Apra <SEP> Fragment <SEP> EcoRI-SacI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 6
<tb> pOS49.1, <SEP> comportant <SEP> une
<tb> délétion <SEP> interne <SEP> de <SEP> 504
<tb> nucléotides, <SEP> dans <SEP> pOJ260
<tb> pOS49. <SEP> 88 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> de <SEP> 3. <SEP> 7 <SEP> kb <SEP> PstI- <SEP> Exemple <SEP> 7 <SEP>
<tb> EcoRI <SEP> de <SEP> pOS49. <SEP> 1 <SEP> dans
<tb> pUC19
<tb> pOS49.106 <SEP> Am <SEP> p049.88 <SEP> avec <SEP> hyg <SEP> dans <SEP> or/8 <SEP> Exemple <SEP> 7 <SEP>
<tb> (hyg <SEP> et <SEP> orf8 <SEP> dans <SEP> la <SEP> même
<tb> orientation)
<tb> pOS49. <SEP> 120 <SEP> Am <SEP> pOS49. <SEP> 88 <SEP> avec <SEP> hyg <SEP> dans <SEP> or/8 <SEP> Exemple <SEP> 7 <SEP>
<tb> (hyg <SEP> et <SEP> orf8 <SEP> dans <SEP> des
<tb> orientations <SEP> opposées)
<tb> pOS49. <SEP> 107 <SEP> Apra, <SEP> Hyg <SEP> Insert <SEP> de <SEP> pOS49.106 <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 7 <SEP>
<tb> pOJ260
<tb> pOS49. <SEP> 32 <SEP> Am, <SEP> Kn <SEP> Fragment <SEP> de <SEP> 1,5 <SEP> kb <SEP> interne <SEP> à <SEP> Exemple <SEP> 8
<tb> or/70 <SEP> dans <SEP> pCR2.1-TOPO
<tb> pOS49. <SEP> 43 <SEP> Am, <SEP> Kn <SEP> pOS49. <SEP> 32 <SEP> avec <SEP> hyg <SEP> dans <SEP> or/70 <SEP> Exemple <SEP> 8
<tb> (hyg <SEP> et <SEP> orf10 <SEP> dans <SEP> la <SEP> même
<tb> orientation)
<tb> pOS49. <SEP> 44 <SEP> Am, <SEP> Kn <SEP> pOS49.32 <SEP> avec <SEP> hyg <SEP> dans <SEP> orf10 <SEP> Exemple <SEP> 8
<tb> (hyg <SEP> et <SEP> orf10 <SEP> dans <SEP> des
<tb> orientations <SEP> opposées)
<tb> pOS49.50 <SEP> Apra, <SEP> Hyg <SEP> Insert <SEP> de <SEP> pOS49. <SEP> 43 <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 8
<tb> pOJ260
<tb> pWHM3Hyg <SEP> Am, <SEP> Hyg <SEP> pWHM3 <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> tsr <SEP> est <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> remplacé <SEP> par <SEP> hyg
<tb>
<Desc/Clms Page number 128>
Figure img01280001
<tb>
<tb> pOSV508 <SEP> Am, <SEP> Ts <SEP> ptrc-xis-int <SEP> dans <SEP> pWHM3 <SEP> Exemple <SEP> 9
<tb> patt1#hyg+ <SEP> Cm, <SEP> Hyg <SEP> Cassette <SEP> attl2hyg+ <SEP> dans <SEP> pBC <SEP> Exemple <SEP> 9
<tb> SK+ <SEP> dont <SEP> le <SEP> site <SEP> HindIII <SEP> a <SEP> été
<tb> supprimé
<tb>
Figure img01280002

patt3SZaac- Cm, Gn Cassette att32aac- dans pBC Exemple 9
Figure img01280003
<tb>
<tb> SK+ <SEP> dont <SEP> le <SEP> site <SEP> HindIII <SEP> a <SEP> été
<tb> supprimé
<tb> pOSV510 <SEP> Am, <SEP> Hyg <SEP> pro <SEP> pra-Amh <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> pWHM3Hyg
<tb> pOS49. <SEP> 99 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> EcoRI-BamHI <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> 4,5 <SEP> kb <SEP> de <SEP> pSPM5 <SEP> dans <SEP> pUC19
<tb> pOSK1102 <SEP> Am, <SEP> Apra <SEP> pGP704Not <SEP> contenant <SEP> la <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> cassette <SEP> att3QaacpSPM17 <SEP> Am, <SEP> Apra <SEP> pOS49. <SEP> 99 <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> orf2 <SEP> est <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> interrompue <SEP> par <SEP> la <SEP> cassette
<tb> att3QaacpSPM21 <SEP> Hyg, <SEP> Apra <SEP> pOSK1205 <SEP> contenant <SEP> l'insert <SEP> Exemple <SEP> 10
<tb> EcoRI-Xbal <SEP> de <SEP> pSPM17 <SEP> (dans
<tb> lequel <SEP> orf2 <SEP> est <SEP> interrompue
<tb> par <SEP> la <SEP> cassette <SEP> att3Qaac-)
<tb> pSPM502 <SEP> Am <SEP> Fragment <SEP> BglII <SEP> de <SEP> 15,1 <SEP> kb <SEP> de <SEP> Exemple <SEP> 11
<tb> pSPM7danspMBL18
<tb> pSPM504 <SEP> Hyg <SEP> Insert <SEP> de <SEP> pSPM502 <SEP> dans <SEP> Exemple <SEP> 11
<tb> pOSK1205
<tb> pSPM507 <SEP> Hyg, <SEP> Apra <SEP> pSPM504 <SEP> dans <SEP> lequel <SEP> orf12 <SEP> Exemple <SEP> 11
