NO335995B1

NO335995B1 - Polypeptider involvert i spiramycin biosyntese, nukleotidsekvenser kodende nevnte polypeptider og anvendelser derav.

Info

Publication number: NO335995B1
Application number: NO20052160A
Authority: NO
Inventors: Jean-Luc Pernodet; Marie-Hélène Blondelet-Rouault; Hélène Dominguez; Emmanuelle Darbon-Rongere; Claude Gerbaud; Anne Gondran; Fatma Karray; Patricia Lacroix; Nathalie Oestreicher-Mermet-Bouvier; Karine Tuphile
Original assignee: Aventis Pharma Sa; Cnrs Ct Nationale De La Rech Scient
Priority date: 2002-10-08
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2015-04-13
Also published as: BRPI0314543B1; BRPI0314543B8; IL167854A; JP2006501863A; NO20052160L; JP5042497B2; AU2003300479A1; KR20050084843A; WO2004033689A2; WO2004033689A3; AU2003300479B2; CA2501445C; BR0314543A; KR101110175B1; EP1551975A2; CA2501445A1; MXPA05002852A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår isolering og identifisering av nye gener av den biosyntetiske vei for spiramyciner og nye polypeptider som er involvert i denne biosyntese. Oppfinnelsen angår også anvendelsen av disse gener for å øke produksjonsnivåene og renheten for det fremstilte spiramycin.

Oppfinnelsen angår også anvendelsen av disse gener for å konstruere mutanter som kan lede til syntese av nye antibiotika eller til derivatformer av spiramyciner. Oppfinnelsen angår også molekylene som fremstilles ved ekspresjonen av disse gener, og til slutt farmakologisk aktive preparater av et molekyl fremstilt ved ekspresjon av slike gener.

Streptomyces er Gram-positive filamentøse jordbakterier. De spiller en viktig rolle i dekomponeringen og mineraliseringen av organiske materialer på grunn av stor diversitet av nedbrytningsenzymer de skiller ut. De viser morfologiske differensieringsfenomener som er unike i prokaryoter, ledsaget av en metabolsk differensiering som karakteriseres ved produksjonen av sekundærmetabolitter med en ekstraordinær diversitet av kjemiske strukturer og biologiske aktiviteter. Blant disse metabolitter er det spiramycinene som fremstilles naturlig av bakterien Streptomyces ambofaciens.

Spiramycin er et antibiotikum av makrolidfamilien som er av nytte både i veterinærmedisinen og i humanmedisinen. Makrolider karakteriseres ved nærvær av en laktonring på hvilken det er podet ett eller flere sukkere. Streptomyces ambofaciens produserer naturlig spiramycin I, II og III (jamfør figur 1); imidlertid er den antibiotiske aktivitet spiramycin I klart større enn den til spiramycinene II og III (Liu et al, 1999). Spiramycin I-molekylet består av en laktonbasert makrosykel kalt platenolid, og tre sukkere: forosamin, mykaminose og mykarose (jamfør figur 1). Den biologiske aktivitet for spiramyciner skyldes inhibering av proteinsyntese i prokarioter, ved en mekanisme som involverer binding av antibiotikumet til det bakterielle ribosom.

Visse forbindelser som er medlemmer av makrolidfamilien og som også har en laktonring, har gitt opphav til anvendelser utenfor antibiotikumfeltet. Således har produktet FK506 immunosuppressoreffekter og gir perspektiver med henblikk på terapeutisk anvendelse på området organtransplantasjon, rheumatoid artritt og mer generelt, patologiske tilstander relatert til autoimmune reaksjoner. Andre makrolider som avermektin, har insektisid og anti-helmintaktivitet.

Mange biosyntetiske veier som angår antibiotika som hører til varierte klasser, og også andre sekundærmetabolitter (se K. Chater, 1990, for en oversikt) er til i dag allerede studert i Streptomycetes. Imidlertid er kunnskapen om de biosyntetiske reaksjonsveiene for spiramyciner til dags dato ufullstendig.

Spiramycinbiosyntese er en kompleks prosess som omfatter mange trinn og involverer mange enzymer (Omura et al, 1979a, Omura et al, 1979b). Spiramyciner tilhører den

store klasse av polyketider som inkluderer komplekse molekyler som er spesielt rikelige i mikroorganismer funnet i jord. Disse molekyler er gruppert sammen, ikke på grunn av strukturell analogi, men på grunn av en viss likhet i trinnene for deres biosyntetiske vei. Spesifikt fremstilles polyketider ved en kompleks serie av reaksjoner som har det til

felles at det, i deres biosyntesevei, er en serie reaksjoner som katalyseres av et eller flere enzymer som kalles "polyketidsyntaser" (PKS). I Streptomyces ambofaciens blir biosyntesen av den laktonbaserte makrosyklus av spiramyciner (platenolid) gjenomført av en serie av åtte moduler som kodes av fem PKS-gener (S. Kuhstoss, 1996, US patent 5, 945,320). Spiramyciner oppnås fra denne laktonring. Imidlertid er det forskjellige trinn og enzymer som er involvert i syntesen av sukkerne, og også deres festing til laktonringen og modifiseringen av denne ringen for å oppnå spiramycinene, er fremdeles ukjent.

US patent 5,514,544 beskriver kloning av en sekvens kalt srmR i Streptomyces ambofaciens. I dette patent fremsettes den hypotese at srmR- genet koder et protein som regulerer transkripsjonen av genene som er involvert i makrolidbiosyntesen.

Epp et al., Gene, vol. 85, nr.2, 1989, side 293-301, ISSN 0378-1119 omhandler carE fra Streptomyces thermotolerans og dets involvering i carbomycin biosyntese. 1 1987 viste Richardson og kollegaer (Richardson et al, 1987) at spyramycinresistensen hos S. ambofaciens tilveiebringes av minst tre gener; disse gener ble kalt srmA, srmB og srmC. US patent 4,886,757 beskriver mer spesielt karakteriseringen av et DNA-fragment av S. ambofaciens inneholdende srmC-genet. Imidlertid ble sekvensen for dette gen ikke beskrevet. I 1990 fremsatte Richardson og kollegaer (Richardson et al, 1990) den hypotese at det er tre gener for spiramycinbiosyntese nær srmB. US patent 5,098,837 rapporterer kloning av fem gener som potensielt er involvert i spiramycinbiosyntese. Disse genene ble gitt betegnelsene srmD, srmE, srmF, srmG og srmH.

En av de største vanskelighetene ved fremstilling av forbindelser som spiramyciner, ligger i det faktum at det er nødvendig med meget store fermenteringsvolumer for å produsere relativt små mengder produkt. Det er derfor ønskelig å kunne være i stand til å øke effektiviteten for fremstillingen av slike molekyler for å redusere fremstillingsomkostningene.

Den biosyntetiske vei for spiramyciner er en kompleks prosess, og det ville være ønskelig å identifisere og å eliminere de parasittiske reaksjonene som kan foreligge under denne prosess. Formålet med en slik manipulering er å oppnå et renere antibiotikum og/eller en forbedring av produktiviteten. I denne forbindelse produserer Streptomyces ambofaciens på naturlig måte spiramycin I, II og III (jamfør figur 1); imidlertid er den antibiotiske aktivitet for spiramycin I klart større enn den til spiramycinene II og III (Liu et al, 1999). Det ville derfor være ønskelig å kunne være i stand til å ha stammer som kun produserer spiramycin I.

På grunn av den kommersielle verdi for makrolidantibiotika, tilstrebes det intenst å fremstille av nye derivater og særlig analoger av spiramyciner med fordelaktige egenskaper. Det ville være ønskelig å kunne generere, i tilstrekkelige mengder, de biosyntetiske mellomprodukter for biosynteseveien for spiramyciner eller spiramycinderivater, særlig for å kunne fremstille spiramycinavledede hybridantibiotika.

Generell beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er resultatet av kloningen av gener av visse produkt er involvert i spiramycinbiosyntesen. Denne oppfinnelsen angår fremfor alt nye gener for den biosyntetiske vei for spiramyciner og nye polypeptider som er involvert i denne biosyntese.

Foreliggende oppfinnelse omfatter polynukleotid som koder for et polypeptid involvert i spiramycin biosyntesen, kjennetegnet ved at sekvensene for polynukleotidet er : (a) en av sekvensene SEQ ID-nr. 111 eller 141; (b) en av sekvensene avledet fra sekvensens (a) ved degenerering av den genetiske kode; eller (c) et polunukleotid som har minst 80 %, 90 %, 95 % eller 98 % nukleotididentitet med

et polynukleotid med sekvens (a).

Videre omfatter oppfinnelsen ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter minst en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 3-6.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også ekspresjonssystem, kjenntegnet ved at det omfatter en egnet ekspresjonsvektor og en vertscelle som tillater ekspresjon av ett eller flere polypeptider som angitt i hvilket som helst av kravene 3-6.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge hvilket som helst av kravene 3-6, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: a) innføring av minst en nukleinsyre som koder for nevnte polypeptid i en egnet vektor; b) dyrking, i et egnet kulturmedium, av en vertscelle som er transformert eller transfektert på forhånd med vektoren fra trinn a); c) gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller et celleekstrakt; d) separering og rensing av nevnte polypeptid fra kulturmediet eller fra celleekstraktet oppnådd i trinn c); og e) der det er aktuelt, karakterisering av det fremstilte rekombinante polypeptid.

Omfattet av oppfinnelsen er også makrolidproduserende mutant mikroorganisme,

kjennetegnet ved at den har en genetisk modifikasjon i minst ett gen som omfatter en sekvens som angitt i krav 1 eller 2, og/eller som overuttrykker minst ett gen som omfatter en sekvens som angitt i krav 1 eller 2.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte for fremstilling av makrolider, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: (a) dyrking, i et egnet kulturmedium, av en mikroorganisme som angitt i hvilket som helst av kravene 10-13; (b) gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller et celleekstrakt; og (c) separering og rensing av nevnte makrolid(er) som er fremstilt fra kulturmediet eller fra celleekstraktet oppnådd under trinn b).

Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av en sekvens og/eller av et rekombinant DNA og/eller av en vektor som angitt i hvilket som helst av kravene 1, 2, 7 og 8 for fremstilling av hybride antibiotika.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også en stamme av streptomyces ambofaciens som angitt i hvilket som helst av kravene 10-13, kjennetegnet ved at den er stammen

OSC2/pSPM75(l) eller stammen OSC2/pSPM75(2) deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures and Microorganisms]

(CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 6. oktober 2003, under registreringsummeret 1-3101.

Foreliggende oppfinnelse omfatter vertscelle, kjennetegnet ved at den har innført minst ett polynukleotid som angitt i krav 1.

Genene i biosynteseveien og de assosierte kodende sekvenser er klonet og beskrives heri, og DNA-sekvensen for hver er bestemt. De klonede, kodende sekvenser vil heretter angis som orfl * c, orf2* c, orf3* c, orf4* c, orf5<*>, orf6*, orf7* c, or/ 8*, orflO<*>, orfl, orfl, or/ 3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orf9c, orflO, orfllc, orfl2, orflSc, orfl4, orfl5c, orfl6, orfl 7, orfl8, orfl9, or/ 20, orfllc, orf22c, orf23c, or/ 24c, or/ 25c, or/ 26, orf27, orf28, orf29, orf30c, orf31, orf32c, orf33 og orf34c. Funksjonen for proteinene som er kodet av disse sekvenser i biosynteseveien for spiramyciner, er utvklet i diskusjonen nedenfor og som er illustrert i figurene 4, 5, 6 og 8. 1) Det beskrives et polynukleotid som koder et polypeptid som er involvert spiramycinbiosyntesen, og der sekvensen for polynukleotidet er: en av sekvensene SEQ ID-nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13,15, 17, 19, 21, 23,25, 28, 30, 34, 36,40,43,45, 47,49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 og 149,

en av sekvensene bestående av variantene av sekvensene (a),

en av sekvensene avledet fra sekvensene (a) og (b) på grunn av degenerering av den genetiske kode.

2) Det beskrives også et polynukleotid som hybridiserer, under høystringente hybrideringsbetingelser, til minst ett av polynukleotidene i henhold til avsnitt 1) ovenfor. 3) Det beskrives også et polynukleotid som oppviser minst 70%, 80%, 85%, 90%, 95% eller 98% nukleotididentitet med et polynukleotid omfattende minst 10, 12, 15,18,20 til 25,30,40, 50, 60, 70, 80, 90,100,150,200,250, 300,350,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,1050,1100,1150, 1200, 1250, 1300,1350, 1400, 1450,1500, 1550, 1600,1650, 1700, 1750, 1800, 1850 eller 1900 konsekutive nukleotider av et polynukleotid i henhold til avsnitt 1) ovenfor. 4) Det beskrives videre et polynukleotid i henhold til avsnitt 2) eller 3) ovenfor som er isolert fra en bakterie av genus Streptomyces. 5) Det beskrives også et polynukleotid i henhold til avsnitt 2), 3) eller 4) ovenfor, som koder et protein som er involvert i biosyntesen av et makrolid. 6) Det beskrives også et polynukleotid i henhold til avsnitt 2), 3) eller 4) ovenfor, som koder et protein som har en aktivitet lik proteinet som kodes av polynukleotidet med hvilket det hybridiseres eller med hvilket det oppviser identitet. 7) Det beskrives også et polypeptid som er resultatet av ekspresjon av et polynukleotid i henhold til avsnitt 1), 2), 3), 4), 5) eller 6) ovenfor. 8) Videre beskrives et polypeptid som er involvert i en spiramycin biosyntese, der polypeptidets sekvens er: en av sekvensene SEQ ID nr. 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18,20, 22, 24, 26,27,29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65,67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 85,108,110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 og 150, (b) en av sekvensene som definert under (a), bortsett fra at, i sekvensen, en eller flere aminosyrer er substiutert, insertert eller deletert uten å påvirke de funksjonelle egenskaper,

(c) en av sekvensene bestående av variantene av sekvensene (a) og (b).

9) Beskrevet er også et polypeptid som viser minst 70%, 80%, 85%, 90%, 95% eller 98% aminosyreidentitet med et polypeptid omfattende minst 10, 15,20,30 til 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 eller 640 konsekutive aminosyrer av et polypeptid i henhold til avsnitt 8) ovenfor. 10) Det beskrives videre et polypeptid i henhold til avsnitt 9) ovenfor, som er isolert fra en bakterie av genus Streptomyces. 1 l)Det beskrives et polypeptid i henhold til avsnittene 9) og 10) ovenfor, som koder et protein som er involvert i biosyntesen av et makrolid. 12) Det beskrives også et polypeptid i henhold til avsnitt 9), 10) eller 11) ovenfor, som har en aktivitet tilsvarende den til polypeptidet med hvilket det deler identiteten. 13) Videre beskrives det et rekombinant DNA, som omfatter minst ett polynukleotid i henhold til avsnittene 1), 2), 3), 4), 5) og 6) ovenfor. 14) Det er også beskrevet en rekominant DNA i henhold til avsnitt 13) ovenfor, der den rekombinante DNA er inkludert i en vektor. 15) Det beskrives et rekombinant DNA i henhold til avsnitt 14) ovenfor, der vektoren er valgt blant bakteriofager, plasmider, fagmider, integrative vektorer, fosmider, kosmider, shuttlevektorer, BACer og PACer. 16) Videre beskrives det en rekombinant DNA i henhold til avsnitt 15) ovenfor, som er valgt blant pOS49.1, pOS49.11, pOSC49.12, pOS49.14, pOS49.16, pOS49.28, pOS44.1, pOS44.2, pOS44.4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, pOS49.88, pOS49.106, pOS49.120, pOS49.107, pOS49.32, pOS49.43, pOS49.44, pOS49.50, pOS49.99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPMl, pBXLl 111, pBXLl 112, pBXLl 113, pSPM520, pSPM521, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74, pSPM75, pSPM79, pSPM83, pSPM107, pSPM543 og pSPM106. 17) Det beskrives også en ekspresjonsvektor, som omfatter minst en nukleinsyresekvens som koder et peptid i henhold til avsnitt 7), 8), 9), 10), 11) eller 12) ovenfor. 18) Det beskrives et ekspresjonssystem omfattende en egnet ekspresjonsvektor og en vertscelle, som tillater ekspresjon av ett eller flere polypeptider i henhold til avsnitt 7), 8), 9), 10), 11) eller 12) ovenfor. 19) Beskrevet er også et ekspresjonssystem i henhold til avsnitt 18) ovenfor, som er valgt blant prokaryote ekspresjonssystemer og eukaryote ekspresjonssystemer. 20) Det er også beskrevet et ekspresjonssystem i henhold til avsnitt 19) ovenfor, som er valgt blant ekspresjonssystemer i bakterien E. coli, bakulovirusekspresjonssystemer som tillater ekspresjon i innsektsceller, ekspresjonssystemer som tillater ekspresjon i gjærceller og ekspresjonssystemer som tillater ekspresjon i pattedyrceller. 21) Videre beskrives en vertscelle inn i hvilken minst ett polypeptid og/eller minst en rekombinant DNA og/eller minst en ekspresjonsvektor i henhold til et av avsnittene 1), 2), 3), 4), 5), 6), 13), 14), 15), 16) og 17) ovenfor, er innført. 22) Det er også beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid i henhold til avsnitt 7), 8), 9), 10), 11) eller 12) ovenfor, der fremgangsmåten

omfatter følgende trinn:

a) innføring av minst en nukleinsyre som koder nevnte polypeptid inn i en egnet vektor; b) dyrking, i et egnet kulturmedium, av en vertscelle som er transformert eller transfektert på forhånd med en vektor ifølge trinn a); c) gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller en celleekstrakt; d) separering og rensing av polypeptidet fra kulturmediet eller også fra celleekstraktene som oppnådd under trinn c); og e) eventuelt, hvis aktuelt, karakterisering av det produserte rekombinante polypeptid. 23) Videre er det beskrevet en mikroorganisme som er blokkert i et trinn i den biosyntetiske vei for minst ett makrolid. 24) Det er beskrevet en mikroorganisme ifølge avsnitt 23) ovenfor som er oppnådd ved inaktivering av funksjonen av minst ett protein involvert i biosyntesen av dette eller disse makrolider i en mikroorganisme som produserer dette eller disse makrolider. 25) Det er også beskrevet en mikroorganisme i henhold til avsnitt 24) ovenfor, der inaktiveringen av dette eller disse proteiner gjennomføres ved mutagenese i genet eller genene som koder proteinet eller proteinene, eller ved ekspresjon av en eller flere antisens som er komplementære med mRNA som koder nevnte proteiner. 26) Videre beskrives en mikroorganisme i henhold til avsnitt 25) ovenfor, der inaktiveringen av dette eller disse proteiner gjennomføres ved mutagenese via bestråling, ved innvirkning av et mutagenisk kjemisk middel, ved seterettet mutagenese eller ved generstatning. 27) Beskrevet er også en mikroorganisme i henhold til avsnitt 25 eller 26 ovenfor, der mutagenesen eller mutagenesene gjennomføres in vitro eller in situ ved suppresjon, substitusjon, delesjon og/eller addisjon av en eller flere baser i det eller de angjeldende gener eller ved genaktivering. 28) Det er beskrevet en mikroorganisme i henhold til avsnittene 23), 24), 25), 26) eller 27) ovenfor, der mikroorganismen er en bakterie av genus Streptomyces. 29) Videre beskrives en mikroorganisme ifølge avsnitt 23), 24), 25), 26), 27) eller

28) ovenfor, der makrolidet er spiramycin.

30) Beskrevet er også en mikroorganisme ifølge avsnitt 23), 24), 25), 26), 27), 28) eller 29) ovenfor, der mikroorganismen er en stamme av S. ambofaciens. 31) Det er beskrevet en mikroorganisme ifølge avsnitt 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29) eller 30) ovenfor, der mutagenesen gjennomføres i minst ett gen omfattende en sekvens som koder for et av avsnittene 1), 2), 3), 4) og 6) ovenfor. 32) Det er også beskrevet en mikroorganisme ifølge avsnitt 25), 26), 27), 28), 29), 30) eller 31) ovenfor, der mutagenesen gjennomføres i ett eller flere gener omfattende en eller flere av sekvensene tilsvarende en eller flere av sekvensene SEQ ID-nr. 3,5,7, 9,11,13, 15,17,19,21,23,25,28,30, 34,36,40,43,45, 47,49, 53,60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82,84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 og 149. 33) Videre er det beskrevet en mikroorganisme ifølge avsnitt 25), 26), 27), 29), 30), 31) eller 32) ovenfor, der mutagenesen består i geninaktivering av et gen omfattende en sekvens tilsvarende SEQ ID nr. 13. 34) Videre er det beskrevet en stamme av Streptomyces ambofaciens, som er en stamme valgt blant en av stammene som er deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures and Microorganisms] (CNCM) den 10. juli 2002, under registreringsnumrene I-2909,1-2911,1-2912,1-2913,1-2914,1-2915,1-2916 eller 1-2917. 35) Det er beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av et makrolid biosyntese

mellomprodukt, og som omfatter følgende trinn:

a) dyrking i et egnet kulturmedium, av en mikroorganisme i henhold til et av avsnittene 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31), 32), 33) eller 34) ovenfor,

b) gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller en celleekstrakt,

c) separering og rensing av biosyntese mellomproduktet fra kulturmediet eller

eventuelt fra ekstraktene oppnådd i trinn b).

36) Videre er det beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av et molekyl avledet fra et makrolid der et biosyntesemellomprodukt fremstilles i henhold til metoden ifølge avsnitt 35) ovenfor, og mellomproduktet som fremstilles er modifisert. 37) Beskrevet er også en fremgangsmåte for fremstilling i henhold til avsnitt 36) ovenfor, der mellomproduktet er modifisert kjemisk, biokjemisk, enzymatisk og/eller mikrobiologisk. 38) Videre er det beskrevet er en fremgangsmåte for fremstilling i henhold til avsnitt 36) eller 37) ovenfor, der ett eller flere gener som koder for proteiner som er i stand til å modifisere mellomproduktet ved å benytte det som substrat, innføres i mikroorganismen. 39) Det er beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling i henhold til avsnitt 36), 37) eller 38) ovenfor, der makrolidet er spiramycin. 40) Det er også beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling i henhold til avsnitt 36), 37), 38) eller 39) ovenfor, der mikroorganismen som benyttes er en stamme av S. ambofaciens. 41) Beskrevet er også en mikroorganisme som produserer spiramycin I, men som ikke produserer spiramycin II og III. 42) Det er beskrevet en mikroorganisme i henhold til avsnitt 41) ovenfor, som omfatter alle genene som er nødvendige for biosyntese av spiramycin I, men der genet som omfatter sekvensen SEQ ID-nr. 13 eller en av dettes varianter, eller en av sekvensene avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode, og koder for et polypeptid med SEQ ID-nr. 14 eller en av dennes varienter, ikke uttrykkes eller er gjort iaktiv. 43) Videre er det beskrevet en mikroorganisme i henhold til avsnitt 42), der inaktiveringen gjennomføres ved mutagenese i genet som koder proteinet, eller ved ekspresjon av en antisens RNA som er komplementær til den mRNA som koder proteinet. 44) Det beskrives også en mikroorganisme ifølge avsnitt 43) ovenfor, der mutagenesen gjennomføres i promoteren for dette genet, i den kodende sekvens eller i en ikke-kodende sekvens for å gjøre det kodede proteinet inaktivt eller for å forhindre dets ekspresjon eller dets translasjon derfra. 45) Videre beskrives en mikroorganisme ifølge avsnitt 43) eller 44) ovenfor, der mutagenesen gjennomføres ved bestråling, ved innvirkning av et mutagent, kjemisk middel, ved seterettet mutagenese eller ved generstatning. 46) Det beskrives en mikroorganisme i følge avsnitt 43), 44) eller 45) ovenfor, der mutagenesen gjennomføres in vitro eller in situ, ved suppresjon, substitusjon, delesjon og/eller addisjon av en eller flere baser i det angjeldende gen eller ved geninaktivering. 47) Det beskrives også en mikroorganisme ifølge avsnitt 41) eller 42) ovenfor, der mikroorganismen oppnås ved å uttrykke genene av den biosyntetiske vei for spiramycin uten at disse gener omfatter genet omfattende sekvensen tilsvarende SEQ ID-nr. 13 eller en variant derav, eller en av sekvensene avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode, og koder et polypeptid ved sekvensen SEQ ID-nr. 14 eller en variant derav. 48) Videre beskrives en mikroorganisme i henhold til avsnitt 41, 42), 43), 44), 45),

46) eller 47), der mikroorganismen er en bakterie av genus Streptomyces.

49) Beskrevet er også en en mikroorganisme i henhold til avsnitt 41), 42), 43), 44), 45) , 46), 47) eller 48) ovenfor, der mikroorganismene er oppnådd fra en utgangsstamme som produserer spiramycinene I, II og III. 50) Det beskrives en en mikroorganisme ifølge avsnitt 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47) , 48) eller 49) ovenfor, som oppnås ved mutagenese i et gen omfattende sekvensen tilsvarende SEQ ID-nr. 13 eller en variant derav, eller en av sekvensene avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode, og koder et polypeptid med SEQ ID-nr. 14 eller en variant derav med den samme funksjon. 51) Videre beskrives en mikroorganisme i henhold til avsnitt 41), 42), 43), 44), 45), 46) , 47), 48), 49) eller 50) ovenfor, der mikroorganismen er oppnådd fra en stamme av S. ambofaciens som produserer spiramyciner I, II og III, hvori geninaktiveringen av genet omfattende sekvensene tilsvarende SEQ ID-nr. 13 eller en av sekvensene avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode, er gjennomført. 52) Det beskrives en stamme av S. ambofaciens, som er stammen deponert hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) den 10. juli 2002 under registreringsnummeret 1-2910. 53) Videre beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av spiramycin I, og som

omfatter følgende trinn:

a) dyrking i et egnet kulturmedium av en mikroorganisme i henhold til et av avsnittene 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49), 50), 51) og 52) ovenfor,

b) gjenvinning av kondisjonert kulturmedium eller en celleekstrakt,

c) separering og rensing av spiramycin I fra kulturmediet eller også fra

celleekstrakten oppnådd i trinn b).

54) Det beskrives også anvendelsen av et polynukleotid i henhold til et av avsnittene 1), 2), 3), 4), 5) og 6) ovenfor, for å forbedre makrolidproduksjonen hos en mikroorganisme. 55) Det beskrives en makrolidproduserende, mutant mikroorganisme, som har en genetisk modifikasjon i minst ett gen omfattende en sekvens i henhold til et av avsnittene 1), 2), 3), 4), 5) eller 6) ovenfor, og som overuttrykker minst ett gen omfattende en sekvens i henhold til et av avsnittene 1), 2), 3), 4), 5) og 6) ovenfor. 56) Videre beskrives en mutant mikroorganisme i henhold til avsnitt 55) ovenfor, der den genetiske modifikasjonen består av en suppresjon, en substitusjon, en delesjon og/eller en addisjon av en eller flere baser i ett eller flere av de angjeldende gen, med det formål å overuttrykke ett eller flere proteiner med større aktivitet og/eller å uttrykke et høyere nivå av dette eller disse proteiner. 57) Beskrevet er også en mutant mikroorganisme i henhold til avsnitt 55) ovenfor, der overekspresjonen av det angjeldende gen oppnås ved å øke kopiantallet for genet, og/eller ved å innføre en promoter som er mer aktiv enn villtypepromoteren. 58) Videre beskrives også en mutant mikroorganisme ifølge avsnitt 55) eller 57) ovenfor, der overekspresjonen av det angjeldende gen oppnås ved transformering av en makrolidproduserende mikroorganisme med et rekombinant DNA-konstrukt i henhold til avsnitt 13,14 eller 17 ovenfor, for å tillatte overekspresjon av dette gen. 59) Det beskrives en mutant mikroorganisme ifølge avsnitt 55), 56), 57) eller 58) ovenfor, der genmodifikasjonen er gjennomført i ett eller flere gener omfattende en av sekvensene tilsvarende en eller flere av sekvensene SEQ ID-nr. 3, 5,7, 9, 11,13,15,17, 19,21,23,25, 28, 30,36,40, 43,45,47,49, 53, 60, 62,64, 66, 68, 70, 72,74, 76,78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 og 149, eller en variant derav, eller en av sekvensene avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode. 60) Videre beskrives en mikroorganisme ifølge avsnitt 55), 56), 57), 58) eller 59) ovenfor, der mikroorganismen overuttrykker ett eller flere gener omfattende en av sekvensene tilsvarende en eller flere av sekvensenes SEQ ID-nr. 3, 5, 7, 9, 11,13,15, 17, 19,21,23, 25, 28, 30, 34, 40, 43, 45, 47,49, 53, 60, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82,84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 og 149, eller en variant derav, eller en av sekvensene avledet derfra, på grunn av degenerering av den genetiske kode. 61) Det er også beskrevet en mutant mikroorganisme i henhold til avsnitt 55), 56), 57) , 58), 59), 60) eller 61) ovenfor, der mikroorganismen er en bakterie av genus Streptomyces. 62) Beskrevet er også en mutant mikroorganisme i henhold til avsnitt, 55), 56), 57),

58) , 59), 60) eller 61) ovenfor, der makrolidet er spiramycin.

63) Det beskrives en mutant mikroorganisme i henhold til avsnitt 55), 56), 57), 58) 59) , 60), 61) eller 62) ovenfor, der mikroorganismen er en stamme av S. ambofaciens. 64) Det beskrives også en fremgangsmåte for fremstilling av makrolider, og som

omfatter følgende trinn:

a) dyrking, i et egnet kulturmedium, ev en mikroorganisme i henhold til et av avsnittene 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61), 62), 63) og 64) ovenfor,

b) gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller en celleekstrakt,

c) separering og rensing av makrolidet eller makrolidene som er fremstilt fra

kulturmediet, eller eventuelt fra celleekstrakten som oppnådd i trinn b).

65) Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen angår anvendelsen av en sekvens og/eller en rekombinant DNA og/eller en vektor i henhold til et av avsnittene 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16) og 17) ovenfor, for fremstilling av hybridantibiotika. 66) Videre beskrives anvendelsen av minst ett polynukleotid og/eller minst en rekombinant DNA, og/eller minst en ekspresjonsvektor, og/eller et polypeptid og/eller minst en vertscelle i henhold til et av avsnittene 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16), 17) og 21) ovenfor, for å gjennomføre en eller flere biokonverteringer. 67) Beskrevet er også et polynukleotid som er et polynukleotid som er komplementært til et av polynukleotidene i henhold til avsnitt 1), 2), 3), 4), 5) eller 6 ovenfor. 68) Det beskrives en mikroorganisme som produserer minst en spiramycin, og som omveruttrykker: et gen som kan oppnås ved polymerasekjedereaksjon (PCR) ved bruk av det følgende par av sekvensprimere: 5'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC3' (SEQ ID-nr. 138) og 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID-nr. 139) og, som matriks, kosmidet pSPM36 eller den totale DNA av Streptomyces ambofaciens, eller et gen avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode. 69) Videre beskrives en mikroorganisme i henhold til avsnitt 68 eller 90, som er en bakterie av genus Streptomyces. 70) Beskrevet er også en mikroorganisme i henhold til avsnitt 68, 69 eller 90 som er en bakterie av Streptomyces ambofaciens. 71) Det beskrives en mikroorganisme i henhold til avsnitt 68,69, 70 eller 90, der overekspresjonen av genet oppnås ved transformering av mikroorganismen med en ekspresjonsvektor. 72) Videre beskrives en stamme av Streptomyces ambofaciens, som er stammen OSC2/pSPM75(l) eller stammen OSC2(pSPM75(2), deponert ved Collection

Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) [National Collection of Cultures and Microorganisms] Pasteur Institue, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, den 6. oktober 2003 under registreringsnumre i I-3101.

73) Beskrevet er også et rekombinant DNA som omfatter:

et polynukleotid som kan oppnås ved polymerasekjedereaksjon ved bruk av det følgende par av sekvensprimere: 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID-nr. 138) og 5'-GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID-NR. 139) og, som en matriks, kosmid pSPM36 eller den totale DNA av Streptomyces ambofaciens, eller et fragment på minst 10,12,15, 18,20 til 25, 30,40, 50,60, 70, 80, 90,100,150, 200, 250, 300, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100,1150, 1200, 1250,1300, 1350, 1400, 1450, 1460, 1470, 1480,1490 eller 1500 konsekutive nukleotider av dette polynukleotid. 74) Det beskrives også et rekombinant DNA i henhold til avsnitt 73 eller 91, som er en vektor. 75) Videre beskrives et rekombinant DNA i henhold til asnittene 73, 74 eller 91, som er en ekspresjonsvektor. 76) Beskrevet er også en vertscelle inn i hvilken minst et rekombinant DNA i henhold til et av avsnittene 73, 74, 75 og 91 er innført. 77) Det beskrives en fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid der metoden

omfatter trinnene:

a) transformering av en vertscelle med minst en ekspresjonsvektor i henhold til avsnitt 75; b) dyrking, i et egnet kulturmedium av vertscellen; c) gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller en celleekstrakt; d) separering og rensing av polypeptidet fra kulturmediet eller fra celleekstraktene oppnådd fra kulturmediet eller fra celleekstraktene oppnådd i trinn c); e) der det er hensiktsmessig, karakterisering av det rekombinante produserte polypeptid. 78) Videre beskrives en mikroorganisme i henhold til avsnitt 51, der genaktiveringen er gjennomført ved in-phase delesjon av genet eller en del av genet omfattende sekvensen tilsvarende SEQ ID-nr. 13 eller en av sekvensene avledet derfra ved degenerering og den genetiske kode. 79) Beskrevet er også en mikroorganisme i henhold til et av avsnittene 41,42, 43, 44.45, 46, 47, 48,49, 50, 51 og 78, som også overuttrykkes: et gen som kan oppnås ved polymerasekjedereaksjon ved bruk av det følgende par av sekvensprimere: 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID-nr. 138) og 5'GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID-nr. 139) og, som matriks, kosmidet pSPM36 eller den totale DNA av Streptomyces ambofaciens,

eller et gen avledet derfra, ved degenerering av den genetiske kode.

80) Det er beskrevet en ekspresjonsvektor der polynukleotidet med sekvens SEQ ID-nr. 47, eller et polynukleotid avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode, plasseres under kontroll av en promoter som tillater ekspresjon av produktet kodet av polynukleotidet i Streptomyces ambofaciens. 81) Videre beskrives en ekspresjonsvektor i henhold til avsnitt 80, som er plasmidet pSPM524 eller pSPM525. 82) Beskrevet er også en stamme av Streptomyces ambofaciens som er transformert med en vektor i henhold til avsnitt 80 eller 81. 83) Det beskrives en mikroorganisme i henhold til et av avsnittene 41,42, 43,44, 45.46, 47, 48, 49, 50, 51, 78, 79 og 92, som også overuttrykker genet som har en kodende sekvens SEQ ID-nr. 47 eller en kodende sekvens avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode. 84) Videre beskrives en mikroorganisme i henhold til avsnitt 83, som er en stamme SPM502 pSPM525 deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25 rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, den 26. februar 2003, under registreringsnummer I-2977. 85) Det er også beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av et eller flere

spyramyciner som omfatter de følgende trinn:

a) dyrking, i et egnet kulturmedium, av en mikroorganisme i henhold til et av avsnittene 68, 69, 70, 71, 72, 78, 79, 82, 83, 84, 90 og 92,

b) gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller en celleekstrakt,

c) separering og rensing av spiramycinene fra nevnte kulturmedie eller fra

celleekstrakten oppnådd i trinn b).

86) Det beskrives et polypeptid hvis sekvens omfatter sekvensen SEQ ID-nr. 112 eller sekvens SEQ ID nr. 142. 87) Beskrevet er også et polypeptid hvis sekvenser tilsvarer sekvensen som

translateres fra den kodende sekvens:

av et gen som kan oppnås ved polymerasekjedereaksjon (PCR) ved bruk av det følgende par av sekvensprimere: 5'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID nr. 138) og 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID nr. 139) og, som matriks, kosmidet pSPM36 eller den totale DNA av Streptomyces ambofaciens. eller et gen avledet derfra, på grunn av degenerering av den genetiske kode. 88) Videre beskrives en ekspresjonsvektor som tillater ekspresjon av et polypeptid i henhold til avsnitt 86, 87 eller 93 i Streptomyces ambofaciens. 89) Beskrevet er også en ekspresjonsvektor i henhold til avsnitt 88, som er plasmid pSPM75. 90) Det beskrives en mikroorganisme i henhold til avsnitt 68, der genet som kan oppnås ved polymerasekjedeforsterkning er genet av den kodende sekvens SEQ ID-nr. 141, eller et gen avledet derfra, ved degenerering av den genetiske koden. 91) Videre beskrives det en rekombinant DNA i henhold til avsnitt 73, der polynukleotidet som kan oppnås ved polymerasekjedeforsterkning er polynukleotid med sekvens SEQ ID-nr. 141. 92) Beskrevet er også en mikroorganisme i henhold til avsnitt 79, der genet som kan oppnås ved polymerasekjedeforsterkning er genet med den kodende sekvens SEQ ID-nr. 141, eller et gen avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode.

93) Det er beskrevet et polypeptid hvis sekvens er SEQ ID-nr. 142.

Generelle definisjoner

For oppfinnelsens formål angir uttrykket "isolert" et biologisk materiale (nukleinsyre eller protein) som er fjernet fra sin opprinnelige omgivelse (den omgivelse der det naturlig er lokalisert).

For eksempel er et polynukleotid som er tilstede i naturlig tilstand i en plante eller et dyr, ikke isolert. Det samme polynukleotid, separerte fra nabonukleinsyrene, hvori det naturlige er innskudd i plantens eller dyrets genom, anses for å være "isolert".

Et slikt polynukleotid kan inkluderes i en vektor, og/eller et slikt polynukleotid kan inkluderes i et preparat, og kan ikke desto mindre forbli i isolert tilstand på grunn av det faktum at vektoren eller preparatet ikke utgjør en naturlig omgivelse.

Uttrykket "renset" krever ikke at materialet er tilstede i en absolutt ren form som utelukker nærværet av andre forbindelser. Det er heller en relativ definisjon.

Et polynukleotid er "renset" tilstand etter rensing av utgangsmateriale eller det naturlige materiale med minst en størrelsesorden, fortrinnsvis 2 eller 3 og helst 4 eller 5 størrelsesorden.

For oppfinnelsens formål benyttes uttrykket ORF eller åpen leseramme for å angi særlig den kodende sekvens av et gen.

For oppfinnelsens formål kan uttrykket "nukleotidsekvens" benyttes for på samme måte å angi et polynukleotid eller en nukleinsyre. Uttrykket "nukleotidsekvens" omfatter det genetiske materialet per se, og er derfor ikke begrenset til informasjon angående dets sekvens.

Uttrykkene "nukleinsyre", "polynukleotid", "oligonukleotid" eller alternativt "nukleotidsekvens" omfagger RNA-, DNA- eller cDNA-sekvenser eller RNA/DNA-hybridsekvenser av mer enn ett nukleotid, i enkeltkjedeform eller i form av dupleks.

Uttrykket "nukleotid" angir både naturlige nukleotider (A, T, G, C) og også modifiserte nukleotider som omfatter minst en modifikasjon som (1) en purinanalog, (2) en pyrimidinanalog eller (3) en sukkeranalog, for eksempel av slike modifiserte nukleotider som beskrevet i WO 95/04064.

For oppfinnelsens formål er et første polynukleotid ansett å være "komplementær" til et andre polynukleotid når hver base i det første polynukleotid er parret til den komplementære base av det andre polynukleotid, hvis orientering er reversert. De komplementære basene er A og T (eller A og U), eller C og G.

Uttrygget "gener for den biosyntetiske vei for spiramyciner" omfatter også de regulatoriske gener og gener som gir resistens mot produsentmikroorganismene.

I henhold til oppfinnelsen skal uttrykket "fragment" av en referansenukleinsyre tolkes til å bety en nukleotidsekvens som er kortere sammenlignet med referansenukleinsyren og som, på den vanlige del, omfatter en nukleotidsekvens som er identisk med referansenukleinsyren.

I henhold til oppfinnelsen kan et slikt nukleinsyre "fragment", der det er hensiktsmessig, være inkludert i et større polynukleotid av hvilket det er en bestanddel.

Slike fragmenter kan omfatte, eller alternativt bestå av, polynukleotider med lengder i området 8,10,12,15, 18,20 til 25, 30,40, 50,60, 70, 80, 90,100,150,200,250,300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150,1200, 1250, 1300,1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650,1700, 1750, 1800, 1850 eller 1900 konsekutive nukleotider av en nukleinsyre.

I henhold til oppfinnelsen skal uttrykket "fragment" av et polypeptid bety et polypeptid hvis aminosyresekvens er kortere enn den til referansepolypeptidet og som, over hele den del som er felles med disse referansepolypeptider, omfatter en identisk aminosyresekvens.

Slike fragmenter kan, der det er hensiktsmessig, være inkludert i et større polypeptid av hvilke de er del.

Slike fragmenter av polypeptid i følge oppfinnelsen, kan ha en lengde på 10,15,20, 30 to 40, 50, 60, 70, 80, 90,100,120,140,160,180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440,460,480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 eller 640 aminosyrer.

For oppfinnelsens formål er uttrykket "høy-stringente hybridiseringsbetingelser" eller tilsvarende, ment å bety hybridiseringsbetingelser som er ugunstige for hybridiseringen av ikke-homologe nukleinsyretråder. Høystringente hybridiseringsbetingelser kan for eksempel beskrives som betingelser for hybridisering i den buffer som er beskrevet av Church & Gilbert (Curch & Gilbert, 1984) ved en temperatur mellom 55°C og 65°C; idet hybridiseringsstemperaturen fortrinnsvis er 55°C, enda mer foretrukket 60°C, og aller helst 65°C, fulgt av en eller flere vaskinger gjennomført i 2X SSC-buffer (IX SSC-buffer tilsvarer en vandig oppløsning av 0.15M NaCl, 15 mM natriumsitrat) ved en temperatur mellom 55°C og 65°C idet temperaturen fortrinnsvis er 55°C, helst 60°C og aller helst 65°C, fulgt av en eller flere vaskinger i 0.5X SSC-buffer ved en temperatur mellom 55°C og 56°C; der temperaturen fortrinnsvis er 55°C, helst 60°C og aller helst 65°C.

Det skulle ikke være nødvendig å påpeke at hybridiseringsbetingelsene som beskrevet

ovenfor, kan justeres som en funksjon av lengden av nukleinsyren hvis hybridisering er tilsiktet, eller av typen merking som velges, i henhold til teknikker som er velkjente for fagmannen. De egnede hybridiseringsbetingelser kan for eksempel justeres i henhold til det som er beskrevet av F. Ausubel et al. (2002).

Uttrykket "variant" av en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen er ment å bety en nukleinsyre som skiller seg ved en eller flere baser sammenlignet med referansepolynukleotidet. En variantnukleinsyre kan være av naturlig opprinnelse som en naturlig funnet allelisk variant, eller kan også være en ikke-naturlig variant som for eksempel er oppnådd ved mutageneseteknikker.

Generelt er forskjellene mellom referansenukleinsyren og variantnukleinsyren små, slik at nukleotidsekvensene av referansenukleinsyren og av variantnukleinsyren er meget nær og, i mange områder, identiske. Nukleotidmodifikasjonene som er tilstede i en variantnukleinsyre kan være «silent», noe som betyr at de ikke modifiserer aminosyresekvensene som kodes av nevnte variantnukleinsyre.

Imidlertid kan nukleotidforandringene i en variantnukleinsyre også resultere i substitusjoner, addisjoner og/eller delesjoner i polypeptidet som kodes av variantnukleidsyren sammenlignet med peptidene som kodes av referansenukleinsyren. I tillegg kan nukleotidmodifikasj onene i de kodende områder produsere konservative eller ikke-konservative substitusjoner i aminosyresekvensen.

Fortrinnsvis koder variantnukleinsyrene ifølge oppfinnelsen polypeptider som bevarer i det vesentlige samme funksjon, eller biologiske aktivitet som polypeptid av referansenuklenukleinsyren, eller også evnen til å kunne gjenkjennes av antistoffer mot polypeptidene som kodes av den opprinnelige nukleinsyre.

Noen variantnukleinsyrer vil således kode muterte former av polypeptidene, og det systematiske studium av disse vil gjøre det mulig å trekke slutninger hva angår struktur-aktivitetssammenhenger for de angjeldende proteiner.

Uttrykket "variant" av et polypeptid ifølge oppfinnelsen skal hovedsakelig bety et polypeptid hvis aminosyresekvens inneholder en eller flere substitusjoner, addisjoner eller delesjoner av minst en aminosyrerest, sammenlignet med aminosyrsekvensen for referansepolypeptidet, idet det skal være klart at aminosyresubstitusj onene kan være konservative eller ikke-konservative.

Fortrinnsvis bevarerer variantpolypeptidene ifølge oppfinnelsen i det vesentlige den samme funksjon eller biolgiske aktiviteter som referansepolypeptidet, eller også evnen til å kunne gjenkjennes av antistoffer mot initialpolypeptidet.

For oppfinnelsens formål er polypeptid med "en aktivitet lik" eller et tilsvarende uttrykk, et referansepolypeptid, ment å bety et polypeptid med en biologisk aktivitet som er nær, men ikke nødvendigvis identisk med den til referansepolypeptidet, målt i en biologisk analyse som er egnet for å måle den biologiske aktivitet for referansepolypeptidet.

For oppfinnelsens formål er uttrykket "hybridantibiotikum" ment å bety en forbindelse som er generert ved å konstruere en kunstig, biosyntetisk vei ved bruk av rekombinant DNA-teknologi.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Et formål ved oppfinnelsen er mer spesielt nye gener for biosynteseveien for spiramyciner og nye polypeptider som er involvert i denne biosyntese slik det presenteres i den følgende, detaljerte beskrivelse.

