EP1551975A2 - Polypeptides impliques dans la biosynthese des spiramycines, sequences nucleotidiques codant ces polypeptides et leur utilisation - Google Patents

Polypeptides impliques dans la biosynthese des spiramycines, sequences nucleotidiques codant ces polypeptides et leur utilisation

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EP1551975A2
EP1551975A2 EP03807883A EP03807883A EP1551975A2 EP 1551975 A2 EP1551975 A2 EP 1551975A2 EP 03807883 A EP03807883 A EP 03807883A EP 03807883 A EP03807883 A EP 03807883A EP 1551975 A2 EP1551975 A2 EP 1551975A2
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EP
European Patent Office
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gene
sequence
microorganism
seq
polypeptide
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03807883A
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German (de)
English (en)
Inventor
Marie-Hélène BLONDELET-ROUAULT
Hélène DOMINGUEZ
Emmanuelle Darbon-Rongere
Claude Gerbaud
Anne Gondran
Fatma Karray
Patricia Lacroix
Nathalie Oestreicher-Mermet- Bouvier
Jean-Luc Pernodet
Karine Tuphile
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Aventis Pharma SA
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Publication date
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • the present invention relates to the isolation and identification of new genes from the biosynthetic pathway for spiramycins and to new polypeptides involved in this biosynthesis. It also relates to the use of these genes in order to increase the production rates and the purity of the spiramycin produced.
  • the invention also relates to the use of these genes for the construction of mutants which may lead to the synthesis of new antibiotics or to forms derived from spiramycins.
  • the invention also relates to the molecules produced by the expression of these genes and finally to pharmacologically active compositions of a molecule produced by the expression of such genes.
  • Spiramycin is an antibiotic from the macrolide family, useful in both veterinary and human medicine. Macrolides are characterized by the presence of a lactone cycle on which one or more sugars are grafted. Streptomyces ambofaciens produces in its natural state spiramycin I, II and III (cf. Figure 1), however the antibiotic activity of spiramycin I is clearly superior to that of spiramycins II and III (Liu et al, 1999).
  • the spiramycin I molecule consists of a lactonic macro-cycle, called platenolide and three sugars: forosamine, mycaminose and mycarose (see Figure 1).
  • the antibiotic activity of spiramycins is due to an inhibition of protein synthesis in prokaryotes by a mechanism involving the binding of the antibiotic to the bacterial ribosome.
  • the product FK506 has immunosuppressive effects and offers prospects for therapeutic application in the field of organ transplantation, rheumatoid arthritis and more generally in pathologies linked to autoimmune reactions.
  • Other macrolides like avermectin have insecticidal and anti-helminthic activities.
  • Spiramycins belong to the large class of polyketides which groups together complex molecules which are particularly abundant in soil microorganisms. These molecules are grouped together not by analogy of structure but by a certain similarity at the level of stages of their path of biosynthesis. Indeed, polyketides are produced by a complex series of reactions but have in common that they have in their biosynthetic pathway a series of reactions catalyzed by one or more enzymes called “polyketides synthases” (PKS).
  • PPS polyketides synthases
  • the biosynthetic pathway for spiramycins is a complex process and it would be desirable to identify and suppress unwanted reactions that may exist during this process.
  • the purpose of such manipulation is to obtain a purer antibiotic and / or an improvement in productivity.
  • Streptomyces ambofaciens produces in its natural state spiramycin I, II and III (cf. Figure 1), however the antibiotic activity of spiramycin I is clearly superior to that of spiramycin II and III (Liu et al, 1999). It would therefore be desirable to have available strains producing only spiramycin I.
  • the present invention results from the cloning of genes whose product is involved in the biosynthesis of spiramycins.
  • the invention relates first of all to new genes of the biosynthetic pathway for spiramycins and to new polypeptides involved in this biosynthesis.
  • the biosynthetic pathway genes and associated coding sequences were cloned and the DNA sequence of each was determined.
  • the cloned coding sequences will hereinafter be designated orfI * c, or ⁇ * c, or ⁇ * c, orf4 * c, or ⁇ *, orf ⁇ *, or ⁇ * c, or ⁇ *, or ⁇ *, orflO *, orfl, or ⁇ , or ⁇ , or ⁇ , or ⁇ , orf ⁇ , or ⁇ , or ⁇ c, orflO, orfllc, orf! 2, orfl 3c, orfI4, orfl 5c, orfl 6, orf! 7, orf!
  • the present invention also relates to a polynucleotide which hybridizes under hybridization conditions of high stringency to at least one of the polynucleotides according to paragraph 1) above.
  • the invention also relates to a polynucleotide having at least 70%
  • nucleotide identity with a polynucleotide comprising at least 10, 12, 15, 18, 20 to 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 , 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300 , 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 or 1900 consecutive nucleotides of a polynucleotide according to paragraph 1) above.
  • the invention also relates to a polynucleotide according to paragraph 2) or 3) above, characterized in that it is isolated from a bacterium of the genus Streptomyces.
  • the invention also relates to a polynucleotide according to paragraph 2), 3) or 4) above, characterized in that it codes for a protein involved in the biosynthesis of a macrolide.
  • the invention also relates to a polynucleotide according to paragraph 2), 3) or 4) above characterized in that it codes for a protein having an activity similar to the protein encoded by the polynucleotide with which it hybridizes or it presents identity.
  • Another subject of the invention relates to a polypeptide having at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95% or 98% of amino acid identity with a polypeptide comprising at least 10, 15, 20, 30 to 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 or 640 consecutive amino acids of a polypeptide according to paragraph 8) above.
  • Another aspect of the invention relates to a polypeptide according to paragraph 9) above, characterized in that it is isolated from a bacterium of the genus Streptomyces.
  • Another aspect of the invention relates to a polypeptide according to paragraph 9) or 10) above, characterized in that it codes for a protein involved in the biosynthesis of a macrolide.
  • Another aspect of the invention relates to a polypeptide according to paragraph 9), 10) or 11) above characterized in that it has an activity similar to that of the polypeptide with which it shares identity.
  • Another aspect of the invention relates to a recombinant DNA characterized in that it comprises at least one polynucleotide according to one of paragraphs 1), 2), 3), 4), 5) or 6) above .
  • Another aspect of the invention relates to a recombinant DNA according to paragraph 13) above, characterized in that the said recombinant DNA is included in a vector.
  • Another aspect of the invention relates to a recombinant DNA according to paragraph 14) above, characterized in that said vector is chosen from bacteriophages, plasmids, phagemids, integrative vectors, fosmids, cosmids, shuttle vectors, BAC or PAC.
  • Another aspect of the invention relates to a recombinant DNA according to paragraph 15) above, characterized in that it is chosen from pOS49.1, pOS49.11, pOSC49.12, pOS49.14, pOS49.16, pOS49.28, pOS44.1, pOS44.2, pOS44.4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, pOS49.88, pOS49.106, pOS49.120, pOS49.107, pOS49.32, pOS49.43, pOS49.
  • the invention also relates to an expression system comprising an appropriate expression vector and a host cell allowing the expression of one or more polypeptides according to paragraph 7), 8), 9), 10), 11) or 12) above.
  • the invention also relates to an expression system according to paragraph 18 above, characterized in that it is chosen from prokaryotic expression systems or eukaryotic expression systems.
  • the invention also relates to an expression system according to paragraph 19) above, characterized in that it is chosen from expression systems in the E. coli bacterium, baculovirus expression systems allowing expression in insect cells, expression systems for expression in yeast cells, expression systems for expression in mammalian cells.
  • the invention also relates to a host cell into which has been introduced at least one polynucleotide and / or at least one recombinant DNA and / or at least one expression vector according to one of the paragraphs 1), 2) , 3), 4), 5), 6), 13), 14), 15), 16) or 17) above.
  • the invention also relates to a method for producing a polypeptide according to paragraph 7), 8), 9), 10), 11) or 12) above characterized in that said method comprises the following steps : a) inserting at least one nucleic acid encoding said polypeptide into an appropriate vector; b) cultivating, in an appropriate culture medium, a host cell previously transformed or transfected with the vector of step a); c) recovering the conditioned culture medium or a cell extract; d) separating and purifying from said culture medium or also from the cell extract obtained in step c), said polypeptide; e) where appropriate, characterize the recombinant polypeptide produced.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism blocked in a stage of the biosynthesis pathway of at least one macrolide.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 23) above, characterized in that it is obtained by inactivating the function of at least one protein involved in the biosynthesis of this or these macrolides in a microorganism producing this or these macrolide (s).
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 24) above, characterized in that the inactivation of this or these proteins is carried out by mutagenesis in the gene or genes encoding said protein or proteins or by expression one or more antisense RNAs complementary to the RNA or messenger RNAs encoding said protein (s).
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 25) above, characterized in that the inactivation of this or these proteins is carried out by mutagenesis by irradiation, by the action of chemical mutagenic agent, by mutagenesis directed or by gene replacement.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 25) or 26) above, characterized in that the mutagenesis or mutagens are carried out in vitro or in situ, by suppression, substitution, deletion and / or addition of one or more bases in the gene or genes considered or by gene inactivation.
  • microorganism is a bacteria of the genus Streptomyces.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 23), 24), 25), 26), 27) or 28) above characterized in that the macrolide is spiramycin.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 23), 24), 25), 26), 27), 28) or 29) above characterized in that said microorganism is a strain of S. ambofaciens.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31) or 32) above characterized in that the mutagenesis consists of l gene inactivation of a gene comprising a sequence corresponding to the sequence SEQ ID No. 13.