<tb> est <SEP> interrompue <SEP> par <SEP> la <SEP> cassette
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Dépôt de matériel biologique
Les organismes suivants ont été déposés le 10 juillet 2002 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.
- Souche OSC2 sous le numéro d'enregistrement 1-2908.
- Souche SPM501 sous le numéro d'enregistrement 1-2909.
- Souche SPM502 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.
- Souche SPM507 sous le numéro d'enregistrement 1-2911.
- Souche SPM508 sous le numéro d'enregistrement 1-2912.
- Souche SPM509 sous le numéro d'enregistrement 1-2913.
- Souche SPM21 sous le numéro d'enregistrement 1-2914.
- Souche SPM22 sous le numéro d'enregistrement 1-2915.
- Souche OS49.67 sous le numéro d'enregistrement 1-2916.
- Souche OS49.107 sous le numéro d'enregistrement 1-2917.
- Souche Escherichia Coli DH5a contenant le plasmide pOS44. 4 sous le numéro d'enregistrement 1-2918.
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Claims (67)

REVENDICATIONS
1. Polynucléotide codant un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisé en ce que la séquence dudit polynucléotide est : (a) l'une des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, Il, 13, 15, 17, 19,21,23,25,28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74,76, 78,80, 82 et 84 (b) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a), (c) l'une des séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.
2. Polynucléotide s'hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence à au moins l'un des polynucléotides selon la revendication 1.
3. Polynucléotide présentant au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide comprenant au moins 10,12, 15,18, 20 à 25, 30, 40,50, 60,70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300,350, 400,450, 500,550, 600, 650, 700, 750, 800,850, 900,950, 1000,1050, 1100, 1150,1200, 1250, 1300, 1350,1400, 1450,1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800,1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide selon la revendication 1.
4. Polynucléotide selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.
5. Polynucléotide selon la revendication 2, 3 ou 4 caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.
6. Polynucléotide selon la revendication 2,3, 4 ou 5 caractérisé en ce qu'il code une protéine ayant une activité similaire à la protéine codée par le polynucléotide avec lequel il s'hybride ou il présente l'identité.
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7. Polypeptide résultant de l'expression d'un polynucléotide selon la revendication 1,2, 3, 4, 5 ou 6.
8. Polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisée en ce que la séquence dudit polypeptide est : (a) l'une des séquences SEQ ID N 4,6, 8, 10,12, 14,16, 18,20, 22,24, 26, 27,29,31,32,33,35,37,38,39,41,42,44,46,48,50,51,52,54,55,56,57,58,59,
61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 et 85, (b) l'une des séquences telles que définies en (a) excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles, (c) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a) et (b).
9. Polypeptide présentant au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en acides aminés avec un polypeptide comprenant au moins 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360,380, 400,420, 440,460, 480,500, 520,540, 560,580, 600,620 ou 640 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon la revendication 8.
10. Polypeptide selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.
11. Polypeptide selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.
12. Polypeptide selon la revendication 9,10 ou 11caractérisé en ce qu'il a une activité similaire à celle du polypeptide avec lequel il partage l'identité.
13. ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 1,2,3,4, 5 ou 6.
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14. ADN recombinant selon la revendication 13 caractérisé en ce que le dit ADN recombinant est compris dans un vecteur.
15. ADN recombinant selon la revendication 14 caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC ou les PAC.
16. ADN recombinant selon la revendication 15 caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi pOS49. 1, pOS49.11, pOSC49.12, pOS49. 14, pOS49. 16, pOS49. 28, pOS44. 1, pOS44. 2, pOS44. 4, pSPM5, pSPM7, pOS49. 67, pOS49.88, pOS49. 106, pOS49. 120, pOS49. 107, pOS49. 32, pOS49. 43, pOS49. 44, pOS49. 50, pOS49. 99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509,pSPMl,pBXLlllLpBXL1112etpBXL1113.
17. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant un polypeptide selon la revendication 7,8, 9, 10, 11 ou 12.
18. Système d'expression comprenant un vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides selon la revendication 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.
19. Système d'expression selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression procaryotes ou les systèmes d'expression eucaryotes.
20. Système d'expression selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression chez la bactérie E. coli, les sytèmes
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d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de levures, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de mammifères.
21. Cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4, 5, 6, 13, 14, 15, 16 ou 17.
22. Procédé de production d'un polypeptide selon la revendication 7,8, 9,10, 11ou 12 caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a) insérer au moins un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
23. Microorganisme bloqué dans une étape de la voie de biosynthèse d'au moins un macrolide.
24. Microorganisme selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il est obtenu en inactivant la fonction d'au moins une protéine impliquée dans la biosynthèse de ce ou de ces macrolides dans un microorganisme producteur de ce ou de ces macrolide.
25. Microorganisme selon la revendication 24 caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénèse dans le ou les gènes codant ladite ou lesdites protéines ou par expression d'un ou de plusieurs ARN
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anti-sens complémentaires de l'ARN ou des ARN messagers codant ladite ou lesdites protéines.
26. Microorganisme selon la revendication 25 caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénèse par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée ou par remplacement de gène.
27. Microorganisme selon la revendication 25 ou 26 caractérisé en ce que la ou les mutagénèses sont effectuées in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés ou par inactivation génique.
28. Microorganisme selon la revendication 23,24, 25,26 ou 27 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.
29. Microorganisme selon la revendication 23,24, 25,26, 27 ou 28 caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.
30. Microorganisme selon la revendication 23,24, 25,26, 27,28 ou 29 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souche de S. ambofaciens.
31. Microorganisme selon la revendication 23,24, 25, 26,27, 28,29 ou 30 caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'une des revendication 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
32. Microorganisme selon la revendication 25,26, 27,28, 29,30 ou 31 caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ
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60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80,82 et 84.
ID ? 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25,28,30,34,36,40,43,45,47,49,53,
Figure img01450001
33. Microorganisme selon la revendication 25, 26, 27,28, 29, 30, 31 ou 32 caractérisé en ce que la mutagénèse consiste en l'inactivation génique d'un gène comprenant une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N 13.
34. Souche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche choisie parmi l'une des souches déposées auprès de la Collection Nationale de
Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2909,1-2911,1-2912,1-2913,1-2914,1-2915,1-2916 ou 1-2917.
35. Procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse de macrolide caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'une des revendications 22,23, 24,25, 26,27, 28,29, 30,31, 32,33 ou 34, b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), ledit intermédiaire de biosynthèse.
36. Procédé de préparation d'une molécule dérivée d'un macrolide caractérisé en ce que l'on prépare un intermédiaire de biosynthèse selon le procédé de la revendication 35 et que l'on modifie l'intermédiaire ainsi produit.
37. Procédé de préparation selon la revendication 36 caractérisé en ce que l'on modifie ledit intermédiaire par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.
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38. Procédé de préparation selon la revendication 36 ou 37 caractérisé en ce que l'on introduit dans ledit microorganisme un ou plusieurs gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat.
39. Procédé de préparation selon la revendication 36, 37 ou 38 caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.
40. Procédé de préparation selon la revendication 36,37, 38 ou 39 caractérisé en ce que le microorganisme utilisé est une souche de S. ambofaciens.
41. Microorganisme produisant de la spiramycine 1 mais ne produisant pas de spiramycine II et III
42. Microorganisme selon la revendication 41 caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de la spiramycine 1 mais que le gène comprenant la séquence SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants n'est pas exprimé ou a été rendu inactif.