Genene i den biosyntetiske vei ble klonet og DNA-sekvensene for disse gener ble bestemt. De oppnådde sekvenser ble analysert ved bruk av FramePlot-programmet (J. Ishikawa & K. Hotta, 1999). Blant de åpne leserammer ble de som viser en kodonanvendelse som er typisk for streptomyces, identifisert. Denne analyse viste at dette området omfatter 44 ORF'er lokalisert på hver side av fem gener som koder enzymet "polyketidsyntase" (PKS), og som viser et kodon hvis bruk er typisk for streptomycic. På hver side av disse fem gener som koder PKS'er ble 10, henholdsvis 34 ORF'er, identifisert nedstrøms og oppstrøms (nedstrøms og oppstrøms er definert ved orienteringen av 5 PKS-genene som alle er orientert i samme retning) (jamfør figur 3 og 37). Således viser de 34 åpne leserammer av denne type, og som opptar et område på ca 41.7 kb (jamfør SEQ IDnr. 1 som viser et første området på 31 kb inneholdende 35 ORF'er og SEQ ID-nr. 140 som viser et område på rundt 12.1 kb, der 1.4 kb overlapper den foregående sekvens (SEQ IDnr. 1) og der rundt 10.7 kb tilsvarer den etterfølgende sekvens idet den sistenevnte del på ca 10.7 kb iinneholder 9 ytterligere ORF'er inkludert en ORF av partialsekvens), jamfør også figurene 3 og 37 nedenfor, ble identifisert oppstrøms de 5-gener som koder PKS'ene og 10 som opptar et område på rundt 11.1 kb (SEQ ID-nr. 2 og figur 3) ble identifisert nedstrøms PKS-genene. De 10 gener som er lokalisert nedstrøms i 5 PKS-gener ble således gitt betegnelsene orfl * c, orf2* c, orf3* c, orf4* c, or/ 5*, or/ 6*, orf?* c, or/ 8* orf9<*>og or/ 10* (SEQ ID-nr. 3, 5, 7, 9, 11,13,15,17, 19 og 21). "c" som er føyet til navnet på genet sier, for en angjeldende ORF, at den kodende sekvens er i reversorientering (den kodende tråd er derfor tråden som er komplementær til sekvensen som er gitt i SEQ ID-nr. 2 i disse gener). Ved bruk av den samme nomenklatur ble de 34 ORF'er oppstrøms PKS-genene gitt betegnelsene orfl, orfl, or/ 3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orf9c, orflO, orfllc, orfl2, orfl3c, orfl4, orfl5c, orfl 6, orfl 7, orfl8, orfl9, or/ 20, orfllc, orf22c, orf23c, or/ 24c, or/ 25c, or/ 26, orf27, orf28c, orf29, orf30c, orf31, orf32c, or/ 33 og or/ 34c (SEQ ID-nr. 23, 25, 28, 30,

34, 36, 40,43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 og 149) (jamfør figurene 3 og 37). Proteinsekvensene som er dedusert fra disse åpne leserammer ble sammenlignet med de som er tilstede i forskjellige databaser ved bruk av forskjellige programmer: BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD-søk, COG'er (Cluster of Orthologous Groups) (disse tre programmer er tilgjengelige særlig fra "the National Center for Biotechnology Information" (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988) og (W.R. Pearson, 1990), BEAUTY (K.C. Worley et al, 1995)), disse to programmer er tilgjengelige særlig fra INFOBIOGEN resource center, Evry, Frankrike). Disse sammenligninger gjør det mulig å formulere hypoteser hva angår funksjonen av produktene av disse gener, og å identifisere de som sansynligvis vil være involvert i spiramycin biosyntese.

Gener som er lokalisert nedstrøms genene som koder PKS' ene

En diagram-presentasjon av organiseringen av området er gitt i figur 3. Slik det skal vises nedenfor synes, av de 10 gener som er identifisert nedstrømsgenet som koder PKS'ene, 9 å være involvert i biosyntesen eller resistensen til spiramyciner. Disse er de følgende 9 gener: orfl* c, orft* c, orf3* c, orf4* c, orf5<*>, orf6<*>, orf7* c, or/ 8* og or/ 9*.

I tabell 1 nedenfor gjengis referansene til DNA-sekvensen og aminosyresekvensen av de 10 gener som er identifisert nedstrøms til 5 PKS-gener.

Med det formål å bestemme funksjonen for de identifiserte polypeptider, ble tre typer forsøk gjennomført: sammenligning av de identifiserte sekvenser med sekvensene med kjente funksjoner, geninaktiveringsforsøk som fører til konstruksjon av mutante stammer, og analyser av produksjonen av spiramyciner og av spiramycinbiosyntese mellomprodukter ved hjelp av disse mutantstammer.

Proteinsekvensene som er dedusert fra disse åpne leserammer ble først sammenlignet med de som er tilstede i forskjellige databaser eller ved bruk av forskjellige programmer: BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD-søk, COG'er (Cluster of Orthologous Groups), FASTA ((W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988) og (W.R. Pearson, 1990), BEAUTY (K.C. Worley et al, 1995)). Disse sammenligninger gjør det mulig å formulere hypoteser hva angår funksjonen av produktene av disse gener, og å identifisere de sm sansynligvis vil være involvert i spyramycin biosyntese. Tabell 2 viser proteinene som viser sterk likhet med produktene av de 10 gener som er lokalisert nedstrøms de 5 PKS gener.

Geninaktiveringsforsøk ble gjennomført for å bekrefte disse resultater. Metodene som ble benyttet består i å gjennomføre generstatning. Målgenet som skal brytes erstattes med en kopi av dette gen som er brutt med en kassett som gir resistens mot et antibiotikum (for eksempel apramycin, geneticin eller hygromycin). Kassetten som her benyttes er avgrenset på hver side av translasjonstermineringskodoner i alle leserammene, og av transkripsjonsterminatorer som er aktive i streptomycic. Innføring av kassetten i målgenet kan eventuelt ledsages av en delesjon av dette målgen. Størrelsen på områdene som flankerer kassetten kan ligge fra noen hundre til flere tusen basepar. En andre type kassett kan benyttes for geninaktivering: kassetter kalt "utkuttbare kassetter". Disse kassetter kan ha fordelen av å være i stand til å kunne kuttes ut i streptomycic ved hjelp av et setespesifikk rekombinasjonshendelse etter å ha vært innført i genomet av S. ambofaciens. Formålet er å inaktivere visse gener i stammer av streptomyce uten å etterlate seleksjonsmarkører eller stor DNA-sekvenser som ikke tilhører stammen, i den endelige stammen. Etter utkutting forblir kun en kort sekvens på rundt 30 basepar (kalt "cicatrisielt" sete) tilbake i genomet av stammen (jamfør figur 10). Bruken av dette systemet består i utgangspunktet i å erstatte villtypekopien av målgenet (ved hjelp av to homologe rekombinasjonshedelser, jamfør figur 9) med et konstrukt i hvilket en utskuttbar kassett er innskutt i dette målgen. Innføringen av denne kassett ledsages av en delesjon i målgenet (jamfør figur 9). For det andre tilveiebringes utkuttingen av den utkuttbare kassett fra genomet av stammen. Den utkuttbare kassetten fungerer ved hjelp av et system av setespesifikk rekombinasjon, og har fordelen av å gjøre det mulig å oppnå streptomyces mutanter som ikke til slutt bærer noe resistensgen. Mulige, polare effekter på ekspresjonen av genene som er lokalisert nedstrøms det eller de inaktiverte gener unngås også (jamfør figur 10). De således konstruerte stammene ble testet med henblikk på spiramycinproduksjonen.

Orfl * c, orf2* c, orf3* c og ør/¥<*>c-genene ble ikke inaktivert fordi sekvenssammenligningsforsøkene gjorde det mulig å bestemme at disse gener hadde en relativt høy likhet med genene som var involvert i biosyntesen av relativt nære antibiotika. Således koder orfl<*>c-genet et protein som viser 66% identitet (bestemt ved bruk av BLAST-programmet) med proteinet som var kodet av ty IMI-genet som koder en N-metyltransferase som er involvert i biosyntesen av tyolosin, og som katalyserer 3-N-metylering under produksjon av mykaminose i streptomyces fradiae (A.R. Gandecha et al., 1997; Genbank aksessnummer: CAA57473; BLAST-bedømmelse: 287). Likheten med et protein involvert i biosynteseveien for et annet relativt nært antibiotikum, og mer spesielt i biosyntesen av mykaminose, antyder at orfl<*>c-gen koder en N-metyltransferase som er ansvarlig for en N-metylering under biosyntesen av forosamin eler av mykaminose (jamfør figurene 5 og 6). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orfl<*>c-genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 3).

Orf2* c- genet koder et protein som viser relativ sterk likhet (35% identitet) med et protein som kodes av tylMTII- genet som koder en NDP-heksose 3,4-isomerase som er involvert i biosyntesen av tyolosin i streptomces fradiae (A.R. Gandecha et al, 1997; Genbank aksessnummer: CAA57471; BLAST-bedømmelse: 130). Denne likhet med et protein som er involvert i den biosyntetiske vei for et annet, nært antibiotikum, og mer spesielt biosyntesen av mykaminose, antyder sterkt at orf* 2c- genet koder en NDP-heksose 3,4-isomerase som er ansvarlig for isomerisering under biosyntesen av et av sukkerene av spiramycin og muligens mykaminose (jamfør figurene 5 og 6).

Or/3<*>c-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet (59% identitet) med et protein kodet av tylMII- genet som koder en glykosyltransferase som er involvert i tylosin biosyntesen i streptomyces fradiae (A.R. Gandecha et ai, 1997; Genbank aksessnummer: CAA57471; BLAST-bedømmelse: 448). Denne likhet med et protein som er involvert i biosynteseveien for et annet, nært antibiotikum, antyder sterkt at orf* 3c-genet koder en glykosyltransferase. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av ør/3<*>c-genet viser sterk likhet med anre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 4).

Orf4* c- genet koder for et protein som viser relativ sterk likhet med flere krotonyl-CoA-reduktaser. Særlig har proteinet som kodes av or/ 4* c betydelig likhet med en krotonyl-CoA-reduktase fra streptomyces coelicolor (M. Redenbach et al., 1996; Genbank aksessnummer: NP 630556; BLAST-bedømmelse: 772). Denne likhet med et protein involvert i biosynteseveien for et annet nært antibiotikum antyder sterkt at or/¥<*>c-genet også koder krotonyl-CoA-reduktase. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av or/¥<*>c-genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 5).

Orf6* c- genet viser en viss likhet med mdmB- genet som er tilstede i streptomyces myacarofaciens (Hara og Hutchinson, 1992; Genbank aksessnummer: A42719; BLAST-bedømmelse: 489), og som produserer makrolidantibiotika. I denne produsenten er genet involvert i acyleiingen av laktonringen. Orf6*- genet er derfor antatt å kode en acyltransferase. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som er kodet av orf6*- genet viser en sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 6).

Inaktiveringen av orf6* c- genet ble tilveiebragt ved en in-phase delesjon/inversjon, og viste at den resulterende stamme ikke lenger produserer spiramycin II og III, men kun spriramycin I (jamfør figur 1). Dette bekrefter at ør/ft*-genet virkelig er involvert i syntesen av spiramycin II og III. Enzymet som kodes av dette gen er ansvarlig for dannelsen av spiramycin II og III ved festing av en acetyl- eller butyrylgruppe til karbonet i 3-posisjon. Stammene som ikke lenger uttrykker proteinet som kodes av orf6*- genet er spesielt fordelaktige fordi de ikke lenger produserer spyramycin II og III, men kun spiramycin I. Som spesifisert ovenfor er den antibiotiske aktivitet for spiramycin I klart større enn den til spiramycinene II og III (Liu et al., 1999).

Ør/5<*->genet koder et protein som viser relativ sterk likhet med flere O-metyltransferaser. Særlig har proteinene som kodes av or/ 5* betydelig likhet med en O-metyltransferase (EC 2.1.1.-) MdmC fra streptomyces myacarofaciens (Hara og Hutchinson, 1992; Genbank aksessnummer: B42719; BLAST-bedømmelse: 355). Denne likhet med et protein som er involvert i den biosyntetiske vei for et annet antibiotikum støtter sterkt at ør/5<*->genet også koder en O-metyltransferase. Or/5<*->genet er antatt å være involvert i dannelsen av forløpere som er innarbeidet i laktonringen. I henhold til sekvenssammenligninger er således produktet av orf5 *- genet også relativt nær FkbG, som er ansvarlig for metyleringen av hydroksymalonyl-ACP i henhold til (Wu et al., 2000); Hoffmeister et al, 2000; Genbank aksessnummer: AAF86386; BLAST-bedømmelse: 247) (jamfør figur 8). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av ør/5<*->genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 7).

På grunn av den polare effekt av innskytingen av en ikke-utkuttet kassett i orf6*- genet, har det vært mulig å bestemme at orp<*->genet er vesentlig for den biosyntetiske vei for spiramyciner. Spesielt fører innføring av den utkuttbare kassett i den kodende del av orf5*- gen til en fullstendig stans av spiramycinproduksjonen. Når imidlertid først den innførte kassett er kuttet ut (og når derfor kun orf6*- genet er inaktivert, jamfør eksemplene 14 og 15), observeres produksjonene av spiramycin I igjen. Dette viser at orf5<*->genet er vesentlig for den biosyntetiske vei for spiramyciner fordi dets inaktivering fører til en fullstendig stans av spiramycinproduksjon.

Or/3<*->genet koder et protein som viser relativ sterk likhet med flere O-metyltransferaser. 0//5<*->genet er antatt å være en O-metyltransferase som er involvert enten direkte i syntesen av platenolidet, eller i syntesen av en metylert forløper (metoksymalonyl, se figur 8) som er innarbeidet i platenolidet av PKS. For å verifisere denne hypotese ble analytiske LC/SM- og NMR-forsøk gjennomført på en stamme av S. ambofaciens av genotype: orf5* ::attlQhyg+. I denne stamme er ør/5<*->genet ikke uttrykt, på grunn av den polare effekt av innskuddet, i ør/#<*->genet, av kassetten som inneholder transkripsjonsterminatorer (jamfør eksempel 27). Det er vist at denne stamme produserer et molekyl for hvilket UV-spektere har et utseende tilsvarende det til spiramycin I, men massespekteret viser et molekylært ion ved 829. Klasseforskjellen på 14 sammenlignet med massen til spiramycin, kan forklares ved fraværet av metyl på oksygenet som bæres av karbon nr. 4 i laktonringen (strukturen for denne forbindelse er gitt i figur 39). Resultatene som oppnås ved NMR er kompatible med denne hypotesen. Nærværet av en forbindelse ved 829 gjør det mulig å validere hypotesen om rollen til orf5<*>i spiramycinbiosyntesen. I tillegg viser produktet et tilsvarende spiramycin uten metylgruppe meget svak, mikrobiologisk aktivitet (10 ganger svakere) sammenlignet med det ikke-modifiserte spiramycin, når det testes på mikroorganismen Micrococcus luteus.

Orf7*- genet koder et protein som viser relativ sterk likhet med protein som kodes av mdmA av Streptomyces mycarofaciens, det sistnevnte gen koder et protein som er involvert i midekamycinresistensen i produsererenzymet (Hara et al, 1990; Genbank aksessnummer: A60725; BLAST-bedømmelse: 380). Denne likheten med proteinet som er involvert i den biosyntetiske vei for et annet antibiotikum antyder sterkt at orf7* c-genet også koder et protein som er involvert i spiramycinresistensen. Mer spesielt har enzymer som kodes av ør/7<*>c-genet en metyltransferaseaktivitet og er involvert i spiramycinresistens i Streptomyces ambofaciens. Det er vist at dette gen gir resistens av MLS I-typen, en motstand som er kjent og skyldes monometylering ved posisjon A2058 av 23S ribosomal RNA (Pernodet et al, 1996). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av ør/7<*->genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 8).

Or/S<*->genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med et protein av ABC-transportørtypen i Streptomyces griseusk (Campelo, 2002, Genbank aksessnummer: CAC22119; BLAST-bedømmelse: 191). Denne likhet med et protein av ABC-transportørtypen antyder sterkt at or/ 8*-genet også koder et protein av ABC-transportørtypen som kan være involvert i spiramycinresistens. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av or/#<*->genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 9). Ør/9<*->genet koder et protein som viser relativ sterk likhet med et protein av ABC-transportørtypen i Streptomyces griseus (Campelo, 2002, aksessnummer: CAC22118; BLAST-bedømmelse: 269). Denne likhet med et protein av ABC-transportørtypen antyder sterkt at ør/9<*->genet også koder et protein av ABC-transportørtypen som kan være involvert i spiramycinresistens. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av or/ 9 *-genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 10). OrflO*- genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med et protein av ukjent funksjon. Imidlertid er gener like orfl0<*>funnet i midten av flere grupper av gener involvert i biosyntesen av antibiotika. Således er et gen nær orf 10* funnet i S. coelicolor (Redenbach et al, 1996, Genbank aksessnummer: NP 627432, BLAST-bedømmelse: 109). Et nært gen ( CoY) er også funnet i S. rishiriensis (Wang et al., 2000, Genbank aksessnummer: AAG29779, BLAST-bedømmelse 97).

Gener lokalisert oppstrøms for genene som koder for PKS' er

I DNA-sekvensen som er lokalisert oppstrøms for genene som koder PKS'er (nedstrøms og oppstrøms er definert ved orienteringen av de 5 PKS-gener som alle er orientert i samme retning) (jamfør figur 3), 34 ORF'er er identifisert (jamfør ovenfor). Således opptar de 34 åpne leserammer av denne typen et område på ca 41.7 kb (jamfør SEQ ID-nr. 1 som viser et første område på 31 kb inneholdende 25 ORF'er og SEQ ID-nr. 140 som oppviser et område på ca 12.1 kb, hvorav 1.4 kb overlapper den forutgående sekvens (SEQ ID-nr. 1) og hvorav rundt 10.7 kb tilsvarer den etterfølgende sekvens), den sistnevnte del på rundt 10.7 kb inneholdende 9 ytterligere ORF'er (inkludert en ORF-partialsekvens), jamfør også figurene 3 og 37 nedenfor).

En diagramatisk representasjon av organiseringen av områdene er gitt i figur 5 og 37. De 34 gener ble gitt navnene: orfl, orfl, orf3, orff, orf5, orf6, orfl, orfS, orf9c, orflO, orfllc, orfl2, orflSc, orfl4, orfl5c, or/ 16, orf! 7, orf! 8, or/ 19, or/ 20, or/ 21c, or/ 22c, orf23c, orf24c, orf25c, orf26, orf27, orf28c, orf29, orf30c, or/ 31, or/ 32c, or/ 33 og orf34c.

Gitt i tabell 11 nedenfor er referanser til DNA- og aminosyresekvensen av de 34 gener identifisert oppstrøms av 5 PKS-gener.

2 Når flere proteinsekvenser er antydet for en enkelt orf, er de tilsvarene proteiner avledet fra flere mulige translasjonsinitieringsseter.

Tre typer forsøk ble gjennomført med det formål å bestemme funksjonen av polypeptidene identifisert i tabellen 11 ovenfor: sammenligning av identiteten av de identifiserte sekvenser med sekvenser av kjent funksjon, geninaktiveringsforsøk, og analyser av spiramycinproduksjon av disse mutante stammer.

Proteinsekvensene som var redusert fra disse åpne leserammer ble aller først sammenlignet med de som er tilstede i forskjellige databaser ved bruk av forskjellige programmer: BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD-søk, COG'er (Cluster of Orthologous Groups), FASTA ((W.R. Pearson & DJ. Lipman, 1988) og (W.R. Pearson, 1990), BEAUTY (K.C. Worley et al, 1995)), (jamfør ovenfor). Disse sammenligninger gjør det mulig å formulere hypoteser hva angår funksjonen av produktene av disse genene, og å identifisere de som sansynligvis kan være involvert i spiramycinbiosyntese. Tabell 12 viser proteinene som viser sterk likhet med de 34 gener lokalisert oppstrøms til 5 PKF-gener. Geninaktiveringsforsøk ble gjennomført for å bekrefte disse resultater. De benyttede metoder består i å gjennomføre en generstatning. Målgenet som skal avbrytes erstattes med en kopi av dette gen avbrutt med en kassett som gir resistens mot et antibiotikum (for eksempel apramycin eller hygromycin). De benyttede kassetter avgrenses på begge sider av translasjonsterminasjonskodoner i alle leserammer, og av transkripsjonsterminatorer som er aktive i streptomyces. Ved innføring av kassetten i målgenet kan eventuelt ledsages av delesjon av dette målgen. Størrelsen av områdene som flankerer kassetten kan ligge fra noen hundre til flere tusen basepar. En andre type kassett kan benyttes for geninaktivering: kassetter kalt "kuttbare kassetter" (jamfør ovenfor). De således konstruerte stammer ble testet med henblikk på spiramycinproduksjonen.

Orfl-genet koder et protein som viser sterk likhet med flere cytokrom P450'er. Særlig hra proteinet som kodes av orfl betydelig likhet med proteinet som kodes av tyll- genet som er involvert i biosyntesen av tylosin i streptomyces fradiae (L.A. Merson-Davies et ai, 1994; Genbank aksessnummer: S49051; BLAST-bedømmelse: 530). Denne likhet med et protein involvert i den biosyntetiske vei for et annet nært antibiotikum antyder sterkt at orfl-genet også koder et cytokrom P450. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orfl-genet viser sterk likhet med de andre proteiner av tilsvarene funksjon i andre organismer (jamfør tabell 13).

Or/2-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med en dTDP-6-deoksy-3,4-ketoheksulose isomerase fra Aneurinibacillus thermoaerophilus (Pfoestl, A. et al., 2003, Genbank aksessnummer: AAO06351; BLAST-bedømmelse: 118). Denne likhet antyder sterkt at ør/2-genet koder en isomerase som er ansvarlig for den isomeriseringsreaksjon som er nødvendig for biosyntesen av et av sukkerene som er tilstede i spiramycinmolekyl, idet dette sukker muligens er mykarose (jamfør figur 5). Inaktivering av or/2-genet ble gjennomført. Det kunne vises at den resulterende stamme ikke lenger produserte spiramyciner. Dette bekrefter at or/ 2- genet virkelig er involvert i spiramycin biosyntesen.

Ør/3-genet koder et protein som viser relativ sterk likhet med flere aminotransferaser. Særlig har proteinet som kodes av or/ 3 betydelig likhet med en aminotransferase av streptomyces antibioticus som er involvert i oleandomycin biosyntese (G. Draeger et al.,1999; Genbank aksessnummer: AAF59939; BLAST-bedømmelse: 431). Denne likhet med et protein som er involvert i den biosyntetiske vei for et annet nært antibiotikum, antyder sterkt at or/ 3'-genet koder en 3-aminotransferase som er ansvarlig for den transamineringsreaksjon som er nødvendig for biosyntesen av et av aminosukkerene i spiromyciner (jamfør figur 5). Denne hypotese støttes av det faktum at proteinet som kodes av ør/3-genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 15).

Or/3-genet ble inaktivert. Det var således mulig å vise at den resulterende stamme ikke lenger produserte spiramyciner. Dette bekrefter at or/3-genet virkelig er involvert i spiramycin biosyntese. Enzymet som kodes av dette gen er derfor klart ansvarlig for et biokonverteringstrinn som er vesentlig for spiramycin biosyntesen. Spiramycinproduksjonen kan komplementeres ved ekspresjon av TylB-proteinet fra S. fradiae (jamfør eksempel 23). Dette viser at or/3-genet koder en 3-aminotransferase som er ansvarlig for transamineringsreaksjonen som er nødvendig for mykaminose biosyntese (jamfør figur 5). Fordi mykaminose er det første sukker som festelse til platenolid, er stammen med ør/3-knockouten (OS49.67) ventet å akkumulere platenolid. Biosyntesemellomproduktene av stammer med or/3-genet knockout ble studert (jamfør eksempel 20). Disse forsøk gjorde det mulig å påvise at denne stamme produserer to formler av plateinolid: platenolid A og platenolid B, der den reduserte struktur av disse to molekyler er gitt i figur 36. Denne stamme produserer også platenolid A + mykarose og platenolid B + mykarose (jamfør eksempel 20 og figur 40). Disse forbindelser omfatter et sukker, men omfatter ikke noen mykaminose. I tillegg, og hvis de sammenlignes med spiramycin (jamfør figur 1), omfatter disse forbindelser mykarose i stedet for mykaminose. Disse resultater er i overensstemmelse med produktet av or/ 3-gen som er involvert i mykaminosebiosyntesen og har en rolle som en 3-aminotransferase som er ansvarlig for transamineringsreaksjonen som krevet for mykaminose biosyntesen (jamfør figur 5). Det kan påpekes at spesifisiteten for glykosyleringen ikke synes å være absolutt fordi det finnes molekyler med tilfestet mykarose på den posisjon som vanligvis opptas av mykaminose (jamfør figur 40).

Ør/¥-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med flere NDP-gluklosesyntetaser. Særlig har proteinet som kodes av or/ 4 betydelig likhet med en a-D-glykose-1-fosfat tymidylyltransferase av streptomyces venezuelae (Y. Xue et al. 1998; Genbank-aksessnummer: AAC68682; BLAST-bedømmelse: 404). Denne likhet med et protein som er involvert i biosynteseveien for et annet nært antibiotikum antyder sterkt at or/¥-genet koder en NDP-glukosesyntetase som er ansvarlig for syntese av den NDP-glykose som er nødvendig for biosyntesen av tre atypiske sukkere som er inkorporert i spiramycinmolekylet (jamfør figurene 4, 5 og 6). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av or/¥-genet viser sterk likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 16).

<*>en større sekvenslikhet er assosiert med en høyere BLAST-bedømmelse (Altschul et al, 1990).

Ør/5-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet mellom flere glykosedehydrataser. Særlig har proteinet som kodes av orf5 betydelig likhet med en dTDP-glykose 4,6-dehydratase av streptomyces tenebrarius (T.B. Li et al, 2001;

Genbank aksessnummer: AAG18457, BLAST-bedømmelse: 476). Denne likhet med et protein involvert i den biosyntetiske vei for et annet nært antibiotikum antyder sterkt at or/5-genet koder en NDP-glukose dehydratase som er nødvendig for biosyntesen av de tre atypiske sukkere som er inkorporert i spiramycinmolekylet (jamfør figurene 4, 5 og 6). Denne hypotese er understøttet av det faktum at proteinet som kodes av or/5-genet viser sterk likhet med andre proteiner av lignende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 17).

Ør/ft-genet koder et protein som viser relativ sterk likhet med flere tioesteraser. Særlig har proteinet som kodes av orf6 en betydelig likhet med en tioesterase av streptomyces avermitilis (S. Omura et al, 2001; Genbank-aksessnummer: BAB69315; BLAST-

bedømming: 234). Denne likhet med et protein som er involvert i biosynteseveien for et annet, nært antibiotikum antyder sterkt at orf6- genet koder en tioesterase. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av or/ft-genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 18).

Tabell 18

Or/7-genet koder et protein som viser relativt sterkt likhet med flere heksose dehydrataser. Særlig har proteinet som kodes av orf7 en betydelig likhet med en dNTRP-heksose 2,3-dehydratase (kodet av TylCVi-genet) av streptomycis fradiae involvert i tylosin biosyntesen (L.A. Merseon-Davies et al, 1994; Genbank aksessnummer; AAF29379; BLAST-bedømming: 461). Denne likhet med et protein som er involvert i biosynteseveien for et annet nært antibiotikum antyder sterkt at orf7-genet også koder en heksose 2-3-dehydratase som er nødvendig for biosyntesen av to atypiske sukkere som er inkorporert i spiramycinmolekylet (jamfør figurene 4 og 6). Denne hypotese støttes av det faktum at proteinet som kodes av or/7-genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør 19). Ør/S-genet koder et protein som viser relativ sterk likhet med flere aminotransferaser. Særlig har proteinet som kodes av or/ 8 betydelig likhet med en aminotransferase som sansynligvis er involvert i forosamin biosyntesen i saccharopolyspora spinosa (C. Waldron et al, 2001; Genbank aksessnummer: AAG232379; BLAST bedømming: 465). Denne likhet med et protein som er involvert i biosynteseveien for et annet nært antibiotikum antyder sterkt at ør/S-genet koder en 4-aminotransferase som er ansvarlig for transamineringsreaksjonen som er nødvendig for forosamin biosyntesen (jamfør figur 6). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orfB-genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 20). Or/S-genet ble inaktivert. Det var således mulig å vise at den resulterende stamme ikke lenger produserte spiramycinet. Dette bekrefter at ør/5-genet virkelig er involvert i spiramycin biosyntesen. Enzymet som kodes av dette gen er derfor klart ansvarlig for et biokonverteringstrinn som er vesentlig for spiramycin biosyntese. Validering av hypotesen når det gjelder den rolle som produktet av or/S-genet spiller i forosaminsyntesen, tilveiebringes ved det faktum at en inaktivert mutant for ør/5-genet produserer forocidin idet denne mutant derfor blokkeres på forocidintrinnet og ikke produserer noe neo-spiramycin (jamfør figur 8 og eksempel 25). Dette resultat er i overensstemmelse med produktet av ør/8-genet som er involvert i forosamin biosyntesen (jamfør figur 6).

Or/9c-genet er allerede identifisert i streptomyces ambofaciens og er gitt betegnelsen srmX av Geistlich et al. (M. Geistlich et al, 1992). Likheten mellom proteinet som kodes av dette gen og flere metyltransferaser som er involvert i biosynteseveien hvor andre nære antibiotika antyder sterkt at ør/9c-genet koder en metyltransferase som er ansvarlig for metyleringsreaksj onene som er nødvendig for mykaminose- eller forosaminbiosyntese (jamfør figurene 5 og 6). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av ør/9c-genet viser sterk likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 21).

OrflØ-genet er allerede identifisert i streptomyces ambofaciens og er gitt navnet srmR av Geistlich et al. (M. Geistlich et al, 1992). Proteinet som kodes av dette gen er involvert i regulering av biosynteseveien for spiramyciner i streptomyces ambofaciens. Orfl Ø-genet var inaktivert. Det var således mulig å vise at den resulterende stamme ikke lenger produserer spiramyciner. Dette bekrefter at orflO- gemt virkelig er involvert i spiramycin bisyntese. Proteinet som kodes av dette gen er derfor klart vesentlig for spiramycin biosyntese.

I tillegg ble translasjonen av initieringspunktet av orf 10 bestemt, og det var mulig å vise at en overekspresjon av dette genet førte til en forbedring i produksjonen av spiramyciner. Translasjonsinitieringssetet tilsvarer en ATG-lokalisert oppstrøms den ATG som er foreslått av Geistlich et al. (M. Geistrlich et al., 1992). Det er også vist at denne 5'-ende er essensiell for funksjonen av orflO fordi en 5'-trunkert messenger er inaktiv (jamfør eksempel 17). For å oppnå den ønskede effekt på produksjonen av spiramyciner, er det derfor essensielt at overekspresjonen av orf 10 gjennomføres mens man passer på ikke å uttrykke en 5'-trunkert messenger av orfl 0.

Orflc- genet er allerede identifisert i streptomyces ambofaciens og er gitt navnet srmB av Geistlich et al. (M. Geistlich et al., 1992) og Schoner et a/.,(B. Schoner et al., 1992). Proteinet som kodes av dette genet er involvert i spiramycinresistens i streptomyces ambofaciens og er en ABC-typetransportør.

Orfl2- genet tyder et protein som viser relativ sterk likhet med flere heksose dehydrataser. Særlig har proteinet som kodes av orfl 2 en betydelig likhet med en NDP-heksose, 3,4-dehydratase som kodes av UrdQ- genet av streptomyces fradiea og er involvert i urdamycin biosyntesen (D. Hoffmeister et al., 2000; Genbank aksessnummer: AAF72550; BLAST bedømmelse: 634). Denne likhet med et protein som er involvert i biosynteseveien for et annet nært antibiotikum antyder sterkt at orfl2-genet koder en 3,4-dehydratase som er ansvarlig for dehydratiseringsreaksjonen som er nødvendig for forosasmin biosyntesen (jamfør figur 6). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orf! 2- genet viser sterk likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 22).

Orfl2- genet ble inaktivert. Det var mulig å vise at den resulterende stamme ikke lenger fremstilte spiramyciner. Dette bekrefter at ør/72-genet virkelig er involvert i spiramycin biosyntese. Enzymet som kodes av dette gen er derfor klart ansvarlig for et biokonverteringstrinn som er vesentlig for spiramycin biosyntese. Validering av hypotesen og den rolle som spilles av orfl2 i forosaminbiosyntese tilveiebringes av det faktum at en inaktivert mutant for ør/72-genet ikke lenger produserer forosamin. Imidlertid produserer den en liten mengde forocidin. Denne mutant er derfor blokkert på forocidintrinnet og produserer ikke noen neo-spiramycin (jamfør figur 7 og eksempel 26). Denne mutant produserer også en forbindelse som har den struktur som er vist i figur 38. Den sistnevnte forbindelse inneholder to sukkere, mykaminose og mykarose, men inneholder ikke noe forhåndsamin. I tillegg, og hvis den sammenlignes med strukturen til spiramycin (jamfør figur 1), inneholder denne forbindelse sukkeret mykarose og det forventede sted for forosamin. Disse resultater er i overensstemmelse med at produktet av orfl2'-genet er involvert i forosamin biosyntesen (jamfør figur 16). Det kan påpekes at spesifisiteten for glykosylering ikke er absolutt fordi det observeres molekyler hvori mykarose er festet i den posisjon som vanligvis opptas av forosamin (se figur 38).

Orfl 3 c-$ enet koder et protein som viser en relativt sterk likhet med et protein av ukjent funksjon i streptomyces coelicolor. Dette protein ble kalt SC4H2.17 (Genbank aksessnummer: T35116; BLAST-bedømmelse- 619). Proteinet som kodes av orfl3c-genet viser også sterk likhet med andre proteiner av andre organismer (jamfør tabell 23). Ingen spesiell funksjon er tilskrevet proteinene nær de som kodes av orfl3c. Orf 13c-genet ble inaktivert for å studere funksjonen av dette gen i biosynteseveien for spiramyciner i streptomyces ambofaciens. Det var mulig å vise at den resulterende stamme fremstiller spiramyciner. Dette antyder at orfl3c- genet ikke er vesentlig for spiramycin biosyntese, og at det ikke er vesentlig for overlevelse av bakterien. Enzymer som kodes av dette genet er derfor ikke ansvarlig for noe biokonverteringstrinn som er vesentlig for spiramycin biosyntese.

Orfl '/-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med en putativ reduktase (M. Redenbach et al., 1996; Bentley et al, 2002; Genbank aksessnummer: CAB90862, BLAST-bedømmelse: 147).

Orfl '/-genet ble inaktivert. Det var således mulig å vise at den resulterende stamme ikke lenger produserer spiramyciner. Dette bekrefter at orfl4k-<g>emt virkelig er involvert i spiramycin biosyntese. Enzymet som kodes av dette gen er derfor klart ansvarlig for et biokonverteringstrinn som er vesentlig for spiramycin biosyntese. Biosyntese mellomproduktene av stammen med orf! 4k- gen knockout ble studert (jamfør eksempel 20). Disse forsøk gjorde det mulig å vise at denne stamme produserer platinolid A, men produserer ikke platenolid B (jamfør figur 36).

Orfl 5c-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med flere ketoreduktaser. Særlig har proteinet som kodes av orf 15c betydelig likhet med en 3-ketoreduktase i streptomyces antibioticus (Genbank aksessnummer: T51102, BLAST-bedømmelse: 285). Denne likhet antyder sterkt at orf! 5c- genet koder en 3-ketoreduktase som er ansvarlig for den reduksjonsreaksjon som er nødvendig for forosamin biosyntese (jamfør figur 16). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orfl5c- genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 24).

Orfl 7-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med flere isomeraser. Særlig har proteinet som kodes av orfl6 betydelig likhet med en NDP-heksose 3,4-isomerase av streptomyces fradiae (Gandecha et al., 1997; Genbank aksessnummer: CAA57471, BLAST-bedømmelse: 209). Denne likhet antyder sterkt at ør/75-genet koder et protein som er involvert i biosyntesen av et av sukkerene av spiramycin (jamfør figurene 5 og 6). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orfl 6- geriet viser sterk likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 25).

Orfl 7-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med flere glykosyltransferaser. Særlig har proteinet som kodes av orfl 7 betydelig likhet med en glykosyltransferase av streptomyces venezuelae (Y. Xue et al, 1998; Genbank aksessnummer: AAC68677; BLAST-bedømmelse: 400). Likheten mellom proteinet som kodes av orfl 7-genet og flere glykosyltransferaser som er involvert i biosynteseveien for andre nære antibiotika, antyder sterkt at dette gen også koder en glykocyltransferase. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orfl 7-genet viser en viss likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 26).

Orfl 5-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med flere glykosyltransferaser. Særlig har proteinet som kodes av orfl 8 betydelig likhet med en glykosyltransferase av streptomyces rishiriensis (Wang et al, 2000; Genbank aksessnummer; AAG29785; BLAST-bedømmelse: 185). Likheten mellom proteinet som kodes av orf! 8- genet, og flere glykosyltransferaser som er involvert i biosynteseveien for andre nære antibiotika, antyder sterkt at dette gen også koder en glykosyltransferase. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orf! 8- genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 27).

Orfl P-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med flere ketoseduktaser. Særlig har proteinet som kodes av orfl9 betydelig likhet med en NDP-heksose 4-ketoreduktase (TylCIV) Streptomyces fradiae (Bate et al, 2000; Genbank aksessnummer: AAD41822; BLAST-bedømmelse: 266). Likheten mellom proteinet som kodes av orfl P-genet og denne ketoreduktase som er involvert i den biosyntetiske vei for nære antibiotika antyder sterkt at dette genet også koder en 4-ketoreduktase som er ansvarlig for den reduksjonsreaksjon som er nødvendig for mykarosebiosyntesen (jamfør figur 4). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orfl P-genet viser sterk likhet med andre proteiner som tilsvarer funksjon i andre organismer (jamfør tabell 28).

Ør/20-genet koder et protein som viser relativ sterk likhet med flere heksose reduktaser. Spesielt har proteinet som kodes av orflO betydelig likhet med EryBII av saccharopolyspora erythraea som koder en dTDP-4-keto-L-6-deoksyheksose 2,3-reduktase (R.G. Summers et al, 1997), Genbank aksessnummer: AAB84068; BLAST-bedømmelse: 491). Likheten mellom proteinet som kode av orf20c- genet med flere heksose reduktaser som er involvert i den biosyntetiske vei for andre nære antibiotika antyder sterkt at dette genet koder en 2,3-reduktase som er ansvarlig for den reaksjon som er nødvendig for mykarose biosyntese (jamfør figur 4). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orf20c- genet viser sterk likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 29). Ør/2/c-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med flere heksose metyltransferaser. Særlig har proteinet som kodes av orfllc betydelig likhet med TylCIII- genet av streptomyces fradiae som koder en NDP-heksose 3-C-metyltransferase (N. Bate et al., 2000; Genbank aksessnummer:AAD41823; BLAST-bedømmelse: 669). Likheten mellom proteinet som kodes av ør/2ic-genet og flere heksose metyltransferaser som er involvert i den biosyntetiske vei for andre nære antibiotika, antyder sterkt at dette gen koder en heksose metyltransferase som er ansvarlig for metyleringsreaksjonen som er nødvendig for mykarose biosyntese (jamfør figur 4). Denne hypotese understøttes ved det faktum at proteinet som kodes av orf21c-$ emt viser sterk likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 30).

Ør/22c-genet koder et protein som viser relativt sterkt likhet med proteinet som kodes av fkbH- genet av streptomyces hydroscopicus var. ascomyceticus som koder et enzym som er involvert i metoksymalonyl biosyntesen (K. Wu et al, 2000; Genbank aksessnummer:AAF486387; BLAST-bedømmelse: 463). Likheten mellom proteinet som kodes av ør/22c-genet og proteinet som er involvert i den biosyntetiske vei for et annet nært makrolid, antydes sterkt at dette gen også koder et enzym som er involvert i metoksymalonylbiosyntesen i streptomyces ambofaciens (jamfør figur 8).

Orf23c- gemt koder et protein som viser relativt sterk likhet med proteinet som koder fkbl- genet av Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus som koder en acyl-CoA dehydrogenase som er involvert i metoksymalonyl (K. Wu, et al, 2000; Genbank aksessnummer:AAF86388; BLAST-bedømmelse: 387). Likheten mellom proteinet som kodes av orf23c- genet og flere acyl-CoA dehydrogenaser som er involvert i den biosyntetiske vei for andre nære antibiotika antyder sterkt at dette gen koder en acyl-CoA dehydrogenase som er involvert i metoksymalonyl biosyntese (jamfør figur 8). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av or/23c-genet viser sterk likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 31).

Orffc- genet koder et protein som viser relativ sterk likhet med proteinet som kodes av fkbJ-<g>emt av streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus som antas å kode arylbærerproteinet (ACP) som er involvert i metoksymalonyl biosyntesen (K. Wu et al, 2000; Genbank aksessnummer: AAF86389, BLAST-bedømmelse: 87). Likheten mellom proteinet som kodes av orf24c- genet og dette protein som er involvert i den biosyntetiske vei for et annet, nært makrolid, antyder sterkt at dette gen koder et protein som er involvert i metoksymalonylbiosyntesen i streptomyces ambofaciens (jamfør figur 8).

Ør/25c-genet koder et protein som viser en relativ sterk likhet med proteinet som kodes av fkbK- genet av streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus som koder en acyl-CoA dehydrogenase som er involvert i metoksymalonyl biosyntesen (K. Wu et al., 2000 ; Genbank aksessnummer : AAF86390 ; BLAST-bedømmelse : 268). Likheten mellom proteinet som kodes av ør/25c-genet og flere acyl-CoA-dehydrogenaser som er involvert i den biosyntetiske vei for andre nære antibiotika, antyder sterkt at dette gen koder en acyl-CoA dehydrogenase som er involvert i metoksymalonyl biosyntesen (jamfør figur 8). Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orf2 5c- genet viser sterk likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 32).

Ør/26-genet koder et protein som viser 65% identitet (bestemt ved bruk av BLAST-programmet) med proteinet som kodes av tylCV- genet som koder en mykarosyltransferase som er involvert i tylosin biosyntesen i streptomyces fradiae (N.

Bate, et al, 2000, Genbank aksessnummer: AAD41824, BLAST-bedømmelse: 471). Mer spesielt er TylCV en glykosyltransferase som binder mykarosemolekylet under tylosinsyntese. Denne likhet med et protein som er involvert i den biosyntetiske vei for et annet, relativt nært antibiotikum, og mer spesielt mykaroseoverføring, antyder at or/26-genet er en glykosyltransferase. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av or/25-genet viser sterk likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 33).

Orfl 7-genet koder et protein som viser en 70% identitet (bestemt ved bruk av BLAST-programmet) med proteinet som er kodet av tylCVII- genet som koder en NDP-heksose 3.5- (eller 5-) epimerase involvert i tylosin biosyntesen i streptomyces fradia (N. Bate et al, 2000; Genbank aksessnummer: AAD41825, BLAST-bedømmelse: 243). Mer spesielt er TylCVII en heksose 3,5- (eller 5-) epimerase som er involvert i mykarose biosyntese. Denne likhet med et protein som er involvert i den biosyntetiske vei for et annet, relativt nært antibiotikum, og mer spesielt i mykarosebiosyntese, antyder at ori 7-genet koder en epimerase. Denne hypotese er understøttet av det faktum at proteinet som kodes av orfl 7-genet viser sterkere likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer (jamfør tabell 34). Analyse av de nære sekvenser som oppnås ved bruk av BLAST-programmet antyder sterkt at orfl7-genet koder en 5-epimerase som er ansvarlig for epimeriseringsreaksjonen som er nødvendig for mykarose biosyntese (jamfør figur 4).

Sekvensen til orf28c ble i utgangspunktet bestemt partielt, fordi sekvensen av et område på rundt 450 basepar kun ble bestemt etter resekvensering (dette området er symbolisert ved "N" i den ufullstendige sekvens SEQ ID-nr. 106). Den partielle sekvens for denne ORF (SEQ ID-nr. 111) ble ikke desto mindre benyttet for analyse med forskjellige datamaskinprogrammer som forklart ovenfor. Det var således mulig å bestemme at orf28c- genet koder et protein som viser 65% identitet, og hvor den fastlagte sekvens (SEQ ID-nr. 112 som er partialsekvensen av or/25c-proteinet) (bestemt ved bruk av BLAST-programmet), med proteiner som kodes av acy£2-genet som kodes etter regulatorisk protein som er involvert i karbomycin biosyntesen i streptomyces termotolerartse (A. Arisawa et al, 1993); Genbank aksessnummer: JC2032, BLAST-bedømmelse: 329). Denne likhet med et protein som er involvert i biosynteseveien for et relativt nært antibiotikum antyder at ør/25c-genet koder et regulatorisk protein som er involvert i spyramycin biosyntesen. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orf28c- genet også viser sterk likhet med TylR-proteinet, som er et regulatorisk protein som er involvert i biosyntesen i streptomyces fradiae (N. Bate et al, 1999; Genbank aksessnummer: AAF29380, BLAST-bedømmelse: 167).

Det var mulig å amplifisere orf28c- genet ved bruk av oligonukleotider som var lokalisert på hver side av den ikke-bestemte sekvens, og å subklone det inn i en ekspresjonsvektor. Det var således mulig å vise at overekspresjonen av orf28c- genet signifikant øker spiramycinproduksjonen i OSC2-stammen (jamfør eksempel 24). Dette viser at overekspresjon av orf28c fører til en økning i spiramycinproduksjonen og bekrefter dets rolle som en regulator for den biosyntetiske vei for spiramyciner.

Partialsekvensen av orf28c ble deretter fullført og det manglende område på rundt 450 basepar ble bestemt (jamfør SEQ ID-nr. 140 og SEQ ID-nr. 141). Den fullstendige sekvens for denne ORF (SEQ ID-nr. 141) ble benyttet for analysen med de forskjellige datamaskinprogrammer som forklart ovenfor. Det var således mulig å bestemme at orf28c- genet koder et protein som viser 69% identitet over den bestemte sekvens (SEQ ID-nr. 142, som er den fullstendige sekvens av Orf28c-proteinet) (bestemt ved bruk av BLAST-programmet), med proteinet som kodes av acyB2- genet som koder et regulatorisk protein som er involvert i karbomycin biosyntesen i streptomyces thermotolerans (Arisawa, A, et al, 1993 ; Genbank aksessnummer : JC2032, BLAST-bedømmelse : 451). Denne likhet med et protein som er innvolvert i regulering av biosyntesen av et relativt nært antibiotikum, antyder at orf28c- genet koder et regulatorisk protein som er innvolvert i spiramycin biosyntese. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av orf28c- genet også viser sterk likhet med TylR-proteinet som er et regulatorisk protein som er involvert i regulering av tylosin biosyntese i streptomycec fradiae (Bate, N. et al, 1999 ; Genbank aksessnummer : AAF29380, BLAST-bedømmelse : 224). Resultatene av overekspresjon av dette gen (jamfør eksempel 24) bekrefter dets rolle som en regulator av spiramycin biosynteseveien.

Orf28c- genet ble inaktivert. Det var således mulig å vise at den resulterende stamme ikke lenger produserte spiramyciner. Dette bekrefter at orf28c- genet klart er involvert i spiramycin biosyntese og er vesentlig for spiramycin biosyntese. Disse resultater, kombinert med resultatene av overekspresjon av dette gen (jamfør eksempel 24), stemmer overens med at Orf28c har en rolle som en aktivator som er vesentlig for spiramycin biosyntese.

Ør/29-genet koder et protein som viser 31% identitet (bestemt ved bruk av BLAST-programmet) med en sansynlig glykosylhydrolase som er lokalisert i gengruppen involvert i biosyntesen av sorafen A (et antifugalt middel av polyketidklassen) i sorangium cellulosum (J. Ligon et al, 2002 ; Genbank aksessnummer : AAK19890, BLAST-bedømmelse : 139). Denne likhet med et protein som er involvert i den biosyntetiske vei for et relativt nært molekyl antyder at ør/29-genet koder et protein med glykosyl hydrolaseaktivitet. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av or/29-genet viser sterk likhet med andre proteiner av tilsvarende funksjon

i andre organismer (jamfør tabell 35). Analyser av sekvensen av protein som kodes av or/ 29 ved bruk av CD-søksprogrammet (jamfør ovenfor) antyder også at ør/29-genet koder en glykosylhydrolase.