  • Another aspect of the invention relates to a strain of Streptomyces ambofaciens characterized in that it is a strain chosen from one of the strains deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) on 10 July 2002 under registration number 1-2909, 1-2911, 1-2912, 1- 2913, 1-2914, 1-2915, 1-2916 or 1-2917.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • Another aspect of the invention relates to a process for the preparation of a macrolide biosynthesis intermediate, characterized in that it comprises the following steps: a) cultivating, in an appropriate culture medium, a microorganism according to one paragraphs 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31), 32), 33) or 34) above, b) recover the conditioned culture medium or a cell extract, c) separate and purify from said culture medium or again from the cell extract obtained in step b), said biosynthesis intermediate.
  • Another aspect of the invention relates to a process for the preparation of a molecule derived from a macrolide, characterized in that a biosynthesis intermediate is prepared according to the process of paragraph 35) above and that one modifies the intermediary thus produced.
  • Another aspect of the invention relates to a preparation process according to paragraph 36) above, characterized in that said intermediate is modified by chemical, biochemical, enzymatic and / or microbiological means.
  • Another aspect of the invention relates to a preparation process according to paragraph 36) or 37) above, characterized in that one or more genes encoding proteins capable of modifying the intermediate are introduced into said microorganism. using it as a substrate.
  • Another aspect of the invention relates to a preparation process according to paragraph 36), 37) or 38) above, characterized in that the macrolide is spiramycin.
  • Another aspect of the invention relates to a preparation process according to paragraph 36), 37), 38) or 39) above characterized in that the microorganism used is a strain of S. ambofaciens.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism producing spiramycin I but not producing spiramycin II and m
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 41) above, characterized in that it comprises all of the genes necessary for the biosynthesis of spiramycin I but that the gene comprising the sequence SEQ ID N ° 13 or one of its variants or one of the sequences derived therefrom due to the degeneracy of the genetic code and encoding a polypeptide of sequence SEQ ID No 14 or one of its variants is not expressed or has been rendered inactive.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 42) above, characterized in that said inactivation is carried out by mutagenesis in the gene encoding said protein or by the expression of a complementary antisense RNA messenger RNA encoding said protein.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 43) above, characterized in that said mutagenesis is carried out in the promoter of this gene, in the coding sequence or in a non-coding sequence so as to render inactivate the encoded protein or prevent its expression or translation.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to claim 43) or 44) above characterized in that the mutagenesis is carried out by irradiation, by the action of a chemical mutagenic agent, by directed mutagenesis or by gene replacement .
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 43), 44) or 45) above, characterized in that the mutagenesis is carried out in vitro or in situ, by suppression, substitution, deletion and / or addition one or more bases in the gene under consideration or by gene inactivation.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to ; paragraph 41) or 42) above, characterized in that said microorganism is obtained; by expressing the genes of the spiramycin biosynthesis pathway without these comprising the gene comprising the sequence corresponding to SEQ ID No. 13 or one of its variants or one of the sequences derived from these in due to the degeneracy of the genetic code and encoding a polypeptide of sequence SEQ ID No. 14 or one of its variants.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 41), 42), 43), 44), 45), 46) or 47) above characterized in that said microorganism is a bacterium of the genus Streptomyces .
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47) or 48) above characterized in that said microorganism is obtained at from a starting strain producing spiramycins I, II and III. 50) Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48) or 49) above, characterized in that it is obtained by mutagenesis in a gene comprising the sequence corresponding to SEQ ID No. 13 or one of its variants or one of the sequences derived therefrom due to the degeneration of the genetic code and coding a polypeptide of sequence SEQ ID No. 14 or one of its variants having the same function.
  • microorganism according to paragraph 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49) or 50) above characterized in that that said microorganism is obtained from a strain of S. ambofaciens producing spiramycins I, II and III, in which a gene inactivation of the gene comprising the sequence corresponding to SEQ ID No. 13 or one of the sequences derived is carried out of it due to the degeneration of the genetic code.
  • Another aspect of the invention relates to a strain of S. ambofaciens characterized in that it is the strain deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) on July 10, 2002 under the number, d 1-2910.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • Another aspect of the invention relates to a process for the production of spiramycin I, characterized in that it comprises the following steps:
  • step b separate and purify from said culture medium or also from the cell extract obtained in step b), spiramycin I.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a polynucleotide according to one of paragraphs 1), 2), 3), 4), 5) or 6) above to improve the production of macrolides d 'a microorganism.
  • Another aspect of the invention relates to a mutant macrolide-producing microorganism characterized in that it has a genetic modification in at least one gene comprising a sequence according to one of paragraphs 1), 2), 3), 4 ), 5) or 6) above and / or that it overexpresses at least one gene comprising a sequence according to one of paragraphs 1), 2), 3), 4), 5) or 6) above .
  • Another aspect of the invention relates to a mutant microorganism according to paragraph 55) above, characterized in that the genetic modification consists of a deletion, a substitution, a deletion and / or an addition of one or more bases in the gene or genes considered for the purpose of expressing one or more proteins having a higher activity or of expressing a higher level of this or these proteins.
  • Another aspect of the invention relates to a mutant microorganism according to paragraph 55) above, characterized in that the overexpression of the gene considered is obtained by increasing the number of copies of this gene and / or by placing a more active promoter than the wild promoter.
  • Another aspect of the invention relates to a mutant microorganism according to paragraph 55) or 57) above, characterized in that the overexpression of the gene considered is obtained by transforming a macrolide-producing microorganism by a construction of recombinant DNA according to paragraph 13, 14 or 17 above, allowing the overexpression of this gene.
  • Another aspect of the invention relates to a mutant microorganism according to paragraph 55), 56), 57) or 58) above characterized in that the genetic modification is carried out in one or more genes comprising one of the sequences corresponding to one or more of the sequences SEQ ID N ° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49 , 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 and 149, or one of its variants or one of the sequences derived therefrom due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another aspect of the invention relates to a mutant microorganism according to paragraph 55), 56), 57), 58) or 59) above characterized the microorganism overexpresses one or more genes comprising one of the sequences corresponding to one or more sequences SEQ ID N ° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 and 149, or one of its variants or one of the sequences derived therefrom due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another aspect of the invention relates to a mutant microorganism according to paragraph 55), 56), 57), 58), 59) or 60) above characterized in that said microorganism is a bacteria of the genus Streptomyces.
  • Another aspect of the invention relates to a mutant microorganism according to paragraph 55), 56), 57), 58), 59), 60) or 61) above characterized in that the macrolide is spiramycin.
  • Another aspect of the invention relates to a mutant microorganism according to paragraph 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61) or 62) above characterized in that said microorganism is a strains of S. ambofaciens.
  • Another aspect of the invention relates to a process for producing macrolides, characterized in that it comprises the following steps:
  • step b separating and purifying from said culture medium or also from the cell extract obtained in step b), the said macrolide (s) produced.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a sequence and / or of a recombinant DNA and / or of a vector according to one of paragraphs 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7),
  • Another aspect of the invention relates to the use of at least one polynucleotide and / or at least one recombinant DNA and / or at least one expression vector and / or at least one polypeptide and / or at least one host cell according to one of paragraphs 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16), 17) or 21) above to carry out one or more bioconversions.
  • Another aspect of the invention relates to a polynucleotide characterized in that it is a polynucleotide complementary to one of the polynucleotides according to paragraph 1), 2), 3), 4), 5), or 6) above.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism producing at least one spiramycin, characterized in that it overexpresses:
  • telomere a gene capable of being obtained by polymerase chain reaction (PCR) using the pair of primers with the following sequence: 5 'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID No 138) and 5 'GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N ° 139) and as a matrix the cosmid pSPM36 or the total DNA of Streptomyces ambofaciens,
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 68 or 90 characterized in that it is a bacterium of the genus Streptomyces.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 68, 69 or 90 characterized in that it is a bacterium of the species Streptomyces ambofaciens.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 68, 69, 70 or 90 characterized in that the overexpression of said gene is obtained by transformation of said microorganism by an expression vector.
  • Another aspect of the invention relates to a strain of Streptomyces ambofaciens characterized in that it is the strain OSC2 / pSPM75 (l) or the strain OSC2 / pSPM75 (2) deposited with the National Collection of Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Dondel Roux 75724 Paris Cedex 15, France, October 6, 2003 under registration number 1-3101.
  • CNCM National Collection of Cultures de Microorganismes
  • Another aspect of the invention relates to a recombinant DNA characterized in that it comprises:
  • polynucleotide capable of being obtained by polymerase chain reaction using the pair of primers with the following sequence: 5 'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGCC' '(SEQ ID No. 138) and 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3 '(SEQ ID No. 139) and as a matrix the cosmid pSPM36 or the total DNA of Streptomyces ambofaciens,
  • Another aspect of the invention relates to a recombinant DNA according to paragraph 73 or 91, characterized in that it is a vector.
  • Another aspect of the invention relates to a recombinant DNA according to paragraph 73, 74 or 91 characterized in that it is an expression vector.
  • Another aspect of the invention relates to a host cell into which at least one recombinant DNA has been introduced according to one of paragraphs 73, 74, 75 or 91.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism 'according to paragraph 51 characterized in that the gene inactivation is carried out by deletion in phase of the gene or of part of the gene comprising the sequence corresponding to SEQ ID N ° 13 or one of the sequences derived therefrom due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to one of paragraphs 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 or 78 characterized in that it overexpresses in addition :
  • Another aspect of the invention relates to an expression vector characterized in that the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 47 or a polynucleotide derived therefrom due to the degeneration of the genetic code is placed under the control of 'a promoter allowing the expression of the protein coded by the said polynucleotide in Streptomyces ambofaciens.
  • Another aspect of the invention relates to an expression vector according to paragraph 80, characterized in that it is the plasmid pSPM524 or pSPM525.