43. Microorganisme selon la revendication 42 caractérisé en ce que la dite inactivation est réalisée par mutagénèse dans le gène codant ladite protéine ou par l'expression d'un ARN anti-sens complémentaire de l'ARN messager codant ladite protéine.
44. Microorganisme selon la revendication 43 caractérisé en ce que la dite mutagénèse est effectuée dans le promoteur de ce gène, dans la séquence codante ou dans une séquence non codante de manière à rendre inactive la protéine codée ou à en empêcher son expression ou sa traduction.
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45. Microorganisme selon la revendication 43 ou 44 caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénèse dirigée ou par remplacement de gène.
46. Microorganisme selon la revendication 43, 44 ou 45 caractérisé en ce que la mutagénèse est effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique.
47. Microorganisme selon la revendication 41 ou 42 caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu en exprimant les gènes de la voie de biosynthèse de la spiramycine sans que ceux-ci ne comprennent le gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants.
48. Microorganisme selon la revendication 41,42, 43,44, 45,46 ou 47 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.
49. Microorganisme selon la revendication 41,42, 43,44, 45,46, 47 ou 48 caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de départ produisant les spiramycines I, II et m.
50. Microorganisme selon la revendication 41,42, 43,44, 45, 46,47, 48 ou 49 caractérisé en ce qu'il est obtenu par mutagénèse dans un gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N 13ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N 14 ou l'un de ses variants ayant la même fonction.
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51. Microorganisme selon la revendication 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou
50 caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de S. ambofaciens produisant les spiramycines I, II et III, dans laquelle est effectuée une inactivation génique du gène comprenant la séquences correspondant à SEQ ID N 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
52. Souche de S. ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.
53. Procédé de production de spiramycine I, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'une des revendications 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,51 ou 52, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), la spiramycine I.
54. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1, 2,3, 4,5 ou 6 pour améliorer la production en macrolides d'un microorganisme.
55. Microorganisme mutant producteur de macrolide caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'une des revendication 1, 2,3, 4,5 ou 6 et/ou qu'il surexprime au moins un gène comprenant une séquence selon l'une des revendication 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
56. Microorganisme mutant selon la revendication 55 caractérisé en ce que la modification génétique consiste en une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés dans le but
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d' exprimer une ou des protéines ayant une activité supérieure ou d' exprimer un niveau plus élevé de cette ou de ces protéines.
57. Microorganisme mutant selon la revendication 55 caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en augmentant le nombre de copie de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage.
58. Microorganisme mutant selon la revendication 55 ou 57 caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en transformant un microorganisme producteur de macrolide par une construction d'ADN recombinant selon la revendication 13, 14 ou 17, permettant la surexpression de ce gène.
59. Microorganisme mutant selon la revendication 55,56, 57 ou 58 caractérisé en ce que la modification génétique est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30,34, 36,40, 43,45, 47,49, 53, 60,62, 64,66, 68,70, 72,74, 76,78, 80, 82 et 84 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
60. Microorganisme mutant selon la revendication 55,56, 57,58 ou 59 caractérisé le microorganisme surexprime un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N 3,5, 7,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,74, 76,78, 80,82 et 84 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
61. Microorganisme mutant selon la revendication 55,56, 57,58, 59 ou 60 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactéries du genre Streptomyces.
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62. Microorganisme mutant selon la revendication 55, 56, 57, 58, 59, 60 ou 61 caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.
63. Microorganisme mutant selon la revendication 55, 56, 57, 58,59, 60, 61 ou
62 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souches de S. ambofaciens.
64. Procédé de production de macrolides, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'une des revendications 55,56, 57,58, 59, 60, 61, 62,63 ou 64, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), le ou lesdits macrolides produits.
65. Utilisation d'une séquence et/ou d'un ADN recombinant et/ou d'un vecteur selon l'une des revendication 1, 2, 3,4, 5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12,13, 14,15, 16 ou 17 pour la préparation d'antibiotiques hybrides.
66. Utilisation d'au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un polypeptide et/ou au moins une cellule hôte selon l'une des revendications 1, 2, 3,4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 16, 17 ou 21 pour réaliser une ou plusieurs bioconversions.
67. Polynucléotide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide complémentaire de l'un des polynucléotides selon la revendication 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.
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