Analyse av proteinsekvensen som er redusert fra or/ 29 ved bruk at signalP-programmet ( http:// www. cbs. dtu. dk/ services/ SignalP/) (Nielsen, H., et al., 1997), viser at dette protein har en C-terminal signalsekvens med et prediktert spaltingssete mellom posisjon 30 og 31 (QSA/QA). Det kan forutsis at dette protein er ekstra cellulært. Det kan, som en glykosylhydrolase, ha en rolle i reaktiveringen av spiramycin som er inaktivert ved glykosilering med glykosyltransferase GimA og/eller GimB (Gourmelen et al, 1998). OrflOc- genet koder et protein som viser 31% identitet (bestemt ved bruk av BLAST-programmet) med en nukleosid-difosfatsukkerepimerase i Corynebacterium glutanmicum (Genbank aksessnummer: NP 600590, BLAST-bedømmelse: 89). Denne likhet antyder at ør/30c-genet koder en epimerase. Denne hypotese understøttes av det faktum at analysen av sekvensen ved bruk av CD-søksprogrammet (jamfør ovenfor) også antyder at ør/30c-genet koder en epimerase.

Or/ 30c- genet viser to mulige initieringskodoner (jamfør SEQ ID-nr. 115) som gir to mulige proteiner på 345 og 282 aminosyrer (SEQ ID-nr. 116 og 117). Imidlertid er kodonbruken typisk for streptomyces kun fra den andre ATG; i tillegg er den reduserte proteinsekvens av sekvensen mellom den første ATG og den andre, ikke i linje med de identifiserte, nære sekvenser, mens den korteste proteinsekvens (fra den andre ATG: SEQ ID-nr. 144) er korrekt oppstilt ved begynnelsen av disse proteiner. Det kan derfor deduseres fra dette at den andre ATG er den korrekte initieringskodon og at sekvensen av denne orf derfor er vist i SEQ ID-nr. 143 som, når den først translateres, tilsvarer det proteinet med SEQ ID-nr. 144.

Or/ 31-genet koder et protein som viser 52% identitet (bestemt ved bruk av BLAST-programmet) med en oksidoreduktase i streptomyces coelicolor (Genbank aksessnummer: NP 631148, BLAST-bedømmels: 261). Denne likhet antyder at or/ 31-genet koder reduktase. Denne hypotese understøttes av det faktum at analysen av sekvensen ved bruk av søksprogrammet (jamfør ovenfor) også antyder at or/3i-genet koder en reduktase. Denne hypotese støttes også av det faktum at proteinet som kodes av or/37-genet viser sterk likhet med andre proteiner med lik funksjon i andre organismer (jamfør tabell 36).

Or/ 31 -genet ble inaktivert. Det var derved mulig å vise at den resulterende stamme ikke lenger produserer spiramyciner. Dette bekrefter at or/ 31 -genet virkelig er involvert i spiramycin biosyntesen. Enzymet som kodes av dette gen er derfor klart ansvarlig for et biokonverteringstrinn som er essensielt for spiramycin biosyntese.

Sekvensen til or/ 32c ble aller først bestemt partielt (jamfør eksempel 19), fordi den kodende sekvens i 5' posisjon kun ble bestemt i et andre trinn. Partialsekvensen av denne orf (SEQ ID-nr. 120) ble imidlertid benyttet for analyse med de forskjellige datamaskinprogrammer som forklart ovenfor. Det var således mulig å bestemme or/ 32c-genet koder et protein som viser 47% identitet i forhold til den bestemte sekvens (SEQ ID-nr. 121, som er partialsekvensen av or/32c-proteinet) (bestemt ved bruk av BLAST-programmet) med et regulatorisk protein av GntR-familien i streptomyces coelicolor (Genbank aksessnummer: NP 625576, BLAST-bedømmelse: 229). Denne likhet antyder at ør/32c-genet koder en transkripsjonen regulator av GntR-familien. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av or/32c-genet viser sterkt likhet med andre proteiner med tilsvarende funksjon i andre organismer.

Partialsekvensen av or/ 32c var i det vesentlige komplettert, og det manglende området ble bestemt (jamfør SEQ ID-nr. 140 og SEQ ID-nr. 145). Den fullstendige sekvens av denne orf koder et protein som viser 44% identitet (bestemt ved bruk av BLAST-programmet) med et regulatorisk protein av GntR-familien i streptomyces avermitilis (Genbank aksessnummer: NP 824604, BLAST-bedømmelse: 282). Denne likhet antyder at ør/32c-genet koder en transkripsjonen regulator av GntR-familien. Denne hypotese understøttes av det faktum at proteinet som kodes av or/32c-genet viser sterk likhet med andre proteiner med lik funksjon i andre organismer (jamfør tabell 37).

Ør/32c-genet ble inaktivert med det formål å studere funksjonen for dette gen i spiramycin biosynteseveien i streptomyces ambofaciens. Det var mulig å vise at den resulterende stammen ga spiramyciner. Dette antyder at ør/32c-genet ikke er essensielt til spiramycin biosyntese og at det ikke er essensielt for bakteriens overlevelse.

Ør/33-genet koder et protein som viser 49% identitet (bestemt ved bruk av BLAST-programmet) med et hypotetisk protein av Xanthomonas campestris (Genbank aksessnummer: NP 635564, BLAST-bedømmelse: 54).

Sekvensen til or/ 34 er partiell. Sammenligninger gjennomført mellom produktet av denne orf og database antyder i realtiteten at den C-terminale del av dette protein ikke er produktet som deduseres fra nukleotidsekvensen og at denne orf derfor er lengre og fortsetter ut over det sekvenserte området. Partialsekvensen av denne ORf ble imidlertid benyttet for analyse ved de forskjellige datamaskinprogrammer som forklart ovenfor. Det var mulig å bestemme at or/ 34c- genet koder et protein som viser 91% identitet i forhold til den bestemte sekvens (SEQ ID-nr. 150, som er partialsekvensen av orf34c-proteinet) (bestemt ved bruk av BLAST-programmet), med en arabinofuranosidase fra streptomyces coelicolor (Bentley et al, 2002; Genbank aksessnummer: NP 630049, BLAST-bedømmelse: 654). I S. coelicolor syntes genet som koder arabinofuranosidasen ikke å være involvert i sekundær metabolitt biosyntese. I S. ambofaciens er dette gen derfor sansynligvis ikke involvert i spiramycin biosyntesen.

Det er beskrevet et polynukleotidet som hybridiserer, under høystringente hybrideringsbetingelser, til minst et av polynukleotidene i SEQ ID-nr. 3, 5, 7, 9,11,13, 15, 17, 19,21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43,45,47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 og 149, eller en variant derav, eller en av sekvensene avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode. Fortrinnsvis blir disse polynukleotider isolert fra en bakterie av genus Streptomyces, og mer spesielt koder disse polynukleotider proteiner som er involvert i biosyntesen av et makrolid og enda mer foretrukket koder disse polynukleotider et protein som har aktivitet tilsvarende det protein som kodes av polynukleotidene med hvilke de hybridiserer. Disse høystringente hybridiseringsbetingelser kan defineres som hybridiseringsbetingelser som ikke er gunstig for hybridisering av ikke-homologe nukleinsyretråder. Høystringens hybridiseringsbetingelser kan for eksempel beskrives som hybridiseringsbetingelser i bufferen beskrevet av Churc & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) ved en temperatur mellom 55°C og 65°C; hybridiseringstemperaturen er fortrinnsvis 55°C, helst 60°C og aller helst 65°C, fulgt av en eller flere vaskinger utført i 2X SSC-buffer ved en temperatur mellom 55°C og 65°C; idet temperaturen fortrinnsvis er 55°C, helst 60°C og aller helst 65°C, fulgt av en eller flere vaskinger i 0.5X SSC- buffer ved en temperatur mellom 55°C og 65°C; idet temperaturen fortrinnsvis er 55°C, helst 60°C og aller helst 65°C. Hybridiseringsbetingelsene som beskrevet ovenfor kan justeres som en funksjon av lengden av nukleinsyren hvis hybridisering er tilsiktet, eller av typen merking som velges, i henhold til i og for seg kjente teknikker. Egnede hybridiseringsbetingelser kan for eksempel justeres i henhold til F. Ausubel et al, 2002.

Det er videre beskrevet et polynukleotid med minst 70%, helst 80%, aller helst 85%, spesielt 90%, helt spesielt 95% og mest foretrukket 98% nukleotididentitet med et polynukleotid omfattende minst 10,12,15,18, 20 to 25, 30,40,50, 60, 70, 80,90,100, 150, 200, 250, 300, 350,400,450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,

1000,1050, 1100, 1150,1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500,1550, 1600, 1650, 1700,1750, 1800,1850 eller 1900 konsekutive nukleotider av et polynukleotid valgt fra gruppen bestående av nukleotidsekvensene SEQ ID-nr. 3,5, 7,9,11,13,15,17,19,21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43,45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82,84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 og 149, eller en variant derav, eller en av sekvensene avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode, eller et polynukleotid med komplementær sekvens. Fortrinnsvis blir disse polynukleotider isolert fra en bakterie av genus streptomyces, og mer spesielt koder disse polynukleotider proteiner som var involvert i biosyntesen av et makrolid, og mer foretrukket koder disse polynukleotider proteiner som har aktivitet tilsvarende proteinene som kodes av polynukleotidene med hvilke de viser identitet. Mer foretrukket velges et polynukleotid fra gruppen bestående av nukleotidsekvensene SEQ ID-nr. 3,5,7, 9, 11, 13, 15, 17,19,21,23,25,28,30, 34, 36, 40, 43,45,47, 49, 53, 60, 62, 64, 66,68, 70, 72, 74, 76,78, 80, 82, 84,107,109,111,113,115,118,120,141, 143, 145, 147 og 149, eller et polynukleotid med komplementærsekvens.

Den optimale innretning av sekvensene for sammenligning kan gjennomføres på en datamaskin ved bruk av kjente algoritmer, for eksempel de i FASTA-pakken (W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988) og (W.R. Pearson, 1990), særlig tilgjengelig fra INFOBIOGEN forskningssenter, Evry, Frankrike. Som illustrasjonen kan prosentsekvensidentitet bestemmes ved bruk av LFASTA (K.-M. Chao et ah, 1992) eller LALIGN (X. Huang og W. Miller, 1991) programmer. LFASTA- og LALIGN-programmene er en del av FASTA-pakken. LALIGN gir optimal lokal innretning, dette program er mer rigorøst, men også langsommere enn LFASTA.

Det er beskrevet et polypeptid som er resultatet av ekspresjonen av en nukleinsyresekvens som definert ovenfor. Fortrinnsvis viser polypeptidene minst 70%, helst minst 80%, aller helst 85%, spesielt 90% og helt spesielt 95% og mest spesielt 98% aminosyreidentitet med et polypeptid omfattende minst 15,20, 30 to 40, 50, 60, 70, 80, 90,100,120,140,160,180,200,220,240,260,280, 300, 320, 340, 360, 380, 400,420,440,460,480, 500,520,540,560,580,600,620 eller 640 konsekutive aminosyrer av et polypeptid valgt blant SEQ ID-nr. 4,4, 6, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20,22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59,61,63,65,67, 69,71,73,75,77, 79,81,83,85,108,110,112,114,116,117, 119,121,142,144,146,148 og 150, eller en av disse sekvenser bortsett fra at, alt langs sekvensen, en eller flere aminosyrer er substituert, insertert eller deletert uten å påvirke de funksjonelle egenskaper, eller en av variantene av disse sekvenser. Fortrinnsvis uttrykkes polypeptidene i en naturlig tilstand som en bakterie av genus streptomyces, og mer spesielt er disse polypeptider involvert i biosyntesen av et makrolid og spesielt har disse polypeptider en aktivitet tilsvarende den til polypeptidet med hvilke de deler identitet. Fortrinnsvis er et polypeptid valgt fra gruppen bestående av polypeptidsekvensene SEQ ID-nr. 4, 6, 8, 10,12,14,16, 18,20,22,24,26,27,29,31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67,69,71,73,75,77, 79,81,83,85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 og 150, eller en av disse sekvenser bortsett fra at, langs sekvensen, en eller flere aminosyrer er substituert, insertert eller deletert uten å påvirke de funksjonelle egenskaper, eller en av variantene av disse sekvenser. Aller helst er et polypeptid valgt fra gruppen bestående av polypeptidsekvensene SEQ ID-nr. 4, 6, 8, 10, 12,14,16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58,59, 61, 63, 65, 67,69, 71, 73, 75,77,79, 81, 83, 85,108,110,112,114,116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 og 150.

Den optimale innretning av sekvensene for sammenligning kan gjennomføres på en datamaskin ved bruk av kjente algoritmer, for eksempel de i FASTA-pakken (W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988) og (W.R. Pearson, 1990), særlig tilgjengelig fra INFOBIOGEN forskningssenter, Evry, Frankrike. Som illustrasjonen kan prosentsekvensidentitet bestemmes ved bruk av LFASTA (K.-M. Chao et ah, 1992) eller LALIGN (X. Huang og W. Miller, 1991) programmer ved bril av defaultparameterne som beskrevet av INFOBIOGEN forskningssenteret, Evry, Frankrike. LFASTA- og LALIGN-programmene er en del av FASTA-pakken. LALIGN gir optimal lokal innretning, dette program er mer rigorøst, men også langsommere enn

LFASTA.

Det er videre beakrevt et rekombinant DNA omfattende minst et polynukleotid som beskrevet ovenfor. Fortrinnsvis er denne rekombinante DNA en vektor. Aller helst er vektoren valgt blant bakteriofager, plasmider, fagemider, integrative vektorer, fosmider, kosmider, shuttlevektorer, BACer (Bacterial Artificial Chromosomes) og PACer (Pl-derived Artificial Chromosomes). Som illustrasjon kan X-fagen og M13-fagen nevnes som bakteriofager. Som plasmider kan nevnes plasmider som replikerer i E. coli, for eksempel pBR322 og dennes derivater, pUC18 og dennes derivater, pUC19 og dennes derivater, pGB2 og dennes derivater (G. Churchward et al, 1984), pACYC177 (Genbank aksessnummer: X06402) og dennes derivater og pACYC184 (Genbank aksessnummer: X06403) og dennes derivater. Nevnes kan også plasmider som replikerer i streptomyces, som for eksempel pIJlOl og dennes derivater, pSG5 og dennes derivater, SLP1 og dennes derivater og SCP2<*>og dennes derivater (Kieser et al, 2000). Som fagemider kan som illustrasjon nevnes pBluescript II og dennes derivater (markedsført særlig av firmaet Stratagene (LaJolla, California, USA)), pGEM-T og dennes derivater (markedsførtav firma Promega (Madison, Wisconsin, USA)), [lacuna] IS117-integreringssystem (Kieser et al., 2000). Som fosmider kan som illustrasjoner nevnes fosmidet pFOSl (markedsført av firma New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) og dennes derivater. Som kosmider kan som illustrasjonen nen ves kosmidet SuperCos og denes derivater (særlig markedsført av firma Stratagene (LaJolla, California, USA)) og kosmidet pWED 15 (Wahl et al, 1987) og dennes derivater. Som shuttlevektorer kan, som illustrasjonen nevner, E. coli/ streptomyces shuttleplasmider som for eksempel pIJ903 og dennes derivater, serien av plasmider pUWL, pCAO106, pWHM3 og pOJ446 og disses derivater (Kieser et al, 2000) og E. coli/ streptomyces shuttle BACer som for eksempel de som er beskrevet i WO 01/40497. Som BACer kan som illustrasjoner nevnes BACen pBeloBACl 1 (Genbank aksessnummer: U51113). Som PACer (Pl-derivert Artificial Chromosomes), kan som illustrasjon nevnes vektoren pCYPAC6 (Genbank aksessnummer: AF133437). Aller helst er en vektor valgt blant pOS49.1, pOS49.11, pOSC49.12, pOS49.14, pOS49.16, pOS49.28, pOS44.1, pOS44.2, pOS44.4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, pOS49.88, pOS49.106, pOS49.120, pOS49.107, pOS49.32, pOS49.43, pOS49.44, pOS49.50, pOS49.99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPMl, pBXLl 111, pBXLl 112, pBXLl 113, pSPM520, pSPM521, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74, pSPM75, pSPM79, pSPM83, pSPM107, pSPM543 og pSPM106.

Et aspekt ved oppfinnelsen angår et ekspresjonssystem omfattende en egnet ekspresjonsvektor og en vertscelle som tillater ekspresjon av ett eller flere polypeptider som beskrevet ovenfor i et biologisk system. Ekspresjonsvektorene ifølge oppfinnelsen omfatter en nukleinsyresekvens som koder et eller flere polypeptider som beskrevet ovenfor, og kan være ment for ekspresjon av forskjellige polypeptider ifølge oppfinnelsen i diverse vertsceller som er velkjente for fagmannen. Som eksempel kan nevnes prokaryotiske ekspresjonssystemer som ekspresjonssystemet i bakterien E. coli, og eukaryotiske ekspresjonssystemer som baculovirusekspresjonssystemet som tillater ekspresjon i insektceller, og ekspresjonssystemene som tillater ekspresjon i gjærceller, eller ekspresjonssystemene som tillater ekspresjon i pattedyrceller og særlig humanceller. Ekspresjonsvektorene som kan benyttes i slike systemer er velkjente for fagmannen; hva angår prokaryotiske celler, kan som illustrasjon nevnes ekspresjonsvektorene i E. coli, for eksempel den pET som markedsføres av firma Stratagene (LaJolla, California, USA), vektorene i GATEWAY-familien som markedsføres av firma Invitrogen (Carlsbad, California, USA), vektorene i pBAD-familien som markedsføres av firma Invitrogen (Carlsbad, California, USA), vektorene i pMAL-familien som markedsføres av firma New England Biolabs Inc. (Beverly, Massachussetts, USA), og de rhamnose-induserbare ekspresjonsvektorer som nevnes i publikasjonen B. Wilms et al, 2001 og deres derivater; videre kan også nevnes ekspresjonsvektorene i streptomyces, som for eksempel vektorene pIJ4123, pIJ6021, pPM927, pANT849, pANT 850, pANT 851, pANT1200, pANT1201 og pANT1202 og deres derivater (Kieser et al, 2000). Hva angår gjærceller, kan som illustrasjon nevnes vektoren pESC, markedsført av firma Statagene (LaJolla, California, USA). Hva angår baculovirusekspresjonssystemene som tillater ekspresjon i innsektsceller, kan som illustrasjon nevnes vektoren BacPAK6 som markedsføres av firma BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, California, USA). Hva angår pattedyrceller kan som illustrasjon nevnes vektorene omfattende den CMV (Cytomegalovirus) umiddelbart tidlige genpromoter (for eksempel vektoren pCMV og dennes derivater markedsført av firma Stratagene (LaJolla, California, USA)), eller den SV40 tidligere promoter av den vankuolerende simianvirus (for eksempel vektoren pSG5 som markedsføres av firmaet Stratagene (LaJolla, California, USA)).

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som beskrevet ovenfor, idet metoden omfatter de følgende trinn: a) innføring av en nukleinsyre som koder polypeptidet i en egnet vektor; b) dyrking i et egnet kulturmedium av en vertscelle som er transformert eller transfektert på forhånd med vektoren fra trinn a); c) gjenvinning av det dyrkede kulturmedium eller en celleekstrakt, for eksempel ved sonikering eller osmotisk sjokk; d) separering og rensing av polypeptidet fra kulturmediet eller også fra celleekstrakten oppnådd i trinn c); e) hvis aktuelt, karakterisering av det fremstilte, rekombinante polypeptid.

Et rekombinant polypeptid ifølge oppfinnelsen kan renses ved føring over en egnet serie

kromatografikolonne; i henhold til i og for seg kjente metoder og som for eksempel beskrevet av F. Ausubel et al, (2002). Som illustrasjon kan nevnes "Histidine-Tag"-teknikker som består i å addere en kort polyhistidinsekvens til polypeptidet som skal fremstilles idet det er mulig at polypeptidet renses på en nikkelkolonne. Et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved in vzYrø-synteseteknikker. Som illustrasjon på slike teknikker kan et polypeptid ifølge oppfinnelsen fremstilles ved bruk av det "hurtige translasjonssystem (RTS)", markedsført særlig av firma Roche Diagnostics Frankrike S.A., Meylan, Frankrike.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen angår vertsceller inn i hvilke det er innført minst ett polynukleotid.

Det er imidlertid også mulig å innføre minst ett rekombinant DNA og/eller minst en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen angår mikroorganismer som er blokkert i et trinn i den biosyntetiske vei for minst et makrolid. Fordelen ligger først og fremst ved å studere funksjonen av de muterte proteiner, og for det andre å fremstille mikroorganismer som produserer biosyntesemellomprodukter. Disse mellomprodukter kan modifiseres, eventuelt etter separering, enten ved å sette spesielle forbindelser til produksjonsmediet eller ved i mikroorganismene å innføre således muterte, andre gener som koder proteiner som er i stand til å modifisere mellomproduktet ved å bruke det som et substrat. Disse mellomprodukter kan således modifiseres kjemisk, biokjemisk, enzymatisk og/eller mikrobiologisk. Mikroorganismene som er blokkert i et trinn i den biosyntetiske vei for makrolider, kan oppnås ved inaktivering av funksjonen til et eller flere proteiner som er involvert i biosyntesen av dette eller disse makrolider i mikroorganismer som gir dette eller disse makrolider. Avhengig av de inaktiverte proteiner kan det således oppnås mikroorganismer som er blokkert i de forskjellige trinn i biosynteseveien for dette eller disse makrolider. Inaktiveringen av dette eller disse proteiner kan gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, for eksempel ved mutagenese i genet eller genene som koder proteinene, eller ved ekspresjon av en eller flere antisens RNA'er som er komplementære til mRNA'ene som koder proteinene. Denne mutagenese kan for eksempel gjennomføres ved bestråling, ved innvirkning av et mutagenisk kjemisk middel, ved faststoffrettet mutagenese, ved generstatning, eller ved en hvilken som helst annen metode som er kjent for fagmannen. Betingelsene som er egnet for slik mutagenese kan for eksempel justeres i henhold til den lære som finnes hos T. Kieser et al., (2000) og Ausubel et al. (2002). Mutagenesen kan gjennomføres in vitro eller in situ, ved supresjon, substitusjon, delesjon og/eller addisjon av en eller flere baser i det angjeldende gen, eller ved geninaktivering. Denne mutagenese kan gjennomføres i et gen omfattende en sekvens som beskrevet ovenfor. Fortrinnsvis er mikroorganismene som er blokkert i et trinn for biosynteseveien for makrolider, bakterier av genus streptomyces. Mer spesielt gjennomføres inaktiveringen av funksjonen av et eller flere proteiner involvert i biosyntesen av det eller de angjeldende makrolider, gjenomført ved mutagenese. Aller helst er det angjeldende makrolid spiramycin og mikroorganismene hvori mutagenesen(e) gjennomføres, stammer av S. ambofaciens. Mer spesielt kan mutagenesen gjennomføres i en eller flere gener omfattende en av sekvensene tilsvarende en av sekvensene SEQ ID-nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,17, 19,21,23,25,28, 30, 34, 36,40,43,45,47, 49, 53,60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,107,109,111,113,115,118, 120, 141, 143, 145, 147 og 149. Fortrinnsvis gjennomføres mutagenesen(e) ved geninaktivering. Mutagenesen i geninaktivering kan bestå av et gen omfattende en sekvens tilsvarende SEQ ID-nr. 13.

Som illustrasjon kan de følgende mikroorganismer nevnes som eksempler på slike mikroorganismer: OS49.16 ( orf3:: £2hyg, jamfør eksempel 2), OS49.67 ( orf3 in-phase deletion, jamfør eksempel 6), OS49.107 ( prfSr. jOhyg, jamfør eksempel 7), OS49.50 ( orflO:: Cfoyg, jamfør eksempel 8), SPM21 ( or/ 2::att3fhac-, jamfør eksempel 10), SPM22 ( orf2::att3 in-phase deletion, jamfør eksempel 10), SPM501 ( orf6* ::attl£hyg+, jamfør eksempel 14), SPM502 ( orf5* ::attl in-phase deletion, jamfør eksempel 14), SPM507 ( orfl2::att3fhac-, jamfør eksempel 11), SPM508 ( orfl3c::att3fhac-, jamfør eksempel 12), og SPM509 ( orfl4::att3fhac-, jamfør eksempel 13), SPM107 ( orf28c::att3aac+, jamfør eksempel 29), SPM543 ( orf31::att3aac+, jamfør eksempel 30), SPM106 ( orf32c::att3aac+, jamfør eksempel 31).

Det er beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av et makrolidbiosyntese mellomprodukt ved bruk av en av mikroorganismene som er blokkert i et trinn i biosynteseveien for makrolider som beskrevet ovenfor. Metoden består i dyrking, i et egnet dyrkingsmedium, av en mikroorganisme som er blokkert i et trinn av den biosyntetiske vei for makrolider som beskrevet ovenfor, gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller en celleekstrakt, for eksempel ved sonifikering eller ved osmotisk sjokk, og separering og rensing av biosyntesemellomproduktet fra kulturmediet eller fra celleekstraktene og i det foregående trinn. Betingelsene for dyrking med slike mikroorganismer kan bestemmes i henhold til teknikker som er velkjente av fagfolk. Kulturmediet kan for eksempel være MP5-mediet eller SLI 1-mediet for streptomyces, og særlig for streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). Fagfolk på området kan særlig henvise til en artikkel av Kieser et al. (2000) hva angår dyrking av streptomyces. Mellomproduktet som fremstilles kan gjenvinnes ved en hvilken som helst i og for seg kjent teknikk. Det kan for eksempel henvises til de teknikker som er beskrevet i US patent 3,000,785 og mer spesielt metodene for å ekstrahere spiramyciner som beskrevet i dette patent.

Videre er det beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av et molekyl avledet fra et makrolid ved bruk av mikroorganismene som er blokkert i et trinn av biosynteseveien for dette makrolid, som beskrevet ovenfor. Metoden består i å oppnå et biosyntesemellomprodukt i henhold til metoden som beskrevet ovenfor, og å modifisere det således fremstilte mellomprodukt, eventuelt etter separering fra kulturmediet. Betingelsene for dyrking av slike mikroorganismer kan bestemmes i henhold til i og for seg kjente teknikker. Kulturmediet kan for eksempel være MP5-mediet eller SLI 1-mediet for streptomyces, og særlig for streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). I denne forbindelse kan det særlig henvises til en artikkel av Kieser et al., 2000 når det gjelder dyrking av streptomyces. Mellomproduktene som fremstilles kan modifiseres, eventuelt etter separering, enten ved å tilsette egnede komponenter til produksjonsmedium eller ved i mikroorganismene å innføre andre gener som koder proteiner som er i stand til å modifisere mellomproduktene ved anvendelse av det som et substrat. Disse mellomprodukter kan således modifiseres kjemisk, biokjemisk, enzymatisk og/eller mikrobiologisk. Mer spesielt er det angjeldende makrolidspyramycin og mikroorganismen der mutagenesen(e) gjennomføres, stammer av S. ambofaciens.

Det beskrives mikroorganismer som produserer spiramycin I, men som ikke produserer spiramycin II og III. Denne mikroorganisme omfatter alle de gener som er nødvendige for biosyntese av spiramycin I, men som ikke produserer spiramycin II eller III fordi genet omfattende sekvensen som tilsvarerer SEQ ID-nr. 13, eller en variant derav, eller en av sekvensene avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode, og koder et polypeptid med sekvens SEQ ID-nr. 14, eller en av dennes varianter, ikke uttrykkes eller er gjort inaktiv. Inaktiveringen av dette protein kan gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, for eksempel ved mutagenese i genet som koder proteinet eller ved ekspresjon av antisens RNA som er komplementære til den mRNA som koder protein idet det skal være klart at hvis ekspresjonen av orf5<*>påvirkes ved denne manipulering vil det være nødvendig å gjennomføre en annen modifikasjon slik at or/5<*->genet uttrykkes korrekt. Mutagenesen kan gjennomføres i den kodende sekvens eller i en ikke-kodende sekvens slik at den gjør det kodende protein inaktivt, eller for å forhindre dets ekspresjon eller dets translasjon derfra. Mutagenesen kan gjennomføres ved seterettet mutagenese, ved generstatning eller en hvilken som helst annen metode som er kjent for fagfolk. Betingelsene som er egnet for slik mutagenese kan for eksempel justeres i henhold til den lære som finnes hos T. Kieser et al, (2000) og Ausubel et al, (2002). Mutagenesen kan gjennomføres in vitro eller in situ ved supresjon, substitusjon, delesjon og/eller addisjon av en eller flere baser i det angjeldende gen eller ved geninaktivering. Mikroorganismen kan også oppnås ved å uttrykke genene i den biosyntetiske vei for spiramycin uten de som omfatter genet omfattende sekvensen SEQ ID-nr. 13, eller en av dens varianter, eller en av sekvensene avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode, og koder polypeptid av sekvense SEQ ID-nr. 14 eller en variant derav. Fortrinnsvis er mikroorganismen en bakterie av genus streptomyces. Mer spesielt oppnås mikroorganismen som produserer spiramycin I, men som ikke produserer spiramycin II og III fra en utgangsmikroorganisme som produserer spiramyciner I, II og III. Mere foretrukket ble mikroorganismen oppnådd ved mutagenese i et gen omfattende sekvensen tilsvarende SEQ ID-nr. 13, eller en variant derav, eller en av sekvensene avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode, og koder et polypeptid med sekvensen SEQ ID-nr. 14 eller en variant derav med samme funksjon. Enda mer foretrukket blir mutagenesen gjennomført ved geninaktivering. Fortrinnsvis oppnås mikroorganismen fra en stamme av S. ambofaciens som produserer spiramyciner I, II og III, hvori genaktivering av genet omfattende sekvensen som tilsvarer SEQ ID-nr. 13, eller en av sekvensene avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode, gjennomføres. Helst gjennomføres geninaktiveringen ved in-phasedeletering av genet eller en del av genet omfattende sekvensene tilsvarende SEQ ID-nr. 13 eller en av sekvensene avledet derfra ved degenerering og den genetiske kode. Som illustrasjon kan stammen SPM502

( orf6* ::attl, jamfør eksempel 14) nevnes som en mikroorganisme som produserer spiramycin 1 som ikke produserer spiramycin II og III.

Beskrevet er også en mikroorganisme som produserer spiramycin I, men som ikke produserer spiramycin II og III som beskrevet ovenfor, og som også overuttrykker : - et gen som kan oppnås ved polymerasekjedereaksjon ved bruk av et par av primere med følgende sekvense : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID-nr. 138) og 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID-

nr. 139), og som matrikskosmidet pSPM36 eller den totale DNA av streptomyces ambofaciens, helst er dette genet av den kodende sekvens SEQ ID-nr. 141,

- eller et gen avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode.

Et eksempel på sekvens av et slikt gen er gitt i SEQ ID-nr. 111 (DNA); imidlertid er denne sekvens partiell fordi den ikke omfatter 3'-delen av den tilsvarende kodende sekvens. Translasjonen av dette protein av kodende sekvens til protein er gitt i SEQ ID-nr. 112. Fagmannen på området vil lett være i stand til å fullføre den, spesielt ved bruk av den lære som er gitt i eksempel 24. Sekvensen som ikke er bestemt i SEQ IE-nr. 111 ble bestemt i et andre trinn og den fullstendige sekvens for denne orf ( prf28c) er gitt i SEQ ID-nr. 141. Translasjonen til protein av denne kodende sekvens er gitt i SEQ ID-nr. 142. Eksempel 24 gir en metode for kloning av orf28c- genet, og for å produsere en ekspresjonsvektor som tillater ekspresjon av orf28c. Dette eksempel viser også at overekspresjon av ør/25c-genet i stammen OSC2 fører til en forbedring av spiramycinproduksjonen i denne stamme. Overekspresjonen av orf28c- genet kan oppnås ved å øke antallet kopier av dette gen og/eller ved å innføre en promoter som er mer aktiv enn villtypepromoteren. Fortrinnsvis oppnås overekspresjonen av genet ved i mikroorganismen å innføre et rekombinant DNA-konstrukt som tillater overekspresjon av dette gen. Fortrinnsvis øker dette rekombinante DNA-konstrukt antallet kopier av genet, og gjør det mulig å oppnå overekspresjon av genet. I dette rekombinante DNA-konstrukt kan den kodende sekvens av genet plasseres under kontroll av en promoter som er mer aktiv enn villtypepromoteren. Som illustrasjonen kan nevnes ptrc-promoter som er aktiv i streptomyces ambofaciensk (E. Amann et al., 1988) og også ermE<*->promoteren. Således blir fortrinnsvis kopien(e) av orf28c- genet plassert under kontrol av ermE<*->promoter, som her konstrukt pSPM75 (jamfør eksempel 24).

Det beskrives også en mikroorganisme som produserer spiramycin I, men som ikke produserer spiramycin II og III som beskrevet ovenfor, som også overuttrykker gen som har en kodende SEQ ID-nr. 47 eller har en kodende sekvens avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode. Fortrinnsvis er denne mikroorganisme stammen SPM502 pSPM525, deponert ved "the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" [National Collection of Cultures and Microorganisms] (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 26. februar 2003, under registreringsnummeret 1-2977.

Beskrevet er også en fremgangsmåte for fremstilling av spiramycin I, og denne fremgangsmåte omfatter dyrking, i et egnet kulturmedium, av en mikroorganisme som produserer spiramycin I men som ikke produserer spiramycin II og III, som beskrevet ovenfor, gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller en celleekstrakt, og separering og rensing av spiramycin I fra kulturmediet eller også fra celleekstrakt oppnådd i det foregående trinn. Betingelsene for dyrking av en slik mikroorganisme kan bestemmes i henhold til teknikker som er velkjente for fagmannen. Kulturmediet kan for eksempel være MP5-mediet eller SLI 1-mediet for streptomyces, og særlig for streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). Fagmannen på området kan særlig henvises til en artikkel av Kieser et al., 2000 når det gjelder dyrking av streptomyces. Den fremstilte spiramycin I kan gjenvinnes ved enhver i og for seg kjent teknikk, og det kan for eksempel henvises til de teknikker som er beskrevet i US patent 3,000,785 og mer spesielt metodene for å ekstrahere spiramyciner slik de beskrives i dette patent.

Det beskrives en anvendelse av en nukleotidsekvens ifølge oppfinnelsen for å forbedre makrolidproduksjonen hos en mikroorganisme. Således angår oppfinnelsen en makrolidproduserende, mutant mikroorganisme som har en genetisk modifikasjon i minst et gen omfattende en sekvens som definert ovenfor, og/eller som overuttrykker minst et gen omfattende en sekvens som definert ovenfor. Den genetiske modifikasjon kan bestå i en supresjon, en substitusjon, en delesjon og/eller en addisjon av en eller flere baser i det eller de angjeldende gener med det formål å uttrykke ett eller flere proteiner med større aktivitet, eller som uttrykker et høyere nivå av dette eller disse proteiner. Overekspresjonen for det angjeldende gen kan oppnås ved å øke antallet kopier av dette gen og/eller ved å innføre en promoter som er mer aktiv enn villtypepromoteren. Som illustrasjon kan nevnes den ptrc-promoter som er aktiv i streptomyces ambofaciens (E. Amann et al, 1988) og også ermE<*->promoteren (Bibb et al, 1985), (Bibb et al, 1994). Således kan overekspresjon av det angjeldende gen oppnås ved, i en makrolidproduserende mikroorganisme, og innføre et rekombinant DNA-konstrukt som tillater overekspresjon av dette gen. Spesielt er visse trinn av makrolidbiosyntesen begrensende, hvis et eller flere proteiner som er mer aktiv eller et høyere ekspresjonsnivå av villtypeproteinet eller -proteinene som er involvert i disse begrensende trinn uttrykkes, er det mulig å forbedre produksjonen av det eller de angjeldende makrolider. En økning i produksjonsmengden for tylosin er for eksempel oppnådd i streptomyces fradiae ved duplikkering av genet som koder en begrensende metyltransferase som konverterer makrocin til tylosin (R. Baltz, 1997). Ekspresjonsproduksjonen av et protein som er mer aktivt, kan oppnås særlig ved mutagenese, og det kan spesielt henvises til en artikkel av F. Ausubel et al, (2002). Fortrinnsvis er disse mutante mikroorganismer som er forbedret med henblikk på makrolidproduksjonen, bakterier av genuset streptomyces. Mer preferensielt er den genetiske modifikasjon gjennomført i et eller flere gener omfattende en av sekvensene tlisvarende en eller flere av sekvensene SEQ ID-nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45,47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,107,109,111,113,115,118,120,141,143,145,147 og 149, eller en variant derav, eller en av sekvensene avledet derfra ved degenerering av den gentiske kode. Fortrinnsvis overuttrykker mikroorganismen et eller flere gener omfattende en av sekvensene tilsvarende en eller flere av sekvensene SEQ ID-nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21, 23,25,28, 30, 34, 36,40,43, 45,47,49,53, 60, 62, 64,66, 68, 70, 72, 74,76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111,113,115,118,120,141,143, 145, 147 og 149, eller en variant derav eller en av sekvensene avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode. Fortrinnsvis omfatter mikroorganismen som overuttrykker genet, en sekvens tilsvarende SEQ ID-nr. 111 eller 141, eller en variant derav eller en av sekvensene avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode. Sekvensen som er gitt i SEQ ID-nr. 111 er partiell, imidlertid vil fagmannen på området lett være i stand til å fullføre den, særlig ved bruk av den lære som er gitt i eksempel 24. Den sekvens som ikke er bestemt i SEQ ID-nr. 111 ble bestemt i et andre trinn, og den fullstendige sekvens av denne orf ( orf28c) er gitt i SEQ ID-nr. 141. Translasjon til protein av denne kodende sekvens er gitt i SEQ ID-nr. 142. Eksempel 24 gir en metode for å klone orf28c- genet og for å produsere en ekspresjonsvektor som tillater å uttrykke orf28c. Dette eksempel viser også at overekspresjon av ør/2#c-genet i stammen OSC2 fører til forbedring av spiramycinproduksjonen i denne stamme. Overekspresjonen av orf28c- genet kan oppnås ved å øke antallet kopier av dette gen, og/eller ved å innføre en promoter som er mer aktiv enn villtypepromoteren. Fortrinnsvis oppnås overekspresjonen av gen ved i mikroorganismen å innføre et rekombinant DNA-konstrukt som tillater overekspresjon av genet. Fortrinnsvis øker dette rekombinante DNA-konstrukt antallet kopier i genet og gjør det mulig å oppnå overekspresjon av genet. I dette rekombinante DNA-konstrukt kan den kodende sekvens av genet plasseres under kontroll av en promoter som er mer aktiv enn villtypepromoteren. Som illustrasjon kan nevnes den ptrc-promoter som er aktiv i streptomyces ambofaciens (E. Amann et al, 1988) og også ermE<*->promoteren. Således blir fortrinnsvis kopien(e) av orf28c- genet plassert under kontroll av ermE*-promoteren slik tilfellet er i konstrukt pSPM75 (jamfør eksempel 24).

Et annet aspekt ved oppfinnelsen angår en fremgangmåte for fremstilling av makrolider ved bruk av mikroorganismene som er beskrevet i det foregående. Denne metode består, i et egnet kulturmedium, å dyrke en mikroorganisme som definert i avsnittet foran, gjenvinning av kondisjonert kulturmedium eller celleekstrakt og separering og rensing av det eller de makrolider som er fremstilt fra kulturmediet, eller også fra celleekstrakten oppnådd i det foregående trinn. Betingelsene for dyrking av slike mikroorganismer kan bestemmes i henhold til i og for seg kjente teknikker. Kulturmediet kan for eksempel være MP5-mediet eller SLI 1-mediet for streptomyces, og særlig for streptomyces ambofaciens (Pernodet et al, 1993). Av litteratur kan det særlig henvises til Kieser et al, 2000, hva angår dyrking av streptomyces. Det eller de fremstilte makrolider kan gjenvinnes ved en hvilken som helst i og for seg kjent teknikk, og det kan særlig henvises til det som er beskrevet i US patent 3,000,785 og mer spesielt til metodene for å ekstrahere spiramyciner som beskrevet i dette patent. Mikroorganismen som benyttes i en slik metode er fortrinnsvis bakterier av genus streptomyces. Mer spesielt er det angjeldende makrolid spiramycin og den mutante mikroorganisme som er forbedret med henblikk på spiramycinproduksjonen er stammer av S. ambofaciens.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er anvendelsen av en sekvens og/eller en vektor ifølge oppfinnelsen for fremstilling av hybridantibiotika. Spesielt kan polynukleotidene ifølge oppfinnelsen benyttes for å oppnå mikroorganismer som uttrykker et eller flere mutante proteiner som gir opphav til en modifikasjon i substratspesifisitet, eller ellers kan uttrykkes i mange antibiotikumproduserende mikroorganismer med det formål å generere hybridantibiotika. Således gjør polynukleotidene ifølge oppfinnelsen det mulig, ved genoverføring mellom produserende mikrorganismer, og produsere hybridantibiotika med fordelaktige, farmakologiske egenskaper (Hopwood et al, 1985a, Hopwood et al, 1985b, Hutchinson et al, 1989). Det prinsipp ved hvilken genetisk konstruksjon kan tilveiebringe produksjonen av hybridantibiotika, ble fremfor alt foreslått av Hopwood (Hopwood 1981). Det ble således foreslått at enzymene som var involvert i biosyntesen av antiobiotika ofte aksepterte substrater som er strukturelt relatert, men som skiller seg fra deres naturlige substrat. Det ble generelt akseptert Hopwood et al, 1981, Hutchinson et al, 1988), Robinson 1988) at enzymer som kodes av genene i den biosyntetiske vei for antibiotika, har en mindre strikt substratsepsifisitet enn enzymer for primær metabolisme. Det har således vært mulig å bevise at et stort antall ikke-naturlige substrater konverteres av antibiotikumproduserende mikroorganismer, deres mutanter eller rensede enzymer i den biosyntetiske vei for disse antibiotika (Hutchinson 1988). Ved bruk av denne lære kan fagmannen på området konstruere mikroorganismer som uttrykker et eller flere mutante proteiner som gir opphav til en modifikasjon av substratspesifisiteten med formålet å generere hybridantibiotika.

Det er også beskrevet anvendelse av minst et polynukleotid og/eller minst en rekombinant DNA og/eller minst en ekspresjonsvektor og/eller minst et polypeptid og/eller minst en vertscelle ifølgr oppfinnelsen for å gjennomføre en eller flere biokonverteringer. Det gjør det således mulig å konstruere bakterielle eller fungale stammer, hvori et eller flere proteiner ifølge oppfinnelsen uttrykkes under kontroll av egnede ekspresjonssignaler. Slike stammer kan så benyttes for å gjennomføre en eller flere biokonverteringer. Disse biokonverteringer kan gjennomføres enten ved bruk av hele celler eller ved bruk av acellulære ekstrakter av cellene. Disse biokonverteringer kan gjøre det mulig å konvertere et molekyl til en derivert form, med et enzym i en biosyntesevei. For eksempel beskriver Carreras et al. bruken av en stamme av saccharopolyspora erythraea og av streptomyces coelicolor for fremstilling av nye erytromycinderivater (Carreras et al, 2002). Walczak et al. beskriver bruken av en streptomyces P450 monooksygense for biokonvertering av deacetyladriamycin (en antracyklinanalog) til nye antracykliner (Walczak et al, 2001). Olonao et al. beskriver bruken av en modifisert stamme av streptomyces lividans for biokonvertering av e-rhodomycinon til rhodomycin D (Olonao et al, 1999). Fagfolk på området kan anvende dette prinsipp på et hvilket som helst biosyntesemellomprodukt.

Videre beskrives et rekombinant DNA som omfatter:

_ et polynukleotid som kan oppnås ved polymerasekjedereaksjon ved bruk av et par av primere med følgende sekvens: 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID-nr. 138) og 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID-nr. 139) og som matrikskosmidet pSPM36 eller den totale DNA av streptomyces ambofaciens, mer spesielt er det et polynukleotid med sekvensen SEQ ID-nr. 141. - eller et fragment på minst 10,12,15,18, 20 to 25, 30,40, 50, 60, 70, 80,90,100,150, 200,250, 300, 350,400,450,500,550,600,650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,1000, 1050,1100, 1150, 1200, 1250,1300, 1350, 1400,1450, 1460, 1470, 1480,1490 eller 1500 konsekutive nukleotider av polynukleotidet.

Fortrinnsvis er denne rekombinante DNA en vektor. Aller helst er vektoren valgt blant bakteriofager, plasmider, fagmider, integrative vektorer, fosmider, kosmider, shuttlevektorer, BACer (Bacterial Artificial Chromosomes) og PACer (Pl-derivert Artificial Chromosomes). Som illustrasjon kan X-fagen og M13-fagen nevnes som bakteriofager. Som plasmider kan nevnes plasmider som replikerer i E. coli, for eksempel pBR322 og dennes derivater, pUC18 og dennes derivater, pUC19 og dennes derivater, pGB2 og dennes derivater (G. Churchward et al., 1984), pACYC177 (Genbank aksessnummer: X06402) og dennes derivater og pACYC184 (Genbank aksessnummer: C06403) og dennes derivater. Nevnes kan også plasmider som replikerer i streptomyces, som for eksempel pIJlOl og dennes derivater, pSG5 og dennes derivater, SLP1 og dennes derivater, og SCP2<*>og dennes derivater (Kieser et al. 2000). Som fagemider som illustrasjonen nevnes pBluescript II og dennes derivater (markedsført særlig av firma Stratagene (LaJolla, California, USA)), pGEM-T og dennes derivater (markedsført ved firma Promega (Madison, Wisconsin, USA)) og XZAPII og dets derivater (merkedssført spesielt ved firma Stratagene (LaJolla, California, USA)). Som integrative vektorer kan som illustrasjoner nevnes vektorer som integrerer i streptomyces, som for eksempel de som er avledet fra SLP1 (Kieser et al, 2000), avledet fra pSAM2 (Kieser et al, 2000), vektorer som benytter PhiC31-fagintegreringssystemer (Kieser et al., 2000) (for eksempel pSET152 (Bierman et al, 1992)) eller VWB integreringssystem (L. van Mellaert et al. 1998), og også vektorer som benytter IS117 integreringssystem (Kieser et al, 2000). Som fosmider kan som illustrasjon nevnes fosmidet pFOSl (markedsført av firma New England Biolabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) og dennes derivater. Som kosmider kan som illustrasjon nevnes kosmidet SuperCos og dennes derivater (markedsført spesielt ved firma Stratagene (LaJolla, California, USA)) og kosmidet pWED15 (Waht et al, 1987) og dennes derivater. Som shuttlevektorer kan som illustrasjonen nevnes E. coli/ streptomyces shuttleplasmider som for eksempel pIJ903 og dennes derivater, serien av plasmider pUWL, pCAO106, pWHM3 og pOJ446 og deres derivater (Kieser et al, 2000), og E. coli/ streptomyces shuttle BACer som for eksempel de som er beskrevet i WO 01/40497. Som BACer (Bacterial Artificial Chromosomes) kan som illustrasjonen nevnes BAC pBeloBACl 1 (Genbank aksessnummer: U51113). Som PACer (Pl-derivert Artificial Chromosomes), kan som illustrasjonen nevnes vektoren pCYPAC6 (Genbank aksessnummer: AF133437). Mer preferensielt er den rekombinante DNA-ekspresjonsvektor. Ekspresjonsvektorer som kan benyttes i slike systemer er velkjente for fagfolk, og hva angår prokariotiske celler kan som illustrasjoner nevnes ekspresjonsvektoren i E. coli, for eksempel den pET som markedsføres av firme Stratagene (LaJolla, California, USA), vektorene av GATEWAY-familien som markedsføres av firma Invitrogen (Carlsbad, California, USA), vektorene av pBAD-familien som markedsføres av firma Invitrogen (Carlsbad, California, USA), vektorene av pMAL-familien som markedsføres av firma New England Bioloabs Inc. (Beverly, Massachussetts, USA) og de rhamnoseinduserbare ekspresjonsvektorer som er nevn i publikasjonen av B. Wilms et al., 2001 og disses derivater; nevnes kan også ekspresjonsvektorene i streptomyces, som for eksempel vektorene pIJ4123, pIJ6021, pPM927, pANT849, pANT 850, pANT 851, pANT1200, pANT1201 og pANT1202 og deres derivater (Kieser et al, 2000). Hva angår gjerdeceller, kan som illustrasjonen nevnes vektoren pESC som markedsføres av firma Stratagene (LaJolla, California, USA). Hva angår baculovirusekspresjonssystemet som tillater ekspresjon i innsektsceller, kan som illustrasjon nevnes vektoren BacPAK6 som markedsføres av firma BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, California, USA). Hva angår pattedyrceller kan som eksempel nevnes vektorene omfattende CMV (Cytomegalovirus) umiddelbar tidlig genpromoteren (for eksempel vektoren pCMV og dennes derivater, markedsført av firma Stratagene (LaJolla, California, USA)), eller den SV40 tidlige promoter av den vakuolerende simianvirus (for eksempel vektoren pSG5 som markedsføres av firma Stratagene (LaJolla, California, USA)). Et annet aspekt ved oppfinnelsen angår vertsceller hvori minst en rekombinant DNA, som beskrevet i dette avsnitt, er innført.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, der metoden omfatter de følgende trinn: a) transformering av en vertscelle med minst en ekspresjonsvektor som beskrevet i avsnittet ovenfor; ) dyrking, i et egnet kulturmedium, av vertscellen; b) gjenvinning av et kondisjonert kulturmedium eller en celleekstrakt; c) separering og rensing av polypeptidet fra kulturmediet eller også fra celleekstrakten oppnådd i trin c); d) eventuelt og hvis aktuelt, karakterisering av det fremstilte, rekombinante polypeptid.