  • Another aspect of the invention relates to a strain of Streptomyces ambofaciens transformed by a vector according to paragraph 80 or 81.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to one of paragraphs 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 78, 79 or 92 characterized in that it also overexpresses the coding sequence gene SEQ ID No. 47 or a coding sequence derived therefrom due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 83 characterized in that it is the strain SPM502 pSPM525 deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Dondel Roux 75724 Paris Cedex 15, France, February 26, 2003 under registration number 1-2977.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • Another aspect of the invention relates to a process for the production of spiramycin (s), characterized in that it comprises the following stages: (a) cultivating, in an appropriate culture medium, a microorganism according to ⁇ of paragraphs 68, 69, 70, 71, 72, 78, 79, 82, 83, 84, 90 or 92,
  • step b separating and purifying from said culture medium or also from the cell extract obtained in step b), the spiramycins.
  • Another aspect of the invention relates to a polypeptide characterized in that its sequence comprises the sequence SEQ ID No. 112 or the sequence SEQ ID No. 142.
  • Another aspect of the invention relates to a polypeptide characterized in that its sequence corresponds to the translated sequence of the coding sequence:
  • Another aspect of the invention relates to an expression vector allowing the expression of a polypeptide according to paragraph 86, 87 or 93 in Streptomyces. ambofaciens.
  • Another aspect of the invention relates to an expression vector according to paragraph 88, characterized in that it is the plasmid pSPM75.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 68 characterized in that the gene capable of being obtained by polymerase chain reaction is the gene with coding sequence SEQ ID No. 141 or a gene derived from that due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another aspect of the invention relates to a recombinant DNA according to paragraph 73, characterized in that the polynucleotide capable of being obtained by chain amplification by polymerase is a polynucleotide of sequence SEQ ID No. 141.
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism according to paragraph 79, characterized in that the gene capable of being obtained by amplification in a polymerase chain is the gene with coding sequence SEQ ID No 141 or a gene derived from that due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another aspect of the invention relates to a polypeptide characterized in that its sequence is SEQ ID No. 142.
  • isolated in the sense of the present invention designates a biological material (nucleic acid or protein) which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located).
  • a polynucleotide naturally occurring in a plant or animal is not isolated.
  • the same polynucleotide separated from adjacent nucleic acids within which it is naturally inserted into the genome of the plant or animal is considered to be "isolated”.
  • purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of other compounds. Rather, it is a relative definition.
  • a polynucleotide is in the "purified" state after purification of the starting material or of the natural material of at least one order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably 4 or 5 orders of magnitude.
  • ORF Open Reading Fra e
  • nucleotide sequence can be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information regarding its sequence.
  • nucleic acid include RNA, DNA, cDNA or even RNA / DNA hybrid sequences of more than one nucleotide, in single chain form or in duplex form.
  • nucleotide designates both natural nucleotides (A, T, G, C) as well as modified nucleotides which comprise at least one modification such as (1) an analogue of a purine, (2) an analogue of 'a pyrimidine, or (3) a similar sugar, examples of such modified nucleotides being described for example in PCT application No. WO 95/04064.
  • a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first polynucleotide is paired with the base complementary to the second polynucleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary bases are A and T (or A and U), or C and G.
  • the term 'genes of the spiramycin biosynthetic pathway' also includes regulatory genes and genes conferring resistance to producer microorganisms.
  • fragment of a reference nucleic acid according to the invention will be understood to mean a nucleotide sequence of reduced length compared to the reference nucleic acid and comprising, on the common part, a nucleotide sequence identical to the acid. reference nucleic acid.
  • Such a “fragment” of nucleic acid according to the invention may, where appropriate, be included in a larger polynucleotide of which it is constitutive.
  • Such fragments include or alternatively consist of polynucleotides of length ranging from 8, 10, 12, 15, 18, 20 to 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 , 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900,
  • nucleic acid 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 or 1900 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention.
  • fragment of a polypeptide according to the invention, the expression a polypeptide whose amino acid sequence is shorter than that of the reference polypeptide and which comprises over the entire common ⁇ portion with these reference polypeptides, a sequence in identical amino acids.
  • Such fragments may, if appropriate, be included within a larger polypeptide of which they are part.
  • Such fragments of a polypeptide according to the invention can have a length of 10, 15, 20, 30 to 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 or 640 amino acids.
  • high stringency hybridization conditions within the meaning of the present invention, hybridization conditions are understood to disadvantage the hybridization of strands of non-homologous nucleic acids.
  • High stringency hybridization conditions can for example be described as hybridization conditions in the buffer described by Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) at a temperature between 55 ° C and 65 ° C, preferably the annealing temperature is 55 ° C, more preferably the annealing temperature is 60 ° C and most preferably the annealing temperature is 65 ° C, followed by one or more washes carried out in 2X SSC buffer (the IX SSC buffer corresponds to an 0.15M NaCl aqueous solution, 15 mM sodium citrate) at a temperature between 55 ° C and 65 ° C, preferably this temperature is 55 ° C, even more preferably this temperature is 60 ° C and very preferably this temperature is 65 ° C, followed by one or more washings in 0.5X SSC buffer at a temperature between 55 ° C and
  • hybridization conditions described above can be adapted as a function of the length of the nucleic acid for which hybridization is sought or of the type of labeling chosen, according to techniques known to those skilled in the art.
  • the suitable hybridization conditions can, for example, be adapted according to the work by F. Ausubel et al (2002).
  • variant of a nucleic acid is meant a nucleic acid which differs by one or more bases with respect to the reference polynucleotide.
  • a variant nucleic acid may be of natural origin, such as an allelic variant found naturally, or may also be an unnatural variant obtained for example by mutagenesis techniques.
  • the differences between the reference nucleic acid and the variant nucleic acid are reduced so that the nucleotide sequences of the reference nucleic acid and of the variant nucleic acid are very close and, in many regions , identical.
  • the nucleotide modifications present in a variant nucleic acid can be silent, which means that they do not alter the amino acid sequences encoded by said variant nucleic acid.
  • changes of nucleotides in a variant nucleic acid can also result from substitutions, additions, deletions in the polypeptide encoded by the variant nucleic acid with respect to the peptides encoded by the reference nucleic acid.
  • modifications of nucleotides in the coding regions can produce substitutions, conservative or non-conservative in the amino acid sequence.
  • the variant nucleic acids according to the invention encode polypeptides which retain substantially the same biological function or activity as the polypeptide of the reference nucleic acid or also the ability to be recognized by antibodies directed against the polypeptides encoded by l initial nucleic acid.
  • Certain variant nucleic acids will thus encode mutated forms of the polypeptides whose systematic study will make it possible to deduce structure activity relationships from the proteins in question.
  • variant of a polypeptide according to the invention is mainly meant a polypeptide whose amino acid sequence contains one or more substitutions, additions or deletions of at least one amino acid residue, relative to the sequence amino acids of the reference polypeptide, it being understood that the amino acid substitutions can be either conservative or non-conservative.
  • the variant polypeptides according to the invention retain substantially the same biological function or activity as the reference polypeptide or the ability to be recognized by antibodies directed against the initial polypeptides.
  • polypeptide having "an activity similar" to a reference polypeptide within the meaning of the invention means a polypeptide having a biological activity close, but not necessarily identical, to that of the reference polypeptide as measured in a biological test suitable for measuring the biological activity of the reference polypeptide.
  • hybrid antibiotic within the meaning of the invention means a compound, generated by the construction of an artificial biosynthesis pathway using recombinant DNA technology.
  • the present invention more particularly relates to new genes of the biosynthetic pathway for spiramycins and to new polypeptides involved in this biosynthesis as presented in the detailed description below.
  • the biosynthetic pathway genes have been cloned and the DNA sequence of these genes has been determined.
  • the sequences obtained were analyzed using the FramePlot program (Ishikawa J & Hotta K. 1999).
  • PPS polyketide synthase
  • SEQ ID N ° 1 presenting a first region of 31 kb containing 25 ORFs and SEQ ID N ° 140 presenting a region of approximately 12.1 kb including 1, 4 kb overlap the previous sequence (SEQ ID N ° 1) and approximately 10.7 kb correspond to the rest of the sequence, this last part of approximately 10.7 kb containing 9 additional ORFs (including one ORF of partial sequence), see also Figure 3 and 37 and below), have been identified upstream of the 5 genes encoding PKS and 10 occupying a region of approximately 11.1 kb (SEQ ID No. 2 and Figure 3), have been identified downstream of the PKS genes.
  • the 10 genes located downstream of the 5 PKS genes were thus named orfl * c, or ⁇ * c, or ⁇ * c, or ⁇ * c, or ⁇ * orf ⁇ * or ⁇ * c, or ⁇ *, or ⁇ *, orflO * (SEQ ID N ° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and 21).
  • the “c” added in the name of the gene signifying for the ORF in question that the coding sequence is in the reverse orientation (the coding strand is therefore the complementary strand of the sequence given in SEQ ID No. 2 for these genes) .
  • the 34 ORFs upstream of the PKS genes were named orfl, or ⁇ , or ⁇ , or ⁇ , or ⁇ , orf ⁇ , or ⁇ , or ⁇ , or ⁇ c, orflO, orfl le, orfl2, orfl 3c, orfJ4, orfl 5c, orfl 6, orfl 7, orfl ⁇ , orfl 9, or ⁇ O, or ⁇ lc, or ⁇ 2c, or ⁇ 3c, or ⁇ 4c, or ⁇ 5c, or ⁇ , or ⁇ 7, or ⁇ c, or ⁇ 9, or ⁇ Oc, or ⁇ l, or ⁇ 2c, or ⁇ 3 and or ⁇ 4c (SEQ ID N ° 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145
  • FIG. 3 A schematic representation of the organization of the region is presented in FIG. 3.
  • the 10 genes identified downstream of the genes encoding PKS 9 seem to be involved in biosynthesis or resistance to spiramycins. These are the following 9 genes: orfl * c, or ⁇ * c, or ⁇ * c, or ⁇ * c, or ⁇ *, orf ⁇ *, or ⁇ * c, or ⁇ * and or ⁇ *.
  • the “c” added in the name of the gene indicates that the coding sequence is in the reverse orientation (the coding strand is therefore the complementary strand of the sequence given in SEQ ED No. 2 for these genes).
  • mutant strains constructed of mutant strains and analyzes of the production of spiramycins and biosynthesis intermediates of spiramycins by these mutant strains.
  • the methods used consist in performing a gene replacement.
  • the target gene to be interrupted is replaced by a copy of this interrupted gene by a cassette conferring resistance to an antibiotic (for example apramycin, geneticin or hygromycin).
  • the cassettes used are bordered on either side by translation termination codons in all the reading phases and by transcription terminators active at Streptomyces.
  • the insertion of the cassette into the target gene may or may not be accompanied by a deletion in this target gene.
  • the size of the regions flanking the cassette can range from a few hundred to several thousand base pairs.
  • a second type of cassette can be used for the inactivation of genes: cassettes known as “excisable cassettes”.
  • cassettes have the advantage of being able to be excised in Streptomyces by a site-specific recombination event after having been introduced into the genome of S. ambofaciens.
  • the aim is to inactivate certain X genes in Streptomyces strains without leaving selection markers or large DNA sequences not belonging to the strain in the final strain. After excision there remains only a short sequence of around thirty base pairs (called the “scar” site) in the genome of the strain (cf. FIG. 10).
  • the implementation of this system consists, firstly, in replacing the wild copy of the target gene (thanks to two homologous recombination events, cf. FIG. 9) by a construction in which an excisable cassette has been inserted into this uncomfortable ,; target.
  • the insertion of this cassette is accompanied by a deletion in the target gene (cf. - •> '• Figure 9).
  • the excision of the excisable cassette of the genome of the strain is caused.
  • the excisable cassette functions thanks to a site-specific recombination system and has the advantage of making it possible to obtain mutants of Streptomyces which ultimately do not carry a resistance gene. It also frees itself from possible polar effects on the expression of genes located downstream of the inactivated gene (s) (cf. FIG. 10).
  • the strains thus constructed were tested for their production of spiramycins.
  • the orfl * c gene codes for a protein with an identity of 66% (determined thanks to the BLAST program) with the protein coded by the tylMI gene which codes for an N-methyltransferase involved in the Tylosin biosynthesis and catalyzes 3 N-methylation during the production of mycaminosis in Streptomyces fradiae (Gandecha, AR et al, 1997; GenBank access number: CAA57473; BLAST score: 287).
  • the or ⁇ * c gene encodes a protein with relatively strong similarity (35% identity) with a protein encoded by the tylMIII gene encoding an NDP hexose 3,4 isomerase involved in the biosynthesis of tylosin in Streptomyces fradiae (Gandecha, AR , et al, 1997; GenBank access number: CAA57471; BMAST score: 130).
  • the or ⁇ * c gene codes for a protein having relatively strong similarity (59% identity) with a protein coded by the tylMII gene coding for a glycosyltransferase involved in the biosynthesis of tylosin in Streptomyqes fradiae (Gandecha, AR et al, 1997; GenBank Access Number: CAA57472; BLAST Score: 448).
  • This similarity to a protein involved in the biosynthesis pathway of another nearby antibiotic strongly suggests that the or ⁇ 3c gene codes for a glycosyltransferase.
  • This hypothesis is supported by the fact that protein encoded by the or ⁇ * c gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (see Table 4).
  • the or ⁇ * c gene encodes a protein with relatively strong similarity to several crotonyl-CoA reductases.
  • the protein encoded by or ⁇ * c has significant similarity with a crotonyl CoA reductase from Streptomyces coelicolor (Redenbach, M et al, 1996; GenBank access number: NP_630556; Score BLAST: 772).
  • This similarity with a protein involved in the biosynthetic pathway of another close antibiotic strongly suggests that the or ⁇ * c gene also codes for a crotonyl-CoA reductase.
  • This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the or ⁇ * c gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 5).
  • the orf ⁇ * gene has some similarity with the mdmB gene present in Streptomyces mycarofaciens (Hara and Hutchisnson, 1992; GenBank access number: A42719; BLAST score: 489) producer of macrolide antibiotic. In this producer, the gene is involved in the acylation of the lactone cycle. The orf ⁇ * gene would therefore encode an acyltransferase. This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the orf ⁇ * gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (see Table 6). Table 6
  • the or ⁇ * gene encodes a protein with relatively strong similarity to several O-methyltransferases.
  • the protein encoded by or ⁇ * has significant similarity with an O-methyltransferase (EC 2.1.1.-) MdmC of Streptomyces mycarofaciens (Hara & Hutchinson, 1992; GenBank access number: B42719; BLAST score: 355).
  • This similarity with a protein involved in the biosynthetic pathway of another antibiotic strongly suggests that the or ⁇ * gene also encodes an O-methyltransferase.
  • the or ⁇ * gene is implicated in the formation of precursors incorporated into the lactone cycle.
  • the product of the or ⁇ * gene is also relatively close to FkbG which is responsible for the methylation of hydroxymalonyl-ACP according to (Wu et al, 2000; Hoffrneister et al, 2000 ; GenBank access number: AAF86386; BLAST score: 247) (see Figure 8).
  • FkbG which is responsible for the methylation of hydroxymalonyl-ACP according to (Wu et al, 2000; Hoffrneister et al, 2000 ; GenBank access number: AAF86386; BLAST score: 247)
  • the or ⁇ * gene encodes a protein with relatively strong similarity to several O-methyltransferases.
  • the or ⁇ * gene is an O-methyl transferase involved either directly in the synthesis of platenolide or in the synthesis of a precursor ⁇ methylated (methoxymalonyl, see Figure 8) incorporated into the platenolide by the PKS.
  • CL / SM and NMR analysis experiments were carried out on a strain of S. ambofaciens of genotype: orf ⁇ * :: àttl ⁇ hyg +.
  • the or ⁇ * gene is not expressed because of the polar effect of the insertion, in the orf ⁇ * gene, of the cassette which contains transcription terminators (cf. example 27). This strain has been shown to produce a molecule with a similar spectrum UN
  • the product corresponding to spiramycin without the methyl group has a very low microbological activity (lower by a factor of 10) compared to unmodified spiramycin, when tested on the microorganism Micrococcus luteus.
  • the or ⁇ * c gene codes for a protein with relatively strong similarity to a protein encoded by the mdmA gene from Streptomyces mycarofaciens, the latter encoding a protein involved in resistance to midecamycin in this producer organism (Hara et al, 1990; Issue d '' GenBank access: A60725; BLAST score: 380). This similarity with a protein involved in the biosynthetic pathway of another antibiotic strongly suggests that the or ⁇ * c gene also codes for a protein involved in resistance to spiramycin.
  • the enzyme coded by the or ⁇ * c gene has a methyltransferase activity and is involved in resistance to spiramycin in Streptomyces ambofaciens.
  • This gene has been shown to confer resistance of the MLS I type, resistance which is known to be due to the mono-methylation in position A2058 of the ribosomal RNA 23 S (Pernodet et al, 1996). This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the or ⁇ * c gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 8).
  • the or ⁇ * gene encodes a protein with relatively strong similarity to an ABC transporter type protein in Streptomyces griseus (Campelo, 2002, GenBank access number: CAC22119; BLAST score: 191). This similarity with an ABC transporter type protein strongly suggests that the or ⁇ * gene also codes for an ABC transporter type protein that may be involved in resistance to spiramycin. This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the or ⁇ * gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 9). Table 9
  • the or / 9 * gene encodes a protein with relatively strong similarity to ui ⁇ é, protein of the ABC transporter type in Streptomyces griseus (Campelo, 2002, Number;; GenBank access: CAC22118; BLAST score: 269).
  • This similarity with an ABC transporter type protein strongly suggests that the or ⁇ * gene also codes for an ABC transporter type protein that may be involved in resistance to spiramycin.
  • This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the or ⁇ * gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 10).
  • the orflO * gene encodes a protein with relatively strong similarity to a protein of unknown function.
  • genes similar to orflO * are found in the middle of several groups of genes involved in the biosynthesis of antibiotics.
  • a gene close to orflO * is found in S. coelicolor (Redenbach et al, 1996, GenBank access number: NP_627432, BLAST score: 109).
  • a close gene (CouY) is also found in S. rishiriensis (Wang et al, 2000, GenBank access number: AAG29779, BLAST 97 score).
  • the 34 genes identified have been named: orfl, or ⁇ , or ⁇ , or ⁇ , or ⁇ , orf ⁇ , or ⁇ , or ⁇ c, orflO, orfl le, orfl 2, orfl 3c, orfl4, orfl 5c, orfl 6, orfl 7, orfl 8, orfl 9, or ⁇ O, or ⁇ le, or ⁇ 2c, or ⁇ 3c, or ⁇ 4c, or ⁇ Sc, or ⁇ , or ⁇ 7, or ⁇ 8c, or ⁇ 9, or ⁇ Oc, or ⁇ l, or ⁇ 2c, or ⁇ 3 and or ⁇ 4c.
  • Table 11 below are presented the references to the DNA and amino acid sequence of the 34 genes identified upstream of the 5 PKS genes.
  • the “c” added in the name of the gene indicates that the coding sequence is in the reverse orientation (the coding strand is therefore the complementary strand of the sequence given in SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 140 for these genes) .
  • the methods used consist in performing a gene replacement.
  • the target gene to be interrupted is replaced by a copy of this interrupted gene by a cassette conferring resistance to an antibiotic (for example apramycin or hygromycin).
  • the cassettes used are bordered on either side by translation termination codons in all the reading phases and by transcription terminators active at Streptomyces. Insertion of the cassette into 'the target gene can occur with or without a deletion in the target gene.
  • the size of the regions flanking the cassette can range from a few hundred to several thousand base pairs.