Det således fremstilte, rekombinante polypeptid kan renses ved føring over en egnet serie kromatografikolonne i henhold til i og for seg kjente metoder, og som for eksempel beskrevet hosF. Ausubel et al., (2002). Som illustrasjon kan nevnes "Histidin-Tag"-teknikken, som består i å addere en kort polyhistidinsekvens til polypeptidet som fremstilles idet det er mulig at dette polypeptid renses på en nikkelkolonne. Dette polypeptid kan også fremstilles ved in v#rø-synteseteknikker. Som illustrasjon på slike teknikker kan polypeptidet fremstilles ved bruk av det "rapid translation system (RTS)", som særlig markedsføres av firma Roche Diagnostics France S.A., Meylan, Frankrike.

Det er beskrevet en mikroorganisme som produserer minst en spiramycin, og som overuttykker: -et gen som kan oppnås ved polymerasekjedereaksjon (PCR) ved bruk av paret av primere med følgende sekvens: 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID-nr. 138) og 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID-nr. 139), og som matrikskosmidet pSPM36 eller den totale DNA av streptomyces ambofaciens, mer spesielt er det genet av den kodende sekvens SEQ ID-nr. 141.

- eller et gen avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode.

Et eksempel på sekvens på et slikt gen er gitt i SEQ ID-nr. 111 (DNA); imidlertid er denne sekvens partiell fordi den ikke omfatter 3'-delen av en tilsvarende, kodende sekvens. Translasjonen av denne del av den kodende sekvens til proteinet gitt i SEQ ID-nr. 112. Fagmannen på området vil lett være i stand til å fullføre den, særlig ved bruk av læren som gitt i eksempel 24. Dette eksempel gir således en metode for kloning av ør/25c-genet og for å produsere en ekspresjonsvektor som tillater ekspresjon av orf28. Dette eksempel viser også at overekspresjonen av orf28c- genet i stammen OSC2, fører til en forbedring av spiramycinproduksjonen i denne stamme. Fortrinnsvis er mikroorganismen som overuttrykker

- et gen som kan oppnås ved polymerasekjedereaksjon (PCR) som ved bruk av paret av primere ved følgende sekvens: 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID-nr. 138) og 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID-nr. 139), og som matrikskosmid pSPM36 eller den totale DNA av streptomyces ambofaciens, mer spesielt gen av kodende sekvens SEQ ID-nr. 141,

- eller et gen avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode er en bakterie av genus streptomyces; og helst er den en bakterie av spesien streptomyces ambofaciens. Fortrinnsvis oppnås overekspresjonen av nevnte gen ved transformering av mikroorganismen med en ekspresjonsvektor, og aller helst er stammen av mikroorganismestammen OSC2/pSPM75(l) eller stammen av OSC2/pSPM5(2) deponert hos "the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (CNCM)

[National Collection of Cultures and Microorganisms] Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, 6. oktober 2003, under registreringsnummeret 1-3101.

Det er beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av spiramycin(er), ved bruk av mikroorganismene som beskrevet i avsnittet foran. Denne metode består i, i et egnet kulturmedium, å dyrke en mikroorganisme som definert i avsnittet foran, gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller celleekstrakt, og separering og rensing av det eller de fremstilte spiramyciner fra kulturmediet eller fra celleekstrakten, oppnådd i det foregående trinn. Betingelsene for dyrking av slike mikroorganismer kan bestemmes i henhold til i og for seg kjente teknikker. Kulturmediet kan for eksempel være MP5-mediet eller SLI 1-mediet for streptomyces, og særlig for streptomyces ambofaciens (Pernodet et al, 1993). Av litteratur kan det særlig henvises til en artikkel av Kieser et al., 2000, hva angår dyrking av streptomyces. Det eller de fremstilte spiramyciner kan gjenvinnes ved bruk av en hvilken som helst i og for seg kjent teknikk, og av litteratur henvises det for eksempel til teknikkene som beskrevet i US 3,000,785 og mer spesielt metodene for å ekstrahere spiramyciner beskrevet i dette patent. Fortrinnsvis er mikroorganismene som benyttes i en slik metode bakterier av genus streptomyces. Helst er mikroorganismene stammer av S. ambofaciens.

Videre en ekspresjonsvektor der polynukleotidet med sekvens SEQ ID-nr. 47, eller et polynukleotid som er avledet derfra ved degenerering av den genetiske kode, er plassert under kontroll av en promoter som tillater ekspresjon av proteinet som kodes av polynukleotidet i streptomyces ambofaciens. Eksempler på ekspresjonsvektorer som kan benyttes i streptomyces er gitt ovenfor. Fortrinnsvis er en slik ekspresjonsvektor plasmidet pSPM524 eller pSPM525.

Videre beskrives en stamme av streptomyces ambofaciens som er transformert med en vektor som definert i avsnittet ovenfor.

Det beskrives et polypeptid hvis sekvens omfatter SEQ ID-nr. 112. Oppfinnelsen angår også et polypeptid hvis sekvens tilsvarer sekvensen som er translatert fra den kodende sekvens: - av et gen som kan oppnås ved en polymerase kjedereaksjon (PCR) ved bruk av paret av primere med følgende sekvens: 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID-nr. 138) og 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID-nr. 139) og som matrikskosmidet pSPM36 eller den totale DNA av streptomyces ambofaciens, mer spesielt er det genet med den kodende sekvens SEQ ID-nr. 141, - eller av et gen avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode. Fortrinnsvis uttrykkes disse polypeptider i den naturlige tilstand av en bakterie av genus streptomyces, hvor mer preferensielt disse polypeptider er involvert i spiramycin biosyntese.

Videre beskrives en ekspresjonsvektor som tillater ekspresjon av et polypeptid som definert i avsnittet ovenfor i streptomyces ambofaciens. Eksempler på ekspresjonsvektorer som kan benyttes i streptomyces er gitt ovenfor. Fortrinnsvis er den angjeldende ekspresjonsvektor plasmidet pSPM75.

Figurliste

Figur 1: Kjemisk struktur for spiramycinene I, II og III.

Figur 2: Kosmider som benyttet for sekvensering av område.

Figur 3: Organisering av en gruppe av gener involvert i den biosyntetiske vei for spiramyciner.

Figur 4: Foreslått biosyntesevei for mykarose.

Figur 5: Foreslått biosyntesevei for mykaminose.

Figur 6: Foreslått biosyntesevei for forosamin

Figur 7: Preferensiell rekkefølge for addisjonen av sukkeret på spiramycinmolekylet og mellomprodukter. Figur 8: Foreslått biosyntesevei for metoksymalonyl i S. ambofaciens. Denne vei er foreslått i analogi til biosyntesen av meteoksymalonyl i streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (K. Wu et al., 2000).

Figur 9: Trinn som fører til inaktivering av et gen:

A) Kloning av målegenet inn i en vektor som replikerer E. coli, men ikke i streptomyces; B) Innføring av resistenskassetten i målgenet (ved kloning eller rekombinering mellom korte, identiske sekvenser); C) Innføring av plasmidet i streptomyces ambofaciens (ved transformering eller konjugering med E. coli) og seleksjon av klonene som har integrert kassetten og så screening av klonene som har mistet vektordelen for å ha en generstatning; D) Området av kromosomet av mutantstammen hvori målgenet er inaktivert, ved generstatning. Figur 10: Eventuelle trinn etter inaktivering av et gen i henhold til fremgangsmåten som beskrevet i figur 9, og som kan gjennomføres hvis en utkuttbar kassett er benyttet for å bryte målgenet; E) Innføring i den mutante stamme av plasmidet pOSV508 som bærer xis- og/«/-genene av pSAM2, hvis produkter vil tillate effektiv utkutting ved setespesifikk rekombinering mellom attL-og attR-sekvensene som omkranser kassetten; F) Produksjon av kloner som har mistet den utkuttbare kassett og som er sensitive til antibiotikummet til hvilken kassetten har gitt resistens; G) Etter dyrking og sporulering på fast medium uten antibiotikum, er plasmidet pOSV508 tapt ved høy frekvens. Det er således mulig å oppnå kloner som er sensitive til tiostrepton hvori målgenet inneholder en in-phase-delesjon. Sekvensen av det deleterte målgen kan kontrolleres ved PCR-amplifisering og sekvensering av PCR-produktet. Figur 11: Amplifisering av den utkuttbare kasetten med det formål å benytte den for et homologt rekombineringsforsøk. Denne teknikk med homolog rekombinering via korte homologe sekvenser er beskrevet av Chaveroche et al, 2000. De 39 eller 40 deoksynukleotider som er lokalisert ved 5'-enden av disse oligonukleotider omfatter en sekvens tilsvarende en sekvens av genet som skal inaktiveres, og de 20 deoksynukleotider som er lokalisert i den mest 3' del tilsvarer sekvensen av en av endene av den utskuttbare kassetten. Figur 12: Fremstilling av et konstrukt for inaktivering av et målgen ved bruk av teknikken som beskrevet av Chaveroche et al, 2000. Figur 13: Kart over plasmidet pWHM3. STrepto ori: streptomyces replikasj onsopprinnels e.

Figur 14: Kart over plasmid pOSV508.

Figur 15: Eksempel på strukturen for en utskuttbar kassett. Denne består av D- hyg-kassetten (Blondelet-Rouault et al, 1997), avgrenset av attR- og atfZ-setene (Raynal et al, 1998), mellom hvilke et rekombinasjonshendelset vil tillate utkutting av kassetten, via ekspresjon avxis- og /«/-genene.

Figur 16: Kart over plasmid pBXLl 111.

Figur 17: Kart over plasmid pBXLl 112.

Figur 18: Mikrobiologisk test på spiramycinproduksjon, basert på sensitiviteten for en stamme av Micrococcus luteus mot spiramycin. Stammen av Micrococcus luteus som ble benyttet, er en stamme som naturlig er sensitiv mot spiramycin, men resistent mot congocidin. De forskjellige stammer av streptomyces som testes ble dyrket i 500 ml Erlenmeyer-kolber inneholdende 70 ml MP5-medium, inokulert med en initialkonsentrasjon på 2.5 x IO6 sporer/ml og dyrket ved 27°C med orbitalristing med 250 omdreininger/min. Prøver på fermenteringsbuljonger ble telt ette 48, 72 og 96 timers dyrking og sentrifugert. En ti gangers fortynning av disse supernatanter i sterilt kulturmedium benyttes for testen. Micrococcus /wtews-indikatorstammen som er resistent mot congocidin, men sensitiv mot spiramycin (Goumelen et al, 1998) ble dyrket i den kvadratiske 12 x 12 cm skål. Skiver av Whatman AA-papir ble dynket med 70 1 (?) av ti ganger fortynningen av hver supernatant, og anbragt på overflaten av skålen. Skiver dynket med en oppløsning av spiramycin med forskjellige konsentrasjoner (2-4-8 g/ml i MP5 kulturmedium) ble fortynnet som et standardområde. Skålene ble inkubert ved 37°C i 24 til 48 timer. Hvis det foreligger spiramycin diffunderer denne inn i agaren og inhiberer veksten av Micrococcus luteus-indikatorstammen. Denne inhibering skaper en « halo » rundt skivene, denne halo reflekterer det området der Micrococcus /wtews-stammen ikke har vokst. Nærværet av en slik halo er derfor en indikasjon på nærværet av spiramycin, og gjør det mulig å bestemme hvorvidt den angjeldende stamme av S. ambofaciens er eller ikke er en spiramycinprodusent. Sammenligning med inhiberingsdiameterene som ble oppnådd for standardområdet gjør det mulig å oppnå indikasjon av den mengde spiramycin som fremstilles av denne stamme. Figur 19: HPLC-kromatogram for den filtrerte kulturmediumsupernatant for stamme OSC2. Figur 20: HPLC-kromatogram for den filtrerte kulturmediumsupernatant for stamme SPM501. Figur 21: HPLC-kromatogram for den filtrerte kulturmediumsupernatant for stamme SPM502. Figur 22: HPLC-kromatogram for den filtrerte kulturmediumsupernatant for stamme SPM507. Figur 23: HPLC-kromatogram for den filtrerte kulturmediumsupernatant for stamme SPM508. Figur 24: HPLC-kromatogram for den filtrerte kulturmediumsupernatant for stamme SPM509. Figur 25: Innretning av Orf3-proteinet (SEQ ID-nr. 29) med TylB-proteinet (SEQ ID-nr. 87) av S. fradiae, produsert ved bruk av FASTA-programmet. Figur 26: Innretning av MdmA-proteinet av S. mycarofaciens (SEQ ID-nr. 88) med SrmD-proteinet (SEQ ID-nr. 16) fremstilt ved bruk av FASTA-programmet. Figur 27: Eksempel på sekvens av de gjenværende seter etter utkuttingen av den utkuttbare kassetten. Fremhevet er minimum at 26-setet som definert hos Raynal et al, 1998. Sekvensen av fase 1 (atti) på 33 nukleotider er gitt i SEQ ID-nr. 104, sekvensen av fase 2 (att2) på 34 nukleotider er gitt i SEQ ID-nr. 105 og sekvensen av fase 3 (att3) på 35 nukleotider er gitt i SEQ ID-nr. 95. Figur 28: Diagram presentasjon av ør/70-genet, lokalisering av PCR-primerne som benyttes og konstruktet oppnådd med hvert par av primere.

Figur 29: Konstruksjon av kassetten pac- oritT.

Figur 30: Kart av kosmidet pWED2.

Figur 31: Diagrammatisk presentasjon av gruppen av gener involvert i den biosyntetiske vei for spiramyciner, og lokalisering av de tre prober som ble benyttet for å isolere kosmidene av det genomiske DNA-bibliotek av streptomyces ambofaciertsk-stammen OSC2 i E. coli (jamfør eksempel 19). Figur 32: Lokalisering av innskuddene av kosmidene isolert fra det genomiske DNA-bibliotek av streptomyces ambofacierts- stamm OCS2 i E. coli (jamfør eksempel 19). Nytt kosmid DNA-bibilitek. Figur 33: Subkloning av Pstl- Pstl- ftagmentet av kosmidet pSPM36 (innskudd av plasmid pSPM58), subkloning av SW-StøJ-fragmentet av kosmidet pSPM36 (innskudd av plasmid pSPM72) og subkloning av en EcoRI- StuI (innskudd av plasmid pSPM58 og i pSPM73). Figur 34: Lokalisering av de åpne leserammer identifisert i Pstl- Pstl- irmskudd av plasmidet pSPM58 og i EcoRI- StuI-innskuddet av plasmid pSPM73. Figur 35: Superposisjon av HPLC-kromatogrammene av den filtrerte kulturmediumsupernatant av stammen OS49.67 fremstilt ved 238 og 280 nm (topp) og UV-spektrum av molekylene eluert ved 33.4 minutter og 44.8 minutter (bunn).

Figur 36: Molekylstrukturen for platenolid B-molekylene.

Figur 37: Organisering av gruppen av gener involvert i biosynteseveien for spiramyciner. Figur 38: Molekylstruktur av biosynteseprodukter produsert av stammen SPM507. Figur 39: Struktur av et biosyntesemellomprodukt fremstilt av en stamme av S. ambofaciens med genotypen orf6* ::attinhyg+ oppnådd fra en stamme som overproduserer spiramyciner. Innføring av kassetten attlQhyg+ orf6<*>gir en polareffekt som forhindrer ekspresjon av orf5<*>. Figur 40: Molekylstruktur for platenolid A + mykarose- og platenolid B + mykarosemolekyler fremstilt av stammen OS49.67. Figur 41: Subkloning av et Pstl- Pstl-fragment av kosmidet pSPM36 (innskudd av plasmid (pSPM79)), lokalisering av de åpne leserammer identifisert i Pstl- Pstl-innskuddet av plasmidet pSPM79 og lokalisering av SEQ ID-nr. 140.

Foreliggende oppfinnelse skal illustreres ved bruk av de følgende eksempler som skal anses som ikke-begrensende illustrasjoner. Som en oppsummering blir gener av den biosyntetiske vei for spiramyciner, isolert fra et genomisk DNA-bibliotek av streptomyces ambofaciens. Dette bibliotek ble oppnådd ved partiell kutting av det genomiske DNA av streptomyces ambofaciens, med ÆawHI-restriksjonsenzymet. Store DNA-fragmenter på i gjenomsnitt 35 til 45 kb ble klonet inn i kosmidet pWEDl (Gouemelen et al, 1998) avledet fra kosmidet pWED15 (Wahl et al, 1987). Disse kosmider ble innført i E. coli ved bruk av fagpartikler. Det således oppnådde bibliotek ble hybridert med en probe (med sekvens SEQ ID-nr. 86) tilsvarende en del av tylB-genet av S. fradiae (Merson-Davies & Cundliffe, 1994, Genbank aksessnummer: U08223). Etter hybridering ble et kosmid av de 4 som hybriderte med proben, mer spesielt valgt. Dette kosmid kalt pOS49.1 ble så kuttet med Sacl og et 3.3 kb fragment inneholdende området som hybriderte med proben, ble subklonet inni vektoren pUC19 og sekvenser. Fire åpne leserammer ble identifisert, og et av disse koder et protein (SEQ ID-nr. 29) som viser sterk sekvens likhet med TylB-proteinet av S. fradiae (SEQ ID-nr. 87) (jamfør figur 25). Dette gen ble gitt betegnelsen orf3 (SEQ ID-nr. 28), og ble inaktivert i S. ambofaciens. Det var mulig å påvise at klonene hvori or/3-genet var inaktivert, ikke lenger produserte spiramycin. Dette viser innvolveringen av ør/3-genet, eller av gener lokalisert nedstrøms, i spiramycin biosyntesen.

Etter at denne bekreftelse var oppnådd, ble et større område av kosmidet pOS49.1 sekvensert, hver side av det Sac/-fragment som tidligere var studert. Således var det, fra kosmidet pOS49.1, mulig å oppnå sekvensen av et område omfattende syv hele åpne leserammer og to andre ufullstendige åpne leserammer, lokalisert på begge sider av disse syv hele åpne leserammer. Ved hjelp av et søk i databasen var det mulig å vise at en av de ufullstendige, åpne leserammer tilsvarer srmG-locusen (et område som koder et enzym kalt "polyketidsyntase" (PKS)). De tilsvarende gener ble subklonet av S. Burgett et al. i 1996 (US patent 5,945,320). Videre ble de andre åpne leserammer, de syv hele ORF'er kalt: orfl, orf2, or/ 3, orf4, orf5, orf6 og orf7 (SEQ ID-nr. 23,25,28, 30, 34, 36,40) og starten av den åttende ORF kalt orfSk (sekvens SEQ ID-nr. 43) ble ikke funnet i databasen.

Deretter, og med henblikk på å klone andre gener involvert i spiramycinbiosyntesen ble andre kosmider omfattende fragmenter av S. ambofaciens- genomet i det samme området, isolert. For dette formål ble en ytterligere serie hybrideringer på kolonier gjennomført ved bruk av tre prober. En første probe tilsvarer en 3.7 kb DNA-fragment inneholdende orfl, orfl og starten av orf3, subklonet fra pOS49.1. Den andre probe tilsvarer et 2 kb DNA-fragment som inneholder en del av orf7 og en del av orf8, subklonet fra pOS49.1. Det ble også benyttet en tredje probe. Denne sistnevnte probe tilsvarer et 1.8 kb DNA-fragment inneholdende srmD- gen. SrmD- genet er et gen som er isolert fra S. ambofaciens i stand til å gi spiramycinresistens. Spesifikt hadde tidligere studier muliggjort kloning av flere resistensdeterminanter av S. ambofaciens, som gir spiramycinresistens til en stamme av S. griseofuscus (spiramycin-sensitiv stamme)

(Pernodet et al, 1993) (Pernodet et al, 1999). For å isolere resistensgenet, var et kosmidbibliotek av den genomiske DNA av stammen S. ambofaciens produsert i kosmidet pKC505 (Richardson MA et al, 1987). Denne pool av kosmider var innført i S. griseofuscus, som naturlig er sensitiv mot spiramycin. Fem kosmider i stand til å gi apramycinresistens og spiramycinresistens i S. griseoruscusk ver derved oppnådd. Blant disse 5 kosmider inneholder et kosmid kaltpOS44.1, i sitt innskudd, srmD- gemt som koder et protein som viser en viss likhet med proteinet som kodes av mdmA- genet av

Streptomyces mycarofacierts og er involvert i midecamycinresistens i denne produsentorganisme (Hara et al, 1990, Genbank aksessnummer: A60725) (figur 26). Den tredje probe som ble benyttet for å lokalisere spiramycin biosyntesegenene, var et innskudd på rundt 1.8 kb omfattende srmZ)-genet.

Disse tre prober ble benyttet for å hybridisere det genomiske DNA-bibliotek som beskrevet ovenfor, og gjorde det mulig å velge to kosmider (pSPM7 og pSPM5)som var tilbøyelige til å inneholde de lengste innskudd og ikke hadde noen felles bånd. Kosmidet pSMP5 hybridiserte med den første og den andre probe, men hybridiserte ikke med den tredje probe, mens kosmidet pSPM7 hybridiserte kun med den tredje probe. Disse to kosmider ble fullstendig sekvensert ved bruk av "shotgun-sekvensering"-teknikken. Sekvensene av innskuddene av disse to kosmider: pSPM7 og pSPM5, kunne settes sammen for, selv om de ikke overlappet, omfattet hvert av innskuddene en kjent sekvens med en av sine ender. Spesielt omfattet hvert av disse innskudd et fragment av sekvensen av ett av genene som koder et enzym kalt "polyketidsyntase" (PKS). Disse 5 gener ble klonet av S. Burgett et al i 1996 (US patent 5,945,320) (jamfør figur 2). Således var det mulig å bestemme en enkelt S. ambofaciens genomisk DNA-sekvens. En sekvens på 30 943 nukleotider som starter, i 5'-posisjonen, fra et ÆcøRI-sete lokalisert i det første PKS-gen, og går opp til et BamHl-sete i 3'-posisjon, er gitt i SEQ ID-nr. 1. Denne sekvens tilsvarer området oppstrøms PKS-genene (jamfør figurene 2 og 3). Et andre område på 11 171 nukleotider som starter fra et Pstl- sete i 5'-posisjon og går opp til BstEII- sete i 3'-posisjon, lokalisert i det femte PKS-gen, er gitt i SEQ ID-nr. 2. Dette området er området nedstrøms PKS-genene (nestrøms og oppstrøms definert ved orientering av 5 PKS-genene eller orientert i samme retning) (jamfør figurene 2 og 3).

Deretter, og med henblikk på å klone andre gener involvert i spiramycin biosyntesen, ble andre kosmider omfattende fragmentene av S. ambofaciens genomet i det samme området, isolert (jamfør eksemplene 18 og 19).

Eksempel 1: Konstruksjon av et genomisk DNA-bibliotek av streptomyces ambofaciens- stamme ATCC23877 i E. coli 1. 1. Ekstrahering av den genomiske DNA av streptomyces ambofaciens - stamme ATCC23877.

Streptomyces ambofaciens- stamme ATCC23877 (tilgjengelig særlig fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginia, USA), under nummer 23877) ble dyrket i YEME (Yeast Extract-Malt Extract) (Kieser, T. et al., 2000) og den genomiske DNA av denne stamme ble ekstrahert og renset i henhold til standardteknikker for lysering og presipitering (Kieser, T. et al., 2000).

1. 2. Konstruksjon av det genomiske DNA- bibliotek

Den genomiske DNA av streptomyces ambofaciens stammer ATCC23877 som isolert ovenfor ble partielt digestert medÆawHl-restirksjonsenzymet for å oppnå DNA-fragmenter med en størrelse mellom rundt 35 og 45 kb. Disse fragmenter ble klonet inn i kosmidet pWEDl (Gourmelen et al., 1998) som på forhånd var digestert med BamHl. Kosmidet pWEDl avledes fra kosmidet pWE15 (Wahl, et al., 1987) ved delesjon av 4.1 kb Hpal- Hpal- fragment inneholdende ekspresjonsmodulen som er aktiv i pattedyr (Gourmelen et al., 1998). Ligeringsblandingen ble så enkapsidert in vitro i X-fagpartikler ved bruk av det "Packagent® Lambda DNA packaging system" som markedsføres av firma Promega, i henhold til produsentens anbefalinger. Fagpartiklene som ble oppnådd ble benyttet for å infisere SURE®-stammen av E. coli som markedsføres av firma Stratagene (LaJolla, California, USA). Klonene ble selektert på LB-medium + ampicilling (50fig/ml) fordi kosmidet pWEDl gir ampicillinresistens.

Eksempel 2: Isolering og karakterisering av gener involvert i spiramycin biosyntese i streptomyces ambofaciens

2 . 1 Kolonihvbridering av E . co//- klonene fra det genomiske bibliotek av streptomyces ambofaciens ATCC23877

Ca 2 000 E. co/z-kloner fra biblioteket oppnådd ovenfor ble overført på et filter for kolonihybridisering. Proben som ble benyttet for hybrideringen er et Nael- Nael DNA-fragment (SEQ ID-nr. 86) omfattende en del av tylB- genet av streptomyces fradiae. Dette fragmentet tilsvarerer nukleotidene 2663 til 3702 av det DNA-fragment som er beskrevet av L.A. Merson-Davies & E. Cundiffe (L.A. Merson-Davies & E. Cundliffe, 1984, Genbank aksessnummer: U08223), hvori den kodende sekvens av tylB- genet tilsvarer nukleotidene 2677 til 3843.

Til Nael- Nael DNA-fragmentet som bærer en del av tylB- genet av streptomyces fradiae (SEQ ID-nr. 86) ble merket med<32>P ved bruk av den vilkårlige primingteknikk (sett markedsført av firma Roche) og benyttet som en probe for å hybridisere de 2 000 kloner av biblioteket, overført på et filter. Membranene som ble benyttet er Hybond N nylonmembraner markedsført av firma Amersham (Amersham Bioscinces, Orsay, Frankrike), og hybrideringen ble gjennomført ved 55°C i den buffer som er beskrevet av Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). En vasking ble gjennomført i 2 X SSC ved 55°C i et tidsrom på 15 minutter, og to ytterligere vaskinger i 0.5X SSC ble så gjennomført ved 55°C, hver i et tidsrom på 15 minutter. Under disse hybriderings- og vaskebetingelser viste 4 kloner av de 2 000 hybriderte, et sterkt hybrideringssignal. Disse 4 kloner ble dyrket i LB-medium + ampicillin (50 ug/ml) og de tilsvarende 4 kosmider ble ekstrahert ved standardalkalisk lysering (Sambrook, et al., 1989). Det ble så verifisert at hybrideringen virkelig skyldtes et DNA-fragment som var tilstede i innskuddet i disse fire kosmider. For dette formål ble kosmidene digestert uavhengig med forskjellige enzymer ( BamHl, Ps ti og Sacl). Digesteringsproduktene ble separert på agarosegel, overført til nylonmembran og hybridert med Nael- Nael DNA-fragmentet omfattende en del av tylB- genet av streptomyces fradiae (jamfør ovenfor) under de samme betingelser som ovenfor. Det var mulig å validere de fire kosmider, og et av disse kosmider ble mer spesielt valgt og gitt betegnelsen pOS49.1.

2. 2. Verifisering av involveringen av det identifiserte område, og sekvensering av innskuddet av kosmidet pOS49. 1

Flere fragmenter av innskuddet av kosmidet pOS49.1 ble subklonet, og deres sekvenser bestemt. Kosmidet pOS49.1 ble digestert med Sacl-enzymet og det ble vist, ved Southern blotting, under betingelsene som beskrevet ovenfor, at et 3.3 kb-fragment inneholder området som hybridiserer med tylB- proben. Dette 3.3 kb-fragment ble isolert ved elektroeluering fra en 0.8% agarosegel, og så klonet inn i vektoren pUC19 (Genbank aksessnummer: M77789) og sekvensert. Det således oppnådde plasmidet ble gitt betegnelsen pOS49.11. Fire åpne leserammer som viser en kodonbruk tilsvarende streptomyces kunne identifiseres i dette fragment (to fullstendige og to trunkerte, åpne leserammer), ved bruk av FramePlot-programmet (J. Ishikawa & K. Hotta, 1999). Sekvenssammenligninger ved bruk av FASTA-programmet (jamfør (W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988) og (W.R. Pearson, 1990), tilgjengelig særlig fra INFOBIOGEN resurssenter, Evry, Frankrike) gjorde det mulig å vise at proteinet som var dedusert fra en av disse fire åpne leserammer viser sterk sekvenslikhet med TylB-proteinet (SEQ ID-nr. 87; Genbank aksessnummer: U08223) av S. fradiae (jamfør figur 25). Dette protein ble gitt betegnelsen Orfi (SEQ ID-nr. 29).

For å teste hvorvidt det tilsvarende gen (ør/3-genet (SEQ ID-nr. 28)) var involvert i spiramycinbiosyntesen i S. ambofaciens, ble dette gen interruptert med en jQ^yg-kassett (M-H. Blondelet-Rouault et al, 1998, Genbank aksessnummer: X99315). For dette formål ble plasmidet pOS49.11 digestert med Xfol-enzymet, og fragmentet inneholdende de fire åpne leserammer (to fullstendige og to trunkerte, inkludert or/ 3 i sin helhet) ble subklonet inn i ^Trøl-setet av vektoren pBC SK+ markedsført av firma Stratagene (LaJolla, California, USA). Det således oppnådde plasmid ble betegnet som pOS49.12. For å inaktivere orf3 ble et Pmll- BsteEll- fragment inne i orf3 erstattet med i2feyg-kassetten ved stumpendet kloning inn i det sistnevnte plasmid. For dette formål ble plasmidet pOS49.12 digestert med Pm/I- og ifa/ÆTI-enzymene hvis unike sete er i den kodende sekvens av or/3-genet. Endene av fragmentet tilsvarende vektoren ble gjort bluntendet ved behandling med Klenow-enzymet (DNA-polymerase I stort fragment). i2feyg-kassetten ble oppnådd ved digestering med ÆamM-enzymet av plasmidet pHP45 Cfoyg (Blonelet-Rouault et al, 1997, Genbank aksessnummer: X99315). Fragmentet tilsvarende jQfttyg-kassetten ble gjenvunnet på agarosegel, og endene gjort bluntendet ved behandling med Klenow-enzymet. De to således oppnådde, stumpendede fragmenter (i2feyg-kassetten og plasmidet pOS49.12) ble ligert og ligeringsproduktet benyttet for å transfomere E. co/z-bakterier. Det således oppnådde plasmid ble gitt betegnelsen pOS49.14 og inneholder or/3-genet, brudt med i2feyg-kassetten.

Innskuddet av plasmid pOS49.14, i form av et ^Trøl-^Tørl-fragment, hvis ender var gjort ikke-klebrige ved behandling med Klenow-enzymet, ble klonet inn i ÆcøRV-setet av plasmidet pOJ260 (plasmid pOJ260 er et konjugativt plasmid i stand til replikering av E. coli, men ikke i stand til replikering i S. ambofaciens (M. Bierman et al, 1992). Dette plasmid gir apramycinresistens i E. coli og streptomyces. Det oppnådde plasmid (innskudd av plasmid pOS49.14 klonet inn i plasmidet pOJ260) ble gitt betegnelsen pOS49.16. Den sistnevnte ble overført inn i S. ambofaciens- stammen ATCC23877 ved konjugering ved bruk av den konjugerte E. co/z-stamme Sl7-1, som beskrevet av Mazodier et al (Mazodier et al, 1989). E- coli-stammen S17-1 er avledet fra E. coli-stamme 294 (Simon et al, 1983) (Simon et al, 1986). Det var mulig å oppnå transkonjugerte kloner som hadde hygromycinresistensmarkøren båret av fihyg-kassetten, og som hadde mistet apramycinresistensmarkøren båret av vektoren pOJ260. For dette formål ble klonene etter konjugering valgt med henblikk på hygromycinresistensen. De hygromycinresistente kloner ble så subdyrket henholdsvis på medium med hygromycin (antibiotikum B), og på medium med apramycin (antibiotikum A) (jamfør figur 9). Klonene som var resistente mot hygromycin (HygR) og sensitive for apramycin (ApraS) er i prinsippet de hvori det er skjedd et dobbelt rekombineringshendelse og som derfor har or/ 3-genet avbrutt av i2feyg-kassetten. Erstatning av villtypekopien av or/ 3 ved den brudte kopi ble verifisert ved to suksessive hybrideringer. Således ble total DNA for de oppnådde kloner digestert ved hjelp av forskjellige enzymer, separert på agarosegel, overført på en membran og hybridert med en probe tilsvarende i2feyg-kassetten (jamfør ovenfor) for å verifisere nærværet av kassetten i den genomiske DNA for de oppnådde kloner. En andre hybridering ble gjennomført ved som probe å benytte Xhol- Xhol av plasmidet pOS49.11 inneholdende de fire åpne leserammer (to fullstendige og to trunkerte, inkludert or/ 3 i sin helhet). Verifiseringen av genotypen kan også gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet. En av de således oppnådde or/ 3:: i2feyg-kloner, og hvis genotype var verifisert, ble valgt å gitt betegnelsen OS49.16.

Spiramycinproduksjonen for den således oppnådde OS49.16-klon ble testet ved bruk av produksjonstesten som beskrevet nedenfor (jamfør eksempel 15). Det var således mulig å vise at denne stamme ikke lenger produserer spiramycin, noe som bekrefter involvering av or/ 3 og/eller genene lokalisert nedstrøms som for eksempel orf4, i spiramycin biosyntesen.

Etter at denne bekreftelsen var oppnådd, ble et større område av kosmidet pOS49.1 sekvensert på begge sider av det tidligere studerte Sacl-fragment. Således var det, fra plasmidet pOS49.1, mulig å oppnå sekvensen for et område omfattende syv hele åpne leserammer og to andre ufullstendige åpne leserammer, lokalisert på begge sider av disse syv åpne leserammer. Ved hjelp av leting i databaser var det mulig å vise at en av de ufullstendige, åpne leserammer tilsvarer srmG-locusen (et område som koder et enzym kalt "polyketidsyntase" (PKS)). De tilsvarende gener ble klonet av S. Burgett et al. i 1996 (US-patent 5,945,320). Videre ble de andre åpne leserammer: de syv hele ORF'er kalt: orfl, orfl, orf3, orf4, orf5, orf6 og or/ 7 (SEQ ID-nr. 23,25, 28, 30, 34, 36 og 40) og starten av den åttende ORF kalt orf$ (hele sekvensen av denne orf er gitt i SEQ ID-nr. 43), ble ikke funnet i databasene.

Eksempel 3: Isolering og karakterisering av andre gener involvert i spiramycin biosyntese i streptomyces ambofaciens.

For det andre og med henblikk på kloning av andre gener involvert i spiramycin biosyntesen, ble andre kosmider omfattende fragmenter av S. ambofaciens- genomet i det samme området, isolert. For dette formål ble en ytterligere serie kolonihybrideringer gjennomført ved bruk av tre prober: - Den første probe som ble benyttet tilsvarerer 3.7 kb BamHI- Pstl DNA-fragment inneholdende et fragment av PKS-genet (genene tilsvarende PKS ble klonet av S. Burgett et al. i 1996 (US patent. 5,945,320)), orfl, orfl og starten av orfS, subklonet fra pOS49.1 og som strekker seg fra et ÆamHI-sete lokalisert 1 300 basepar oppstrøms ÆcøRI-sete som definerer posisjon i SEQ ID-nr. 1 opp til Pst\- sete lokalisert ved 2472 (SEQ ID-nr. 1). Dette BamHI- Pstl-fragment ble subklonet, fra pOS49.1, inn i plasmidet pBCSK+, som gjorde det mulig å oppnå plasmidet pOS49.28. - Den andre probe som ble benyttet tilsvarerer et Pstl- BamHl DNA-fragment på rundt 2 kb inneholdende et fragment av orf7 og or/ 8, subklonet fra pOS49.1 og som løper fra et Pstl- sete lokalisert ved posisjon 6693 av SEQ ID-nr. 1 opptil 2?amHI-sete lokalisert ved posisjon 8714 i SEQ-ID-nr. 1. Dette Pstl-Æam.HI-fragment ble subklonet, frapOS49.1, inn i plasmidet pBC SK+, som gjorde det mulig å oppnå plasmidet pOS49.76. - Det ble også benyttet en tredje probe. Denne tilsvarerer et 1.8 kb EcoRl- Hindlll DNA-fragment inneholdende srmD- genet. SrmD- genet er et gen isolert fra S. ambofaciertsk i stand til å gi spiramycinresistens. Spesifikt har tidligere studier muliggjort kloning av flere resistensdeterminanter av S. ambofaciens, som gir spiramycinresistens til en stamme av S. griseofuscus (spiramycin-sensitiv stamme) (Pernodet et al., 1993)

(Pernodet et al., 1999). For å isolere resistente gener var det fremstilt et kosmidbibliotek av den genomiske DNA av S. ambofaciens- stamme ATCC23877 i kosmidet pKC505 (M.A. Richardson et al., 1987). For dette formål var den genomiske DNA av S. ambofaciens- stamme ATCC23877 partielt digestert ved Sau3Al for å oppnå fragmenter med en størrelse mellom rundt 30 og 40 kb. Den således digesterte genomiske DNA (3fig) var ligert med 1 ug pKC505 digestert på forhånd med ÆamHI-enzymet (Pernodet et al, 1999). Ligeringsblandingen var så enkapsidert in vitro i fagpartikler. De oppnådde fagpartikler var benyttet for å infisere E. coli- stamme HB 101 (tilgjengelig særlig fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginia, USA), under

nummeret 33694). Ca 20 000 apramycinresistente E. co/z-kloner ble slått sammen, og kosmidene av disse kloner ble ekstrahert. Denne pool av kosmider ble innført ved protoplasttransformasjon i S. griseofuscus- st& mmen DSM 10191 (K.L. Cox & R.H. Baltz, 1984), naturlig sensitiv mot spiramycin (R.N. Rao et ai, 1987, denne stamme er særlig tilgjengelig fra German Collection og Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschweig, Tyksland), under nummeret DSM 10191). Transformantene ble valgt på et medium inneholdende apramycin. 1 300 av klonene som vokser på mediet inneholdende apramycin ble transformert på medium inneholdende 5fig/ml spiramycin. Flere apramycinresistente kloner var også dyrket på medium inneholdende spiramycin og kosmidene av disse kolonier var ekstrahert og benyttet for å transformere E. coli og S. griseofuscus (Pernodet et ai, 1999). Fem kosmider i stand til å gi apramycinresistens til E. coli og ko-resistens til apramycin og spiramycin, i S. griseofuscus ble oppnådd på denne måte. Blant disse 5 kosmider ble det bestemt at et kosmid kalt pOS44.1 i sitt innskudd inneholdt et gen (SEQ ID-nr. 15) som koder et protein (SEQ ID-nr. 16) som viser en viss likhet med et protein kodet av mdmA- genet av streptomyces mycarofaciens (SEQ ID-nr. 88); dette gen ble gitt betegnelsen srmD (jamfør innretning vist i figur 26, gjennomført ved bruk av FASTA-programmet (jamfør. (W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988) og (W.R. Pearson, 1990), særlig tilgjengelig fra INFOBIOGEN resurssenter, Evry, Frankrike)).

For å isolere resistensdeterminanten inneholdt i plasmidet pOS44.1, ble det sistnevnte partielt digestert med Sawi^I-restriksjonsenzymet for å oppnå fragmenter med en størrelse på rundt 1.5 til 3 kb, og disse fragmenter ble ligert inn i vektoren pIJ486 som var linearisert med ÆamHI-enzymet (Ward et ai, 1986). Et plasmid ble valgt med henblikk på sin evne til å gi spiramycinresistens i S. griseofuscus- stammen DSM 10191 (R.N. Rao et ai, 1987), naturlig sensitiv mot spiramycin (jamfør ovenfor). For dette formål ble poolen av plasmider tilsvarende Sau3Al-fragmentet av pOS44.1 ligert inn i vektoren pIJ486 (jamfør ovenfor) innført ved protoplast transformasjon inn i stammen DSM 10191, og transformantene selektert med henblikk på tiostreptonresistensen (på grunn av tør-genet båret av pIJ486). Klonene som vokste på medium inneholdende tiostrepton ble overført på mediuminneholdende spiramycin. Flere tiostreptonresistente kloner vokste også på medium inneholdende spiramycin, og plasmidene av disse koloninene ble ekstrahert. Et plasmid som gir resistent, og inneholder et rundt 1.8 kb innskudd, ble valgt og betegnet som pOS44.2. Dette 1.8 kb-innskudd kan lett kuttes ut ved hjelp av et Hindlll- sete og et ÆcøRI-sete som er tilstede i vektoren på hver side av innskuddet. Dette 1.8 kb //w<iIII-iscøRI-innskudd ble sekvensert og resistensgenet det inneholdt ble gitt betegnelsen srmD. Dette fragment inneholdende srmD- genet kunne så lett subklones inn i vektoren pUC19 (Genbank aksessnummer: M77789) åpnet med EcoRl- HindUl, og det oppnådde plasmid ble kalt pOS44.4. 1.8 kb Hindlll- EcoRl-innskuddet inneholdende srm.D-genet av dette plasmid ble benyttet som en probe for å lokalisere spiramycin biosyntesegenet (jamfør nedenfor).

En prøve på en Escherichia Coli DH5oc-stamme inneholdende plasmidet pOS44.4 ble deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures and Microorganisms] (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. juli 2002, under registreringsnummeret 1-2918.

Ca 2 000 kloner av biblioteket, oppnådd ovenfor (jamfør eksempel 1), ble overført på et filter for kolonihybridering i henhold til konvensjonelle teknikker (Sambrook, et al, 1989).

De tre prober som beskrevet ovenfor ble merket med<32>P ved bruk av den vilkårlige primingteknikk (sett markedsført av Roche), og benyttet for å hybridisere de 2 000 kloner i biblioteket, overført på filteret. Hybridering ble gjennomført ved 65°C i den buffer som er beskrevet av Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). En vasking ble gjennomført ved 2X SSC ved 65°C i 15 minutter og to suksessive vaskinger ble så gjennomført i 0.5X SSC ved 65°C, begge i et tidsrom på 15 minutter. Under disse hybriderings- og vaskebetingelser, viste 16 kloner av de hybriderte 2 000 et sterkt hybrideringssignal med minst en av probene. Imidlertid hybriderte intet kosmid med det tre prober. De 16 kosmider ble ekstrahert og digestert med ÆawHI-restriksjonsenzymet. Sammenligning med restriksjonsprofilene for disse forskjellige kosmider førte til at to kosmider ble valgt som var tilbøyelig til å inneholde de lengste innskudd av området og som ikke hadde noen felles bånd. Således ble det valgt to kosmider, et kalt pSPM5 og den andre pSPM7. Kosmidet pSPM5 hybridert med probene orfl til orffk, og proben orfB, men hybriderte ikke med progen srmD. pSPM7 hybriderte kun med proben srmD og ikke med de andre prober.

Disse to kosmider ble sekvensert fullstendig ved bruk av "shot gun" sekvensering. Sekvensen av innskuddene av disse to kosmider: pSPM7 og pSPM5, kunne settes sammen fordi, selv om de ikke overlappet, omfattet hvert av innskuddene en kjent sekvens ved en av sine ender. Spesifikt omfattet hvert av disse innskudd et fragment av sekvensen av et av genene som koder et enzym kalt "polyketidsyntase" (PKS). Disse fem gener var klonet av S. Burgett et al. i 1996 (US patent 5,945,320) (jamfør 2). Således var det mulig å bestemme en enkelt S. ambofaciens genomisk DNA-sekvens. En sekvens på 30 943 nukleotider som starter, i 5'-posisjonen, fra et ÆcøRI-sete lokalisert i det første PKS-gen, og går opp til et BamHl- sete i 3'-posisjon, er gitt i SEQ ID-nr. 1. Denne sekvens tilsvarer området oppstrøms PKS-genene (jamfør figurene 2 og 3). Et andre område på 11 171 nukleotider som starter fra et Pstl- sete i 5'-posisjon og går opp til TVcoI-sete i 3'-posisjon, lokalisert i det femte PKS-gen, er gitt i SEQ ID-nr. 2. Dette området er området nedstrøms PKS-genene (nedstrøms og oppstrøms definert ved orientering av 5 PKS-genene som alle er orientert i samme retning) (jamfør figurene 2 og 3).

Eksempel 4: Analyse av nukleotidsekvensene, bestemmelse av de åpne leserammer og karakterisering av genene involvert i spiramycin biosyntese.

Sekvensene som ble oppnådd ble analysert ved bruk av FramePlot-programmet (J. Ishikawa & K. Hotta, 1999). Dette gjør det mulig, blant de åpne leserammer, å identifisere de åpne leserammer som viser en kodonbruk typisk for streptomyces. Denne analyse gjorde det mulig å bestemme at dette området omfatter 35 ORF'er lokalisert på begge sider av de fem gener som koder enzymet "polyketidsyntase" (PKS). 10 og 25 ORF'er ble identifisert henholdsvis nedstrøms og oppstrøms for disse gener (nedstrøms og oppstrøms er definert ved orienteringen av de 5 PKS-gener som alle er orientert i samme retning (jamfør figur 3). Således ble de 25 åpne leserammer av denne type, og som opptar et område på ca 31 kb (SEQ ID-nr. 1 og figur 3), identifisert oppstrøms de 5 PKS-gener og 10 opptok et område på ca 11.1 kb (SEQ ID-nr. 2 og figur 3) ble identifisert nedstrøms PKS-genene. Genene i oppstrømsområdet ble gitt betegnelsene orfl, orfl, or/ 3, orf4, orfl, orf6, orfl, orf8, orf9c, orflO, orfllc, orfl2, orfl3c, orfl4, orfl5c, orfl 6, orf 17, orfl8, orfl9, orflO, orfllc, orf22c, orf23c, orf24c ogorf25c (SEQ ID-nr. 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45,47,49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 og 84). Genene i nedstrømsområdet ble betegnet som orfl * c, orfl* c, orf3* c, orff* c, orfl<*>orf6* orfl* c, orf8* orf9<*>og orf 10* (SEQ ID-nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 og 21). Bokstaven "c" som ble føyet til navnet av genene betyr, for den angjeldende ORF, at den kodende sekvens er i reversorientering (den kodende tråd er derfor tråden som er komplementær til sekvensene gitt i SEQ ID-nr. 1 eller SEQ ID-nr.

2 for disse gener) (jamfør figur 3).

Proteinsekvensene som er dedusert fra disse åpne leserammer ble sammenlignet med de som er tilstede i forskjellige databaser ved bruk av forskjellige programmer: BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD-søk, COGs (Cluster of Orthologous Groups) (disse tre programmer er tilgjengelig særlig fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988) og (W.R. Pearson, 1990), BEAUTY (K.C. Worley et al, 1995)), (disse to programmer er tilgjengelige særlig fra INFOBIOGEN resurssenter, Evry, Frankrike). Disse sammenligninger gjør det mulig å formulere hypoteser hva angår funksjonen av produktene av disse gener, og identifisere de som kan være involvert i spiramycin biosyntesen.

Eksempel 5: Geninaktivering: prinsippet for konstruering av en knocked-out-stamme av streptomyces ambofaciens.

De benyttede metoder bestod i å gjennomføre en generstatning. Målgenet som skal avbrytes erstattes med en kopi av dette gen, avbrudt med en kassett som gir resistens mot et antibiotikum (for eksempel apramycin eller hygromycin), som vist i figur 9. Kassetten som benyttes kantes på begge sider av translasjonstermineringskodonet i alle leserammene, og av transkripsjonsterminatorer som er aktiv i streptomyces.

Innføringen av kassetten i målgenet kan eventuelt ledsages av en delesjon av dette målgen. Størrelsen for områdene som flankerer kassetten kan ligge fra noen hundre til flere tusen basepar.

Konstruktene som er nødvendige for inaktivering av genet med kassetten ble oppnådd i E. coli, referanseorganismen for å oppnå rekombinante DNA-konstrukter. Det interupterte gen ble oppnådd i et plasmid som replikerer i E. coli, men som ikke kan replikere i streptomyces.

Konstruktene ble så subklonet inn i vektorer for å tillate transformasjon og inaktivering av det ønskede gen i S. ambofaciens. For dette formål ble det benyttet to plasmider: - pOJ260 (M. Bierman et al, 1992) (jamfør eksempel 2) som gir apramycinresistens i E. coli og streptomyces og som ble benyttet når målgenet var interuptert med en kassett som gir hygromycinresistens. -pOSK1205 (4726 bp). Dette plasmid stammer fra plasmid pBK-CMV (markedsført av firma Stratagene (LaJolla, California, USA)) hvori et ^vrll-fragment inneholdende sekvensen som koder Neomycin/Kanamycin-resistens var erstattet med en sekvens som koder hygromycinresistens, mens samtidig P SV40-promoteren ble bevart. For dette ble plasmidet pHP45-Q«yg (Blondelet-Rouault et al, 1997) digestert med Noti- og Pflml-enzymer, og fragmentet som gir hygromycinresistens ble subklonet inn i ^vrll-setet av vektoren pBK-CMV etter at alle ender var gjort stumpendet ved behandling med Klenow-enzymet. I pOSK1205, foregås kassetten som gir hygromycinresistens av pSV40-promoteren. Dette plasmid gir hygromycinresistens i E. coli og streptomyces, og ble benyttet når målgenet var brudt med en kassett som gir apramycinresistens.

Kassettene ble innført i målgenet enten ved kloning ved bruk av restriksjonsseter som er tilstede i målgenet, eller ved rekombinering mellom korte, identiske sekvenser som beskrevet for eksempel av Chaveroche et al, (M.K. Chaveroche et al, 2000).

Plasmidet som bærer genet som er brudt av kassetten kan så innføres i streptomyces ambofaciens, for eksempel ved konjugering mellom E. coli og streptomyces (P. Mazodier et al, 1989). Denne teknikk ble benyttet når basisvektoren er vektoren pOJ260. En andre teknikk kan benyttes: tenikken med protoplasttransformering etter denaturering av DNA ved alkalibehandling (T. Kieser et al, 2000), for å øke frekvensen av rekombinering som beskrevet for eksempel av Oh & Chater (Oh & Chater, 1997). Denne teknikk ble benyttet når basisvektoren er pOJ260 eller pOSK1205 (jamfør nedenfor). Transformantene ble så valgt med antibiotikum tilsvarende kassetten som er tilstede i målgenet (jamfør figur 9, antibiotikum B). En blanding av kloner, blant hvilke det har vært en integrering ved et enkelt eller to rekombineringshendelse, velges deretter. Deretter søkes klonene som er sensitive mot antibiotikum for hvilke resistensgenet er tilstede i vektoren (utenfor rekombineringskassetten) (jamfør figur 9, antibiotikum A) ut. Det er således mulig å velge klonene for hvilke det i prinsippet har vært to rekombineringshendelser som resulterer i erstatningen av villtypegenet med kopien brudt av kassetten. Disse trinn er vist diagrammatisk i figur 9.

Flere kassetter kan benyttes for å interruptere målgenene. Q/ryg-kassetten som gir hygromycinresistens (Blondelet-Rouault et al, 1997, Genbank aksessnummer: X99315) kan for eksempel benyttes.

Eksempel 6: Konstruksjon av en stamme av streptomyces ambofaciens med en in-phase knockout i ør/3-genet.

Ør/3-genet var brudt med Q/ryg-kassetten (jamfør eksempel 2.2), og det var mulig å påvise at en or/3:: QAyg-stamme ikke lenger produserer spiramycin, noe som bekrefter involveringen av et eller flere gener av det klonede område i spiramycinbiosyntesen (jamfør eksempel 2.2). I lys av sin orientering er kotranskripsjon av ORF'ene 1 til 7 mulig (jamfør figur 3), og den observerte fenotype (ikke-produserer av spiramyciner) kan skyldes inaktiveringen av et eller flere av genene som er kotranskribert med orfl. For å bekrefte involveringen av orfl i spiramycinbiosyntese, ble en ytterligere inaktivering av or/3-genet gjennomført idet den siste inaktivering ble gjennomført i fase. For dette ble et Z>raIII-fragment inne i orfl på 504 basepar, deletert. Et DNA-fragment oppnådd fra pOS49.1, og som forløp fra ÆcøRI-setet lokalisert ved posisjon 1 (SEQ ID-nr. 1) opptil Sacl-setet lokalisert ved posisjon 5274 (SEQ ID-nr. 1), og som omfatter en delesjon mellom de to Dralll-seter ved posisjonene 2563 og 3067 (504 nukleotider var fjernet), ble klonet inn i plasmidet pOJ260 (M. Bierman et al., 1992). Det således oppnådde plasmid ble gitt betegnelsen pOS49.67.

Innskuddet av pOS49.67 består derfor av et DNA-fragment av S. ambofaciens inneholdende or/7-genet, ør/2-genet, ør/3-genet med in-phase-delesjonen, ør/¥-genet og en del av or/5-genet. Vektoren i hvilken dette innskudd ble subklonet er pOJ260, plasmidet pOS49.67 gir derfor apramycinresistens og ble innført i stammen OS49.16 ved protoplasttransformasjon (jamfør eksempel 2). Fordi stammen OS49.16 er resistent mot hygromycin, ble det oppnådd hygR- og apraR-transformanter. Etter føring av slike kloner to ganger på ikke-selektivt medium, ble kloner som var sensitive mot apramycin og hygromycin (apraS og hygS) søkt. I noen av disse kloner, er rekombinasjonshendelse mellom homolog sekvens i realiteten forventet å føre til erstatning av kopien av orfl som var brudt med en i2feyg-kassett (inneholdt i genomet av stammen OS49.16) med kopien av orfl med in-phase-delesjonen til stede på vektoren. Klonene som er resultatet av denne rekombinasjon, er forventet å være apraS og hygS etter eliminering av vektorsekvensene. Genotypen av de således oppnådde stammer kan verifiseres ved hybridering eller ved PCR, og sekvensering av PCR-produktet (for å verifisere at kun en in-phase deletert kopi av orfl er tilstede i genomet i de således oppnådde kloner). Kloner med kun kopien av orfl med en in-phase-delesjon ble derfor oppnådd, og disses genotype ble verifisert. En klon som viser de ønskede karakteristika ble mer spesielt selektert og gitt betegnelsen OS49.67.

En prøve av stammen OS49.67 ble deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. juli 2002, under registreringsnummeret 1-2916.

Eksempel 7: Konstruksjon av en stamme av streptomyces ambofaciens med en knockout i or/ ff- genet

For å gjennomføre inaktiveringen av or/ 8-genet, ble det oppnådd et konstrukt hvori i2feyg-kassetten var innført i den kodende sekvens av or/ 8. For dette formål ble aller først plasmidet pOS49.88 konstruert. Dette plasmid er avledet fra plasmidet pUC19 (Genbank aksessnummer: M77789) ved innføring av et 3.7 kb-fragment ( Pstl- EcoRl-fragment oppnådd fra kosmidet pSPM5) inneholdende enden av orf7, or/ 8 og begynnelsen av orf9, klonet inn i PM-iscoRI-setene av pUC19. i2^yg-kassetten (i form av et ÆamHI-fragment ble gjort stumpendet ved behandling med Klenow-enzymet) ble klonet inn i det unike Sa/I-setet av pOS49.88, lokalisert i or/ 8, etter at alle endene var gjort stumpe ved behandling med Klenow-enzymet.

Fordi kloningen var bluntendet, ble det oppnådd to typer plasmid avhengig av retningen av innføringen av kassetten: pOS49.106 hvori hyg- og or/8-genene er i samme orientering, og pOS49.120 hvori hyg- og ør/8-genene er i motsatte orienteringer. Innskuddet av plasmidet pOS49.106 ble så subklonet inn i plasmidet pOJ260, for å gi pOS49.107. For dette formål ble pOS49.106 digestert medÆsp7181-enzymet, og endene ble gjort stumpendet ved behandling med Klenow-enzymet; dette digesteringsprodukt ble redigestert med PM-enzymet og fragmentet inneholdende orf8-genet inn i hvilket i2feyg-kassetten var innskutt, ble klonet inn i vektoren pOJ260 (jamfør ovenfor). For dette formål ble vektoren pOJ260 digestert med EcoRV- og .Fil-systemene og benyttet for ligering. Denne manipulering gjør det derfor mulig å oppnå en orientert ligering forde hvert av de to fragmenter er stumpendet på en side og Pstl på den annen. Det oppnådde plasmid ble betegnet som pOS49.107.

Plasmidet pOS49.107 ble innført i S. ambofaciens- stammen ATCC23877 ved protoplasttransformasjon (T. Kieser, et al, 2000). Etter protoplasttransformasjon selekteres klonene med henblikk på deres hygomycinresistens. De hygromycinresistente kloner blir så subdyrket henholdsvis på medium med hygromycin (antibiotikum B), og på medium med apramycin (antibiotikum A) (jamfør figur 19). Klonene som er resistente mot hygromycin (antibiotika B), og sensitive mot apramycin (ApraS) er i prinsippet de hvori det har inntrådd et dobbelt crossover-hendelse og som inneholder or/5-genet brudt med i2feyg-kassetten. Erstatningen av villtypekopien av orf8 ved kopien som er brudt eller avbrutt av iJzyg-kassetten ble verifisert ved Southern blotting. Således ble totale DNA for de oppnådde kloner digestert med flere enzymer, separert på agarosegel, overført på en membran og hybridert med en probe tilsvarende Chyg-kassetten for å verifisere nærværet av kassetten i den genomiske DNA av de oppnådde kloner. En andre hybridering ble gjennomført der det som probe ble benyttet det Pstl-ÆcøRI-innskudd som inneholdt enden av orfl, or/ 8 og begynnelsen av or/ 9, med en størrelse på rundt 3.7 kb. Av plasmidet pOS49.88. Verifiseringen av genotypen kan gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet.

En or/ 8:: £2iyg- klon ble valgt å gi betegnelsen OS49.107. Et eksempel på stammen OS49.107 er deponert ved "the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes"

(CNCM) [National Collection of Cultures and Microorganisms] Pasteur Institue, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, den 10. juli 2002 under registreringsnummeret 1-2917.

Eksempel 8: Konstruksjon av en stamme av streptomyces ambofaciens med en knockout i ør/70-genet

Et 1.5 kb DNA-fragmentene inne i orfl 0-genet ble oppnådd ved PCR ved at det som matriks ble benyttet den genomiske DNA av S. ambofaciens og de følgende primere:

Dette PCR-avledede DNA-fragment ble klonet inn i vektoren pCR2.1 som markedsføres av firma Invitrogen (Carlsbad, California, USA). Det således oppnådde plasmid ble betegnet som pOS49.32. £2hyg- kassetten (i form av et ÆamHI-fragment, jamfør ovenfor) ble klonet inn i det unike BstEll- setet inne i fragmentet av or/70-genet, etter at alle endene var gjort stumpendet ved behandling med Klenow-enzymet. Fordi kloningen var bluntendet var det oppnådd to typer plasmid avhengig av retningen av innskuddet av kassetten: pOS49.43 hvori hyg- og ør/70-genene er i samme orientering, og pOS49.44 hvori hyg- og or/70-genene er i motsatte orienteringer. Innskuddet av plasmidet pOS49.43 ble overført (i form av et AsplX 81-X6aI-fragment hvis ender var gjort stumpendet ved behandling med Klenow-enzymet) i ÆcøRV-setet av plasmidet pOJ260, noe som gjorde det mulig å oppnå plasmidet pOS49.50. Plasmidet pOS49.50 inneholdende fragmentet av orfl Ø-genet, brudt med i2feyg-kassetten, ble innført i streptomyces ambofaciens- stammen ATCC23877. Etter transformering ble klonene selektert med henblikk på hygromycinresistensen. De hygromycinresistente kloner ble så subdyrket henholdsvis på medium med hygromycin (antibiotikum B) og på medium med apramycin (antibiotikum A) (jamfør figur 9). Klonene som var resistente mot hygromycin (HygR) og sensitive for apramycin (ApraS) er i prinsippet de hvori det har inntrådd et dobbelt crossover-hendelse, og som inneholder ør/70-genet, brudt med i2feyg-kassetten. Kloner som inneholdt hygromycinresistensmarkøren som bæres av kassetten, og som hadde mistet apramycinresistensmarkøren båret av vektoren pOJ260, ble oppnådd på denne måte. Hendelsen bestående av erstatning av villtypekopien av orflO med den orflO:: Chyg brudte kopi ble verifisert ved Southern blotting. Således ble det totale, genomiske DNA av de oppnådde kloner digestert med flere enzymer, separert på agarosegel, overført på en membran og hybridert med en probe tilsvarende Cfryg-kassetten for å verifisere nærværet av kassetten i det genomiske DNA av de oppnådde kloner. En andre hybridering ble gjennomført ved at et som probe ble benyttet 1.5 kb PCR-produktet i ør/70-genet (jamfør ovenfor).

En klon som viste de ventede karakteristika { orf 10:: Chyg) ble spesielt selektert og betegnet OS49.50. Det var således mulig, ved hjelp av to hybrideringer, å verifisere at i2feyg-kassetten virkelig var tilstede i genomet av denne klon og at den ventede digesteringsprofil virkelig ble oppnådd ved erstatning, etter et dobbelt rekombineringshendelse, av villtypegenet med kopien som er brudt med Chyg-kassetten, i genomet av denne klon. Verifiseringen av genotypen kan også gjennomføres på en hvilken som helst kjent måte, og særlig ved PCR ved bruk av egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet.

Eksempel 9: Geninaktivering: prinsipp for konstruksjon av en stamme av streptomyces ambofaciens, knocked out i henhold til "utkuttbar kassett"-teknikken

(jamfør figurene 9 og 10)

En andre type kassett kan benyttes for geninaktiveringen: kassetter kalt "utkuttbare kassetter". Disse kassetter har fordelen av å kunne kuttess ut i streptomyces ved et setespesifikt eller kombineringshendelse etter å ha vært innført i genomet av S. ambofaciens. Formålet er å inaktivere visse gener i stammer av streptomyces uten at det, i den endelige stamme, er tilbake seleksjonsmarkører eller store DNA-sekvenser som ikke hører til stammen. Etter utkutting forblir bare en kort sekvens på omtrent 30 basepar eller der omkring (kalt "arr"-sete) tilbake i genomet av stammen (jamfør figur 10).

Implementering av dette system består først og fremst i å erstatte villtypekopien av målgenet (ved hjelp av to homologe rekombineringshendelseer, jamfør figur 9) med et konstrukt hvori en utkuttbar kassett er innført i dette målgen. Innføringen av denne kassett ledsages av en delesjon av målgenet (jamfør figur 9). For det andre gjennomføres så utkuttingeningen av den utkuttbare kassett fra genomet av stammen. Den utkuttbare kassett virker ved hjelp av et setespesifikt rekombineringssystem, og har fordelen av at det tillater å oppnå streptomyces mutanter som til slutt ikke bærer noe resistensgen. Mulige polare effekter på ekspresjonen av gener lokalisert nedstrøms det eller de inaktiverte gener unngås også (jamfør figur 10).

Anvendelsen av utkuttbare kassetter er beskrevet og benyttet i mange organismer inkludert pattedyrceller og gjærceller, og i E. coli (Bayley et al, 1992; Brunelli and Pall, 1993; Camilli et al, 1994; Dale and Ow, 1991; Russell et al, 1992; Lakso et al, 1992). Disse utkuttbare kassetter benytter alle den Cre setespesifikke rekombinase som virker på lox-seter. Dette rekombineringessystem stammer fra Pl-bakteriofagen. For å konstruere et system av "utkuttbar kassett"-typen i Streptomyces, eksploteres det setespesifikke rekombineringssystem for det mobile, genetiske element pSAM2 av streptomyces ambofaciens (Boccard et al, 1989a og b). Systemoppsettet består i utgangspunktet i å konstruere en rekombinant vektor omfattende genet som skal interrupteres, og hvori det innføres en utkuttbar kassett. Innføringen i målgenet av den utkuttbare kassett ledsages av en delesjon av målgenet. Den kan gjennomføres ved kloning ved bruk av restriksjonsseter som er tilstede i målgenet, eller ved rekombinasjon mellom korte, identiske sekvenser, som beskrevet for eksempel av Chaveroche et al, (Chaveroche MK et al, 2000). Den utkuttbare kassett kan konstrueres, for eksempel ved bruk av i2feyg-kassetten (Blondelet Rouault et al, 1997). Denne kassett var avgrenset av attR- og a#Z-sekvenser som normalt flankerer den integrerte kopi av pSAM2 (jamfør figur 15). attL- og atfi?-sekvensen inneholder alle de seter som er nødvendige for den setespesifikke rekombinering som tillater utkutting av pSAM2 eller av et hvilket som helst DNA-fragment som er lokalisert mellom disse to områder (Sezonov et al, 1997, Raynal et al, 1998). Det skal være klart at konstruksjonen av en slik kassett ikke er begrenset til bruken av en i2feyg-kassett, men andre resistenskassetter kan benyttes som basis for å konstruere denne kassett (for eksempel Qaac eller £2v/?«-kassetten (Blondelet Rouault et al, 1997)).

Etter å ha oppnådd dette konstrukt blir stammen av streptomyces transformert med det rekombinante plasmid. Transformantene velges så med det antibiotikum som tilsvarerer kassetten som er tilstede i målgenet (jamfør figur 9, antibiotikum B, dette involverer for eksempel seleksjon med hygromycin hvis den utkuttbare kassett stammer fra Chyg-kassetten). En blanding av kloner blant hvilke det har vært integrering ved et enkelt eller to rekombinasjonshendelser blir således valgt. Deretter søkes klonene som er sensitive for det antibiotikum for hvilket resistensgenet er tilstede i vektoren (utenfor rekombinasjonskassetten) (jamfør figur 9, antibiotikum A). Det er således mulig å velge klonene for hvilke det i prinsippet har vært to rekombinasjonshendelser som resulterer i erstatning av villtypegen med kopien brudt med kassetten. Disse trinn er vist diagrammatisk i figur 9; genotypen av klonene som er oppnådd på denne måte verifiseres ved Southern blotting og en stamme som viser de ønskede karakteristika (erstatning av villtypegen med kopien brudt med den utkuttbare kassett) velges.

Deretter blir den ovenfor valgte stammen transformert med et plasmid som tillater ekspresjon av xis- og int.genene, som begge er nødvendige for den setespesifikke rekombinasjon mellom attR- og a//Z-setene. Denne rekombinasjon fører til at den utkuttbare kassett forlater stammens genom ved hjelp av et rekombinasjonshendelse (jamfør figur 10) (Ryanal et al, 1998). Det er fordelaktig å velge vektoren som bærer xis- og/«/-genene blant vektorene som er relativt stabile i streptomyces (for eksempel avledet fra streptomyces- vektor pWHM3, (Vara et al, 1980)), dette gjør det mulig å oppnå en stamme som har mistet den sistnevnte vektor etter få sporuleringssykler i fravær av seleksjonstrykk.

For å kutte ut kassetten, er det for eksempel mulig å benytte plasmidet pOSV508 (jamfør figur 14), som er innført ved protoplasttransformasjon i stammen av S. ambofaciens inneholdende et gen som er brudt med den utkuttbare kassett. Plasmidet pOSV508 er avledet fra plasmidet pWHM3 (J. Vara et al, 1989) (jamfør figur 13) hvortil xis- og/«/-genene av pSAM2 (F. Boccard et al, 1989b) er addert, plassert under kontroll av ptrc-promoteren (E. Amann et al, 1988). Xis- og/«/-genene, plassert under kontroll av ptrc-promoteren, ble subklonet inn i plasmidet pWHM3 fra plasmidet pOSint3 (Raynal et al, 1998) (jamfør figur 14). Innføring av plasmidet pOSV508 som bærer xis- og/«/-genene av pSAM2 i den mutante stamme, vil tillate effektiv utkutting, ved setespesifikk rekombinasjon, av den utkuttbare kassett mellom attL- og a#i?-setene som flankerer denne kassett (A. Raynal et al, 1998) (figur 10). Blant transformantene, valgt med henblikk på tiostreptonresistensene på grunn av tør-genet som bæres av pOSV508, velges de som er blitt sensitive mot det antibiotikum til hvilket nærvær av kassetten gir resistens (jamfør figur 10). Utkuttingen er effektiv, og det blir observert at mer enn 90% av transformantene er av denne type. Etter en eller flere cykler med vekst og sporulering på et fast medium som mangler tiostrepton, oppnås kloner som har mistet plasmidet pOSV508. Disse kloner kan detekteres ved sensitiviteten mot tiostrepton. Sekvensen av det deleterte målgen kan verifiseres ved PCR og sekvensering av PCR-produktet.

Til slutt bærer de resulterende stammer i det inaktiverte gen (for eksempel indre delesjon), et "arr" att-sete tilsvarende det minimale attB- sete (Raynal et al, 1998), som stammer fra rekombinasjonen mellom attR- og atfZ-setene. Dette minimale attB- setet som forblir er lik det som naturlig er tilstede i stammer av streptomyces ambofaciens, streptomyces pristinaespiralis og streptomyces lividans (Sezonow et al, 1997).

Genet, hvis inaktivering er ønsket, kan kotranskriberes med andre gener lokalisert nedstrøms. For å unngå inaktivering av et av genene som har en polareffekt på ekspresjonen av genene nedstrøms operonet, er det viktig å oppnå en in-phasedelesjon etter utkutting av kassetten. Det utkuttbare kassettsystem som beskrevet ovenfor, gjør det mulig å tilfredsstille et slikt krav. Fagmannen på området kan således lett konstruere tre forskjellige, utkuttbare kassetter idet kassetene etter utkutting etterlater en sekvens på 33, 34 eller 35 nukleotider, uten en stoppkodin, uansett leseramme. Kjenner man sekvensen for målgenet og størrelsen av delesjonen assosiert med innføring av kassett, er det mulig å velge mellom disse tre utkuttbare kassetter slik at utkuttingen gir en in-phase-delesjon. Av de 33, 34 eller 35 adderte nukleotider, tilsvarer 26 den minimale atfÆ-sekvens (jamfør figur 27).

Det ble det benyttet to utkuttbare kassetter. Disse to kassetter er de følgende: attlQhyg+ (SEQ ID-nr. 91) og att3Qaac- (SEQ ID-nr. 92); disse kassetter har 33 og henholdsvis 35 nukleotider etter utkutting. De omfatter henholdsvis atti Qhyg- kassetten og £?aac-kassetten idet + og - tilsvarerer orienteringen av resistenskassetten. Disse to kassetter ble konstruert og klonet inn i ÆcaRV-setet av vektoren pBC SK+ hvis Hindlll-setet var deletert på forhånd. De oppnådde plasmider ble betegnet pattlQhyg+ og patt3Q aac-. De utkuttbare kassetter kan lett tas ut ved digestering av plasmidet med EcoRV.

Eksempel 10: Konstruksjon av en stamme av streptomyces ambofaciens med en knockout i ør/2-genet

Inaktiveringen av or/2-genet ble gjennomført ved bruk av teknikker med utkuttbar kassett (jamfør ovenfor). Utgangsstammen som ble benyttet er streptomyces ambofaciens- stamme OSC2 som stammer fra stamme ATCC23877. Imidlertid skilller stamme OSC2 seg fra stamme ATCC23877 ved at den har mistet det mobile, genetiske element pSAM2 (Boccard et al, 1989a og b). Dette mobile element kan mistes spontant under protoplastisering (virkning av lysozymer for å digestere bakterieveggen og fragmentere mycelium (Kieser et al, 2000)) og regenerering av protoplastene i stamme ATCC238877. For å velge klonene som hadde mistet pSAM2-elementet, ble det satt opp en screen, basert på represjon av pr a- genet med KorSA-transkripsjonsrepresson (Sezonow et al, 1995) (G. Sezonov et al, 2000). For dette formål ble et DNA-fragment inneholdende promoteren av pra- genet plassert oppstrøms aph- genet (som gir kanamycinresistens som mangler sin egen promoter) klonet inn i den ustabile vektor pWHM3Hyg, idet den siste stamme fra plasmiet pWHM3 (Vara et al, 1989) der Ur-genet var erstattet av hyg- genet (som gir hygromycinresistens). Det således oppnådde plasmid ble kalt pOSV510. Stammen ATCC23877 ble transformer, etter protoplastisering, med plasmidet pOSV510. Pra-promoteren er en promoter som er repressert av KorSA-repressoren, genet som koder den sistnevnte er lokalisert i det pSAM2-mobile element (Seqonov G. et al, 2000). Etter transformering med plasmidet pOSV510, velges de transformerte bakterier med henblikk på kanamycinresistens (på grunn av aph- genet båret av pOSV510). Klonene som har mistet det pSAM2 integrative element, har mistet KorSA-repressoren og Pra-promoteren er ikke lenger repressert og tillater ekspresjon av a/?«-kanamycinresistensgenet. Seleksjon med kanamycin etter transformasjon med plasmid pOSV510 gjør det derfor mulig å velge klonene som har mistet det pSAM2-integrative element (og derfor KorSA), og som inneholder plasmidet pOSV510. Fordi plasmidet pOSV510 er ustabilt blir, etter få cykler av sporulering uten antibiotikum, isolerte kloner subdyrket på medium med kanmycin, på medium med hygromycin og på medium uten antibiotikum. Klonene som er sensitive for kanamycin og hygromycin har mistet pOSV510. Tapet av pSAM2-elementet ble verifisert ved hybridering og PCR. En klon som viser de ønskede karakteristika ble valgt og kalt OSC2.

En prøve på stammen 0SC2 ble deponert hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. juli 2002, under registreringsnummer 1-2908.

Inaktiveringen av or/2-genet ble gjennomført ved bruk av teknikken med utkuttbar kassett (jamfør ovenfor og figuren 10). For dette formål ble et 4.5 kb-innskudd, hvis sekvens starter fra ÆcoRI-setet lokalisert i posisjon I og opptil ÆamHI-setet lokalisert ved posisjon 4521 (SEQ ID-nr. 1), subklonet inn i EcoRI- og ÆamHI-setene av plasmidet pUC19 (Genbank aksessnummer: M77789) fra kosmid pSPM5. Plasmidet som ble oppnådd på denne måte ble betegnet pOS49.99.

Dette plasmid ble innført i E. co/z-stamme KS272, som allerede inneholdt plasmidet pKOBEG (Chaveroche et al, 2000) (jamfør figur 12).

Parallelt ble den att3Qaac- skjærbare kassett (SEQ ID-nr. 92, jamfør ovenfor) amplifisert ved PCR der det som matriks ble benyttet plasmid pOSKl 102 (plasmid pOSKl 102 er et plasmid avledet fra vektoren pGP704Not (Cahveroche et al, 2000)

(V.L. Miller & J.J. Mekalanos, 1988) hvori a#3£2aac-kassetten var klonet, som et EcoRV-fragment inn i det unike ÆcøRV-setet av pGP704Not) og ved bruk av følgende primere:

De 40 deoksynukleotider som er lokalisert med 5'-enden av disse oligonukleotider omfatter en sekvens tilsvarende en sekvens i målgenet (or/2 i foreliggende tilfelle) og de 20 deoksynukleotider lokalisert i den mest 3'-posisjonen (vist fremhevet ovenfor) tilsvarer sekvensen til en av endene av den att3Qaac utkuttbare kassett (jamfør figur 11).

PCR-produktet som oppnås på denne måte ble benyttet for å transformere E. coli-stammen inneholdende plasmidene pKOBEG og pOS49.99 som beskrevet (Chaveroche et al, 2000) (jamfør figur 12). Således ble bakteriene transformert ved elektroporering og valgt på grunn av deres apramycinresistens. Plasmidene av de oppnådde kloner ble ekstrahert og digestert med flere restriksjonsenzymer for å verifisere at digesteringsprofilen som ble oppnådd tilsvarte profilen som var ventet hvis det hadde vært innføring av kassetten ( tt3Qaac-) i målgenet ( or/ 2), det vil si hvis det virkelig hadde vært homologrekombinering mellom endene av PCR-produktet og målgenet (Chaveroche et al, 2000). Verifiseringen av konstruktet kan også gjennomføres ved en hvilken som helst metode som er velkjent for fagmannen, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet. En klon hvori plasmidet har den ventede profil ble valgt, og den tilsvarende profil ble klat pSPM17. Dette plasmid stammer fra pOS49.99 hvori orfl er brudt med apramycinkassetten (jamfør figur 12).

Innføringen av kassetten ledsages av en delesjon av orfl, mellom nukleotidene 211 og 492 av den kodende del av orfl.

Plasmidet pSPM17 ble digestert med ÆcøRI-enzymet og endene ble så gjort stumpendet ved behandling med Klenow-enzymet; dette digesteringsprodukt ble så digestert med Xba\- emymet og innskuddet inneholdende det deleterte orfl- gen ble klonet inn i vektoren pOSK1205 (jamfør ovenfor). For dette formål ble vektoren pOSK1205 ble digestert med ÆamHI-enzymet, og endene ble gjort stumpendede ved behandling med Klenow-enzymet; og dette produkt ble så digestert med Xbal- enzymet og benyttet for ligering med innskuddet oppnådd fra pSPM17 ovenfor. Denne manipulering gjør det derfor mulig å oppnå en orientert ligering fordi hvert av de to fragmenter er stumendede på en side, og Xbal på den andre. De således oppnådde plasmider ble kalt pSPM21; de bærer et hygromycin resistensgen (vektordel) og et innskudd hvori det deleterte orfl-gen er erstattet med en att3Qaac- kassext.

Vektoren pSPM21 ble innført i streptomyces ambofaciens- stamme OSC2 (jamfør

ovenfor) ved protoplasttransformasjon (T. Kieser et al, 2000). Etter transformering ble klonene valgt med henblikk på apramycinresistensen. Apramycinresistente kloner ble så subdyrket henholdsvis på medium med apramycin (antibiotikum B) og på medium med hygromycinen (antibiotika A) (jamfør figur 9). Klonene som var resistente mot

apramycin (ApraR) og sensitive for hygromycinet (HygS) er i prinsippet de der det er skjedd et dobbelt crossover-hendelse og som inneholder ør/2-genet, brudt med att3Qaac- kassetten. Disse kloner ble valgt, og erstatning av villtypekopien av orfl med kopien som var brudt med kassetten, ble verifisert. Nærværet av a#3£2aac-kassetten ble verifisert ved koloni PCR. En hybridering ble også gjennomført. For dette formål ble den totale DNA av klonene som var oppnådd, digestert med forskjellige enzymer, separert på agarosegel, transformert på en membran og hybridert med en 3 kb-probe tilsvarende et £cøRI-2?amHI-fragment av innskuddet av plasmidet pOS49.99 (jamfør ovenfor). Verifiseringen av genotypen kan også gjennomføres ved en hvilken som helst kjent metode, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet.

En klon som viste de ventede karakteristika ble valgt og kalt APM21. Det var, ved bruk av PCR og hybridering, mulig å verifisere at att3Qaac- kassetten virkelig var tilstede i genomet av denne klonen og at digesteringsprofilen som var ventet ved erstatning, etter et dobbelt rekombineringshendelse, av villtypegenet med kopien brudt med en att3Qaac- kassett i genomet for dette klon, virkelig er oppnådd. Denne klon har derfor genotypen: orfl:: att3Qaac-.

En prøve av stammen SPM21 ble deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. juli 2002, under registreringsnummeret 1-2914.

Stammen SPM21 ble transformert med vektoren pOSV508 ved protoplasttransformering for å gi utkutting av kassetten (jamfør figur 14). Plasmidet pOSV508 stammer fra plasmidet pWHM3 (J. Vara et al, 1989) (jamfør figur 13) der xis- og /«/-genene av pSAM2 (F. Boccard et al, 1989b) er addert, satt under kontroll av ptrc-promoteren (E. Amann et al, 1988) (jamfør figur 14). Innføringen i stammen SPM21, av plasmidet pOSV508 som bærer xis- og m/-genene av pSAM2 tillater effektiv utkutting, ved setespesifikk rekombinering, av den utkuttbare kassett mellom attL- og atfi?-setene som flankerer denne kassett (A. Raynal et al, 1998) (figur 10). Blant transformantene som er valgt med henblikk på deres tiostreptonresistens på grunn av tsr- gen som bæres av pOSV508, velges de som er blitt sensitive mot apramycin, hvis resistensgen bæres av att3Qaac- kassetten; utkuttingen fører således til tap av dette resistensgen (jamfør figur 10). Plasmidet pOSV508 er ustabil, og etter to suksessive passasjer på medium uten antibiotikum blir isolerte kloner subdyrket på medium med tiostrepton og på medium uten tiostrepton. De tiostrepton-sensitive kloner har mistet pOSV508. Det ble verifisert at utkuttingene av denne kassett virkelig resulterte i en in-phase-delesjon av orfl- genet, ved PCR og sekvensering av PCR-produktet; utkuttingen av kassetten etterlot således en karakteristisk "scar" att3-sekvens (som er lik attB-opprinnelsessetet etter rekombinering mellom attL- og a#i?-setene):

Den således oppnådde stammen som hadde den ønskede genotype ( orfl::att3) ble kalt SPM22.

En prøve av stammen SPM22 ble deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. juli 2002, under registreringsnummeret 1-2915.

Eksempel 11: Konstruksjon av en stamme av streptomyces ambofaciens med en knockout i ør/72-genet

For inaktivering av orfl2, orfl3c og orfl4, ble det samme startplasmid (pSPM504) benyttet for å innføre en kassett av typen "utkuttbar kassett" ved forskjellige posisjoner. Dette plasmid inneholdt et 15.1 kb innskudd som tilsvarte området fra orfl til orfl 7. For å konstruere dette plasmid, ble et 15.1 kb 2?g7il-fragment som stammet fra digestering av kosmidet pSPM7 (jamfør ovenfor) klonet inn i plasmidet pMBL18 (Nakano et al, 1995) digestert med BamHl. Fordi BamHl- og 2?gÆI-endene er kompatible, ble plasmidet pSPM502 oppnådd etter ligering. Hele innskudet av pSPM502 ble så subklonet (i form av et Hindlll/ Nhel- fragment) inn i plasmidet pOSK1205 (digestert med Hindlll/ Nhe), noe som gjorde det mulig å oppnå plasmidet pSPM504.

Dette plasmid ble innført i E. co/z-stammen KS272 som allerede inneholdt plasmidet pKOBEG (Chaveroche et al, 2000) (jamfør figur 12).

Parallelt ble den a#3£?aac-utkuttbare kassett amplifisert ved PCR ved bruk av, som matriks, plasmidet pOSKl 102 (plasmidet pOSKl 102 er et plasmid som stammer fra vektoren pGP704Not (Chaveroche et al, 2000) (V.L. Miller & J.J. Mekalanos, 1988) der a#3£2aac-kassetten er klonet, som et EcoRV-fragment, inn i det unike £c<?RV-sete av pGP704Not); de benyttede primere var som følger:

De 40 (kun 39 for EDR8) deoksynukleotider som var lokalisert ved 5'-enden av disse oligonukleotider, omfatter en sekvens som tilsvarer en sekvens i målgenet ( or/ 2 i det foreliggende tilfellet) og de 20 deoksyoligonukleotider som er lokalisert i den mest 3' del (vist fremhevet) tilsvarer sekvensen av en av endene av att3Qaac- kassetten (jamfør figur 11).

PCR-produktet som ble oppnådd på denne måte ble benyttet for å transformere E. coli-stamme KS272 inneholdende plasmidene pKOBEG og pSPM504 (jamfør ovenfor), som beskrevet av Chaveroche et al. (Chaveroche et al, 2000) (jamfør figur 12 når det gjelder prinsippet, plasmidet pOS49.99 bør erstattes av plasmidet pSPM504, og det oppnådde plasmid er ikke lenger pSPM17, men pSPM507). Således ble bakterien transformert ved elektroporering og klonene ble så selektert med henblikk på apramycinresistens. Plasmidene av de oppnådde kloner ble ekstrahert og digestert med flere restriksjonsenzymer for å verifisere at den oppnådde digesteringsprofil tilsvarer den profil som ventes hvis det hadde vært et innskudd av kassetten ( att3Qaac-) i målgenet ( orfl2), det vil si hvis det virkelig hadde vært en homolog rekombinering mellom endene av PCR-produktet og målgenet (Chaaveroche et al, 2000). Verifiseringen av konstruksjonen kan også gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet. En klon hvori plasmidet hadde den forventede profil ble valgt, og det tilsvarende plasmid ble kalt pSPM507. Dette plasmid stammer fra pSPM504 der orfl2 er brudt med att3Qaac- kassetten (jamfør figur 12). Innskuddet av kassetten ledsages av en delesjon av or/72-genet, interrupsjonen begynner ved den 13. kodon av orfl2. De siste 46 kodoner av orfl2 er tilbake etter kassetten.

Vektoren pSPM507 ble innført i streptomyces ambofaciens stamme OSC2 (jamfør ovenfor) ved protoplasttransformasjon (T. Kieser et al, 2000). Etter transformasjon ble klonene valgt med henblikk på apramycinresistens. Apramycinresistente kloner ble så subdyrket, henholdsvis på medium med apramycin (antibiotikum B) og på medium med hygromycin (antibiotikum A) (jamfør figur 9). Klonene som var resistente mot apramycin (ApraR) og sensitive for hygromycin (HygS) er i prinsippet de der et dobbel crossover-hendelse har skjedd, og som inneholder ør/72-genet brudt av att3Qaac-kassetten. Klonene ble mer spesielt valgt, og erstatning av villtypekopiene av orf 12 med kopien som var brudt med kassetten, ble verifisert ved hybridering. Således ble den totale DNA av de oppnådde kloner digestert med flere enzymer, separert på agarosegel, overført på en membran og hybridert med en probe tilsvarende att3Qaac- kassetten for å verifisere nærværet av kassetten i den genomiske DNA av de oppnådde kloner. En andre hybridering ble gjennomført ved bruk av en probe av DNA-fragment oppnådd ved PCR og tilsvarende en meget stor del av den kodende sekvens av orfl 2'-genet.

Verifisering av genotypen kan også gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet.

En klone som viser de ventede karakteristika ( orfl2:: att3Qaac-) ble mer spesielt valgt ut og kalt SPM507. Det var virkelig mulig å verifisere, ved hjelp av to hybrideringer, at a#3£?aac-kassetten virkelig var tilstede i genomet i denne klonen og at digesteringsprofilen som var ventet ved erstatning, etter to dobbelt rekombineringshendelser av villtypegenet med kopien som var interuptert med at a#3£2aac-kassetten i dette genom av denne klon, virkelig ble oppnådd. Denne klon har derfor genotypen: orfl2:: att3Qaac- og kalt SPM507. Gitt orienteringen av genene (jamfør figur 3), var det intet behov for å kutte ut kassetten for å studere effekten av inaktiveringen av orf 12. Spesifikt viste det faktum at orfl3c er orientert i motsatt retning av orfl2k, at disse gener ikke blir kotranskribert. Bruken av en utkuttbar kassett gjør det på den andre side mulig å ha muligheten for å bli kvitt seleksjonsmarkøren på et hvilket som helst tidspunkt, og særlig ved transformering av plasmidet pOSV508. En prøve av stammen SPM507 ble deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue de Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. juli 2002, under registreringsnummeret 1-2911.

Eksempel 12: Konstruksjon av en stamme av streptomyces ambofaciens med en knockout i ør/7Jc-genet

Den att3Qaac- kassetten ble amplifisert ved PCR ved bruk av en matriks av plasmidet pOSKl 102 (jamfør ovenfor), ved bruk av de følgende primere:

De 40 deoksynukleotider som er lokalisert ved 5'-enden av disse oligonukleotider, omfatter en sekvens som tilsvarer en sekvens i målgenet ( orfl 3c i det foreliggende tilfellet) og de 20 deoksynukleotider som er lokalisert i den mest 3' del (vist fremhevet) tilsvarer sekvensen av en av endene av den att3Qaac utkuttbare kassetten (jamfør figur 11).

PCR-produktet som ble oppnådd på denne måte ble benyttet for å transformere E. coli-stamme KS272 inneholdende plasmidene pKOBEG og pSPM504 (jamfør ovenfor), som beskrevet av Chaveroche et al. (Chaveroche et al, 2000) (jamfør figur 12 når det gjelder prinsippet, plasmidet pOS49.99 bør erstattes av plasmidet pSPM504, og det oppnådde plasmid er ikke lenger pSPM17, men pSPM508). Således ble bakterien transformert ved elektroporering med dette PCR-produkt, og klonene ble så selektert med henblikk på apramycinresistens. Plasmidene av de oppnådde kloner ble ekstrahert og digestert med flere restriksjonsenzymer for det formål å verifisere at den oppnådde digesteringsprofil tilsvarer den profil som ventes hvis det hadde vært innføring av kassetten ( att3Qaac-) i målgenet ( orfl3c), det vil si hvis det virkelig hadde vært en homolog rekombinering mellom endene av PCR-produktet og målgenet (Chaveroche et al, 2000). Verifiseringen av konstruksjonen kan også gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet. En klon hvori plasmidet hadde den forventede profil ble selektert, og det tilsvarende plasmid ble kalt pSPM508. Dette plasmid stammer fra pSPM504 der orf! 3c er brudt med apramycin-kassetten (jamfør figur 12). Innsføringen av kassetten ledsages av en delesjon av or/73c-genet, interrupsjonen begynner ved den 6. kodon av orfl3c. De siste 3 kodoner av orfl3c er tilbake etter kassetten.

Vektoren pSPM508 ble innført i streptomyces ambofaciens stamme OSC2 (jamfør ovenfor) ved protoplasttransformasjon (T. Kieser et al, 2000). Etter transformasjon ble klonene valgt med henblikk på apramycinresistens. Apramycinresistente kloner ble så subdyrket, henholdsvis på medium med apramycin (antibiotikum B) og på medium med hygromycin (antibiotikum A) (jamfør figur 9). Klonene som var resistente mot apramycin (ApraR) og sensitive for hygromycin (HygS) er i prinsippet de der et dobbel crossover-hendelse har skjedd, og som inneholder or/iic-genet brudt av attSQaac-kassetten. Klonene ble mer spesielt valgt, og erstatning av villtypekopiene av orfl 3c med kopien som var brudt med kassetten, ble verifisert ved hybridering. Således ble den totale DNA av de oppnådde kloner digestert med flere enzymer, separert på agarosegel, transformert på en membran og hybridert med en probe tilsvarende a#3£2aac-kassetten for å verifisere nærværet av kassetten i det genomiske DNA av de oppnådde kloner. En andre hybridering ble gjennomført ved som probe å benytte et PCR-produkt tilsvarende en sekvens som forløp ca 100 basepar oppstrøms og nedstrøms fra den kodende sekvens av orfl3c-$ emt. Verifisering av genotypen kan også gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, og særlig ved PCR,ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCT-produktet.

En klon som viser de ventede karakteristika ( orfl3c:: att3Qaac-) ble så særlig selektert og gitt betegnelsen SPM508. Det var derved mulig å verifisere, ved hjelp av to hybrideringer, at a#3£?aac-kassetten virkelig var tilstede i genomet av denne klonen og at digesteringsprofilen som var forventet ved erstatning, etter dobbelt rekombineringshendelse, av villtypegenet med kopien som var interuptert med at att3Qaac- kassetten i dette genom av denne klon, virkelig ble oppnådd. Denne klon har derfor genotypen: orfl3c:: att3Qaac- og kalt SPM508. Gitt orienteringen av genene (jamfør figur 3), var det intet behov for å kutte ut kassetten for å studere effekten av inaktiveringen av orfl 3c. Spesifikt viste det faktum at orfl 4 er orientert i motsatt retning av orfl 3c, at disse gener ikke blir kotranskribert. Bruken av en utkuttbar kassett gjør det på den andre side mulig å ha muligheten for å bli kvitt seleksjonsmarkøren på et hvilket som helst tidspunkt. En prøve av stammen SPM508 ble deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue de Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. juli 2002, under registreringsnummeret 1-2912.

Eksempel 13: Konstruksjon av en stamme av streptomyces ambofaciens med en knockout i ør/7¥-genet

Den att3Qaac utkuttbare kassett forsterker PCR ved som matriks å benytte plasmidet pOSKl 102 (jamfør ovenfor) og ved bruk av de følgende primere:

De 40 deoksynukleotider som er lokalisert ved 5'-enden av disse oligonukleotider, omfatter en sekvens som tilsvarer en sekvens i målgenet ( orfl 4 i det foreliggende tilfellet) og de 20 deoksynukleotider som er lokalisert i den mest 3' del (vist fremhevet) tilsvarer sekvensen av en av endene av den attSQaac utkuttbare kassetten (jamfør figur 11).