  • a second type of cassette can be used for the inactivation of genes: cassettes known as “excisable cassettes” (cf. above). The strains thus constructed were tested for their production of spiramycins.
  • the orfl gene encodes a protein with relatively strong similarity to
  • the or ⁇ gene encodes a protein with relatively strong similarity to a dTDP-6-deoxy-3,4-keto-hexulose isomerase from Aneu ⁇ n ⁇ bacillus thermoaerophilus (Pfoestl, A. Et al, 2003, GenBank access number: AAO06351; BLAST score : 118).
  • This similarity strongly suggests that the or ⁇ gene codes for an isomerase responsible for the isomerization reaction necessary for the biosynthesis of one of the sugars present in the spiramycin molecule, this sugar possibly being mycarose (cf. FIG. 5).
  • the or ⁇ gene was inactivated. It could be shown that the resulting strain no longer produced spiramycins. This confirms that the or ⁇ gene is indeed involved in the biosynthesis of spiramycins.
  • the or ⁇ gene encodes a protein with relatively strong similarity to several aminotransferases.
  • the protein encoded by or ⁇ has significant similarity with an aminotransferase from Streptomyces antibioticus involved in the biosynthesis of oleandomycin (Draeger, G., Et al, 1999; GenBank access number: AAF59939; BLAST score: 431).
  • This similarity with a protein involved in the biosynthesis pathway of another close antibiotic strongly suggests that the or ⁇ gene codes for a 3 amino transferase responsible for the transamination reaction necessary for the biosynthesis of one of the amino sugars of spiramycins (cf. figure 5). This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the or ⁇ gene 004/033
  • the or ⁇ gene was inactivated. It could thus be shown that the strain ' ;; resulting no longer produces spiramycins. This confirms that the or ⁇ gene is bié ⁇ ; i
  • the enzyme encoded by this gene is therefore well responsible for a bioconversion step essential to the biosynthesis of spiramycins.
  • the production of spiramycins can be complemented by the expression of the TylB protein of S. fradiae (cf. example 23). This demonstrates that the or ⁇ gene codes for a 3 amino transferase responsible for the transamination reaction necessary for the biosynthesis of mycaminosis (cf. FIG. 5). As mycaminose is the first sugar to be fixed on platenolide, it is expected that the strain interrupted in or ⁇ (OS49.67) accumulates platenolide.
  • the or ⁇ gene encodes a protein with relatively strong similarity to several NDP-glucose synthetases.
  • the protein encoded by ot ⁇ has significant similarity with an alpha-D-glucose-1-phosphate thymidylyltransferase from Streptomyces venezuelae (Xue Y and ⁇ /., 1998; GenBank access number: AAC68682; BLAST score 404).
  • the or ⁇ gene encodes a protein with relatively strong similarity to several glucose dehydratases.
  • the protein encoded by or ⁇ has significant similarity with a dTDP-glucose 4,6-dehydratase from Streptomyces tenebrarius (Li, T.B. Et al, 2001; GenBank access number: AAG18457, BLAST score: 476).
  • This similarity with a protein involved in the biosynthetic pathway of another close antibiotic strongly suggests that the or ⁇ gene codes for an NDP glucose dehydratase necessary for the biosynthesis of the three atypical sugars incorporated; , in the spiramycin molecule (see figures 4, 5 and 6).
  • This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the or ⁇ gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 17).
  • the orf ⁇ gene encodes a protein with relatively strong similarity to several thioesterases.
  • the protein encoded by orf ⁇ has significant similarity with a thioesterase from Streptomyces avermitilis (Omura, S. Et al., 2001; .. GenBank access number: BAB69315; BLAST score: 234).
  • This similarity to an X protein involved in the biosynthetic pathway of another close antibiotic strongly suggests that the or ⁇ gene also codes for u ⁇ e ⁇ tMpestàa ⁇ é
  • This hypothesis is supported ff by the fact that the protein encoded by the orf ⁇ gene strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (see Table 18).
  • the or ⁇ gene encodes a protein with relatively strong similarity to several hexose dehydratases.
  • the protein encoded by or ⁇ has significant similarity to a dNTP hexose 2,3-dehydratase (encoded by the TylCNI gene) from Streptomyces fradiae involved in the biosynthesis of tylosin (Merson-Davies, LA et a, 1994; Issue number '' GenBank access: AAF29379; BLAST score: 461).
  • the or ⁇ gene encodes a protein with relatively strong similarity to several aminotransferases.
  • the protein encoded by or ⁇ has significant similarity with an aminotransferase probably involved in the biosynthesis of forosamine in Saccharopolyspora spinosa (Waldron, C. Et al, 2001; GenBank access number: AAG23279; BLAST score: 465).
  • This similarity with a protein involved in the biosynthesis pathway of another close antibiotic strongly suggests that the or ⁇ gene codes for a 4 amino transferase responsible for the transamination reaction necessary for the biosynthesis of forosamine (see Figure 6).
  • This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the or ⁇ gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 20).
  • the or ⁇ gene was inactivated. It has thus been possible to show that the resulting strain no longer produces spiramycins. This confirms that the or ⁇ gene is indeed involved in the biosynthesis of spiramycins.
  • the enzyme encoded by this gene is therefore well responsible for a bioconversion step essential to the biosynthesis of spiramycins.
  • the validation of the hypothesis of the role played by the product of the or ⁇ gene in the biosynthesis of forosamine is provided by the fact that an inactivted mutant for the or ⁇ gene produces forocidine, this mutant is therefore blocked at the forocidine stage. and does not produce neo-spiramycin (cf. FIG. 7 and example 25).
  • the or ⁇ c gene has already been identified in Streptomyces ambofaciens and has been designated srmXpwc Geistlich et al (Geistlich, M., Et al, 1992).
  • This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the or ⁇ c gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 21).
  • the orflO gene has already been identified in Streptomyces ambofaciens and has been designated .srmR by Geistlich et al. (Geistlich, M., Et al, 1992).
  • the protein encoded by this gene is involved in the regulation of the biosynthetic pathway for spiramycins in Streptomyces ambofaciens. Inactivation of the orflO gene has been performed. It has thus been possible to show that the resulting strain no longer produces spiramycins. This confirms that the orflO gene is well involved in the biosynthesis of spiramycins.
  • the protein encoded by this gene is therefore very essential for the biosynthesis of spiramycins.
  • the starting point for the translation of orflO has been determined and it has been shown that overexpression of this gene leads to an improvement in the production of spiramycins.
  • the translation start site corresponds to an ATG located upstream of the ATG proposed by Geistlich et al. (Geistlich, M., Et al, 1992). It has also been shown that this 5 ′ end is essential to the function of OrflO since a messenger truncated in 5 ′ is inactive (cf. example 17). To obtain the desired effect on the production of spiramycins, it is therefore essential that the overexpression of orflO is carried out while taking care not to express a messenger truncated in 5 ′ of orflO.
  • the orfl le gene has already been identified in Streptomyces ambofaciens and has been designated srmB by Geistlich et al (Geistlich, M. Et al, 1992) and Schoner et al (Schoner B et a, 1992).
  • the protein encoded by this gene is involved in resistance to spiramycin in Streptomyces ambofaciens and is an ABC-type transporter.
  • the or72 gene encodes a protein with relatively strong similarity to several hexose dehydratases.
  • the protein coded by orfl 2 has an important similarity with an NDP -hexose 3,4-dehydratase coded by the UrdQ gene of Streptomyces fradiae and involved in the biosynthesis of urdamycin (Hoffineister, D. Et al, 2000; Number GenBank access: AAF72550; BLAST score: 634).
  • This similarity with a protein involved in the biosynthesis pathway of another close antibiotic strongly suggests that the orfl 2 gene codes for a 3,4 dehydratase responsible for the dehydration reaction necessary for the biosynthesis of forosamine (see Figure 6).
  • This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the orfl 2 gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 22).
  • the or / 12 gene was inactivated. It could be shown that the resulting strain no longer produced spiramycins. This confirms that the orfl 2 gene is indeed involved in the biosynthesis of spiramycin. The enzyme encoded by this gene is therefore well responsible for a bioconversion step essential to the biosynthesis of spiramycin.
  • the validation of the hypothesis of the role played by Orfl 2 in the biosynthesis of forosamine is provided by the fact that an inactivted mutant for the orfl 2 gene no longer produces forosamine. However, it produces a small amount of forocidin. This mutant is therefore blocked at the forocidin stage and does not produce neo-spiramycin (cf. FIG. 7 and example 26).
  • This mutant also produces a compound of structure presented in FIG. 38.
  • the latter compound comprises two sugars, mycaminose and mycarose but does not contain forosamine.
  • this compound contains the sugar mycarose in the expected place of the forosamine.
  • the orfl 3c gene encodes a protein with relatively strong similarity to a protein of unknown function in Streptomyces coelicolor. This protein was named SC4H2.17 (GeneBank access number: T35116; BLAST score: 619). The protein encoded by the orfl 3c gene also has a strong similarity with other proteins from other organisms (see Table 23).
  • the orfl 4 gene encodes a protein with relatively strong similarity to a putative reductase (Redenbach, M., And ⁇ /., 1996; Bentley et a, 2002; GenBank access number: CAB90862; BLAST score: 147).
  • the orfl5c gene encodes a protein with relatively strong similarity to several ketoreductases.
  • the protein encoded by orfl 5c has significant similarity to a 3-ketoreductase in Streptomyces antibioticus (GenBak access number: T51102, BLAST score: 285).
  • This similarity strongly suggests that the orfl 5c gene codes for a 3 keto-reductase responsible for the reduction reaction necessary for the biosynthesis of forosamine (cf. FIG. 6).
  • This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the orfl 5c gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 24).
  • the orfl ⁇ gene codes for a protein with relatively strong similarity to several isomerases.
  • the protein encoded by orfl ⁇ has significant similarity to an NDP hexose 3,4 isomerase in Streptomyces fradiae (Gandecha et al., 1997; GenBak access number: CAA57471, BLAST score: 209).
  • This similarity strongly suggests that the orfl ⁇ gene codes for a protein involved in the biosynthesis of one of the spiramycin sugars (see Figures 5 and 6).
  • This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the orfl ⁇ gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (see Table 25). Table 25
  • the orfl 7 gene encodes a protein with relatively strong similarity to several glycosyl transferases.
  • the protein encoded by orfl 7 has significant similarity with a glycosyl transferase from Streptomyces venezuelae (Xue, Y. I and ⁇ /., 1998; Access number ⁇ GenBank: AAC68677; BLAST score: 400).
  • the similarity of the protein encoded by the orfl 7 gene with several glycosyl transferases involved in the biosynthesis pathway of other close antibiotics strongly suggests that this gene also encodes a glycosyl transferase. This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the orfl 7 gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 26).
  • the orfl 8 gene encodes a protein with relatively strong similarity to several glycosyl transferases.
  • the protein encoded by orfl 8 has significant similarity with a glycosyl transferase from Streptomyces rishiriensis (Wang et al, 20Q0; GenBank access number: AAG29785; BLAST score: 185).
  • the or / 79 gene encodes a protein with relatively strong similarity to. several ketoreductases.
  • the protein encoded by orfl 9 has a similarity> important with NDP-hexose-4-ketoreductase (TylCIV) Streptomyces fradiae:; (Bâte et ⁇ /., 2000; GenBank access number: AAD41822; BLAST score: 266).
  • TylCIV NDP-hexose-4-ketoreductase
  • the or ⁇ O gene encodes a protein with relatively strong similarity to several hexose reductases.
  • the protein encoded by or ⁇ O has significant similarity with the EryBII gene of Saccharopolyspora erythraea which codes for a dTDP-4-keto-L-6-deoxy-hexose 2,3-reductase (Summers, RG, et al., 991) , GenBank Access Number: AAB84068; BLAST score: 491).
  • the or ⁇ lc gene codes for a protein with relatively strong similarity to several hexose methyltransferases.
  • the protein encoded by or ⁇ lc has significant similarity with the TylCIII gene from Streptomyces fradiae which codes for a
  • the or ⁇ 2c gene codes for a protein with relatively strong similarity to the protein encoded by the fkbH gene from Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus which codes for an enzyme involved in the biosynthesis of methoxymalonyl (Wu, K. and ⁇ /., 2000; GenBank access number: AAF86387; BLAST score: 463).
  • the similarity of the protein encoded by the or ⁇ 2c gene with this protein involved in the biosynthetic pathway of another close macrolide strongly suggests that this gene also codes for an enzyme involved in the biosynthesis of methoxymalonyl in Streptomyces ambofaciens (see Figure 8).
  • the or / 23c gene encodes a protein with relatively strong similarity to the
  • the or ⁇ 4c gene codes for a protein with relatively strong similarity to the protein encoded by the fkbJ gene from Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus which, ' - :, would code the binding protein of the acyl group (Acyl Carrier Protein (ACP)) ' ,, y- involved in the biosynthesis of methoxymalonyl (Wu, K., et al, 2000; GenBank access number : ⁇ AJF86389; BLAST score: 87).
  • ACP Adiyl Carrier Protein
  • the or ⁇ 5c gene codes for a protein with relatively strong similarity to the protein encoded by the ⁇ bK gene from Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus which codes for an acyl CoA dehydrogenase involved in the biosynthesis of methoxymalonyl (Wu, K., et al, 2000; GenBank access number: AAF86390; BLAST score: 268).
  • the similarity of the protein encoded by the or ⁇ 5c gene with several acyl CoA dehydrogenases involved in the biosynthesis pathway of other close antibiotics strongly suggests that this gene codes for an acyl CoA dehydrogenase involved in the biosynthesis of methoxymalonyl (cf. FIG. 8). This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the or ⁇ 5c gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 32).
  • the or ⁇ gene codes for a protein with an identity of 65% (determined thanks to the BLAST program) with the protein coded by the tylCV gene which codes for a mycarosyl transferase involved in the tylosin biosynthesis in Streptomyces fradiae (Bate, N. Et al, 2000 ; GenBank access number: AAD41824, BLAST score: 471). More particularly, TylCV is a glycosyl transferase which binds the mycarose molecule during the synthesis of tylosin. This similarity with a protein involved in the biosynthetic pathway of another relatively close antibiotic and more particularly in the transfer of mycarosis, suggests that the or ⁇ gene codes for a glycosyl transferase. This hypothesis is supported by the fact that the protein encoded by the or ⁇ gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (cf. table 33). 67
  • the or ⁇ 7 gene codes for a protein with an identity of 70% (determined thanks to the BLAST program) with the protein coded by the tylCVII gene which codes for an NDP- 3,5- (or 5-) epimerase hexose involved in the biosynthesis of tylosin at;. Streptomyces fradiae (Bate, N. And, ⁇ f., 2000; GenBank access number: AAD41825j BLAST score: 243) ⁇ More specifically, TylCVII is a 3,5- (or 5-i epimerase hexose involved the biosynthesis of mycarosis.
  • the or ⁇ 8c gene could be amplified using oligonucleotides located on either side of the undetermined sequence and subcloned in an expression vector. It has thus been possible to demonstrate that the overexpression of the or ⁇ 8c gene significantly increases the production of spiramycins of the OSC2 strain (cf. example 24). This demonstrates that the overexpression of or ⁇ 8c leads to an increase in the production of spiramycins ⁇ [and confirms its role as regulator of the biosynthetic pathway for spiramycins.
  • the or ⁇ 9 gene encodes a protein with an identity of 31% (determined thanks to the BLAST program) with a probable glycosyl hydrolase located in the group, of genes involved in the biosynthesis of soraphen A (an antifungal of the polyketide class) in Sorangium cellulosum (Ligon, J., Et al, 2002; GenBank access number: AAK19890, BLAST score: 139).
  • soraphen A an antifungal of the polyketide class
  • Sorangium cellulosum Ligon, J., Et al, 2002
  • GenBank access number: AAK19890 BLAST score: 139
  • the or ⁇ Oc gene encodes a protein with an identity of 31% (determined thanks to the BLAST program) with a sugar epimerase-nucleoside-diphosphate of Corynebacterium glutamicum (GenBank access number: NP 600590, BLAST score: 89). This similarity suggests that the or ⁇ Oc gene codes for an epimerase. This hypothesis is supported by the fact that an analysis of the sequences using the CD-search program (cf. above) also suggests that the or ⁇ Oc gene codes for an epimerase.
  • Vor ⁇ Oc presents two possible initiation codons (cf. SEQ ID No 115) which give two possible proteins of 345 and 282 amino acids respectively (SEQ ID No 116 and 117).
  • the use of codons is typical of Streptomyces only at ' J / ' from the second ATG moreover, the protein sequence deduced from the sequence between
  • the second ATG is the correct initiation codon and that the sequence of this orf is therefore that presented in SEQ ID No. 143 which once translated corresponds to the protein of sequence SEQ ID No. 144.
  • the or ⁇ 1 gene codes for a protein with an identity of 52% (determined thanks to the BLAST program) with an oxidoreductase in Streptomyces coelicolor (GenBank access number: NP_631148, BLAST score: 261). This similarity suggests that the or ⁇ 1 gene codes for a reductase. This hypothesis is supported by the fact that an analysis of the sequences using the CD-search program (cf. above) also suggests that the or ⁇ 1 gene codes for a reductase. This assumption is also supported by the fact that the protein encoded by the or ⁇ 1 gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms (see Table 36).
  • the or ⁇ 1 gene was inactivated. It has thus been possible to show that the resulting strain no longer produces spiramycins. This confirms that the or ⁇ 1 gene is well involved in the biosynthesis of spiramycins.
  • the enzyme encoded by this gene is therefore g responsible for a bioconvergence step essential for the biosynthesis of? . 10 spiramycins.
  • sequence d or ⁇ 2c was first of all determined in part (cf. example 19), since the coding sequence in 5 ′ was only determined in a second step.
  • the partial sequence of this orf (SEQ ID N ° 120) was nevertheless used for the analysis with the various computer programs as explained above. He has
  • the or ⁇ 2c gene codes for a protein having an identity of 47% on the determined sequence (SEQ ID No. 121, which is the partial sequence of the Orf32c protein) (determined thanks to the BLAST program) with a regulatory protein of the GntR family in Streptomyces coelicolor (GenBank access number: NP_625576, BLAST score: 229).
  • SEQ ID No. 121 which is the partial sequence of the Orf32c protein
  • BLAST program a regulatory protein of the GntR family in Streptomyces coelicolor
  • protein encoded by the or ⁇ 2c gene has a strong similarity with other proteins of similar function in other organisms.
  • the partial LVor ⁇ 2c sequence was subsequently completed and the missing region was determined (cf. SEQ ID No. 140 and SEQ ID No. 145).
  • the complete sequence of this orf encodes a protein with an identity of 44% (determined thanks to the program
  • the or ⁇ 2c gene was inactivated in order to study the function of this gene in the biosynthesis pathway for spiramycins in Streptomyces ambofaciens. It has been shown that the resulting strain produces spiramycins. This indicates that the or ⁇ 2c gene is not essential for the biosynthesis of spiramycins and that it is not essential for the survival of the bacteria.
  • the or ⁇ 3 gene codes for a protein with an identity of 49% (determined through the BLAST program X) with a hypothetical protein from Xanthomonas campestris (GenBank access number: NP_635564, BLAST score: 54).
  • the present invention also relates to polynucleotides which hybridize under hybridization conditions of high stringency to at least one of the polynucleotides of sequence SEQ ID No. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 , 19, 21, 23, 25, 28, 30,
  • these polynucleotides are isolated from a bacterium of the genus Streptomyces, more preferentially, these polynucleotides encode proteins involved in the biosynthesis of a macrolide and even more preferentially, these polynucleotides encode a protein having an activity similar to the encoded protein by the polynucleotides with which they hybridize.