PCR-produktet som ble oppnådd på denne måte ble benyttet for å transformere E. coli-stamme KS272 inneholdende plasmidene pKOBEG og pSPM504 (jamfør ovenfor), som beskrevet av Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (jamfør figur 12 når det gjelder prinsippet, plasmidet pOS49.99 erstattes av plasmidet pSPM504, og det oppnådde plasmid er ikke lenger pSPM17, men pSPM509). Således ble bakterien transformert ved elektroporering med dette PCR-produkt, og klonene ble så selektert med henblikk på apramycinresistensen. Plasmidene av de oppnådde kloner ble ekstrahert og digestert med flere restriksjonsenzymer for det formål å verifisere at den oppnådde digesteringsprofil tilsvarer den profil som ventes hvis det hadde vært innføring av kassetten ( att3Qaac-) i målgenet ( orfl4), det vil si hvis det virkelig hadde vært en homolog rekombinering mellom endene av PCR-produktet og målgenet (Chaveroche et al., 2000). Verifiseringen av dette konstrukt kan også gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet. En klon hvori plasmidet hadde den forventede profil ble selektert, og det tilsvarende plasmid ble kalt pSPM509. Dette plasmid stammer fra pSPM504 der orfl4 er brudt med apramycin-kassetten (jamfør figur 12). Innsføringen av kassetten ledsages av en delesjon av orfl4'-genet, interrupsjonen begynner ved den 4. kodon av orfl4. Sluttkodonen av orfl4 er tilbake etter kassetten.

Vektoren pSPM509 ble innført i streptomyces ambofaciens stamme OSC2 (jamfør ovenfor) ved protoplasttransformering (T. Kieser et al., 2000). Etter transformering ble klonene valgt med henblikk på apramycinresistensen. Apramycinresistente kloner ble så subdyrket, henholdsvis på medium med apramycin (antibiotikum B) og på medium med hygromycin (antibiotikum A) (jamfør figur 9). Klonene som var resistente mot apramycin (ApraR) og sensitive for hygromycin (HygS) er i prinsippet de der et dobbel crossover-hendelse har skjedd, og som inneholder orfl4- genet brudt med attSQaac-kassetten. Klonene ble mer spesielt valgt, og erstatning av villtypekopiene av orfl 4 med kopien som var brudt med kassetten, ble verifisert ved hybridering. Således ble den totale DNA av de oppnådde kloner digestert med flere enzymer, separert på agarosegel, overført på en membran og hybridert med en probe tilsvarende att3Qaac- kassetten for å verifisere nærværet av kassetten i det genomiske DNA for de oppnådde kloner. En andre hybridering ble gjennomført ved at det som probe ble benyttet et PCR-produkt tilsvarende en sekvens som forløp ca 100 basepar oppstrøms og nedstrøms for den kodende sekvens av orfl4\. Verifisering av genotypen kan også gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, og særlig ved PCR,ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCT-produktet.

En klon som viste de ventede karakteristika ( orfl3c:: attSQaac-) ble mer spesielt valgt og gitt betegnelsen SPM509. Det var derved mulig å verifisere, ved hjelp av to hybrideringer, at a#3£?aac-kassetten virkelig var tilstede i genomet av denne klonen og at digesteringsprofilen som var forventet ved erstatning, etter dobbelt rekombineringshendelse, av villtypegenet med kopien som var interuptert med at att3Qaac- kassetten i dette genom av denne klon, virkelig ble oppnådd. Denne klon har derfor genotypen: orfl4:: att3Qaac- og kalt SPM509. Gitt orienteringen av genene (jamfør figur 3), var det intet behov for å kutte ut kassetten for å studere effekten av inaktiveringen av orfl 4. Spesifikt viste det faktum at orfl 15c er orientert i motsatt retning til orfl4, at disse gener ikke blir kotranskribert. Bruken av en utkuttbar kassett gjør det på den andre side mulig å ha muligheten for å bli kvitt seleksjonsmarkøren på et hvilket som helst tidspunkt. En prøve av stammen SPM509 ble deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue de Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. juli 2002, under registreringsnummeret 1-2913.

Eksempel 14: Konstruksjon av en stamme av streptomyces ambofaciens med en knockout i ør/6<*->genet

Inaktiveringen av or/6<*->genet ble gjennomført ved bruk av teknikken med utkuttbar kassett (jamfør ovenfor og figur 10). For dette formål ble kosmidet pSPM7 benyttet som matriks for å forsterke et fragment av or/6<*->genet ved bruk av de følgende nukleotider: De 20 deoksynukleotider som er lokalisert ved 3'-enden av disse oligonukleotider, tilsvarer en sekvens som er lokalisert i den kodende del av orf6*- genet (SEQ ID-nr. 13) og de 6 deoksynukleotider som er lokalisert i den mest 5' posisjon tilsvarer sekvensen av et Pstl- sete som letter etterfølgende kloning. Det forsterkede DNA-fragment har en størrelse på rundt 1.11 kb. Dette PCR-produkt ble klonet inn i vektoren pGEM-T easy (markedsført av firma Promega (Madison, Wisconsin, USA)), noe som gjorde det mulig å oppnå plasmidet pBXLl 111 (jamfør figur 16).

Den attlfihyg+ utkuttbare kassett ble så innført i den kodende sekvens av or/6*-genet. For dette formå ble plasmidet pBXLl 111 digestert med Smal- og Aspl181-restriksjonsenzymer og digesteringsproduktet ble behandlet med Klenowenzymet. Denne manipulering gjør det mulig å produsere en indre delesjon på 120 bp i det kodende området av orf6*- genet (jamfør figur 15). I tillegg forble det på hver side av restriksjonssetene henholdsvis 511 bp og 485 bp av sekvensen av orf6 som vil tillate den homologe rekombinering for inaktivering av or/6*-genet. Den attl£2hyg+ utkuttbare kassett ble fremstilt fra plasmidet pattlfhyg+ (jamfør ovenfor) ved digestering av dette plasmid med EcoRV. Det sistnevnte ble så subklonet inn i vektoren pBXLl 111, fremstilt på forhånd som beskrevet ovenfor ( Sml- og AsplX81 -digestering, og så behandling med Klenowenzym). Det oppnådde plasmid ble kalt pBXLl 112 (jamfør figur 17). I dette konstrukt omfatter ør/6<*->genet en 120 bp delesjon og er brudt med a#7i2?yg+-kassetten.

Plasmidet pBXLl 112 ble så digestert med PM-enzymet (sete kanter kassetten fordi de er tilstede i PCR-oligonukleotidene) og 3.7 kb Pstl-innskuddet omfattende en del av orf6<*>, brudt med attl£jhyg+- kassetten ble så klonet inni PM-setet av plasmidet pOJ260 (jamfør ovenfor). Det således oppnådde plasmid ble gitt betegnelsen pBXLl 113.

Vektoren pBXLl 113 ble innført i streptomyces ambofaciens- stamme OSC2 (jamfør ovenfor) ved protoplasttransformasjon (T. Kieser et al., 2000). Etter transformasjonen ble klonene valgt med henblikk på dens hygromycinresistens. De hygromycinresistente kloner ble så subdyrket henholdsvis på medium med hygromycin (antibiotikum B) og på medium ved apramycin (antibiotikum A) (jamfør figur 9). Klonene som var resistente mot hygromycin (HygR) og sensitive for apramycin (ApraS), var i prinsippet de der det hadde skjedd et dobbelt crossover-hendelse og som inneholdt ør/ft*-genet brudt med atfii2/yg+-kassetten. Disse kloner ble mer spesielt valgt, og erstatningen av villtypekopien av orf6<*>med kopien som var brudt med kassetten, ble verifisert ved Southern blotting teknikk. Således ble den totale DNA for de oppnådde kloner, digestert med flere enzymer, separert på agarosegel, overført på en membran og hybridert med en probe tilsvarende /ryg-genet (oppnådd ved PCR) for å verifisere nærværet av kassetten i den genomiske DNA av de oppnådde kloner. En andre hybridering ble gjennomført ved som probe å benytte PM-PM-innskuddet inneholdende ør/6<*->genet, med størrelse ca 1.1 kb, og oppnådd fra plasmidet pBXLl 111 (jamfør ovenfor og figur 16). Denne verifisering av genotypen kan også gjennomføres på en hvilken som helst måte som er kjent for fagmanne, og særlig ved PCR ved bruk av egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet.

En klon som viser de ventede karakteristika ( or/ 6* ::att£Jiyg+) ble så valgt og betegnet SPM501. Det var således mulig å verifisere, ved hjelp av to hybrideringer, at attfihyg+-kassetten virkelig var tilstede i genomet av denne klon og at den ventede digesteringsprofil virkelig ble oppnådd ved erstatning, etter et dobbelt rekombineringshendelse, av villtypegenet med kopien som er brudt med attChyg-kassetten, i genomet av denne klon virkelig er oppnådd. Denne klon har derfor genotypen: orf6* :: attQhyg+ og ble kalt SPM501. En prøve av stammen SPM501 ble deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue de Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. juli 2002, under registreringsnummeret 1-2909.

Stammen SPM501 ble transformert med vektoren pOSV508 med protoplastransformasjon for å gjennomføre utkutting av kassetten (jamfør figur 14). Plasmidet pOSV508 er avledet fra plasmidet pWHM3 (J. Vara et al, 1989) (jamfør figur 13) hvori xis- og /«/-genene av pSAM2 (F. Boccard et al, 1989b), plassert under kontroll av ptrc-promoteren (E. Amann et al, 1988), er addert (jamfør figur 14). Innføringen i stammen SPM501 av plasmidet pOSV508 som bærer xis- og/«/-genene av pSAM2, tillater effektiv utkutting, ved setespesifikk rekombinering, av den utkuttbare kassett mellom attL- og a#i?-setene som flankerer kassetten (A. Raynal et al., 1998) (figur 10). Blant transformantene, valgt på grunn av deres tiostreptonresistens på grunn avfcr-genet som bæres av pOSV508, velges de som er blitt sensitive for hygromycin og for hvilke resistensgenet bæres av atti fihyg- kassetten; utkuttingen leder derved til tapet av dette resistensgen (jamfør figur 10). Plasmidet pOSV508 er ustabilt og, etter to suksessive passasjer på medium uten antibiotikum, blir isolerte kloner subdyrket på medium med tiostrepton og på medium uten tiostrepton. De tiostreptonsensitive kloner har mistet pOSV508. Det ble verifisert at utkuttingen av kassetten virkelig hadde inntrådd in-phase i or/6<*->genet ved PCR og sekvensering av PCR-produktet. Interrupsjonen begynner ved den 158. kodon, 40 kodoner er deletert (120 bp), og utkuttingen av kassetten etterlater en karakteristisk "arr" attl-sekvens på 33 bp:

Den således oppnådde stammen, og med den ønskede genotype ( prf6* ::attl) ble kalt SPM502.

En prøve av stammen SPM502 er deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue de Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. juli 2002, under registreringsnummeret 1-2910.

Eksempel 15: Analyse av stammene av streptomyces ambofaciens med en knockout i ør/2, or/ 3, orfB, orflO, orf 12, orfl3c, orfl4 eller ør/6<*->genet

For å teste spiramycinproduksjonen hos de forskjellige oppnådde stammer, ble det utviklet en mikrobiologisk test basert på sensitiviteten for en stamme av Micrococcus luteus (jamfør (A. Gourmelen et al, 1998)). Den stamme av Micrococcus luteus som ble benyttet, er en stamme avledet fra stammen DSM1790 som er naturlig sensitiv mot spiramycin (denne stamme er tilgjengelig særlig fra German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschweig, Tyskland), under nummeret DSM 1790); den stamme som ble benyttet i den foreliggende test skiller seg fra stammen DSM 1790 idet at den er resistent mot kongocidin. Denne stamme er en spontanmutant oppnådd ved seleksjon på mediuminneholdende økende doser kongocidin. En slik stamme ble valgt på grunn av det faktum at streptomyces ambofaciens produserer både spiramycin og kongocidin. Fordi formålet er å analysere spiramycinproduksjonen for de forskjellige oppnådde stammer ved bruk av en mikrobiologisk test basert på sensitiviteten for en stamme av Micrococcus luteus, var det nødvendig å ha en kongocidinresistent stamme. De forskjellige stammer av streptomyces for testing ble dyrket i 500 ml Erlenmeyerkolber med baffles (bafflede Erlenmeyere) inneholdende 70 ml MP5-medium (Pernodet et al, 1993). Kolbene ble inokulert ved en initialkonsentrasjon på 2.5 x IO6 sporer per ml av de forskjellige stammer av S. ambofaciens og dyrket ved 27°C under orbitalristing ved 250 omdreininger per min. 2 ml prøver av suspensjonene ble tatt etter 48, 72 og 96 timers dyrking, og sentrifugert. De forskjellige supernatanter ble så frosset ved -20°C. En ti gangers fortynning av disse supernatanter i sterilt kulturmedium ble benyttet for testen (jamfør figur 18).

Micrococcus luteus indikatorstammen som er resistent mot kongocidin, men sensitiv for spiramycin ble dyrket i 2TY-medium (Sambrook et al, 1989) inneholdende kongocidin ved 5fig/ml i 48 timer ved 37°C. Den optiske densitet (OD) for kulturen måles, og denne kultur fortynnes for å justere den optiske densitet til 4. 0.4 ml av denne prekultur fortynnes i 40 ml DAM5-medium (Difco Antibiotic Medium 5, markedsført av firma Difco), bragt til en temperatur på rundt 45°C på forhånd. Dette medium helles så i en 12 cm x 12 cm kvadratisk skål, og settes hen ved omgivelsestemperatur.

Etter at mediet er avkjølt og har størknet, blir ark av Whatman AA-papir (jamfør A. Gourmelen et al, 1998), 12 mm i diameter, bløtt med 70 ul av en 10 gangers fortynning av hver supernatant og plassert på overflaten av skålene. Papirene dynket med en oppløsning av spiramycin i forskjellige konsentrasjoner (2-4-8fig/ml i MP5-kulturmedium) benyttes som et standardområde. Skålene ble satt hen ved 4°C i 2 timer for å tillate difusjon av antibiotika inn i agaren, og det hele ble så inkubert ved 37°C i 24-48 timer.

Hvis papirene inneholder spiramycin, diffunderer denne inn i agaren og inhiberer vekst av Micrococcus /wtews-indikatorstammen. Denne inhibering skaper en "halo" rundt papiret, og denne halo reflekterer det området der Micrococcus luteus- stammen ikke har vokst. Nærværet av denne halo er derfor en indikasjon på nærværet av spiramycin og gjør det mulig å bestemme hvorvidt stammen av S. ambofaciens tilsvarende det angjeldende papir virkelig er eller eventuelt ikke er en spiramycinprodusent. Sammenligning med inhiberingsdiametrene som oppnås for standardområde, gjør det mulig å oppnå en indikasjon på mengden spiramycin som er produsert av denne stammen.

De forskjellige stammer som er beskrevet i de foregående eksempler ble benyttet i denne test for å detektere deres spiramycinproduksjon. Resultatene som oppnås er oppsummert i tabell 38.

Disse resultater gjør det mulig å trekke noen konklusjoner når det gjelder funksjonen av de forskjellige gener som er involvert i spiramycin biosyntesen. Således er ør/3-genet essensielt for spiramycinbiosyntese. Spesifikt fører en in-phase inaktivering av dette gen til en stamme (OS49.67, (jamfør eksempel 6)) som ikke lenger produserer spiramycinen. Denne in-phase-inaktivering gjør det mulig å kassere hypotesen om en mulig innvirkning av kassetten som innføres på ekspresjonen av genene som er lokalisert nedstrøms or/ 3.

Tilsvarende koder or/ 8- og ør/70-genene proteiner som er essensielle for spiramycin biosyntese fordi stammene OS49.107 og OS49.50 har en ikke-produsentfenotype. I tillegg er det i disse to sistnevnte stammer klart inaktiveringen av det tilsvarende gen som er ansvarlig for denne ikke-produsent fenotype fordi, i lys av orienteringen av de forskjellige orf er (jamfør figur 3), kan det innførte konstrukt ikke ha noen polareffekt. Studien av stammene med en utkuttbar kassett gjør det også mulig å trekke et antall konklusjoner når det gjelder funksjonen av det brudte gen. Stammen SPM507 har genotypen: orf2::attSChac-, I lys av orienteringen av genene (jamfør figur 3), er det ikke noe punkt å kutte ut kassetten for å studere effekten av inaktiveringen av orfl2. Det faktum at orfl 3c er orientert i motsatt retning til orfl 2, viser at disse gener ikke kotranskriberes. Bruken av en utkuttbar kassett gjør det på den annen side mulig å ha muligheten for å bli kvitt seleksjonsmarkøren på et hvilket som helst tidspunkt. Fenotypen av stammen SPM507 er ikkeproduserende, det kan derfor trekkes den konklusjon at ør/72-genet er essensielt for spiramycinbiosyntese i S. ambofaciens.

Stammen SPM508 har genotypen: orfSr. attSQaac-. I lys av orienteringen av genene (jamfør figur 3) er det ikke noe poeng å kutte ut kassetten for å studere effekten av inaktiveringen av orfl Sc. Det faktum at orfl 4 er orientert i motsatt retning av orfl Sc viser at genene ikke er kotranskribert. Bruken av en utkuttbar kassett gjør det på den annen side mulig å ha muligheten til å bli kvitt seleksjonsmarkøren på et hvilket som helst tidspunkt. Fenotypen av stammen SPM508 er produserende, og det kan derfor trekkes den konklusjon at ør/73c-genet ikke er et gen som er vesentlig for spiramycin biosyntese i S. ambofaciens.

Stammen SPM509 har genotypen: orf4::attSfhac-. I lys av orienteringen av genene (jamfør figur 3) er det ikke noe poeng å kutte ut kassetten for å studere effekten av inaktiveringen av orfl 4. Det faktum at orfl 5c er orientert i motsatt retning av orfl 4 viser at genene ikke er kotranskribert. Bruken av en utkuttbar kassett gjør det på den annen side mulig å ha muligheten til å bli kvitt seleksjonsmarkøren på et hvilket som helst tidspunkt. Fenotypen av stammen SPM509 er ikke-produserende, og det kan derfor trekkes den konklusjon at orfl '/-genet er et gen som er essensielt for spiramycin biosyntese i S. ambofaciens.

Stammen SPM521 har genotypen: orf2::attS£hac-. Denne stamme har en spiramycin ikke-produserende fenotype. Imidlertid antyder orienteringen av genene orfl til orf8 (jamfør figur 3) at disse gener er kontranskribert. Således kan den observerte fenotype skyldes en polareffekt av kassetten innført i or/ 2 på ekspresjonen av genene lokalisert nedstrøms i operonen. Stammen SPM22 har genotypen orf2::attS, og ble oppnådd etter in-phase utkutting av den innførte kassett. Utkuttingen av kassetten etterlater kun den karakteristiske "arr"-sekvens (jamfør eksempel 10). Fordi stammen SPM22 også har en ikke-produserende fenotype, kan det fra dette trekkes den konklusjon at ør/2-genet er et gen som er essensielt for spiramycin biosyntesen i S. ambofaciens. Kun effekten som skyldes inaktiveringen av ør/2-genet, observeres her.

Stammen SPM501 har genotypen: orf6::att3£hac-. Denne stamme har en spiramycin ikke-produserende fenotype. Fordi Imidlertid orf5<*->og or/5<*->genene (jamfør figur 3) har samme orientering kan den observerte fenotype skyldes en polareffekt av kassetten innført i orf6<*>på ekspresjonen av orf5<*>. Dette arrangement av gener implikerer at de kan være kotranskribert. For å få svar på dette spørsmål ble stammen SPM502 oppnådd etter in-phase utkutting av den innførte kassett. I denne stamme ble kun effekten av inaktiveringen av orf6<*>observert. Denne stamme har genotypen orf6* ::attl (jamfør eksempel 14). Utkutting av kassetten etterlater kun en in-phase "arr"sekvens (jamfør eksempel 14). Stammen SPM502 har en produsererfenotype (imidlertid produserer denne stammen kun spiramycin I (jamfør eksempel 16). Man kan derfor trekke den konklusjon at orf5 *-genet er et gen som er essensielt for spiramycinbiosyntese i S. ambofaciens, fordi indirekte inaktivering derav i stammen SPM501 fører til en ikke-produserende genotype. På den annen side er ør/6<*->genet ikke et gen som er essensielt for biosyntesen av spiromycin I i S. ambofaciens (på den annen side er det essensielt for produksjon av spiramycin II og III (jamfør eksempel 16)).

Eksempel 16: Analyse av produksjonen av spiramycinene I, II og III i de oppnådde, mutante stammer

De forskjellige stammer for testing ble alle dyrket i syv 500 ml baffled Erlenmeyere inneholdende 70 ml MP5-medium (Pernodet et al, 1993). Elrenmeyerne ble inokulert med 2.5 x IO6 sporer/ml av de forskjellige stammer av S. ambofaciens og dyrket ved 27°C under orbitalristing ved 250 omdreininger i 72 timer. Kulturene tilsvarende den samme klon ble slått sammen, eventuelt filtrert gjennom et foldefilter og sentrifugert i 15 minutter ved 7 000 omdreininger/min. De forskjellige supernatanter ble så lagret ved -30°C.

Analysene ble gjennomført ved ioneparings høyytelsesvæskekromatografi (HPLC). HPLC-analysen av kulturmediet gjorde det mulig nøyaktig å bestemme konsentrasjonen av de tre former av spiramycin. Den benyttede kolonne (Macherey-Nagel) fylles med nukleosiloktyl podende silikafase. Partikkelstørrelsen er 5 um, og porestørrelsen 100 Å. Den indre diameter for kolonnen er 4.6 mm og den er 25 cm lang. Den mobile fase er en blanding av H^PCvbuffer (pH 2.2) og acetonitril inneholdende 6.25 g/l NaCICv, i volumforholdet 70:30. Analysen gjennomføres i et isokratisk system med en strømningshastighet satt til 1 ml/min. Kolonnene termokontrolleres ved 23°C. Detekteringen skjer ved UV-spektrofotometri ved 238 nm. Prøven avkjøles til +10°C og kvantiteringen bestemmes fra arealet av toppene (ved ekstern kalibrering). Under disse betingelser er retensjonstidene for spiramycin I, II og III, henholdsvis rundt 17, 21 og 30 minutter, slik det kunne verifiseres ved bruk av en kommersiell prøve omfattende de tre former av spiramycin.

Stammen OSC2 hadde en spiramycin produsererfenotype. Den er opphavsstammen som benyttes for å oppnå stammene med en utkuttbar kassett (jamfør eksempel 15). Denne stamme ble derfor benyttet som en positiv kontroll for produksjon av de tre former av spiramycin. Denne stamme produserte klart de tre former av spiramycin som verifisert ved HPLC (jamfør figur 19).

Studien av stammene med en utkuttbar kassett gjør det mulig å trekke noen konklusjoner hva angår funksjonen for de brudte gener. Denne stamme SPMj507 hadde genotypen: orfl2::att3fhac-. Fenotypen for stammen SPM507 er ikke-produserende (jamfør eksempel 15); man kan derfor trekke den konklusjon at ør/72-genet er et gen som er essensiell for spiramycin biosyntese i S. ambofaciens. Denne stamme produserer ikke lenger spiramyciner, slik det ble verifisert ved HPLC (jamfør figur 22). Dette resultat bekrefter den vesentlige art av or/72-genet i spiramycin biosyntesen.

Stammen SPM508 hadde genotypen: orfl3c::att3Qaac-. Stammen SPM508 har en spiramycinproduserer fenotype (jamfør eksempel 15); det kan derfor trekkes den konklusjon at ør/73c-genet ikke er et gen som er essensielt for spiramycinbiosyntese i S. ambofaciens. Denne stamme produserer spiramycin I, II og III, som verifisert ved HPLC (jamfør figur 23). Dette resultat bekrefter at orflic-genet ikke er et gen som er essensielt for biosyntesen av spiromyciner I, II og III i S. ambofaciens.

Stammen SPM509 har genotypen: orfl4c::att3f3aac-. Fenotypen for stammen SPM509 er ikke-produserende, og det kan derfor trekkes den konklusjon at ør/74-genet er et gen som er essensielt for spiramycinbiosyntesen i S. ambofaciens. Denne stamme produserer ikke lenger spiramyciner, slik det verifiseres ved HPLC (jamfør figur 24). Dette resultat bekrefter den essensielle art av or/74-genet i spiramycinbiosyntese. Stammen SPM501 har genotypen: orft6* ::att£JhygJr. Denne stamme har en spiramycin ikke-produserende fenotype. Denne stamme produserer ikke lenger spiramyciner slik det ble verifisert ved HPLC (jamfør figur 20). Fordi imidlertid orf5<*->og or/ft*-genene (jamfør figur 3) har samme orientering, kan den observerte fenotype skyldes en polareffekt av kassetten som ble innført i orf6<*>på ekspresjonen av orf5<*>i operonen. Dette implikerer at disse gener er kotranskribert. For å svare på dette spørsmål ble stammen SPM502 oppnådd ved utkutting av den innførte kassett, noe som ga en in-phase-delesjon av orf5<*->$ emt og gjenoppgir dette til ekspresjonen av or/ 5*. Denne stamme har genotypen orft6* ::attl (jamfør eksempel 14 og 15). Utkutting av kassetten etterlater kun en in-phase "arr" att-sekvens (jamfør eksempel 14). Stammen SPM502 har en spiramycin produsererfenotype. Slik det imidlertid ble bevist ved HPLC, produserer denne stamme kun spiramycin I og produserer ikke spiramycin II og III (jamfør figur 21). Det kan derfor trekkes den konklusjon fra disse resultater at orf5<*->genet er et gen som essensielt for spiramycinbiosyntese i S. ambofaciens, fordi indirekte inaktivering derav i stammen SPM501 fører til en spiramycin inne-produserer fenotype (jamfør figur 20). På den annen side er ør/6<*->genet ikke et gen som er vesentlig for biosyntese av spiramycin I i S. ambofaciens fordi inaktiveringen av dette gen fører til en spiramycin I-produsererfenotype (jamfør figur 21). Imidlertid er orf6<*>essensiell for fremstilling av spiramycin II og III (jamfør eksempel 16). Ør/ft<*->genet koder derfor klart en acyltransferase som er ansvarlig for modifisering av platenolidet i posisjon 3 (jamfør figur 1).

Eksempel 17: Bestemmelse av translasjonsinitieringspunktet av or/ 10 og forbedring av spiramycinproduksjonen

17. 1. Konstruksjon av plasmidenePSPM523.pSPM524 og pSPM525

Orfl Ø-genet ble identifisert i streptomyces ambofaciens og ble kalt srmR av Geistrilch et al. (M. Geistlich et al., 1992). Inaktivering av orflØ-genet ble gjennomført (jamfør eksempel 8). Det var således mulig å vise at den resulterende stamme ikke lenger produserer spiramyciner (jamfør eksempel 15). Dette bekreter at ør/70-genet klart er involvert i spiramycin biosyntese. Proteinet som kodes av dette gen er derfor klart essensielt for spiramycin biosyntese. Imidlertid viser analyse av sekvensen at to ATG-kodoner som er lokalisert i den samme leseramme kan benyttes for translasjon av or/ 10 (jamfør figur 28). En av de to mulige kodoner (kodenen mest oppstrøms), begynner ved posisjon 10656 i sekvensen som er gitt i SEQ ID-nr. 1, mens den andre mulige kodon er lokalisert lengre nedstrøms og begynner ved posisjonen 10809 (jamfør SEQ ID-nr. 1). Før testing av en mulig effekt av overekspresjonen av srmR på

spiramycinproduksjonen, er det viktig først å bestemme translasjonsinitieringspunktet.

Med det mål å bestemme translasjonsinitieringssetet ble det produsert tre konstrukter omfattende tre former av orf 10. Disse former ble oppnådd ved PCR ved bruk av oligonukleotider omfattende enten et i/wcflll-restriksjonssete eller et BarriRl-restriksjonssete.

Det første par som ble benyttet for forsterkningen tilsvarer de følgende oligonukleotider: EDR39:

5' CCCAAGCTTGAGAAGGGAGCGGACATTCATGGCCCGCGCCGAACGC3'

(SEQ ID-nr. 122) (i/wcflll-setet er vist fremhevet)

EDR42:

5' CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3'

(SEQ ID-nr. 123) ( BamHl- setet er vist fremhevet).

Paret av primere EDR39-EDR42 tillater forsterkning av et fragment av orfl0 omfattende ATG'en lokalisert lengst 3' (posisjon 10809 i sekvensen gitt i SEQ ID-nr. 1)

(jamfør figur 28). Det oppnådde fragment er på rundt 2 kb i størrelse, og angis heretter kort som "kort orf 10"\ den inneholder ikke ør/70-promoteren. Dette 2kb-fragment ble klonet inn i vektoren pGEM-T-easy for å gi plasmidet pSPM520.

Det andre par som ble benyttet for forsterkning til de følgende oligonukleotider: EDR40:

5' CCCAAGCTTGAGAAGGGAGCGGACATTCAATGCTTTGGTAAAGCAC3'

(SEQ ID-nr. 124) ( Hindlll- setet er vist fremhevet)

EDR42:

5' CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3'

(SEQ ID-nr. 123) ( BamHI- setet er vist fremhevet).

Paret av primere EDR40-EDR42 tillater forsterkning av et fragment av orfl 0 omfattende ATG'en lokalisert lengst 5' (posisjon 10656 i sekvensen gitt i SEQ ID-nr. 1)

(jamfør figur 28). Det oppnådde fragment er på rundt 2.2 kb i størrelse, og angis heretter som "lang orf 10" ; ble klonet inn i vektoren pGEM-T-easy, for å gi plasmidet pSPM521; dette plasmid inneholder ikke or/70-promoteren.

Det tredje par som ble benyttet for forsterkningen tilsvarer de følgende oligonukleotider:

EDR41:

5' -CCCAAGCTTTCAAGGAACGACGGGGTGGTCAGTCAAGT-3'

(SEQ ID No. 125) (7/wcffiI-setet er vist fremhevet).

EDR42:

5' CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3'

(SEQ ID No. 123) ( BamHI- setet er vist fremhevet).

Paret av primere EDR41-EDR42 tillater forsterkning av ør/70-genet med to ATG'er, og også sin egen promoter (jamfør figur 28). Dette fragment på 2.8 kb, heretter kalt "pro orf 10", ble klonet inni vektoren pGEM-T-easy, og man oppnådde plasmidet pSPM522.

"Pro ør/70"-fragmentet ble som matriks å benytte den kromosomale DNA av stammen OSC2. "Kort orfl0"- og "lang ør/70"-fragmentene ble i sin tur oppnådd ved som matriks å benytte DNA av "pro ør/70"-fragmentet som var renset i forkant.

Tfw^II-ÆamHI-innskuddene av plasmidene pSPM520, pSPM521 og pSPM522 ble så subklonet inn i vektoren pUWL201 (plasmid avledet fra plasmid pUWL199 (U.F. Wehmeier, 1995) hvori 7£/wI-ÆamHI-fragmentet av området av erwis-promoteren (jafør Bibb et al., 1985, særlig figur 2) som bærer en mutasjon som øker styrken for promoteren (ermE<*->promoter) (Bibb et al., 1994) var innført (jamfør Doumith et al., 2000)) predigestert med HindUl- BamUl- enzymeT. Således ble det oppnådd tre plasmider: pSPM523 (avledet fra pUWL201 med "kort ør/70"-formen som innskudd), pSPM524 (avledet fra pUWL201 med "lang or/70"-formen som innskudd) og pSPM525 (avledet fra pUWL201 med "pro or/70-formen) (figur 28).

17. 2. Transformering av stammen OS49. 50 med konstruktene pSPM523, pSPM524 ogPSPM525

Stammen OS49.50 (stammer med en knock-out i orflØ-genet, jamfør eksmepel 8) ble transformert uavhengig ved protoplasttransformasjon (T. Kieser et al, 2000) med hvert av plasmidene pSPM523, pSPM524 og pSPM525. En negativ kontroll ble også preparert ved transformering av stammen OS49.50 med plasmidet pUWL201 uten innskudd. Etter protoplasttransformering ble klonene valgt med henblikk på tiostreptonresistensen. Transformeringen av klonene med hvert av plasmidene ble verifisert ved ekstrahering av disse plasmider. Således ble det oppnådd fire nye stammer: stamme OSC49.50 pUWL201, avledet fra transformering med plasmidet pUWL201 uten innskudd; stammen OSC49.50 pSPM523, avledet fra transformering med plasmid pSPM523; stammen OSC49.50 pSPM524, avledet fra transformering med plasmidet pSPM524; og til slutt stammen OS49.50 pSPM525, avledet fra transformering med plasmidet pSPM525.

Spiramycinproduksjonen for hver av disse fire stammer ble testet ved HPLC. For dette formål ble de forskjellige stammer av streptomyces som skulle testes, dyrket i 500 ml Erlenmeyere med baffler (baffled Erlenmeyere) inneholdende 70 ml MP5-medium (Pernodet et al, 1993). Når stammen inneholdt plasmidet pUWL201, eller en av dets derivater, ble 5fig/ml tiostrepton tilsatt. Baffled Erlenmeyerne ble inokulert ved en initialkonsentrasjon på 2.5 x 106 sporer/ml av de forskjellige stammer av S. ambofaciens og kulturene ble inkubert ved 27°C under orbitalristing ved 250 omdreininger/min. i 96 timer. Cellene ble så separert fra mediet ved sentrifugering, og supernatanten analysert ved HPLC (jamfør eksempel 16) for å bestemme mengden produsert spiramycin. Ved hjelp av en standardprøve og måling av arealet av toppene, var det mulig å bestemme mengden av hvert av spiramycinene som var fremstilt av disse stammer. Resultatene ved denne analyse er gitt i tabell 39, og data er uttrykt i mg per liter supernatant. Resultatene tilsvarer den totale produksjon av spiramyciner (oppnådd ved å addere produksjonen av spiramycin I, II og III).

Som vist ved resultatene som er gitt i tabell 39, produserer den negative kontroll (stamme OS49.50 transformert med plasmid pUWL201) ikke spiramycin. Når plasmid pSPM523 (som inneholder "kort orfl0"-formen) innføres i stammen OS49.50, observeres ingen spiramycinproduksjon. På den annen side gjenoppretter nærværet av plasmidet pSPM524 (som inneholder "lang ør/70"-formen) og plasmidet pSPM525 (som inneholder "pro ør/70"-formen) spiramycinproduksjonen i vertsstammen OS49.50. Således gjør kun ør/70-fragmentene som inneholder ATG lengst oppstrøms det mulig å gjenopprette spiramycinsyntesen.

For å bekrefte disse resultat ble plasmidet pSPM521 (plasmid pGEM-T-easy inneholdende "lanf orfl 0"-formen) digestert med^7/øI-restriksjonsenzymet (dette enzym har et unikt sete i dette plasmid, lokalisert mellom de to ATG'er (jamfør figur 28)). ^rtøl-endene ble gjort stumpendet ved behandling med Klenowenzymet. Plasmidet ble så lukket opp bak mot seg selv ved innvirkning av T4 DNA-ligase, for å gi plasmidet pSPM527. Hvis den lengst oppstrøms ATG (posisjon 10656 i sekvensen gitt i SEQ ID-nr. 1) så benyttes som translasjonsinitieringssete, vil denne behandling føre til et skift i leserammen vedXwøI-setet og vil ha effekten av å produsere et protein som ikke viser noen aktiverende aktivitet. Hvis på den annen side translasjonsinitieringen skjer ved den lengst nedstrøms ATG (posisjon 10809 i sekvensen gitt i SEQ ID-nr. 1), skulle denne behandling ha liten eller ingen effekt på ekspresjonen av OrflO (gitt lokasjonen av transkripsjonsinitieringspunktet) og ingen effekt på det fremstilte protein.

BamKl- Hindlll- irmskuddet av pSPM527 ble så subklonet inn i vektor pUWL201, for å gi plasmid pSPM528. Dette plasmid ble innført i stamme OS49.50 og en klon med det ønskede plasmid ble mer spesielt valgt. Spiramycinproduksjonen for den resulterende stamme ble så testet ved HPLC (jamfør eksempel 16 og ovenfor). Til forskjell fra det som ble observert med plasmid pSPM524 (jamfør tabell 39), reetablerer nærværet av plasmid pSPM528 i stamme OS49.50 ikke spiramycinproduksjonen. Dette bekrefter at translasjonsinitieringen av ør/70-genet er det ATG som er lokalisert lengst nedstrøms (ATG1 jamfør figur 28).

17. 3. Forbedring av spiramycinproduksjonen i S . ambofaciens - stamme OSC2

For å teste effekten av overekspresjonen av orflØ-genet på spiramycinproduksjonen, ble plasmidene pSPM523, pSPM524, pSPM525 og pSPM528 innført i stamme OSC2. For dette formål ble protoplaster av stammen OSC2 transformert (T. Kieser et al., 2000) uavhengig av hvert av plasmidene pSPM523, pSPM524, pSPM525 og pSPM528. En negativ kontroll ble også produsert ved transformering av stamme OSC2 med plasmidet pUWL201 uten innskudd. Etter fotoplast transformering ble klonene valgt med henblikk på tiostreptonresistensen. Således ble det oppnådd fem nye stammer: OSC2 pUWL201, som var avledet fra transformeringen med plasmidet pUWL201 uten innskudd, stammen OSC2 pSPM523, som var avledet fra transformeringen med plasmid pSPM523; stamme OSC2 pSPM524, som var avledet fra transformering med plasmidet pSPM524; stammen OSC2 pSPM525, som var avledet fra transformering med plasmidet pSPM525; og til slutt stamme OSC2 pSPM528, som var avledet fra transformeringen med plasmidet pSPM528. Spiramycinproduksjonen for disse stammer ble så analysert ved HPLC (på samme måte som i eksempel 17.2). Analyse av spiramycinproduksjonen av stammen OSC2, ble også gjennomført parallelt for sammenligning. Resultatene av denne analyse er gitt i tabell 40, der data er uttrykt som mg per liter supernatant. Resultatene tilsvarer den totale produksjon av spiramyciner (oppnådd ved addisjon av produksjonen av spiramycin I, II og III).

Således observeres det at nærværet av plasmid pSPM524 eller av plasmid pSPM525 signifikant øker spiramycinproduksjonen i stamme OSC2. Dette viser klart at overekspresjon av OrflO har en positiv effekt på spiramycinproduksjonen. På den annen side har plasmid pSPM528 ingen effekt på spiramycinproduksjonen.

På samme måte ble plasmidene pSPM525 og pUWL201 innført i stammen SPM502 (jamfør eksempel 14). Det ble således oppnådd to nye stammer: stamme SPM502 pUWL201, som var avledet fra transformering med plasmidet pUWL201 uten innskudd; og stammen SPM502 pSPM525, som var avledet fra transformering med plasmidet pSPM525.

En prøve av stamme SPM502 pSPM525 (denne stamme inneholder plasmidet pSPM525, jamfør ovenfor) ble detponert hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25, rue de Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 26. februar 2003, under registreringsnummeret 1-2977.

Spiramycinproduksjonen for stammene SPM502 pUWL201 og SPM502 pSPM525 ble analysert ved HPLC (på samme måte som i eksempel 17.2). Analyse av spiramycinproduksjonen for stamme SPM502 ble også gjennomført parallelt for sammenligningens skyld. Resultatene av denne analyse er gitt i tabell 41, der data er uttrykt i mg per liter supernatant. Resultatene tilsvarer produksjonen av spiramycin I. Således produserte ingen av disse stammer spiramycinene II og III.

Således var det mulig å observere at overekspresjon av or/70-genet i stame SPM502 betydelig øker produksjonen av spiramycin I.

Eksempel 18: Konstruksjon av et genomisk DNA-bibliotek av streptomyces ambofaciens- stamme: OSC2 i E. coli i kosmidet pWED2

18. 1. Konstruksjon av kosmidet pWED2

For å lette inaktiveringen av gener i streptomycesk, ble det konstruert et kosmid som bærer ønT-sekvensen av plasmidet RK2 (som tillater dets innføring ved konjugering i streptomyces fra en egnet stamme av E. coli) og også bærer et gen for resistens mot et antibiotikum som gir en detekterbar fenotype i streptomycesk. Et slikt kosmid inneholdende store innskudd av genomiske DNA av streptomyces ambofaciensk kan benyttes i geninaktiveirngsforsøk.

For å konstruere denne vektor ble en /?ac-ønT-kassett (Æcoi? F-fragment) innført i kosmidet pWEDl (Gourmelen et al, 1998), avledet fra kosmidet pWED15 (Wahl et al, 1987), ved det unike Hpal- setet Pac-onT-kassetten ble oppnådd ved PCR. For dette formål ble pac- genet amplifisert ved PCR fra plasmidet pVF 10.4 (Vara et al, 1985; Lacalle et al, 1989) ved bruk av, som første primer, primer A (med sekvens 5'-CCAGTAGATATCCCGCCAACCCGGAGCTGCAC-3' (SEQ ID-nr 126), der ÆcøRV-restriksjonssete er understreket og de 20 nukleotider som er fremhevet tilsvarer et område på oppstrømspromoteren av pac-genet) og, som andre primer, primer B (med sekvens 5 - GAAAAGATCCGTCATGGGGTCGTGCGCTCCTT-3' (SEQ ID-nr. 127), som, ved sin 5'-ende, omfatter en 12 nukleotidsekvens tilsvarende starten av oriT-sekvensen (understreket dobbelt) og en sekvens på 20 nukleotider i fremhevet trykk som tilsvarer slutten av pac-genet (jamfør figur 29,1. PCR).

Hva angår ønT-genet ble dette amplifisert med PCR fra plasmid pPM803 (P. Mazodier et al, 1989) ved bruk av, som første primer, primer C (med sekvens 5'-CACGACCCCATG ACGGATCTTTTCCGCTGCAT-3' (SEQ ID-nr. 128)), som ved 5'-enden omfatter en 12 nukleotidsekvens som tilsvarer en sekvens nedstrøms den kodende sekvens av pac-genet (fremhevet) og en 20 nukleotidsekvens tilsvarende starten av ør/T-sekvensen og, som andre primer, primer D (med sekvens 5'-GAGCCG GATATCATCGGTCTTGCCTTGCTCGT-3' (SEQ ID-nr. 129)), som omfatter TicøRV-restriksjonssetet (understreket) og en 20 nukleotidsekvens tilsvarende enden av ør/T-sekvensen (understreket dobbelt) (jamfør figur 28, 2. PCR).

Forsterkningsproduktet som ble oppnådd med primere A og B, og det som ble oppnådd med primere C og D hadde, med en av sine ender, en fellessekvens på 24 nukleotider. En tredje PCR ble gjennomført ved å blande de to forsterkingsprodukter som var oppnådd tidlig, og ved som primere å benytte primere A og D (jamfør figuren 29, 3. PCR). Dette gjorde det mulig å oppnå et forsterkingsprodukt tilsvarende kombinasjonen pac+ oriT. Dette pac-ønT-fragment ble så klonet inn i vektoren pGEM-T-easy (markedsført av firma Promega (Madison, Wisconsin, USA)), som gjør det mulig å oppnåd plasmidet vGEM- T- pac- oriTk. Innskuddet av dette plasmid ble så subklonet inn i kosmidet pWEDl. For dette formål ble plasmid pGEM-pac-ønT digestert med ÆcoRV-enzymet og ÆcoRV-innskuddet inneholdende kombinasjonen pac+ oriTble ført inn i kosmidet pWEDl som på forhånd var åpnet med Hpal- enzymet. Det således oppnådde kosmid ble betegnet pWED2 (jamfør figur 30).

Dette kosmid gjør det mulig å lette inaktiveringen av gener i streptomyces. Spesifikt bærer den ønT-sekvensen som tillater dens innføring ved konjugering i streptomyces fra en egnet stamme av E. coli, men også et gen for resistens mot et antibiotikum som gir en detekterbar fenotype i streptomyces. Et slikt kosmid inneholdende store innskudd av genomisk DNA av streptomyces ambofaciens kan benyttes i geninaktiveirngsforsøk.

Således kan for eksempel et kosmid avledet fra pWED2 inneholdende et målgen for eksempel innføres i E. co/z-stammen KS272 inneholdende plasmidet pKOBEG (jamfør Chaveroche et ai, 2000) og en kassett vil innføres i målegenet i henhold til den teknikk som er beskrevet av Chaveroche et al., 2000. Kosmidet som oppnås ved denne teknikk (kosmid der målgenet er inaktivert) kan så innføres i en E. co/z-stamme som Sl 7.1-stamme eller en hvilken som helst annen stamme som gjør det mulig å overføre plasmider inneholdende ønT-sekvensen til streptomyces ved konjugering.

Etter konjugering mellom E. coli og streptomyces, vil kloner av streptomyces der villtypekopien av målgenet er erstattet med den brudte kopi oppnås som beskrevet i eksempel 2.

Resistensgenet som utvikles i streptomyces, tilstede på dette nye kosmid, er pac-genet av streptomyces alboniger (J. Vara et al, 1985 ; Lacalle et al, 1989), som koder puromycin N-acetyltransferase og som gir pyromycinresistens. I geninaktiveirngsforsøk søkes kloner der et dobbelt rekombineringshendelse har skjedd. Disse kloner vil ha eliminerte kosmider pWED2 og vil derfor være blitt sensitive mot puromycin igjen.

18. 2. Konstruksjon av et genomisk DNA- bibliotek av streptomyces ambofaciens - stamme OSC2 i E . Coli i kosmidet pWED2

Den genomiske DNA av streptomyces ambovaciens- stamme OCS2 ble partielt digestert med ÆamHI-restriksjonsenzym for å oppnå DNA-fragmenter på mellom rundt 35 og 45 kb. Disse fragmenter ble så klonet inn i kosmid pWED2, der det sistnevnte på forhånd er digestert med BamHl, og så behandlet med alkalisk fosfatase. Ligeringsblandingen ble så enkapsidert in vitro i X-fagpartikler ved bruk av « Packagene® Lamda DNA-packaging system », markedsført av Promega (Madison, Wisconsin, USA), i henhold til produsentenes anbefalinger. De oppnådde fagpartikler ble benyttet for å infektere E. Co/z-stammen SURE® som markedsføres av firma Strategene (LaJolla, California, USA). Klonene ble selektert på LB-medium + ampicillin (50fig/ml), kosmidet pWED2 ga ampicillinresistens.

Eksempel 19 : Isolering av kosmider av det nye bibliotek som dekker området av den biosyntetiske vei for spiramyciner. Subkloning og sekvensering av fragmenter av disse kosmider

19. 1. H<y>bridering av kolonier av det genomiske bibliotek av streptomyces ambofaciens OSC2

Kosmider av det nye bibliotek av streptomyces ambofaciens OSC2 (jamfør eksempel 18) som dekker orfl<*>til orf 10* eller en del eller hele av orfl til orfl5c, eller et område lenger oppstrøms orf25c, ble isolert. For dette formål ble det gjennomført suksessiv hybridering av kolonier av E. coli oppnådd i henhold til eksempel 18 ved bruk av de følgende tre prober (jamfør figur 31): - Den første probe som ble benyttet tilsvarer et DNA-fragment på ca 0.8 kb, amplifisert ved PCR ved bruk av kosmidet pSPM5 som matriks, og de følgende primere : ORF23c: 5'-ACGTGCGCGGTGAGTTCGCCGTTGC-3' (SEQ ID-nr. 130) og ORF25c: 5'-CTGAACGACGCCATCGCGGTGGTGC-3' (SEQ ID-nr. 131). PCR-produktet som ble oppnådd på denne måte inneholder et fragment av starten av orf23c, orf24c i sin helhet og slutten av orf25c (jamfør figur 31, probe I). - Den andre probe som ble benyttet tilsvarer DNA-fragment på ca 0.7 kb, amplifisert ved PCR ved som matriks å benytte den totale DNA av S. ambofaciens- stamme ATCC23877, og de følgende primere : ORFl<*>c: 5'-GACCACCTCGAACCGTCCGGCGTCA-3' (SEQ ID-nr. 132) og ORF2<*>c: 5'-GGCCCGGTCCAGCGTGCCGAAGC-3' (SEQ ID-nr. 133).