  • the high stringency hybridization conditions can be defined as hybridization conditions which disadvantage the hybridization of strands of non-homologous nucleic acids.
  • High stringency hybridization conditions can for example be described as: ..; hybridization conditions in the buffer described by Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) at a temperature between 55 ° C and 65 ° C, preferably the annealing temperature is 55 ° C, even more preferred temperature
  • 0.5X SSC at a temperature between 55 ° C and 65 ° C, preferably this temperature is 55 ° C, even more preferably this temperature is 60 ° C and most preferably this temperature is 65 ° C.
  • the hybridization conditions described above can be adapted according to the length of the nucleic acid whose hybridization is sought or the type of labeling chosen, according to techniques known to those skilled in the art.
  • the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the work by F. Ausubel et al, 2002.
  • the invention also relates to a polynucleotide having at least 70%, more preferably 80%, more preferably 85%, even more preferably 90%, even more preferably 95% and most preferably 98 % identity in nucleotides with a polynucleotide comprising at least 10, 12, 15, 18, 20 to 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 or 1900 consecutive nucleotides d a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID N ° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43 , 45, 47, 49,
  • these so-called polynucleotides are isolated from a bacterium of the genus Streptomyces, more preferentially, these polynucleotides encode proteins involved in the biosynthesis of a macrolide and even more preferentially, these polynucleotides encode proteins having activities similar to the proteins encoded by the polynucleotides with which they present identity.
  • a polynucleotide according to the invention is chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID No. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74,, ' ?
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be achieved by computer using known algorithms, for example those of the FASTA package (Pearson W. R & DJ Lipman, 1988) and (Pearson WR, 1990), accessible notably with the INFOBIOGEN resource center, Evry, France.
  • the percentage of sequence identity can be determined using the LFASTA software (Chao K.-M. et al., 1992) or LALIGN (Huang X. and Miller W., 1991).
  • the LFASTA and LALIGN programs are part of the FASTA package. LALIGN returns the optimal local alignments: this program is more rigorous, but also slower than LFASTA.
  • the polypeptides according to the invention are expressed in the natural state by a bacterium of the genus Streptomyces, more preferably, these polypeptides are involved in the biosynthesis of a macrolide and even more preferably, these polypeptides have a
  • a polypeptide according to the invention is chosen from the group consisting of polypeptide sequences SEQ ID No.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out by computer using known algorithms, for example those of the package FASTA (Pearson W. R & DJ Lipman, 1988) and (Pearson WR, 1990), available in particular from the INFOBIOGEN resource center, Evry, France.
  • the percentage of sequence identity can be determined using the LFASTA software (Chao K.-M. et a, 1992) or LALIGN (Huang X. and Miller W., 1991), in using the default settings as defined by the INFOBIOGEN resource center, Evry, France.
  • the LFASTA and LALIGN programs are part of the FASTA package. LALIGN returns the optimal local alignments: this program is more rigorous, but also slower than LFASTA.
  • a recombinant DNA comprising at least one polynucleotide as described above.
  • this recombinant DNA is a vector.
  • the vector is chosen from bacteriophages, plasmids, phagemids, integrative vectors, fosmids,, cosmids, shuttle vectors, BAC (Bacterial Artificial Chromosome) or PAC (Pl-derived Artificial Chromosome) .
  • BAC Bacterial Artificial Chromosome
  • PAC Pl-derived Artificial Chromosome
  • phagemids there may be mentioned by way of illustration pBluescript II and its derivatives (marketed in particular by the company Stratagene (LaJolla, California, USA)), pGEM-T and its derivatives (marketed by the company Promega (Madison, Wisconcin, USA)), ⁇ ZAPII and its derivatives (sold in particular by the company Stratagene (LaJolla, California, USA)).
  • integrative vectors there may be mentioned by way of illustration, the integrative vectors in Streptomyces such as for example those derived from SLP1 (Kieser et al, 2000), those derived from pSAM2 (Kieser et al, 2000), the vectors using the integration systems phages PhiC31 (Kieser et al, 2000) (for example pSET152 (Bierman et al, 1992)) or VWB (Van Mellaert L, et al. 1998), as well as the vectors using the IS117 integration system (Kieser et al. 2000).
  • fosmids the fosmid pFOS1 (sold by the company New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) and its derivatives may be mentioned by way of illustration.
  • cosmids there may be mentioned by way of illustration the cosmid SuperCos and its derivatives (sold in particular by
  • shuttle vectors mention may be made, by way of illustration, of the E. coli I Streptomyces shuttle plasmids, such as, for example, pIJ903 and its derivatives, the series of plasmids pUWL, pC AO 106, ⁇ WHM3, pO 446 and their derivatives (Kieser et al. 2000). , the BAC shuttle E. coli I Streptomyces such as for example those described in the application; •
  • BAC Bacterial Artificial Chromosome
  • PAC Pl-derived Artificial Chromosome
  • an i vector according to the invention is chosen from ⁇ OS49.1, pOS49.11, ⁇ OSC49.12, ⁇ OS49.14, : ;
  • Another aspect of the invention relates to an expression system comprising a suitable expression vector and a host cell allowing the expression of one or more polypeptides as described above in a biological system.
  • the expression vectors according to the invention comprise a nucleic acid sequence encoding one or more polypeptides as described above and can be intended for the expression of the different polypeptides according to the invention in various host cells well known in the art. the skilled person.
  • prokaryotic expression such as expression systems in E. coli
  • eukaryotic expression systems such as the baculovirus expression system allowing expression in insect cells, expression systems allowing expression in yeast cells, expression systems allowing expression in mammalian cells, in particular human cells.
  • the expression vectors which can be used in such systems are well known to those skilled in the art, as regards prokaryotic cells, there may be mentioned by way of illustration the expression vectors in E. coli for example, of the p ⁇ T family . marketed by the company Stratagene (LaJolla, California, USA), the vectors of the i ;; GATEWAY family marketed by Invitrogen (Carlsbad, California, USA), pBAD family vectors marketed by Invitrogen (Carlsbad, California, USA) vectors, pMAL family vectors marketed by New England Bioloabs Inc.
  • the vector BacPAK6 sold by the company BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, California, USA) may be mentioned by way of illustration.
  • mammalian cells mention may be made, by way of illustration, of vectors comprising the promoter of the early genes of the CMV virus (Cytomegalovirus) (for example the vector pCMV and its derivatives marketed by the company Stratagene (LaJolla, California, USA) , or the promoter of the immediate genes (S V40 early promoter) of the vacuolating simian virus SV40 (for example the vector pSG5 marketed by the company Stratagene (LaJolla, California, USA).
  • CMV virus Cytomegalovirus
  • S V40 early promoter the immediate genes of the vacuolating simian virus SV40
  • the invention also relates to a method for producing a polypeptide as described above, said method comprising the following steps: 004/033689
  • step c) separating and purifying from said culture medium or also from the cell extract obtained in step c), said polypeptide;
  • a recombinant polypeptide according to the invention can be purified by passage through an appropriate series of chromatography columns, according to the methods known to those skilled in the art and described for example in F ⁇ usubel et al (2002).
  • the “Tag-Histidine” technique which consists in adding a short poly-histidine sequence to the polypeptide to be produced, the latter then being able to be; purified on a nickel column.
  • a polypeptide according to the invention can also be prepared by in vitro synthesis techniques. By way of illustration of such techniques, a polypeptide according to the invention may be prepared using the "rapid translation System (RTS)" system, sold in particular by the company Roche Diagnostics France S.A, Meylan, France.
  • RTS rapid translation System
  • Another aspect of the invention relates to host cells into which at least one polynucleotide and / or at least one recombinant DNA and / or at least one expression vector according to the invention has been introduced.
  • Another aspect of the invention relates to microorganisms blocked in a stage of the biosynthetic pathway of at least one macrolide.
  • the interest resides on the one hand in the study of the function of the mutated proteins and on the other hand in the realization of microorganisms producing intermediates of biosynthesis.
  • These intermediaries may be modified, possibly after separation, either by adding particular components to the production media, or by introducing into the microorganisms thus mutated other genes coding for proteins capable of modifying the intermediate by using it as a substrate.
  • These intermediates can thus be modified chemically, biochemically, enzymatically and / or microbiologically.
  • the microorganisms blocked in a stage of the macrolide biosynthesis pathway can be obtained by inactivating the function of one or more proteins involved in the biosynthesis of this or these macrolides in microorganisms producing this or these macrolide. According to the protein or inactivated, so we can get:, microorganisms blocked in the various stages of the biosynthetic pathway of this or these macrolide.
  • the inactivation of this protein or these proteins can be carried out by any method known to those skilled in the art, for example by mutagenesis in the gene or genes encoding said protein (s) or by the expression of one or more anti RNA -sense complementary to the RNA or messenger RNAs encoding said protein or proteins.
  • Mutagenesis can, for example, be carried out by irradiation, by the action of a mutagenic chemical agent, by site-directed mutagenesis, by gene replacement,]; ,: or any other known method * 'I like in the art.
  • the suitable conditions for such a mutagenesis can, for example, be adapted according to the teaching contained in the works of Kieser, T et al (2000) and Ausubel et al., (2002).
  • Mutagenesis can be carried out in vitro or in situ, by deletion, substitution, deletion and / or addition of one or more bases in the gene considered or by gene inactivation. This mutagenesis can be carried out in a gene comprising a sequence as described above.
  • the microorganisms blocked in a stage of the macrolide biosynthesis pathway are bacteria of the genus Streptomyces. More preferably, the inactivation of the function of one or more proteins involved in the biosynthesis of the macrolide (s) in question is carried out by mutagenesis. Even more preferably, the macrolide in question is spiramycin and the microorganisms in which the mutagenesis are carried out are strains of S. ambofaciens.