Det således oppnådde PCR-produktet inneholder et fragment av enden av orfl * c og av starten av orf2* c (jamfør 31, probe II). - Den tredje benyttede probe tilsvarer et EcoRl- BamHl-fragment på ca 3 kb inneholdende orfl, orfl og orf3 og oppnådd ved digestering av plasmidet pOS49.99 (jamfør figuren 31, probe III).

Ca 2 000 kloner fra biblioteket oppnådd under eksempel 18.2 ble overført på et filter for kolonihybridering i henhold til konvensjonelle teknikker (Sambrook et ai, 1989).

Den første probe (jamfør figur 31, probe I) ble merket med<32>P ved den vilkårlige primingteknikk (sett markedsført av firma Roche), og benyttet for hybridering på 2 000 kloner i biblioteket etter overføring på et filter. Hybrideringen ble gjennomført ved 65°C i bufferen som beskrevet av Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). To vaskinger ble gjennomført i 2 x SSC, 0.1% SDS ved 65°C, den første i 10 minutter og den andre i 20 minutter, og en tredje vasking i 30 minutter ble så utført i 0.2 XCCC, 0.1% SDS ved 65°C. Under disse hybriderings- og vaskebetingelser viste 20 kloner av de 2 000 hybriderte et sterkt hybriderings signal med den første probe. Disse 20 kloner ble dyrket i LB-medium + ampicillin (50fig/ml) og de tilsvarende 20 kosmider ble ekstrahert ved alkalisk lysering (Sambrook, et ai, 1989) og digestert medÆawHI-restirksjonsenzymet. Digesteringsproduktene ble så separert på agarosegel, overført på en nylonmembran og hybridert med den første probe (jamfør ovenfor : PCR-produktet ORF23c-ORF25c, probe I) under de samme betingelser som ovenfor. Tolv kosmider inneholdt et BamHl-fragment som hybriderte sterkt med den benyttede probe. Disse 12 kosmider ble gitt betegnelsene pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44 og pSPM45. Profilene, etter digestering med BamHl for disse 12 kosmider, ble samlet med hverandre og med den til kosmidet pSPM5.1 tillegg gjorde en PCR-forsterkningsforsøk ved bruk av forskjellige primere tilsvarende forskjellige gener som allerede var identifisert i orfl- orf25c- området det mulig å posisjonere innskuddet for noen av disse kosmider i forhold til hverandre, og også å bestemme lokasjonen av disse idet de allerede kjente orfl- orf25c- området (jamfør figur 32). Kosmidet pSPM36 ble valgt spesielt fordi det var i stand til å inneholde et stort område oppstrøms orf25c (jamfør figurene 31 og 32).

Deretter, og ved bruk av de samme betingelser som beskrevet ovenfor, ble 2 000 kloner fra biblioteket av streptomyces ambofaciens OSC2 hybridert med den andre probe tilsvarende PCR-produktet: ORFl<*>c-ORF2<*>c (jamfør figur 31, probe II). Denne hybridering gjorde det mulig å isolere kosmider hvis innskudd er lokalisert i området fra orfl<*>til orfl0* c. Under de benyttede hybrideringsbetingelser viste 16 kloner av de 2 000 hybriderte et sterkt hybrideringssignal med denne andre probe. Disse 16 kloner ble dyrket i LB-medium + ampicillin (50fig/ml) og de tilsvarende 16 kosmider ble ekstrahert ved alkalisk lysering (Sambrook et al., 1989) og så digestert med BamHl-restriksjonsenzymet. Digesteringsprofilene (etter digestering med BamHl) for disse 16 kosmider ble sammenlignet med hverandre og med den til kosmidet pSPM7, PCR-forsterkningsforsøk med primerne ORF1<*>c og ORF2<*>c gjorde det mulig å velge to kosmider som klart inneholdt orfl * c- og ør/2<*>c-genene og hvis profiler hadde felles bunn, men også forskjellige bunner. I tillegg gjorde ytterligere PCR-forsterkningsforsøk ved bruk av forskjellige primere tilsvarende forskjellige gener som allerede var identifisert i området orfl * c til orfl0* c det mulig å posisjonere innskuddet av disse kosmider i forhold til hverandre, og også å bestemme lokasjonen av disse innskudd i det allerede kjente området orfl * c til orfl0* c (jamfør figuren 32). De to kosmider som spesielt ble valgt ble betegnet pSPM47 og pSPM48 (jamfør figur 32).

Ved anvendelse av de samme betingelser som beskrevet ovenfor, ble 2 000 kloner av biblioteket av streptomyces ambofaciens OSC2 også hybridert med den tredje probe tilsvarende EcoRl- BamHl DNA-fragmentet av plasmidet pOS49.99 (jamfør figuren 31 probe III). Denne hybridering gjorde det mulig å isolere kosmidene inneholdende området fra orfl opptil orfS, og i stand til å inneholde enten en stor del av PKS-genene eller en stor del av genene orfl til orf25c av den biosyntetiske vei for spiramyciner. Under disse hybrideringsbetingelser viste 35 kloner av de 2 000 hybriderte et sterkt hybrideringssignal med den 3. probe. Disse 35 kloner ble dyrket i LB-medium + ampicillin (50 ug/ml) og de tilsvarende 35 kosmider ble ekstrahert ved alkalisk lysering (Sambrook et al, 1989) og så digestert medÆawHI-restirsjonsenzymet. Profilene, etter digestering med BamHl, av disse 35 kosmider, ble sammenlignet med hverandre og med den til kosmidet pSPM5.1 tillegg gjorde PCR-forsterkningsforsøk ved bruk av forskjellige primere tilsvarende forskjellige gener som allerede er identifisert i region orfl til orf25c det mulig å verifisere at disse kosmider klart inneholdt innskudd som stammet fra området orfl til orf25c, og opposisjonere innskuddene av disse kosmider i forhold til hverandre og i forhold til det allerede kjente området orfl til orf25c (jamfør figur 32). Fem kosmider ble spesielt valgt, og disse ble betegnet som pSPM50, pSPM51, pSPM53, pSPM55 og pSPM56 (jamfør figur 32).

19. 2. Subkloning og sekvensering av en del av innskuddet av kosmidet pSPM36

Proben på rundt 0.8 kb, oppnådd ved PCR med primerne ORF23c- og ORF25c (jamfør ovenfor), ble benyttet i Southern blottingforsøk på den totale DNA av S. ambofaciens OSC2 som var digestert med Pil-enzymet. Under de hybrideringsbetingelser som er beskrevet ovenfor avdekket denne probe et enkelt Pstl-fragment på ca 6 kb når det var hybridert på den totale DNA av S. ambofaciens OSC2 som var digestert med Pstl-enzymet. Et Pstl- sete eksisterer i området for orf23c (jamfør SEQ ID-nr. 80), men intet annet Pstl- sete foreligger opptil enden (ÆamHI-sete) av den kjente sekvens (jamfør SEQ ID-nr. 1). Dette PM-ÆamHI-fragment er på rundt 1.4 kb. 6 kb PM-fragmentet som hybriderte på den totale DNA av S. ambofaciens som var digestert med Pstl- enzymet inneholder derfor et område på ca 4.6 kb som er lokalisert oppstrøms orf25c. Dette området er i stand til å inneholde andre gener hvis produkter er involvert i biosynteseveien for spiramycin. Det ble ved digestering verifisert at kosmidet pSPM36 virkelig inneholdt dette 6 kb Py/I-fragment. Dette fragment var isolert fra pSPM36, med det formål å bestemme sekvensen ytterligere oppstrøms orf25c. For dette formål ble kosmidet pSPM36 digestert med PM-restriksjonsenzymet. PM-P<y>/I-fragmentet på ca 6 kb ble isolert ved elektroeluering fra en 0.8% agarosegel og så klone inn i vektoren pBK-CMV (4512 bp) (markedsført av firma Stratagene (La Jolla, California, USA)). Det således oppnådde plasmid ble kalt pSPM58 (jamfør figur 33) og sekvensen for dets innskudd ble bestemt. Sekvensen for dette innskudd er gitt i SEQ ID-nr. 134. Imidlertid ble ikke hele sekvensen bestemt, og det forblir et gap på rundt 450 nukleotider, den ubestemte del av sekvensen ble angitt ved en følge av "N"'er i den tilsvarende sekvens. I-fragmentet på ca 6 kb ble isolert ved elektroeluering fra en 0.8% agarosegel og så klone inn i vektoren pBK-CMV (4512 bp) (markedsført av firma Stratagene (La Jolla, California, USA)). Det således oppnådde plasmid ble kalt pSPM58 (jamfør figur 33) og sekvensen for dets innskudd ble bestemt. Sekvensen for dette innskudd er gitt i SEQ ID-nr. 134. Imidlertid ble ikke hele sekvensen bestemt, og det forblir et gap på rundt 450 nukleotider, den ubestemte del av sekvensen ble angitt ved en følge av "N"'er i den tilsvarende sekvens.

19. 3. Analyse av den nve nukleotidsekvens. bestemmelse av den åpne leseramme og karakterisering av genene involvert i spiramycinbiosyntesen

Sekvensen for innskuddet av det oppnådde kosmid pSPM58 ble analysert ved bruk av FramePlotprogrammet (J. Ishikawa & K. Hotta, 1999). Dette gjorde det mulig, blant de åpne leserammer, å identifisere de åpne leserammer som viste en kodonbruker typisk for streptomyces. Denne analyse gjorde det mulig å bestemme at dette innskudd omfatter fire nye ORF'er oppstrøms av orf25c (jamfør figur 34). Disse gener ble gitt betegnelsen orf26 (SEQ ID-nr. 107), or/ 27 (SEQ ID No. 109), orf28c (SEQ ID-nr. 111, der sekvensen for denne orf ikke ble fullstendig bestemt fordi et gap på ca 450 nukleotider er tilbake ved sekvensering av innskuddet av pSPM58, disse 450 nukleotider opptrer i form av en serie "N"'er i sekvensen SEQ ID-nr. 111) og orf29 (der sekvensen av den sistnevnte var ufullstendig i dette innskudd). Den "c" som er føyet til navnet på genet betyr at for den angjeldende ORF er den koden sekvens i reversorientering (jamfør figur 34).

Proteinsekvensene som ble dedusert fra disse åpne leserammer ble sammenlignet med de som er tilstede i forskjellige databaser ved bruk av forskjellige programmer: BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD-søk, (disse to programmer er tilgjengelige særlig fra National Center for Biotechnology Information (NCBI)

(Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988) og (W.R. Pearson, 1990) (dette programmet er tilgjengelig særlig fra INFOBIOGEN resurssenter, Evry, Frankrike). Disse sammenligninger gjorde det mulig å formulere hypoteser hva angår funksjonen av produktene av disse gener, og å identifisere de som er i stand til å involveres i spiramycin biosyntese.

19. 4. Subkloning og sekvensering av en annen del av innskuddet av kosmidet pSPM36 Proben på rundt 0.8 kb, oppnådd ved PCR med primerne ORF23c og ORF25c (jamfør ovenfor og figur 31, probe 1), ble også benyttet i Southern blotforsøk på den totale DNA av stammen OSC2 som var digestert med Støl-enzymet. Under de hybridbetingelser som er beskrevet ovenfor for denne probe, avdekker proben et enkelt Sføl-fragment på ca 10 kb ved hybridering på den totale DNA av stammen OSC2 som var digestert med Støi-enzymet. Gitt nærværet av et SM-sete i orf23c (jamfør SEQ ID-nr. 80) og lokasjonen av dette sete i forhold til PM-setet, inkluderer dette 10 kb-fragment hele det PM-fragment som tidligere ble studert (innskudd av pSPM58) og gjorde det mulig å få tilgang til et ca 4 kb-område som ennå ikke var studert (jamfør figur 33). Det ble, ved digestering, verifisert at kosmidet pSPM36 virkelig inneholdt et 10 kb Stul-fragment. Dette fragment ble isolert fra kosmidet pSPM36, med det formål å bestemme sekvensen av slutten av or/ 29k og av andre gener ytterligere oppstrøms or/ 29. For dette formål ble kosmidet pSPM36 digestert med SM-restriksjonsenzymet. Dette SM-SM-fragment, med en størrelse på ca 10 kb, ble isolert ved elektroeluering fra en 0.8% agarosegel og så klonet inn i vektoren pBK-CMV (4512 bp) (markedsført av firmaet Stratagene (La Jolla, California, USA)). Det således oppnådde plasmid ble betegnet pSPM72 (jamfør figur 33). Det sistnevnte ble så digestert med EcoRl ( EcoRl-setet i innskuddet av pSPM58) og HirtdUl ( HindUl- setet i det multiple kloninssetet av vektoren, umiddelbart etter SM-setet av slutten av innskuddet) (jamfør figur 33). EcoRl- HirtdUl DNA-fragmentet som ble oppnådd på denne måte, tilsvarer et fragment av innskuddet av plasmidet pSPM72 (jamfør figur 33) og ble subklonet inn i vektoren pBC-SK+ (markedsført av firma Stratagene (La Jolla, California, USA)), digestert på forhånd med EcoRl og Hindlll. Det således oppnådde plasmid ble kalt pSPM73 og sekvensen for innskuddet ble bestemt. Sekvensene for dette innskudd er gitt i SEQ ID-nr. 135.

En sammensetning av sekvenser av innskuddene av pSPM58 og pSPM73, er gitt i SEQ ID-nr. 106. Denne sekvens starter fra Pstl- setet i or/ 23c (jamfør SEQ ID-nr. 80) og fortsetter til Støl-setet i or/ 32c (jamfør figur 34). Fordi sekvensen av or/ 28c (SEQ ID-nr. 111) er ikke komplett (jamfør eksempel 19.3), er et område på ca 450 nukleotider ikke sekvensert, disse 450 nukleotider opptrer i form av en serie "N"'er i sekvensen SEQ ID-nr. 106.

19. 5. Analyse av de nye nukleotidsekvenser, bestemmelse av de åpne leserammer og karakterisering av genene involvert i spiramycinbiosyntese

Partialsekvensen for innskuddet av det oppnådde kosmid pSPM73 ble analysert ved bruk av FramePlot-programmet (J. Ishikave & Hotta, 1999). Dette gjorde det mulig, blant de åpne leserammer, å identifisere de åpne leserammer som viste en kodon brukt typisk for streptomyces. Denne analyse gjorde det mulig å bestemme at dette innskudd omfattet fire ORF'er, en ufullstendig og tre fullstendige (jamfør figur 34). Den ufullstendige ORF tilsvarer 3'-delen av den kodende sekvens av orf29, som gjorde det mulig å fullføre sekvensen for dette gen ved hjelp av partialsekvensen fra denne samme orf oppnådd under sekvenseringen av innskuddet av plasmidet pSPM58 (jamfør eksemplene 19.2 og 19.3); kombinasjonen av de to sekvenser gjør det således mulig å oppnå den fullstendige sekvens for or/ 29. De fire gener ble således betegnet orf29 (SEQ ID-nr. 113), or/ 30c (SEQ ID-nr. 115), or/ 31 (SEQ ID-nr . 118) og or/ 32c (SEQ ID-nr.

120). Den"c" som er føyet til navnet for genene for den angjeldende ORF, betyr at den kodende sekvens er i reversorientering (jamfør figur 34).

De proteinsekvenser som er dedusert fra disse åpne leserammer (SEQ ID-nr. 114 for or/ 29, SEQ ID-nr. 116 og 117 for orf30c, SEQ ID-nr. 119 for or/ 31 og SEQ ID-nr. 121 for or/ 32c) ble sammenlignet med de som er tilstede i forskjellige databaser ved bruk av forskjellige programmer: BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD-søk, (disse to programmer er tilgjengelige særlig fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988) og (W.R. Pearson, 1990) (dette programmet er tilgjengelig særlig fra INFOBIOGEN resurssenter, Evry, Frankrike). Disse sammenligninger gjør det mulig å formulere hypoteser i forbindelse med funksjonen av produktene av disse gener, og å identifisere de som er i stand til å involveres i spiramycinbiosyntese.

19. 6. Subkloning og sekvensering av en tredje del av innskuddet av kosmid pSPM36

En probe (0.8 kb DNA-fragment) tilsvarende en sekvens intern til or/ 32c ble oppnådd ved PCR som matriks, og benyttet den totale DNA av streptomyces ambofaciens-stammen og de følgende primere

Det således oppnådde PCR-produktet representerer en indre sekvens av orf32c. Denne

probe ble benyttet i Southern blotforsøk på den kromoaomale DNA av stammen OSC2, og på DNA av kosmidet pSPM36, digestert med Ps/T-enzymet. Ved bruk av de samme hybrideringsbetingelser som beskrevet ovenfor (jamfør eksempel 19.1), avdekket denne probe to Pstl-fragmenter på ca 3.4 kb og 2.5 kb ved hybridering på den totale DNA av stamme OSC2, og på DNA av kosmidet pSPM36, digestert med P<y>/I-enzymet. Gitt nærværet av et Pstl- sete i den benyttede probe kan disse resultater forklares. Det første DNA-fragment, som har en størrelse på ca 3.4 kb, er et fragment hvis sekvens allerede fullstendig er kjent. Sekvensen til 2.5 kb fragment er kun partielt kjent, over et område på 700 pb. Dette fragment ble isolert fra kosmidet pSPM36 med det formål å bestemme sekvensen av slutten av orf32c og andre gener oppstrøms dette. For dette ble kosmidet pSPM36 digestert med P<y>fl-restriksjonsenzymet. PM-Py/I-fragmentet med en størrelse på ca 2.5 kb, ble isolert ved rensing fra en 0.8% agarosegel og så klonet inn i vektoren

pBK-CMV (4518 bp) (markedsført av firma Strategene (La Jolla, California, USA)). Det således oppnådde plasmidet ble kalt pSPM79 (jamfør figur 41) og sekvensen for innskuddet ble bestemt.

Sekvensen for or/ 28c (SEQ ID-nr. 111) var ikke fullstendig (jamfør eksempel 19.3). Særlig hadde det ikke vært mulig å bestemme et område på ca 450 nukleotider, idet disse 450 nukleotider opptrer i form av en serie "N"'er i sekvensen SEQ ID-nr. 106. Sekvensen for det hele manglende området ble bestemt ved resekvensering av dette området. Sekvensen av innskuddene av pSPM58 og pSPM73 ble derfor bestemt i sin helhet. Den fullstendige sekvens av den kodende del av orf28c er gitt i SEQ ID-nr. 141, og proteinet som er dedusert fra denne sekvens i SEQ ID-nr. 142. Sekvensen for innskuddet av plasmidet pSPM79 er gitt i SEQ ID-nr. 161.

En sammensetning av sekvensene av innskuddene av pSPM58, pSPM73 og pSPM79 er gitt i SEQ ID-nr. 140 (jamfør figur 14). Denne sekvens starter fra PsÆ-setet i orf23c (jamfør SEQ ID-nr. 80) og fortsetter opptil PM-setet i orf34c (jamfør figur 41).

19. 7. Analyse av de nye oligonukleotidsekvenser, bestemmelse av de åpne leserammer og karakterisering av genene som kan være involvert i spiramycinbiosyntese

Sekvensen av innskuddet av det oppnådde plasmid pSPM79 ble analysert ved bruk av FramePlot-programmet (Ishikawa J. & Hotta K., 1999). Dette gjorde det mulig, blant de åpne leserammer å identifisere de åpne leserammer som viser en kodonbruk typisk for streptomyces. Denne analyse gjorde det mulig å bestemme at dette innskudd inneholder tre ORF'er, to ufullstendige ( orf32c og orf34c) og en fullstendig ( or/ 33) (jamfør figur 41).

Den første ufullstendige ORF tilsvarer 5'-delen av den kodende sekvens av or/ 32c. Dette gjør det mulig å fullføre sekvensen av dette gen ved hjelp av paritalsekvensen av denne samme orf som oppnådd under sekvensering av innskuddet av plasmidet pSPM73 (jamfør eksempel 19.4 og 19.5), kombinasjonen av de to sekvenser gjorde det således mulig å oppnå den fullstendige sekvens for or/ 32c (SEQ ID-nr. 145). Den "c" som er føyet til navnet av genet betyr, for den angjeldende ORF, at den kodende sekvens er i reversorientering (jamfør figur 41). Den fullstendige ORF ble betegnet or/ 33 (SEQ ID-nr. 147). Den tredje ORF ble betegnet or/ 34c (SEQ ID-nr. 149). Den "c" som er føyet til navnet av genet betyr, for den angjeldende ORF, at den kodende sekvens er i reversorientering (jamfør figur 37). Sammenligningene som ble gjennomført mellom produktet av denne orf og databankene, antyder at C-terminaledelen av dette protein ikke er i produktet som er dedusert fra nukleotidsekvensen, og at denne orf derfor er lenger og fortsetter utover det sekvenserte område.

Proteinsekvensene som er dedusert fra disse åpne leserammer ble sammenlignet med de som er tilstede i forskjellige databaser ved bruk av forskjellige programmer: BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD-søk, COG'er (Cluster of Orthologous Groups) (disse tre programmer er tilgjengelige særlig fra "the National Center for Biotechnology Information" (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((W.R. Pearson & D.J. Lipman, 1988) og (W.R. Pearson, 1990), BEAUTY (K.C. Worley et al, 1995)), disse to programmer er tilgjengelige særlig fra INFOBIOGEN resurssenter, Evry, Frankrike). Disse sammenligninger gjør det mulig å formulere hypoteser hva angår funksjonen av produktene av disse gener, og å identifisere de som sansynligvis vil være involvert i spiramycin biosyntese.

Eksempel 20: Analyse av produksjonen av spiromycinen biosyntese mellomproduktet

20. 1. Prøvepreparering

De forskjellige stammer som skal testes blir hver dyrket i syv 500 ml baffled Erlenmeyere inneholdende 70 ml MP5-medium (Pernodet et al, 1993). Erlenmeyerne ble inokulert med 2.5 x IO6 sporer/ml av de forskjellige stammer av S. ambofaciens og dyrkes ved 27°C med orbitalristing med 250 omdreininger/min. i 96 timer. Kulturene tilsvarende den samme klon ble slått sammen, eventuelt filtrert gjennom et foldefilter og sentrifugert i 15 minutter ved 7 000 omdreininger per minutt.

pH-verdien ble så justert ti. 9 med natriumhydroksyd og supernatanten ekstrahert med metylisobutylketon (MIBK). Den organiske fase (MIBK) ble så gjenvunnet og fordampet. Tørrekstrakten ble så tatt opp i 1 ml acetonitril, så fortynnet til 1/10 (100 ul qs 1 ml med vann) før anvendelse for væskekromatografi/massespektrometri (LC/MS) analyser.

20. 2. Analyse av prøvene ved LC/ MS

Prøvene ble analysert ved LC/MS med det formål å bestemme massene for de forskjellige produkter som var syntetisert av stammene som skulle testes.

Den høyytelsesvæskekromatografikolonne som ble benyttet var en Kromasil C8 150<*>4.6 mmm, 5 mmm (?), 100 Å-kolonne.

Den mobile fase er en gradient bestående av en blanding av acetonitril og en vandig 0.05% trifluoreddiksyreoppløsning, og strømningshastigheten er fiksert med 1 ml/min. Temperaturen for kolonneovnen holdes ved 30°C.

UV-detekteringen ved kolonneutløpet ble gjennomført ved to forskjellige bølgelengder, 238 nm og 280 nm.

Massespektrometer koblet til kromatografikolonnen er en Single Quadripole-innretning, markedsført av firma Agielnt, med konusspenninger ved 30, henholdsvis 70 volt.

20. 3. Analyse av biosyntesemellomproduktene som ble fremstilt av stamme OS49. 67

Stamma OS49.67 hvori or/3-genet er inaktivert ved en in-phase-delesjon, produserer ikke spiramyciner (jamfør eksemplene 6 og 15).

En prøve ble preparert i henhold til en metode som er beskrevet ovenfor (jamfør paragraf 20.1) og ble analysert ved LC/MS som beskrevet ovenfor (jamfør paragraf 20.2).

Mer spesielt ble analysen ved kromatografi gjennomført i en oppløsningsmiddelgradient med, som mobilfase: 20% acetonitril fra tid T=0 til 5 minutter, så lineær økning til 30% ved T=35 minutter, fulgt av et platå opptil T=50 minutter.

Under disse betingelser ble det mer spesielt observert to produkter: en absorbent ved 238 nm (retensjonstid 33.4 min.) og en absorbent ved 280 nm (retensjonstid 44.8 min.)

(jamfør figur 35). Figur 35 viser superposisjonen av HPLC-kromatogrammene som ble produsert ved 238 og 280 nm (topp), og også UV-spektra for molekylene som ble eluert ved 33.4, henholdsvis 44.8 minutter (bunn).

De koblede massespektrometri analysebetingelser var som følger: scanningen gjennomføres i en scannmodus, og dekker et masseområde mellom 100 og 1 000 Da. Elektromultiplikatorens gain var 1 volt. Hva angår elektrospraykilden, var trykket på fortåkningsgassen 35 psig, strømningshastigheten for tørkegassen var 12.0 l/min"<1>, temperaturen for tørking av gassen var 350°C, og kapilarspenningen ble bragt til +/-3 000 volt. Disse forsøk gjorde det mulig å bestemme massen for de to produkter separert. Disse masser er henholdsvis 370 g/mol for produktet som eluerte først ([M-H20]<+=>353 hovedprodukt) og 368 g/mol for det andre produkt ([M-H20]<+=>351 hovedprodukt).

For å oppnå strukturen, ble produktene som nevnt ovenfor isolert og renset under følgende betingelser: den mobile fase er en 70/30-blanding på volumbasis av en vandig 0.05% trifluoreddiksyreoppløsning og acetonitril. Kromatografien gjennomføres i et isokratisk system med en fast strømningshastighet på 1 ml/min. Under disse betingelser er retensjonstidene for de to produkter 8, henholdsvis 13.3 minutter. I tillegg ble den preparerte prøve i dette tilfellet (jamfør paragraf 20.1) ikke fortynnet med vann før injeksjon av 10 ul.

De 2 produkter oppnås ved kromatografikolonneutløpet og isoleres under følgende betingelser: en Oasis HLB 1 cm<3>30 mg søyle (Waters) kondisjoneres sekvensielt med 1 ml acetonitril, så 1 ml vann/acetonitril (20/80 på volumbasis) og vann/acetonitril 80/20. Prøven innføres så, og søylen vaskes suksessivt med 1 ml vann/acetonitril (95/5) og 1 ml vann/deutererte acetonitril (95/5), og elureres så med 600 fil vann/deuterert acetonitril 40/60. Oppløsningen som gjenvinnes analyseres direkte ved NMR.

NMR-spektra som ble oppnådd for de to forbindelser er som følger:

- Første eluerte produkt: platenolid A: (spektrum 9646V)

1H spektrum i CD3CN (kjemiske skift i ppm): 0.90 (3H, t, J=6Hz), 0.93 (3H, d, J=5Hz), 1.27 (3H, d, J=5Hz), mellom 1.27 og 1.40 (3H, m), 1.51 (1H, m), 1.95 (1H, m), 2.12 (1H, m), 2.30 (1H, d, J=12Hz), 2.50 (1H, d, J=l 1Hz), 2.58 (1H, dd, J=9 og 12 Hz), 2.96 (1H, d, J=7Hz), 3.43 (3H, s), 3.70 (1H, d, J=9Hz), 3.86 (1H, d, J=7Hz), 4.10 (1H, m), 5.08 (1H, m), 5.58 (1H, dt, J=3 og 12Hz), 5.70 (1H, dd, J=8 and 12 Hz), 6.05 (1H, dd, J=9 and 12 Hz), 6.24 (1H, dd, J=9 og 12Hz).

- Andre eluerte produkt: platenolid B: (spektrum 9647V)

1H spektrum i CD3CN (kjemiske skift i ppm): 0.81 (3H, t, J=6Hz), 0.89 (1H, m), 1.17 (3H, d, J=5Hz), 1.30 (4H, m), 1.47 (2H, m), 1.61 (1H, t, J=10Hz), 2.20 (1H, m), 2.38

(1H, d, J=13Hz), 2.52 (1H, m), 2.58 (1H, m), 2.68 (1H, dd, J=8 og 13Hz), 3.10 (1H, d, J=7Hz), 3.50 (3H, s), 3.61 (1H, d, J=8Hz), 3.82 (1H, d, J=7Hz), 5.09 (1H, m), 6,20 (1H, m), 6.25 (1H, dd, J=9 og 12 Hz), 6.58 (1H, d, J=12 Hz), 7.19 (1H, dd, J=9 og 12Hz).

Disse forsøk gjorde det således mulig å bestemme strukturen for disse to forbindelser. Det første eluerte produkt er platinolid A, og den andre er platinolid B; den reduserte struktur for disse to molekyler er gitt i figur 36.

Det var også mulig, ved bruk av LC/MS-teknikken kombinert med NMR, under betingelser lett forskjellig fra det som er beskrevet ovenfor, men et oppsett som er velkjent for fagfolk på området, at stammen OS49.67 i tillegg til platinolid A og B, produserer derivater av disse to forbindelser. Disse er platenolid A+mykarose og platenolid B+mykarose (strukturen for disse to forbindelser er gitt i figur 40). Resultatene av analysen av musten for stammen OS49.67 er gitt i tabell 42.

20. 4. Analyse av biosvntesemellomproduktene fremstilt av stammen SPM 509

Stammen SP509 der orfl4- genet er inaktivert ( prfl4::att30ciac-) produserer ikke spiramyciner (jamfør eksemplene 13, 15 og 16). En prøve ble preparert i henhold til metoden som beskrevet ovenfor (jamfør paragraf 20.1) og ble analysert ved LC/MS som beskrevet ovenfor (jamfør paragraf 20.2 og 20.3). Analyse av biosyntesemellomproduktene som er tilstede i kultursupernatanten av stammen SPM509, dyrket i MP5-medium, viste at denne stammen produserte kun form B av platinolid ("platenolide B", jamfør figur 36) og ikke form A", jamfør figur 36).

Eksempel 21: Interrupsjon av ør/7¥-genet i en stamme med en knockout i orJ3-genet (OS49.67).

Produktet av or/74-genet er essensielt for spiramycin biosyntesen (jamfør eksemplene 13, 15 og 16: stammen SPM509 hvori dette gen er brudt produserer ikke lenger spiramyciner). Analyse av biosyntesemellomproduktene som er tilstede i kultursupernatanten av stamme SPM509 som er dyrket i MP5-medium, viste at denne stamme kun produserte form B av platinolidet og ikke form A(jamfør eksempel 20). En av hypotesene som kan forklare denne observasjon, er at produktet av orf 14 er involvert i konverteringen til form B av platenolid til form A via et enzymatisk reduksjonstrinn. For å teste denne hypotese, ble orfl '/-genet inaktivert i en mutant som ikke lenger produserer spiramycin, men produserer formene A og B av platinolid. Dette er tilfelle når det gjelder stammen OS49.67 (jamfør ekseplene 6 og 20) hvori ør/3-genet er inaktivert ved en in-phase-delesjon ( orf3). For å inaktivere or/74-genet i denne stamme, ble plasmid pSPM509 innført ved protoplasttransformasjon i stamme OS49.67 (T. Kieser et al, 2000). Inaktiveringen av or/74-genet er allerede beskrevet når det gjelder stammen 0SC2 (jamfør eksempel 13) og samme prosedyre ble gjennomført for inaktivering av or/74-genet i stammen OS49.67. Etter transformering med plasmid pSPM509, ble klonene selektert med henblikk på apramycinresistens. De apramycinresistente kloner ble så subdyrket, henholdsvis på medium med apramycin og på medium med hygromycin. Klonene som var resistente mot apramycin (ApraR) og sensitive for hygromycin (HygS) er i prinsippet de der det har inntrådd et dobbelt crossover-hendelse, og hvori or/74-genet er erstattet med en kopi av orfl 4, brudt med a#3i2zac-kassetten. Disse kloner ble plukket ut og erstatning av villtypekopien av orf! 4 med kopien som var brudt med kassetten, ble verifisert ved hybridering. Således ble den totale DNA av de oppnådde kloner digestert med flere enzymer, separert på agarosegel, overført på en membran og hybridert med en probe tilsvarende a#3i2rac-kassetten for å verifisere at generstatning virkelig hadde inntrådd. Verifiseringen av genotypen kan også gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede nukleotider og sekvensering av PCR-produktet.

En klon som viser de ventede karakteristika ( prf3, orfl4:: att3fhac-) ble spesielt valgt, og kalt SPM510. Det var således mulig, ved hjelp av to hybrideringer, å verifisere at a#3i2*ac-kassetten virkelig var tilstede i genomet av denne klon, og at digesteringsprofilen som var ventet i tilfelle en erstatning, etter et dobbelt rekombinasjonshendelse, av villtype orfl4-$ enet med kopien brudt med att3fhac-kassetten i genomet av denne klon, virkelig var oppnådd.

Eksempel 22: Funksjonell komplementering av interrupsjonen av ør/74-genet 22. 1. Konstruksj on av plasmidet pSPM519

Orfl4-% QX\ sX ble amplifisert ved PCR ved bruk av det følgende par av oligonukleotider: EDR31: 5' CCCAAGCTTCTGCGCCCGCGGGCGTGAA 3' (SEQ ID-nr. 136) og EDR37: 5' GCTCTAGAACCGTGTAGCCGCGCCCCGG 3' (SEQ ID-nr. 137) og som matriks, den kromosomale DNA av stamme ORC2. Oligonukleotidene EDR31 og EDR37 bærer henholdsvis Hindlll- og .X&al-restriksjonssete (sekvensen fremhevet). 1.2 kb fragmentet som ble oppnådd på denne måte ble klonet inn i vektoren pGEM-T-easy (markedsført av firma Promega (Madison, Wisconsin, USA)), for å gi plasmidet pSPM515. Dette plasmid ble så digestert med Hindlll- og^&al-restriksjonsenzymer. Det oppnådde 1.2 kb Hindlll/ Xbal- mnskuåd ble klonet inn i vektoren pUWL201

(jamfør eksempel 17.1) som på fohånd var digestert med de samme enzymer. Det således oppnådde plasmid ble betegnet pSPM519.

22. 1. Transformering av stammene SPM509 og SPM510 med plasmid pSPM519

Plasmid pSPM519 ble innført i stammene SPM509 (jamfør eksempel 13) og SPM510 (jamfør eksempel 17) ved protoplasttransformasjon (T. Kieser et al., 2000). Etter transformasjon ble klonene valgt med henblikk på tiostreptonresistens. Klonene ble så subdyrket på et medium inneholdende tiostrepton.

Stammen SPM509 er en spiramycin ikke-produsererstamme (jamfør eksempel 13, 15 og 16 og figuren 24). Spiramycinproduksjonen for stammen SPM509 som er transformert med vektoren pSPM519 (stamme betegnet som SPM509 pSPM519) ble analysert ved dyrking av denne stamme i MP5-medium i nærvær av tiostrepton. Kultursupernatanten ble så analysert ved HPLC (jamfør eksempel 16 og 17). Resultatene av denne analyse er gitt i tabell 43, og data er uttrykt som mg/l supernatant. Resultatene tilsvarer den totale produksjon av spiramyciner (oppnådd ved å addere produksjonen av spiramycin I, II og III). Det ble observert at nærværet av vektoren pSPM519 i stammen SPM509 gjenoppretter spiramycinproduksjonen (jamfør tabell 43).

Stammen SPM510 som var transformert med plasmid pSPM519 ble betegnet SPM510 pSPM509.

Eksempel 23: Funksjonell komplementering av interrupsjonen av ør/3-genet med tylB- genet av S. fradiae

23. 1. Konstruksjon av plasmidet pOS49. 52

Plasmidet pOS49.52 tilsvarer et plasmid som tillater ekspresjon av TylB-proteinet i S. ambofaciens. For å konstruere ble den kodende sekvens av tylB- genet av S. fradiae

(Merson-Davies & Cundliffe, 1994, Genbank aksessnummer:U08223 (sekvens for område), SFU08223 (DNA-sekvens) og AAA21342 (proteinsekvens)) innført i plasmid pKC1218 (Bierman et al, 1992, Kieser et al, 2000, en stamme av Ti. coli inneholdende dette plasmid er tilgjengelig særlig fra ARS (NRRL) Agricultural Research Service Culture Collection) (Peoria, Illinois, USA), under nummeret B-14790). I tillegg ble denne kodende sekvens plassert under kontroll av ermE<*->promoteren (jamfør ovenfor, særlig eksempel 17.1, Bibb et al, 1985, Bibb et al, 1994).

23. 1. Transformering av stammen OS49. 67 med plasmidet pOS49. 52

Stammen OS49.67 hvori ør/3-genet er inaktivert ved en in-phase-delesjon produserer ikke spiramyciner (jamfør eksemplene 6 og 15). Plasmidet pOS49.52 ble innført i stammen OS49.67 ved protoplasttransformasjon (T. Kieser et al, 2000). Etter transformering ble klonene valgt med henblikk på apramycinresistens. Klonene ble så subdyrket på et medium inneholdende apramycin. En klon ble mer spesielt valgt og betegnet OS49.67 pOS49.52.

Som påvist ovenfor produserer stammen OS49.67 ikke spiramyciner (jamfør eksemplene 6 og 15). Spiramycinproduksjonen for stamme OS49.67 som er transformert med vektoren pOS49.52 ble analysert ved den teknikk som er beskrevet i eksempel 15. Det var derved mulig å påvise at denne stammen har spiramycinproduserer fenotype. Således tillater TylB-proteinet funksjonell komplementering av interrupsjonen av or/3-genet.

Eksempel 24: Forbedring av spiramycinproduksjonen ved overekspresjon av ør/2Æc-genet

24. 1. Konstruksjon av plasmid pSPM75

Orf28c- genet ble amplifisert ved PCR ved bruk av et par oligonukleotider omfattende et ifwoTII-restirksjonssete eller et ÆamHI-restriksjonssete. Disse primere har følgende sekvens: KF30: 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID-nr. 138) med et Hindlll restriksjonssete (vist fremhevet)

KF31: 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID-nr. 139) med et BamHl restriksjonssete (vist fremhevet.)

Primerne KF30 og KF31 bærer henholdsvis Hindlll- og ÆamHI-restriksjonssetene (sekvensfremhevet). Paret av primere KF30 og KF31 gjør det mulig å forsterke et DNA-fragment på rundt 1.5 kb inneholdende or/25c-genet, ved som matriks å benytte kosmidet pSPM36 (jamfør ovenfor). Det således oppnådde 1.5 kb-fragment ble klonet inn i vektoren pGEM-T-easy (markedsført av Promega (Madison, Wisconsin, USA)) for å gi plasmidet pSPM74. Dette ble så digestert med Hindlll- og BamKl-restriksjonsenzymer og det oppnådde rundt 1.5 kb HindllVB amHl- irmskadd ble subklonet inn i vektoren pUWL201 (jamfør eksempel 17.1) som på forhånd var digestert med de samme enzymer. Det således oppnådde plasmid ble betegnet pSPM75; det inneholder alle de kodende sekvenser av orf28c plassert under kontroll av ermE<*->promoteren.

24. 2. Transformering av stammen OSC2 med plasmidet pSPM75

Plasmidet pSPM75 ble innført i stammene OSC2 ved protoplasttransformering (T. Kieser et al, 2000). Etter protoplasttransformering ble klonene valgt med henblikk på tiostreptonresistensen. Klonene ble så subdyrket på et medium inneholdende tiostrepton, og transformeringen med plasmid ble verifisert med plasmidekstrahering. Det ble mer spesielt valgt to kloner som ble betegnet OSC2/pSPM75(l) og OSC2/pSPM75(2).

En prøve av stammen OSC2/pSPM75(2) ble deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Pasteur Institute, 25 rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, den 6. oktober 2003, under registreringsnummer 1-3101.

For å teste effekten av overekspresjon av orf28c- genet på spiramycinproduksjonen, ble spiramycinproduksjonen for OSC2/pSPM76(l)- og OSC2/pSPM75(2)-klonene testet ved den teknikk som er beskrevet i eksempel 15. Analyse av spiramycinproduksjonen for stamme OSC2 ble også gjennomført parallelt for sammenligningens skyld. Det var derved mulig å observere at nærvær av plasmidet pSPM75 signifikant øker spiramycinproduksjonen for stammen OSC2. Dette viser at overekspresjon av orf28c fører til en økning i spiramycinproduksjonen og bekrefter dennes rolle som regulator.

Spiramycinproduksjonen for OSC2/pSPM75(l)- og OSC2/pSPM75(2)-klonene ble også analysert ved HPLC (på samme måte som i eksempel 17.1). Analyse av spiramycinproduksjonen for stamme OSC2 ble også gjennomført i parallell for sammenligningens skyld. Resultatene av denne analyse er gitt i tabell 44, og data er uttrykt i mg/l supernatant. Resultatene tilsvarer den toale produksjon av spiramyciner (oppnådd ved å addere produksjonen av spiramycinene I, II og III).

Således ble det observert at nærværet av plasmidet pSPM75 signifikant øker spiramycinproduksjonen for stammen OSC2. Dette viser klart at overekspresjon av orf28c har en positiv effekt på spiramycinproduksjonen.

Eksempel 25: Analyse av produksjonen av spiramycin biosyntesemellomprodukter av en stamme som er inaktivert i ør/5-genet

Stammen OS49.107, der ør/5-genet er inaktivert ved innføring av iJryg-kassetten, produserer ikke spiramyciner (jamfør eksemplene 7 og 15). Ør/5-genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med flere aminotransferaser og sterkt antyder at or/ 8-genet koder en 4-aminotransferase som er ansvarlig for transamineringsreaksjonen som er nødvendig for forosamin biosyntese (jamfør figur 6). Det er derfor ventet at spiramycin biosyntesen vil blokkeres på forocidintrinnet (jamfør figur 7). Stamme OS49.107, som er en spiramycin ikke-produserer, skulle derfor produsere forocidin.

En prøve av supernatanten av stamme OS49.107 ble preparert i henhold til metoden som beskrevet ovenfor (jamfør eksempel 16, uten MIBK-ekstrahering) og ble analysert ved LC/MS som beskrevet ovenfor (jamfør paragrafene 20.2 og 20.3). I SIM-modus ble masse 558 relatert molekylionet av forocidin valgt, og flere topper ble detektert. Nærværet av forbindelser med masse 558 er kompatibel med hypotese om at or/ 8 har en rolle i forosaminsyntesen.

Eksempel 26: Analyse av produksjonen av spiramycin biosyntesemellomprodukter av en stamme som er inaktivert i ør/72-genet

Stammen SPM507, hvori ør/72-genet er inaktivert, produserer ikke spiramyciner (jamfør eksemplene 11 og 15). Ør/72-genet antas å kode en 3,4-dehydratase som er ansvarlig for dehydratiseringsreaksjonen som er nødvendig for forosaminbiosyntesen (jamfør figur 6). Det er derfor ventet at spiramycin biosyntesen vil blokkeres på forocidintrinnet (jamfør figur 7). Stammen SPM507, som er en spiramycin ikke-produserende stamme, skulle derfor produsere forocidin.

En prøve av supernatant av stamme SPM507 ble preparert i henhold til metoden som er beskrevet ovenfor (jamfør eksempel 16, uten MIBK-ekstrahering) og ble analysert ved LC/MS som beskrevet ovenfor (jamfør paragrafene 20.2 og 20.3). Under disse betingelser er forocidinretensjonstiden rundt 12.9 minutter. I SIM-modus ble masse 558 relatert til det molekylære ion [M+H]<+>av forocidin valgt og en topp ble detektert. Nærværet av en forbindelse ved 558 gjør det mulig å validere den hypotese av produktet av orfl 2 som har en rolle i spiramycinbiosyntesen.

Forocidinet er imidlertid tilstede i relativt lav mengde, og under disse betingelser ble det mer spesielt observert et produkt som absorberer ved 238 nm (retensjonstid 17.1 min.). LC/MS-analysen gjorde det mulig å bestemme massen for denne forbindelse som er 744.3 g/mol ([MpH]<+>= 744.3 hovedprodukt).

For å oppnå strukturen ble produktene som nevnt ovenfor isolert og renset under de ovenfor beskrevne betingelser (jamfør paragraf 20.1). Den organiske fase (MIBK) gjenvinnes og fordampes. Tørrekstrakten tas opp med vann og ekstraheres med heptan. Den vandige oppløsning ekstraheres så ved binding til en Oasis HLB 1 g søyle (Waters SAS, St-Quentin en-Yvelines, Frankrike). Forbindelsen gjenvinnes ved eluering med vann/acetonitril (30/70. Oppløsningen injiseres så (100fil) på den analytiske kolonne, og fraksjonene gjenvinnes på en Oasis HLB 1 cm<3>30 mg søyle (Waters). Før bruk kondisjonerens Oasis HLB 1 cm<3>30 mg søylen (Waters) sekvensielt med acetonitril, deretter med vann/acetonitril i volumforholdet 20/80 og en blanding vann/acetonitril 80/20.

Oasis HLB-søylen 1 cm<3>30 mg søylen (Waters) vaskes så suksessivt med 1 ml vann/acetonitril (95/5) og 1 ml vann/deuterert acetonitril (95/5) og elueres så med 600 fil vann/deuterert acetonitril 40/60. Den oppnådde oppløsning analyseres så direkte ved

NMR.

NMR-spekteret som oppnås for denne forbindelse er som følger (19312V NMR-spektrum): 1H spektrum i CD3CN/D20 (kjemiske skift i ppm): 0.92 (3H, d, J=6Hz), 1.10 (1H, ikke oppløst topp), 1.14 (3H, s), 1.17 (3H, d, J=6Hz), 1.22 (3H, d, J=6Hz), 1.25 (3H, d, J=6Hz), 1.40 (1H, ikke oppløst topp), 1.75 (1H, dd, J=12 og 2Hz), 1.81 (1H, ikke oppløst topp), 1.90 (1H, d, J=12Hz), 2.05 (IFLikke oppløst topp), 2.12 (3H, s), 2.15 (lH,ikke oppløst topp), 2.35 (2H,ikke oppløst topp), 2.45 (6H, bredde s), 2.53 (1H, unresolvedpeak), 2.64 (1H, dd, J=12 og 9Hz), 2.80 (1H, dd, J=9 og 16Hz), 2.95 (1H, d, J=8Hz), 3.23 (2H, unresolved peak), 3.34 (1H, d, J=7Hz), 3.45 (3H, s), 3.49 (lH,ikke oppløst topp), 3.93 (1H, dd, J=7 og 3Hz), 4.08 (1H, ikke oppløst topp), 4.37 (1H, d, J=6Hz), 4.88 (lH,ikke oppløst topp), 5.05 (2H,ikke oppløst topp), 5.65 (2H,ikke oppløst topp), 6.08 (1H, dd, J=8 og 12Hz), 6.40 (1H, dd, J=12 og 9Hz), 9.60 (1H, s).

Dette forsøk gjør det derved mulig å bestemme strukturen for denne forbindelse idet strukturen er gitt i figur 38.

Eksempel 27: Analyse av produksjonen av spiramycin

biosyntesemellomproduktene fra en stamme som er inaktivert i orf5 *-genet

Stammen SPM501 har genotypen orf6* ::attl hyg+. Ved hjelp av den polare effekt av innskuddet av atti /ryg+-kassetten i ør/6<*->genet, var det mulig å bestemme at dette er essensielt for spiramycinbiosynteseveien. Spesielt fører innføring av en utkuttbar kassett i den kodende del av or/5<*->genet til en fullstendig stans i spiramycinproduksjonen på grunn av en polareffekt på ekspresjonen av orf5<*->genet. Når imidlertid først den innførte kassett er skåret ut (og derfor når kun ør/6<*->genet er inaktivert, jamfør eksemplene 14 og 15), gjenopprettes produksjonen av spiramycin I. Dette viser at orf5<*->genet er essensielt for spiramycin biosyntese fordi inaktiveringen fører til en fullstendig stans i spiramycinproduksjonen.

Orp<*->genet koder et protein som viser relativt sterk likhet med flere O-metyltransferaser. Orf5<*->genet antas å være en O-metyltransferase involvert i platenolidbiosyntesen. For å verifisere denne hypotese ble LC/MS- og NMR-analyseforsøk gjennomført på en stamme av S. ambofaciens med genotype orf6* ::attl hyg+, oppnådd fra en stamme som overproduserer spiramyciner.

En prøve av supernatanten av denne stamme ble preparert i henhold til den metode som er beskrevet ovenfor (jamfør eksempel 16, uten MIBK-ekstrahering) og ble analysert ved LC/MS som beskrevet ovenfor (jamfør paragraf 20.2 og 20.3). Imidlertid er den benyttede kolonne en X-Terrakolonne (Waters SAS, St-Quentin en-Yvelines, Frankrike) og konspenningen på spektrometeret settes til 380 volt for å gi fermentering av den analyserte forbindelse. Under disse betingelser observeres det et produkt for hvilket retensjonstiden er rundt 13.1 minutt. Massespektrum for denne forbindelse har et utseende tilsvarende det til spiramycin I, men molekylærionet er 829. Differansen på 14 når det gjelder massen, sammenlignet med massen til spiramycin, kan forklares ved fraværet av metylgruppen på oksygenet som bæres av karbon nr. 4 i laktonringen (strukturen for denne forbindelse er gitt i figur 39). Nærværet av en forbindelse ved 829 gjør det mulig å validere den hypotese at or/5<*>spiller en rolle i spiramycinbiosyntesen.

Ved bruk av en mikrobiell test gjennomført på en sensitiv stamme av M. luteus (jamfør eksempel 15 og figur 18) ble det påvist at mellomproduktmolekylet (spiramycin minus metylgruppen, hvis struktur er gitt i figur 39) produsert av stamme orf6* ::fhtthyg+ er meget mindre aktiv (med en faktor 10) enn opprinnelsesspiramycinet med metylgruppen i posisjon 4.

Eksempel 28: Konstruksjon av nye "utkuttbare kassetter"

Det ble konstruert nye, utkuttbare kassetter. Disse er meget lik de som allerede er beskrevet i eksmepel 9. Hovedforskjellen mellom tidligere kassetter og de nye er, i de sistnevnte, fraværet av sekvensene som tilsvarer endene av Q-interposonet, hvilke sekvenser inneholder en transkripsjonsterminator som stammer fra T4-fagen.

I kassettene uten terminator er genet som gir resistens mot et antibiotikum flankert av attR- og attL-sekvensene som tillater utkuttingen. Resistensgenet er aac( 3) IV- genet som koder en acetyltransferase som gir apramycinresistens. Dette gen er tilstede i Daac-kassetten (Genbank aksessnummer: X99313, Blondelet-Rouault, M.H. et al, 1997) og ble amplifisert ved PCR, som matriks, og benyttet plasmidet pOSKl 102 (jamfør ovenfor) og, som primere, oligonukleotidene KF42 og KF43, hver inneholdende //waTII-restriksjonssetet (fremhevet) (AAGCTT) i 5'-posisjonen.

Det oppnådde PCR-produkt på ca 1 kb, ble klonet inn i E. coli-vektoren pGEMT-easy, og man oppnådde plasmid pSPM83.

Vektoren pSPM83 ble digestert med //zwcttll-restriksjonsenzymet. Hindlll- Hindlll-fragmentet av dette innskudd ble isolert ved rensing fra en 0.8% agarosegel, og så klonet inn i //walil-setet lokalisert mellom attL- og attR-sekvensene av de forskjellige plasmider som bærer de forskjellige mulige, utkuttbare kassetter (jamfør eksempel 9 og figur 27) for å erstatte i/walll-fragmentet tilsvarende acc med Hindlll-fragmentet tilsvarende aac-genet alene. Dette gjør det mulig å oppnå at en av attlaac-, att2aac- og a#3aac-kassetter (avhengig av den ønskede fase, jamfør eksempel 9). Avhengig av orienteringen av aac-genet i forhold til attL- og atfR-sekvensen er attlaac+, attlaac-, att2aac+, att2aac-, att3aac+ and attSaa- er adskilt (i henhold til de samme konvensjoner som benyttet i eksempel 9).

Eksempel 29: Konstruksjon av en stamme av S. ambofaciens med en knockout i ør/25c-genet

Orf28c- genet ble inaktivert ved bruk av teknikken med en utkuttbar kassett. Den

utkuttbare kassett ble amplifisert ved PCR ved som matriks å benytte plasmid pSPMlOl (plasmidet pSPMlOl er et plasmid som stammer fra vektoren pGP704Not (Chaveroche et al., 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) hvori a#3aac+-kassetten er klonet som et ÆcøRV-fragment inn i det unike EcoRV- setet av pGP704Not) og ved bruk av følgende primere:

KF32:

De 39 nukleotider som er lokalisert ved 5'-enden av disse oligonukleotider inneholder en sekvens tilsvarende en sekvens i ør/25c-genet, og de 26 nukleotider lokalisert i den mest 3' posisjon (vist fremhevet og understreket ovenfor) tilsvarende sekvensen av en av endene av den utkuttbare kassett att3aac+.

Det således oppnådde PCR-produkt ble benyttet for å transformere den hyperrekombinante E. Co/z-stamme DY330 (Yu et al. 2000) (denne stamme inneholder exo-, bet- og gaw-genene av X-fagene, integrert inn i sitt kromosom, disse gener uttrykkes ved 42°C, den ble benyttet i stedet for E. co/z-stammen KS272 (Chaveroche et al, 2000)) inneholdende kosmidet pSPM36. Således ble bakterien transformert ved elektroporering med dette PCR-produkt og klonene ble valgt med henblikk på deres resistens mot apramycin. Kosmidene av de oppnådde kloner ble ekstrahert og digestert med 5amHI-restriksjonsenzymet for å verifisere at den oppnådde digesteringsprofil tilsvarer den ventede profil hvis innføring av kassetten ( att3aac+) i or/2#c-genet hadde skjedd, det vil si hvis det virkelig hadde vært en homolog rekombinering mellom endene av PCR-produktet og målgenet. Konstruktet kan også verifiseres på en hvilken som helst kjent måte, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider, og sekvensering av PCR-produktet. En klon for hvilken kosmidet hadde den ventede profil ble valgt, og det tilsvarende kosmid kalt pSPM107. Dette kosmid er et derivat av pSPM36, der orf28c er brudt av a#3aac+-kassetten. Innføring av kassetten ledsages av en delesjon av orf28c-$ emt, interrupsjonen begynner ved den 28. kodon av orf28c. Etter kassetten er det tilbake minst 137 kodoner av orf28c.

Kosmidet pSPM107 ble i et første trinn innført i E. co/z-stammen DH5a og så i streptomyces ambofaciens- stammeri OSC2 ved protoplasttransformasjon. Etter transfomering ble klonene valgt med henblikk på deres resistens mot apramycin. De apramycinresistente kloner ble så subdyrket, henholdsvis på medium med apramycin (antibiotikum B) og på medium med puromycin (antibiotika A) (jamfør figur 9). Klonene som var resistente mot apramycin (ApraR) og sensitive for puromycin (PuroS) er i prinsippet de hvori dette har skjedd et dobbelt crossover-hendelse og som har orf28c- genet brudt av att3aac+-kassetten. Disse kloner ble mer spesielt valgt, og erstatning av villtypekopien av orf28c med kopien som er brudt med kassetten, ble verifisert ved hybridering. Således ble den totale DNA av de oppnådde kloner digestert med flere enzymer, separert på agarosegel, overført på en membran og hybridert med en probe tilsvarende a#3aac+-kassetten for å verifisere nærværet av kassetten ved den ventede lokus i den genomiske DNA av de oppnådde kloner. Genotypen kan også verifiseres ved en hvilken som helst metode som er velkjent for fagmannen, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet. En klon som viser de ventede karakteristika ( orf28c::att3aac+) ble mer spesielt valgt og betegnet SPM107. Denne klon har derfor genotypen: orf28c::att3aac+ og ble klat SPM107.1 lys av orienteringen av genene (jamfør figur 3), var det intet poeng å kutte ut kassetten for å studere effekten av inaktiveringen av orf28c. Det faktum at orf29 er orientert i motsatt retning av orf28c, viser at disse gener ikke er kotranskribert. Bruken av en utkuttbar kassett gjør det på den annen side mulig å bli kvitt seleksjonsmarkøren på et hvilket som helst tidspunkt, særlig ved transformering med plasmidet pOSV508.

For å teste effekten av å skru av orf28c- genet på spiramycinproduksjonen, ble spiramycinproduksjonen for stammen SPM107 testet ved den teknikk som er beskrevet i eksempe 15. Det var således mulig å vise at denne stamme har en spiramycin ikke-produserende fenotype. Dette viser at ør/25c-genet er et gen som er essensielt for spiramycin biosyntesen i S. ambofasiens.

Eksempel 30: Konstruksjon av en stamme av S. ambofaciens med knockout i or/ 31-genet

Orf31 -genet ble inaktivert ved bruk av teknikken ved utkuttbar kassett. Den utkuttbare kassett att3aac+ ble amplifisert ved PCR ved, som matriks, å benytte plasmidet pSPMlOl, og oligonukleotidene EDR71 og EDR72.

EDR71:

EDR72:

De 39 nukleotider som er lokalisert ved 5'-enden av disse oligonukleotider inneholder en sekvens som tilsvarer en sekvens i orf31-genet, og de 26 nukleotider som er lokalisert i den mest 3' posisjon (vist fremhevet og understreket ovenfor) tilsvarer sekvensen av en av endene av den utkuttbare kassett att3aac+.

Det således oppnådde PCR-produkt ble benyttet for å transformere E. Co/z-stamme KS272 inneholdende plasmidet pKOBEG og kosmidet pSPM36, som beskrevet av

Chaveroche et al (Chaveroche et al, 2000) (jamfør figur 12 for prinsippet, plasmidet pOS49.99 skal erstattes med kosmid pSPM36 og plasmidet som oppnås er ikke lenger pSPM17, men pSPM543). Således ble bakterien transformert med dette PCR-produkt ved elektroporering, og klonene ble valgt med henblikk på deres resistens mot apramycin. Kosmidene av de oppnådde kloner ble ekstrahert og digestert med flere restriksjonsenzymer med det formål å verifisere at den oppnådde digesteringsprofil tilsvarer den ventede profil hvis innføring av kassetten ( att3aac+) i or/ 31 -genet hadde skjedd, det vil si hvis det virkelig hadde vært en homolog rekombinering mellom endene av PCR-produktet og målgenet. Konstruktet kan også verifiseres på en hvilken som helst kjent måte, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider, og sekvensering av PCR-produktet. En klon for hvilken kosmidet hadde den ventede profil ble valgt, og det tilsvarende kosmid kalt pSPM543. Dette kosmid er et derivat av pSPM36, der or/ 31 er brudt av a#3aac+-kassetten (jamfør figur 12). Innføring av kassetten ledsages av en delesjon av or/ 31 -genet, interrupsjonen begynner ved den 36. kodon av or/ 31. Etter kassetten er de siste 33 kodoner av or/ 31 tilbake.

Kosmidet pSPM543 ble innført i streptomyces ambofaciens- stammen OSC2 (jamfør ovenfor) ved protoplasttransformasjon (Kieser, T. et al, 2000). Etter transfomering ble klonene valgt med henblikk på deres resistens mot apramycin. De apramycinresistente kloner ble så subdyrket, henholdsvis på medium med apramycin (antibiotikum B) og på medium med puromycin (antibiotika A) (jamfør figur 9). Klonene som var resistente mot apramycin (ApraR) og sensitive for puromycin (PuroS) er i prinsippet de hvori dette har skjedd et dobbelt crossover-hendelse og som har or/37-genet brudt med a#3aac+-kassetten. Disse kloner ble mer spesielt valgt, og erstatning av villtypekopien av or/ 31 med kopien som er brudt med kassetten, ble verifisert ved hybridering. Således ble den totale DNA av de oppnådde kloner digestert med flere enzymer, separert på agarosegel, overført på en membran og hybridert med en probe tilsvarende att3aac+-kassetten for å verifisere nærværet av kassetten ved den ventede lokus i den genomiske DNA av de oppnådde kloner. En andre hybridering ble gjennomført ved som probe å benytte et DNA-fragment oppnådd ved PCR, og tilsvarende en meget stor del av den kodende sekvens av or/ 31- genet.

Genotypen kan også verifiseres ved en hvilken som helst metode som er velkjent for fagmannen, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet.

En klon som viser de ventede karakteristika ( orf31::att3aac+) ble mer spesielt valgt og betegnet SPM543. Det var således mulig, ved hjelp av to hybrideringer, å verifisere at att31::att3aac+- kassetten virkelig var tilstede i klonens genom, og at digesteringsprofilen som var ventet i tilfelle erstatning, etter et dobbeltrekombineringshendelse, av villtypegen ved kopien brudt med att3aac+-kassetten i klonens genom, virkelig var oppnådd. Klonen har derfor genotypen: orf31::att3aac+ og ble klat SPM543.1 lys av orienteringen av genene (jamfør figur 3), var det intet poeng å kutte ut kassetten for å studere effekten av inaktiveringen av orf31. Det faktum at orf32c er orientert i motsatt retning av or/ 31, viser at disse gener ikke er kotranskribert. Bruken av en utkuttbar kassett gjør det på den annen side mulig å bli kvitt seleksjonsmarkøren på et hvilket som helst tidspunkt, særlig ved transformering med plasmidet pOSV508.

For å teste effekten av å skru av or/ 31 -genet på spiramycinproduksjonen, ble spiramycinproduksjonen for stammen SPM543 testet ved den teknikk som er beskrevet i eksempel 15. Det var således mulig å vise at denne stamme har en spiramycin ikke-produserende fenotype. Dette viser at or/ 31 -genet er et gen som er essensielt for spiramycin biosyntesen i S. ambofasiens.

Eksempel 31: Konstruksjon av en stamme av S. ambofaciens med en knockout i ør/?2c-genet

Ør/32c-genet ble inaktivert ved bruk av teknikken med utkuttbar kassett. Den utkuttbare kassett att3aac+ ble amplifisert ved PCR ved som matriks å benytte plasmidet pSPMlOl og å benytte de følgende primere:

KF52:

og KF53:

De 40 nukleotider som er lokalisert ved 5'-enden av disse oligonukleotider inneholder en sekvens tilsvarende en sekvens i orf32c- genet, og de 26 nukleotider lokalisert i den mest 3' posisjon (vist fremhevet og understreket ovenfor) tilsvarende sekvensen av en av endene av den utkuttbare kassett att3aac+.

Det således oppnådde PCR-produkt ble benyttet for å transformere den hyperrekombinante E. Co/z-stamme DY330 (Yu et al. 2000) inneholdende kosmidet pSPM36. Således ble bakterien transformert med dette PCR-produkt og elektroporering, og klonene ble valgt med henblikk på deres resistens mot apramycin. Kosmidene av de oppnådde kloner ble ekstrahert og digestert med ÆamHI-restriksjonsenzymene for å verifisere at den oppnådde digesteringsprofil tilsvarer den ventede profil hvis innføring av kassetten ( att3aac+) i or/32c-genet hadde skjedd, det vil si hvis det virkelig hadde vært en homolog rekombinering mellom endene av PCR-produktet og målgenet. Konstruktet kan også verifiseres på en hvilken som helst annen kjent måte, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider, og sekvensering av PCR-produktet. En klon for hvilken kosmidet hadde den ventede profil ble valgt, og det tilsvarende kosmid kalt pSPM106. Dette kosmid er et derivat av pSPM36, der orf32c er brudt av att3aac+-kassetten. Innføring av kassetten ledsages av en delesjon av or/32c-genet, interrupsjonen begynner ved den 112. kodon av orf32c. Etter kassetten er de siste 91 kodoner av orf32c tilbake.

Kosmidet pSPM106 ble i et første trinn innført i E. co/z-stammen DH5a og så i streptomyces ambofaciens- stammen OSC2 ved transformering. Etter transfomering ble klonene valgt med henblikk på deres resistens mot apramycin. De apramycinresistente kloner ble så subdyrket, henholdsvis på medium med apramycin (antibiotikum B) og på medium med puromycin (antibiotika A) (jamfør figur 9). Klonene som var resistente mot apramycin (ApraR) og sensitive for puromycin (PuroS) er i prinsippet de hvori dette har skjedd et dobbelt crossover-hendelse og som har ør/32c-genet brudt av azY3aac+-kassetten. Disse kloner ble mer spesielt valgt, og erstatning av villtypekopien av orf32c med kopien som er brudt med kassetten, ble verifisert ved hybridering. Således ble den totale DNA av de oppnådde kloner digestert med flere enzymer, separert på agarosegel, overført på en membran og hybridert med en probe tilsvarende a#3aac+-kassetten for å verifisere nærværet av kassetten i den genomiske DNA. Genotypen kan også verifiseres ved en hvilken som helst metode som er velkjent for fagmannen, og særlig ved PCR ved bruk av de egnede oligonukleotider og sekvensering av PCR-produktet.

En klon som viser de ventede karakteristika ( orf32c::att3aac+) ble valgt. Denne klon har derfor genotypen: orf32c::att3aac+ og ble klat SPM106.1 lys av orienteringen av genene (jamfør figur 3), var det intet poeng å kutte ut kassetten for å studere effekten av inaktiveringen av orf32c. Det faktum at orf33 er orientert i motsatt retning av orf32c, viser at disse gener ikke er kotranskribert. Bruken av en utkuttbar kassett gjør det på den annen side mulig å bli kvitt seleksjonsmarkøren på et hvilket som helst tidspunkt, særlig ved transformering med plasmidet pOSV508.

For å teste effekten av å skru av or/32c-genet på spiramycinproduksjonen, ble spiramycinproduksjonen for stammen SPM106 testet ved den teknikk som er beskrevet i eksempe 15. Det var således mulig å vise at denne stamme har en spiramycinproduserende fenotype. Dette viser at ør/32c-genet er et gen som er essensielt for spiramycin biosyntesen i S. ambofasierts.

Liste over konstruktene som er beskrevet i foreliggende beskrivelse

Liste over forkortelser: Am: Ampicillin; Hyg: Hygromycin; Sp: Spiramycin;

Ts: Tiostrepton; Cm: kloramfenikol. Kn: Kanamycin, Apra: apramycin.

Deponering av biologisk materiale

De følgende organismer ble deponert hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures and Microorganisms] (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. juli 2002, i henhold til Budapestavtalens regelverk.

-Stamme OSC2 under registreringsnummer 1-2908.

-Stamme SPM501 under registreringsnummer 1-2909.

-Stamme SPM502 under registreringsnummer 1-2910.

-Stamme SPM507 under registreringsnummer 1-2911.

-Stamme SPM508 under registreringsnummer 1-2912.

-Stamme SPM509 under registreringsnummer 1-2913.

-Stamme SPM21 under registreringsnummer 1-2914.

-Stamme SPM22 under registreringsnummer 1-2915.

-Stamme OS49.67 under registreringsnummer 1-2916.

-Stamme OS49.107 under registreringsnummer 1-2917.

- Escherichia Co/z-stamme DH5a inneholdende plasmidet pOS44.4, under registreringsnummer 1-2918.

De følgende organismer ble deponert hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures and Microorganisms] (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 26. februar 2003, i henhold til Budapestavtalens regelverk.

-Stamme SPM502 pSPM525 under registreringsnummer 1-2977.

De følgende organismer ble deponert hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures and Microorganisms] (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 6. oktober 2003, i henhold til Budapestavtalens regelverk.

-Stamme OSC2/pSPM75(2) under registreringsnummer 1-3101.

Bibliografi

- Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search toolJ Mol Biol. (1990). 215 (3):403-410. - Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. (1997). 25 (17):3389-402. - Amann,E., Ochs,B. and Abel,K.J. Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli Gene (1988) 69 (2), 301-315. - Arisawa,A., Kawamura,N., Tsunekawa,H., Okamura,K., Tone,H. and Okamoto,R. Cloning and nucleotide sequences of two genes involved in the 4"-0-acylation of macrolide antibiotics from Streptomyces thermotolerans. Biosci. Biotechnol. Biochem. (1993). 57 (12): 2020-2025. - Arisawa A, Kawamura N, Takeda K, Tsunekawa H, Okamura K, Okamoto R. Cloning of the macrolide antibiotic biosynthesis gene acyA, which encodes 3-0-acyltransferase, from Streptomyces thermotolerans and its use for direct fermentative production of a hybrid macrolide antibiotic. Appl Environ Microbiol. (1994). 60 (7):2657-2660. - August,P.R., Tang,L., Yoon,Y.J., Ning, Streptomyces, Mueller,R., Yu,T.W., Taylor,M., Hoffmann,D., Kim,C.G., Zhang,X., Hutchinson,C.R. and Floss,H.G. Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin: deductions from the molecular analysis of the rif biosynthetic gene cluster of Amycolatopsis mediterranei S699. Chem. Biol. (1998) 5 (2), 69-79. - Ausubel Fred M., Brent Roger, Kingston Robert E., Moore David D., Seidman J.G., Smith John A., Struhl Kevin (Editeurs). Current Protocols in Molecular Biology, published by John Wiley & Sons Inc. Current Protocols Customer Service, 605 Third Avenue, 9th Floor New York, NY 10158 USA (updated edition, March 2002).

Baltz RH, McHenney MA, Cantwell CA, Queener SW, Solenberg PJ. Applications of transposition mutagenesis in antibiotic producing streptomycetes. Antonie Van Leeuwenhoek. (1997). 71 (1-2): 179-187. - Bate N, Butler AR, Gandecha AR, Cundliffe E. Multiple regulatory genes in the tylosin biosynthetic cluster of Streptomyces fradiae. Chem Biol. (1999). 6 (9): 617-624. - Bate,N., Butler,A.R., Smith,I.P. and Cundliffe,E. The mykarose-biosynthetic genes of Streptomyces fradiae, producer of tylosin. Microbiology (2000). 146 (Pt 1), 139-146. - Bayley C, Morgan, Dale E. C, Ow D. W. Exchange of gene activity in transgenic plants catalysed by the Cre-lox site specific system. Plant Mol. Biol (1992). 18 :353-361. - Bentley,S.D., Chater,K.F., Cerdeno-Tarraga,A.M., Challis,G.L., Thomson,N.R., James,K.D., Harris,D.E., Quail,M.A., Kieser,H., Harper,D., Bateman,A., Brown,S., Chandra,G., Chen,C.W., Collins,M., Cronin,A., Fraser,A., Goble,A., HidalgoJ., Hornsby,T., Howarth,S., Huang,C.H., Kieser,T., Larke,L., Murphy,L., 01iver,K., 0'Neil,S., Rabbinowitsch,E., Rajandream,M.A., Rutherford,K., Rutter,S., Seeger,K., Saunders,D., Sharp,S., Squares,R., Squares,S., Taylor,K., Warren,T., Wietzorrek,A., Woodward,J., Barrell,B.G., Parkhill,J. and Hopwood,D.A. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature (2002). 417 (6885), 141-147.

Bibb MJ, Findlay PR, Johnson MW. The relationship between base composition and codon usage in bacterial genes and its use for the simple and reliable identification of protein-coding sequences. Gene. (1984) 30 (1-3): 157-166. - Bibb MJ, Janssen GR, Ward JM. Cloning and analysis of the promoter region of the erythromycin resistance gene (ermE) of Streptomyces erythraeus. Gene. (1985). 38 (1-3): 215-26. - Bibb MJ, White J, Ward JM, Janssen GR. The mRNA for the 23 S rRNA methylase encoded by the ermE gene of Saccharopolyspora erythraea is translated in the absence of a conventional ribosome-binding site. Mol Microbiol. (1994). 14 (3): 533-45. - Bierman M, Logan R, O'Brien K, Seno ET, Rao RN, Schoner BE. Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp. Gene. 1992;116(l):43-9. - Blondelet-Rouault M-H., Weiser J., Lebrihi A., Branny P. and Pernodet J-L. Antibiotic resistance gene cassettes derived from the Cl interposon for use in E. coli and Streptomyces. Gene (1997) 190 : 315-317. - Boccard F., Smokvina T., J.-L., Pernodet Fridmann A., and Guérineau M., Structural analysis of loci involved in pSAM2 site-specific integration in Streptomyces. Plasmid, (1989a). 21 : 59-70.

Boccard F., Smokvina T., J.-L., Pernodet Fridmann A., and Guérineau M.. The integrated conjugative plasmid pSAM2 of Streptomyces ambofaciens is related to temperate bacteriophages. EMBOJ. (1989b) 8 : 973-980.

Brunelli J.P., Pall M.L., A series of Yeast/ E. coli lambda expression vectors designed for directional cloning of cDNA and cre/lox mediated plasmid excision. Yeast. (1993) 9 : 1309-1318.

Camilli A., Beattie D. T. and Mekalanos J. J. Use of genetic recombination as a reporter of gene expression. Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1994) 91(7), 2634-2638.

- Campelo,A.B. and Gil,JA. The candicidin gene cluster from Streptomyces griseus IMRU 3570. Microbiology (2002) 148 (Pt 1), 51-59. - Carreras C, Frykman S, Ou S, Cadapan L, Zavala S, Woo E, Leaf T, Carney J, Burlingame M, Patel S, Ashley G, Licari P. Saccharopolyspora erythraea-catalyzed bioconversion of 6-deoxyerythronolide B analogs for production of novel erythromycins. J Biotechnol. (2002). 92(3): 217-28. - Chao K.-M., Pearson W.R., Miller W. Aligning two sequences within a specified diagonal band. Comput. Appl. Biosci. (1992) 8 : 481-487.

Chater K. F. The improving prospects for yield increase by genetic engineering in

antibiotic-producing Streptomycetes. Biotechnology. (1990). 8 (2): 115-121.

- Chaveroche MK, Ghigo JM, d'Enfert C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 2000; 28(22) :E97. - Church GM, Gilbert W. Genomic sequencing. Proe Nati Acad Sei USA. (1984) 81 (7):1991-5. - Churchward G, Belin D, Nagamine Y. A pSClOl-derived plasmid which shows no sequence homology to other commonly used cloning vectors. Gene. (1984) 31 (1-3): 165-71.

Comstock,L.E., Coyne,M.J., Tzianabos,A.O. and Kasper,D.L. Interstrain variation of the polysaccharide B biosynthesis locus of Bacteroides fragilis: characterization of the region from strain 638R J. Bacteriol. (1999). 181 (19): 6192-6196.

Cox KL, Baltz RH. Restriction of bacteriophage plaque formation in Streptomyces

spp. J Bacteriol. (1984) 159(2): 499-504. - Dale E.C., Ow D.W., Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1991). 88 : 10558-10562.

Doumith M, Weingarten P, Wehmeier UF, Salah-Bey K, Benhamou B, Capdevila C,

Michel JM, Piepersberg W, Raynal MC. Analysis of genes involved in 6-deoxyhexose biosynthesis and transfer in Saccharopolyspora erythraea. Mol Gen Genet. (2000) 264(4): 477-485.

Draeger,G., Park,Streptomyces-H.H. and Floss,H.G. Mechanism of the 2-deoxygenation step in the biosynthesis of the deoxyhexose moieties of the antibiotics granaticin and oleandomycin J. Am. Chem. Soc. (1999) 121: 2611-2612.

Gandecha,A.R., Large,S.L. and Cundliffe,E. Analysis of four tylosin biosynthetic genes from the tylLM region of the Streptomyces fradiae genome. Gene. (1997). 184 (2): 197-203.

Geistlich,M., Losick,R., TurnerJ.R. and Rao,R.N. Characterization of a novel regulatory gene governing the expression of a polyketide synthase gene in Streptomyces ambofaciens. Mol. Microbiol. (1992). 6 (14): 2019-2029.

Gourmelen A, Blondelet-Rouault MH, Pernodet JL. Characterization of a glycosyl transferase inactivating macrolides, encoded by gimA from Streptomyces ambofaciens. Antimicrob Agents Chemother. (1998). 42(10): 2612-9. - Huang X. and Miller W. A time-efficient, linear-space local similarity algorithm. Adv. Appl. Math. (1991). 12 : 337-357.

Hara O and Hutchinson CR. Cloning of midecamycin(MLS)-resistance genes from Streptomyces mycarofaciens, Streptomyces lividans and Streptomyces coelicolor A3(2). JAntibiot ( Tokyo). (1990). 43 (8):977-991.

Hara O and Hutchinson CR. A macrolide 3-O-acyltransferase gene from the midecamycin-producing species Streptomyces mycarofaciens. J Bacteriol. (1992). 174(15) :5141-5144. - Hoffmeister D, Ichinose K, Domann S, Faust B, Trefzer A, Drager G, Kirschning A, Fischer C, Kunzel E, Bearden D, Rohr J and Bechthold A. The NDP-sugar co-substrate concentration and the enzyme expression level influence the substrate specificity of glycosyltransferases: cloning and characterization of deoxysugar biosynthetic genes of the urdamycin biosynthetic gene cluster. Chem Biol. (2000). 7 (11):821-831. - Hopwood, D.A. Future possibilities for the diskovery of new antibiotics by genetic engineering. In Beta-lactam antibiotics. Edited by M. R. J. Salton and G. D. Shockman. New York: Academic Press. (1981). 585-598. - Hopwood D. A., Malpartida F., Kieser H. M., Ikeda H., Duncan J., Fujii I., Rudd A. M., Floss H. G. and Omura S. Production of 'hybrid' antibiotics by genetic engineering. Nature. (1985a). 314 (6012): 642-644. - Hopwood D. A., Malpartida F., Kieser H. M., Ikeda H. and Omura S. (1985b) In Microbiology ( ed S. Silver). American Society for Microbiology, Washington D. C, 409-413.

Houben Weyl, 1974, in Methode der Organischen Chemie [Methods in Organic

Chemistry], E. Wunsch Ed., Volume 15-1 and 15-11,

Hutchinson, CR. Prospects for the diskovery of new (hybrid) antibiotics by genetic

engineering of antibiotic-producing bacteria. Med Res Rev. (1988). 8 (4): 557-567.

- Hutchinson C. R., Borell C. W., Otten S. L., Stutzman-Engwall K. J. and Wang Y. Drug diskovery and development through the genetic engineering of antibiotic-producing microorganisms/. Med. Chem. (1989) 32 (5): 929-937. Ishikawa J, Hotta K. FramePlot: a new implementation of the frame analysis for predicting protein-coding regions in bacterial DNA with a high G + C content. FEMSMicrobiolLett. (1999) 174(2):251-3. - Kieser, T, Bibb, MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA. Practical Streptomyces Genetics. 2000. The John Innes Foundation, Norwich UK.

Kuhstoss and al. Production of a novel polyketide through the construction of a

hybrid polyketide synthase. Gene. (1996). 183(1-2): 231-236.

- Lacalle RA, Pulido D, Vara J, Zalacain M, Jimenez A. Molecular analysis of the pac gene encoding a puromycin N-acetyl transferase from Streptomyces alboniger. Gene.

(1989). 79(2):375-380. - Lakso M, Sauer B, Mosinger B Jr, Lee EJ, Manning RW, Yu SH, Mulder KL, Westphal H. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proe Nati Acad Sei U SA. (1992) 89 (14) :6232-6. - Li,T.B., Shang,G.D., Xia,H.Z. and Wang,Y.G. Cloning of the sugar related biosynthesis gene cluster from Streptomyces tenebrarius H6. Sheng Wu Gong Cheng XueBao (2001). 17 (3): 329-331. - LigonJ., Hill,S., Beck,J., Zirkle,R., Molnar,I., ZawodnyJ., Money,S. and Schupp,T. Characterization of the biosynthetic gene cluster for the antifungal polyketide soraphen A from Sorangium cellulosum So ce26. Gene (2002). 285 (1-2), 257-267. - Liu L, Saevels J, Louis P, Nelis H, Rico S, Dierick K, Guyomard S, Roets E, Hoogmartens J. Interlaboratory study comparing the microbiological potency of spiramycins I, II and III. JPharm BiomedAnal. (1999). 20 (l-2):217-24. - Mazodier P, Petter R, Thompson C. Intergeneric conjugation between Escherichia coli and Streptomyces species JBacteriol. (1989). 171 (6):3583-5.

- Merrifield RB, 1965a, Nature, 207(996): 522-523.

- Merrifield RB., 1965b, Science, 150(693): 178-185.

Merson-Davies,L.A. and Cundliffe,E. Analysis of five tylosin biosynthetic genes from the tyllBA region of the Streptomyces fradiae genome, Molecular microbiology. (1994). 13 (2): 349-355. - Miller VL, Mekalanos JJ. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. JBacteriol. (1988) 170(6):2575-83. - Nakano, Y., Yoshida, Y., Yamashita, Y. & Koga, T. Construction of a series of pACYC-derived plasmid vectors. Gene (1995). 162 : 157-8. - Nielsen FL, Engelbrecht J., Brunak S. et von Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering. (1997). 10: 1-6.

Oh SH, Chater KF. Denaturation of circular or linear DNA facilitates targeted integrative transformation of Streptomyces coelicolor A3(2): possible relevance to other organisms. JBacteriol. 1997; 179 (1): 122-7. - Olano C, Lomovskaya N, Fonstein L, Roll JT, Hutchinson CR. A two-plasmid system for the glycosylation of polyketide antibiotics: bioconversion of epsilon-rhodomycinone to rhodomycin D. Chem Biol. (1999). 6 (12):845-55.

Omura S, Kitao C, Hamada H, Ikeda H. Bioconversion and biosynthesis of 16-membered macrolide antibiotics. X. Final steps in the biosynthesis of spiramycin, using enzyme inhibitor: cerulenin. Chem Pharm Bull ( Tokyo). (1979a). 27(1): 176-82. - Omura S, Ikeda H, Kitao C. Isolation and properties of spiramycin I 3-hydroxyl acylase from Streptomyces and ambofaciens. J Biochem (Tokyo). (1979b). 86(6): 1753-8.

Omura,S., Ikeda,H., Ishikawa,J., Hanamoto,A., Takahashi,C, Shinose,M.,

Takahashi,Y., Horikawa,H., Nakazawa,H., Osonoe,T., Kikuchi,H., Shiba,T., Sakaki,Y. and Hattori,M. Genome sequence of an industrial microorganism Streptomyces avermitilis: Deducing the ability of producing secondary metabolites. Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. (2001). 98 (21), 12215-12220. - Pearson W.R. and D. J. Lipman. Improved Tools for Biological Sequence Analysis. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1988, 85: 2444-2448. - Pearson W. R. Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA. Methods in Enzymology. 1990,183: 63-98. - Pernodet JL, Simonet JM, Guérineau M. Plasmids in different strains of Streptomyces ambofaciens: free and integrated form of plasmid pSAM2. Mol Gen Genet. (1984);198 (1):35-41. - Pernodet JL, Alegre MT, Blondelet-Rouault MH, Guérineau M. Resistance to spiramycin in Streptomyces ambofaciens, the producer organism, involves at least two different mechanisms. J Gen Microbiol. (1993); 139 (Pt 5): 1003-11. - Pernodet JL, Fish S, Blondelet-Rouault MH, Cundliffe E. The macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance phenotypescharacterized byusing a specifically deleted, antibiotic-sensitive strain of Streptomyces lividans. Antimicrob Agents Chemother. (1996), 40 (3): 581-5. - Pernodet JL, Gourmelen A, Blondelet-Rouault MH, Cundliffe E. Dispensable ribosomal resistance to spiramycin conferred by srmA in the spiramycin producer Streptomyces ambofaciens. Microbiology. (1999), 145 (Pt 9):2355-64. Pfoestl,A., Hofinger,A., Kosma,P. and Messner,P. Biosynthesis of dTDP-3- acetamido-3,6-dideoxy-alpha-D-galactose in Aneurinibacillus thermoaerophilus L420-91T. J. Biol. Chem. (2003), 278 (29): 26410-26417. - Rao RN, Richardson MA, Kuhstoss S. Cosmid shuttle vectors for cloning and analysis of Streptomyces DNA. Methods Ertzymol. (1987); 153: 166-98. - Raynal A, Tuphile K, Gerbaud C, Luther T, Guérineau M, and Pernodet JL.. Structure of the chromosomal insertion site for pSAM2: functional analysis in Escherichia coli. Molecular Microbiology (1998) 28 (2) 333-342. - Redenbach,M., Kieser,H.M., Denapaite,D., Eichner,A., CullumJ., Kinashi,H. and Hopwood,D.A. A set of ordered cosmids and a detailed genetic and physical map for the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome Mol. Microbiol. (1996). 21 (1): 77-96. Richardson MA, Kuhstoss S, Solenberg P, Schaus NA, Rao RN. A new shuttle cosmid vector, pKC505, for streptomycetes: its use in the cloning of three different spiramycin-resistance genes from a Streptomyces ambofaciens library. Gene. (1987); 61 (3):231-41.

Robinson, J.A. Enzymes of Secondary Metabolism in Microorganisms. Chem Soc

Rev. (1988). 17 :383-452.

Russell SH, Hoopes JL, Odell JT. Directed excision of a transgene from the plant

genome. Mol Gen Genet. (1992). 234 (1): 49-59.

Sambrook J, Frisch EF, Maniatis T . Molecular Cloning : a laboratory manual 2<nd>ed.

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York USA (1989).

- Schoner B, Geistlich M, Rosteck P Jr, Rao RN, Seno E, Reynolds P, Cox K, Burgett S and Hershberger C. Sequence similarity between macrolide-resistance determinants and ATP-binding transport proteins. Gene. (1992). 115 (1-2), 93-96.

Sezonov G, Hagege J, Pernodet JL, Friedmann A and Guérineau M. Characterization of pra, a gene for replication control in pSAM2, the integrating element of Streptomyces ambofaciens. Mol Microbiol. (1995). 17(3): 533-44.

Sezonov G., Blanc V., Bamas-Jacques N., Friedmann A., Pernodet J.L. and M.

Guérineau, Complete conversion of antibiotic precursor to pristinamycin IIA by over expression of Streptomyces pristinaespiralis biosynthetic genes, Nature Biotechnology. (1997) 15 : 349-353.

Sezonov G, Possoz C, Friedmann A, Pernodet JL, Guérineau M. KorSA from the Streptomyces integrative element pSAM2 is a central transcriptional repressor: target genes and binding sites. JBacteriol. (2000). 182(5): 1243-50.

Simon R., Priefer U and Puhler. A broad host range mobilisation system for in vivo genetic engeneering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Bio/ Technology (1983). 1 : 784-791.

Simon, and al., Plasmid vectors for the genetic analysis and manipulation of rhizobia and other gram-negative bacteria, p. 640-659. In A. Weissbach, and H. Weissbach (eds.), Methods in enzymology, vol 118, Academic Press, Inc., Orlando, 1986

Summers,R.G., Donadio,Streptomyces, Staver,M.J., Wendt-Pienkowski,E.,

Hutchinson,C.R. and Katz,L. Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mykarose and D-desosamine production. Microbiology (1997). 143 (Pt 10): 3251-3262. - Van Mellaert L, Mei L, Lammertyn E, Schacht S, Anne J. Site-specific integration of bacteriophage VWB genome into Streptomyces venezuelae and construction of a VWB-based integrative vector. Microbiology. (1998). 144 (Pt 12): 3351-8. - Vara J, Lewandowska-Skarbek M, Wang YG, Donadio S, Hutchinson CR.Cloning of genes governing the deoxysugar portion of the erythromycin biosynthesis pathway in Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythreus). J Bacteriol. (1989). 171(11): 5872-81. - Vara J, Malpartida F, Hopwood DA, Jimenez A. Cloning and expression of a puromycin N-acetyl transferase gene from Streptomyces alboniger in Streptomyces lividans and Escherichia coli. Gene. (1985). 33(2): 197-206.

Wahl, G. M., K. A. Lewis, J. C. Ruiz, B. Rothenberg, J. Zhao, and G. A. Evans.

Cosmid vectors for rapid genomic walking, restriction mapping, and gene transfer. Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1987). 84: 2160-2164. - Waldron,C, Matsushima,P., Rosteck,P.R., Broughton,M.C, TurnerJ., Madduri,K., Crawford,K.P., Merlo,D.J. and Baltz,R.H. Cloning and analysis of the spinosad biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora spinosa(l) Chem. Biol. (2001) 8 (5): 487-499.

Walczak RJ, Hines JV, Strohl WR, Priestley ND.Bioconversion of the anthracycline analogue desacetyladriamycin by recombinant DoxA, a P450-monooxygenase from Streptomyces sp. strain C5. Org Lett. (2001). 3 (15):2277-9.

Wang,Z.X., Li,S.M. and Heide,L. Identification of the coumermycin A(l)

biosynthetic gene cluster of Streptomyces rishiriensis DSM 40489. Antimicrob. Agents Chemother. (2000) 44 (11), 3040-3048. - Ward, J.M., Janssen, G.R., Kieser, T, Bibb, M.J., Buttner, M.J. & Bibb, M.J. Construction and characterization of a series of multi-copy promoter-probe plasmid vectors for Streptomyces using the aminoglycoside phosphotransferase from Tn5 as indicator. Mol Gen Genet (1986). 203 : 468-478.

Wehmeier UF. New multifunctional Escherichia coli-Streptomyces shuttle vectors

allowing blue-white screening on XGal plates. Gene. (1995). 165(1): 149-150.

Wilms B, Hauck A, Reuss M, Syldatk C, Mattes R, Siemann M, Altenbuchner J.

High-cell-density fermentation for production of L-N-carbamoylase using an expression system based on the Escherichia coli rhaBAD promoter. Biotechnol Bioeng. (2001). 73(2) :95-103. - Worley K. C, Wiese B. A., and Smith R. F. BEAUTY: An enhanced BLAST-based search tool that integrates multiple biological information resources into sequence similarity search results. Genome Research (1995). 5: 173-184. - Wu K, Chung L, Revill WP, Katz L and Reeves CD. The FK520 gene cluster of Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891) contains genes for biosynthesis of unusual polyketide extender units. Gene. (2000). 251 (1): 81-90.

Xue Y, Zhao L, Liu HW and Sherman DH. A gene cluster for macrolide antibiotic biosynthesis in Streptomyces venezuelae: architecture of metabolic diversity. Proe Nati Acad Sei U SA. (1998). 95 (21): 12111-12116.

Yu D, Ellis HM, Lee EC, Jenkins NA, Copeland NG et Court DL. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proe Nati Acad Sei USA. (2000). 97(11): 5978-83.

Claims

1. Polynukleotid som koder for et polypeptid involvert i spiramycin biosyntesen,karakterisert vedat sekvensene for polynukleotidet er : (a) en av sekvensene SEQ ID-nr. 111 eller 141; (b) en av sekvensene avledet fra sekvensens (a) ved degenerering av den genetiske kode; eller (c) et polunukleotid som har minst 80 %, 90 %, 95 % eller 98 % nukleotididentitet med et polynukleotid med sekvens (a).

2. Polyonukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat det er isolert fra en bakterie av genus Streptomyces.

3. Polypeptid,karakterisert vedat det er resultat av ekspresjonen av et polynukleotid som angitt i krav 1 eller 2.

4. Polypeptid ifølge krav 3,karakterisert vedat det er involvert i spiramycin biosyntesen.

5. Polypeptid ifølge krav 3 eller 4,karakterisert vedat polypeptidet har en sekvens som omfatter SEQ ID-nr. 142.

6. Polypeptid ifølge krav 3 eller 4,karakterisert vedat polypeptidet har en sekvens som omfatter SEQ ID-nr. 112.

7. Ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter minst en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som angitt i hvilket som helst av kravene 3-6.

8. Ekspresjonssystem,karakterisert vedat det omfatter en egnet ekspresjonsvektor og en vertscelle som tillater ekspresjon av ett eller flere polypeptider som angitt i hvilket som helst av kravene 3-6.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge hvilket som helst av kravene 3-6,karakterisert vedat den omfatter følgende trinn: a) innføring av minst en nukleinsyre som koder for nevnte polypeptid i en egnet vektor; b) dyrking, i et egnet kulturmedium, av en vertscelle som er transformert eller transfektert på forhånd med vektoren fra trinn a); c) gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller et celleekstrakt; d) separering og rensing av nevnte polypeptid fra kulturmediet eller fra celleekstraktet oppnådd i trinn c); og e) der det er aktuelt, karakterisering av det fremstilte rekombinante polypeptid.

10. Makrolidproduserende mutant mikroorganisme,karakterisertv e d at den har en genetisk modifikasjon i minst ett gen som omfatter en sekvens som angitt i krav 1 eller 2, og/eller som overuttrykker minst ett gen som omfatter en sekvens som angitt i krav 1 eller 2.

11. Mutant mikroorganisme ifølge krav 10,karakterisertv e d at overekspresjonen av det angjeldende gen oppnås ved å øke kopiantallet for dette gen og/eller innføring av en promoter som er mer aktiv enn villtypepromoteren.

12. Mutant mikroorganisme ifølge krav 10 eller 11,karakterisertv e d at den genetiske modifikasjon gjennomføres i ett eller flere gener omfattende en sekvens tilsvarende en eller flere av sekvensene SEQ ID-nr. 111 eller 141, eller en variant derav, eller en av sekvensene avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode.

13. Mutantmikroorganisme ifølge hvilket som helst av kravene 10-12,karakterisert vedat mikroorganismen overuttrykker ett eller flere gener som omfatter en av sekvensene tilsvarende en eller flere av sekvensene SEQ ID-nr. 111 eller 141, eller en av dens varianter, eller en av sekvensene avledet derfra på grunn av degenerering av den genetiske kode.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av makrolider,karakterisertv e d at den omfatter følgende trinn: (a) dyrking, i et egnet kulturmedium, av en mikroorganisme som angitt i hvilket som helst av kravene 10-13; (b) gjenvinning av det kondisjonerte kulturmedium eller et celleekstrakt; og (c) separering og rensing av nevnte makrolid(er) som er fremstilt fra kulturmediet eller fra celleekstraktet oppnådd under trinn (b).

15. Anvendelse av en sekvens og/eller av et rekombinant DNA og/eller av en vektor som angitt i hvilket som helst av kravene 1,2, 7 og 8 for fremstilling av hybride antibiotika.

16. Stamme av streptomyces ambofaciens som angitt i hvilket som helst av kravene 10-13,karakterisert vedat den er stammen OSC2/pSPM75(l) eller stammen OSC2/pSPM75(2) deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Cultures and Microorganisms] (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 6. oktober 2003, under registreringsummeret 1-3101.

17. Vertscelle,karakterisert vedat den har innført minst ett polynukleotid som angitt i krav 1.