  • the mutagenesis is carried out in one or more genes comprising one of the sequences corresponding to one or more of the sequences SEQ ID N ° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60 , 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 and 149.
  • the mutagenesis (s) are carried out by gene inactivation.
  • mutagenesis consists in the gene inactivation of a gene comprising a sequence corresponding to the sequence SEQ BD No. 13.
  • microorganisms can be cited as an example of such microorganisms: OS49.16 (or ⁇ :: ⁇ hyg, cf. example 2), OS49.67 (or ⁇ deletion in phase, cf. example 6), OS49.
  • Another aspect of the invention relates to a process for the preparation of a macrolide biosynthesis intermediate using microorganisms blocked in a step of the macrolide biosynthesis pathway, as described above.
  • the method consists in cultivating, in an appropriate culture medium, a microorganism blocked in a step of the macrolide biosynthesis pathway, as described above, recovering the conditioned culture medium or a cell extract, for example by sonication or by osmotic shock, separate and purify from said culture medium or from the cell extract obtained in the previous step, said biosynthesis intermediate.
  • the culture conditions for such microorganisms can be determined according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the culture medium may for example be MP5 medium or SL11 medium for Streptomyces and in particular for Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al, 1993). Those skilled in the art may in particular refer to the work by Kieser et al. (2000) regarding culture Streptomyces.
  • the product intermediate can be recovered by any techniques known to those skilled in the art. Those skilled in the art may refer, for example, to the techniques taught in US patent US 3,000,785 and more particularly to the methods of extraction of spiramycins described in this patent.
  • Another object of the invention relates to a process for the preparation of a molecule derived from a macrolide using the microorganisms blocked in a stage of the pathway for biosynthesis of this macrolide, as described above.
  • the method consists in obtaining a biosynthesis intermediate according to the above method and in modifying the intermediate thus produced, possibly after separation from the culture medium.
  • the culture conditions for such microorganisms can be determined according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the culture medium could for example be MP5 medium or SL11 medium for Streptomyces and in particular for Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al, 1993). Those skilled in the art may in particular refer to the work by Kieser et al.
  • the intermediates produced can be modified, optionally after separation, either by adding appropriate components to the production media, or by introduction into microorganisms of other genes coding for proteins capable of modifying the intermediary by using them as a substrate.
  • These intermediates can thus be modified chemically, biochemically, enzymatically and / or microbiologically.
  • the macrolide in question is spiramycin and the microorganisms in which the mutagenesis are carried out are strains of S. ambofaciens.
  • the invention also relates to a microorganism producing spiramycin I but not producing spiramycin II and III.
  • This microorganism comprises all of the genes necessary for the biosynthesis of spiramycin I but does not produce spiramycin II and III because the gene comprising the sequence corresponding to SEQ ID No. 13 or one of its variants or one of the sequences derived therefrom due to the degeneracy of the genetic code and encoding a polypeptide of sequence SEQ ID No. 14 or one of its variants is not expressed or has been rendered inactive.
  • the inactivation of this protein can be carried out by any known method of those skilled in the art, for example by mutagenesis in the gene encoding said protein or by the expression of an antisense RNA complementary to the messenger RNA encoding said protein, it being understood that if the expression of or ⁇ * is affected by this manipulation, it will be necessary to make another modification so that the or ⁇ * gene is correctly expressed.
  • Mutagenesis can be carried out in the coding sequence or in a non-coding sequence so as to render the eodinated protein inactive or to prevent its expression or translation. Mutagenesis can be carried out by site-directed mutagenesis, by gene replacement or any other method known to those skilled in the art.
  • the suitable conditions for such a mutagenesis can, for example, be adapted according to the teaching contained in the works of Kieser, T et al (2000) and Ausubel et al, 2002.
  • the mutagenesis can be carried out in vitro or in situ, by suppression , substitution, deletion and / or addition of one or more bases in the gene under consideration or by gene inactivation.
  • the microorganism can also be obtained by expressing the genes of the spiramycin biosynthetic pathway, without these comprising the gene comprising the sequence SEQ ID No. 13 or one of its variants or one of the sequences derived therefrom.
  • the microorganism is a bacterium of the genus Streptomyces. More preferably, the microorganism producing spiramycin I but not producing spiramycin II and III is obtained from a starting microorganism producing spiramycins I, II and III.
  • the microorganism is obtained by mutagenesis in a gene comprising the sequence corresponding to SEQ ID No. 13 or one of its variants or one of the sequences derived therefrom due to the degeneracy of the genetic code and encoding a polypeptide of sequence SEQ ID No. 14 or one of its variants having the same function. Even more preferably, this mutagenesis is carried out by gene inactivation.
  • the microorganism is obtained from a strain of S. ambofaciens producing spiramycins I, II and III in which a gene inactivation is carried out of the gene comprising the sequence corresponding to SEQ ID No.
  • strain SPM502 (orf ⁇ * :: attl, cf. example 14) can be cited as a microorganism producing spiramycin I but not producing spiramycin II and III.
  • the invention also relates to a microorganism producing spiramycin I but not producing spiramycin II and III as described above, characterized in that it additionally overexpresses: - a gene capable of being obtained by polymerase chain reaction using the pair of primers with the following sequence: 5 'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID No 138) and 5 'GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID No 139) or as the cosmid pSPM36 or l Total DNA of Streptomyces ambofaciens, more preferably it is the gene of coding sequence SEQ ID No. 141,.:
  • SEQ ID No. 111 DNA
  • SEQ ID No. 112 The translation into protein of this part of the coding sequence is given in SEQ ID No. 112.
  • the undetermined sequence in SEQ ID No. 111 was determined in a second step and the complete sequence of this orf (or ⁇ 8c) is given in SEQ ID No. 141.
  • the protein translation of this coding sequence is given in SEQ ID No. 142. It is presented in Example 24 a method for cloning the or ⁇ 8c gene and for manufacturing an expression vector allowing the expression of or ⁇ 8c.
  • the overexpression of the or ⁇ 8c gene in the OSC2 strain leads to an improvement in the production of spiramycins of this strain.
  • the overexpression of the or ⁇ 8c gene can be obtained by increasing the number of copies of this gene and / or by placing a promoter more active than the wild-type promoter.
  • the overexpression of said gene is obtained by bringing into the microorganism a construction of recombinant DNA, allowing the overexpression of this gene.
  • this construction of recombinant DNA increases the number of copies of said gene and makes it possible to obtain an overexpression of said gene.
  • the coding sequence of the gene can be placed under the control of a promoter which is more active than the wild type promoter.
  • a promoter which is more active than the wild type promoter.
  • the copy or copies of the or ⁇ 8c gene supplied are placed under the control of the ermE * promoter as is the case in the construction pSPM75 (cf. example 24).
  • the invention also relates to a microorganism producing ⁇ ; spiramycin I but not producing spiramycin II and III as described above, characterized in that it additionally overexpresses the gene of coding sequence SEQ ID No. 47 or of a coding sequence derived therefrom because of the degeneracy of the genetic code.
  • this microorganism is characterized in that it is added to the strain SPM502 pSPM525 deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Dondel Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le February 26, 2003 under registration number 1-2977.
  • the invention also relates to a method for producing spiramycin I, the method consists in cultivating in a suitable culture medium a microorganism producing spiramycin I but not producing spiramycin II and III as described above, recover the conditioned culture medium or a cell extract, separate and purify from said culture medium or also from the cell extract obtained in the preceding step spiramycin I.
  • the conditions for culturing such a microorganism may be determined according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the culture medium may for example be MP5 medium or SL11 medium for Streptomyces and in particular for Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al, 1993).
  • spiramycin I produced can be recovered by any techniques known to those skilled in the art. Those skilled in the art may refer, for example, to the techniques taught in US patent US 3,000,785 and more particularly to the methods of extraction of spiramycins described in this patent.
  • the invention relates to a mutant macrolide-producing microorganism characterized in that it has a genetic modification in at least one gè ⁇ è] ' - ' comprising a sequence as defined above and / or that it overexpresses at least one gene comprising a sequence as defined above.
  • the genetic modification can consist in a suppression, a substitution, a deletion and / or an addition of one or more bases in the genes considered in order to express one or more ' -. : proteins with higher activity or express a higher level of this or '' -i these proteins.
  • Overexpression of the gene under consideration can be obtained by increasing the g; number of copies of this gene and / or by placing a promoter more active than the prompter
  • the overexpression of the gene considered can be obtained by bringing into a microorganism producing the macrolide considered a construction of recombinant DNA according to the invention, allowing the overexpression of this gene.
  • certain stages of macrolide biosynthesis are limiting and if one or more more active proteins or a higher level of expression of the wild protein (s) involved in these limiting stages are expressed, the production of the or the macrolides concerned.
  • An increase in the rate of production of tylosin has for example been obtained in Streptomyces fradiae by duplication of the gene encoding a limiting methyl transferase converting macrocin into tylosin (Baltz R, 1997).
  • mutagenesis a person skilled in the art may for example refer to this subject in the work by F. Ausubel et al (2002).
  • these mutant microorganisms improved for their production in macrolides are bacteria of the genus Streptomyces.
  • the macrolide in question is spiramycin and the microorganisms in which the mutagenesis are carried out are strains of S. ambofaciens.
  • the genetic modification is carried out in one or more genes comprising one of the sequences corresponding to one or more of the sequences SEQ ID No.
  • the microorganism overexpresses one or more genes comprising one of the sequences corresponding to one or more of the sequences SEQ ID No.
  • the microorganism overexpresses the gene comprising a sequence corresponding to SEQ ID No.
  • SEQ ID N ° 111 or 141, or one of its% variants or one of the sequences derived therefrom due to the degeneration ⁇ j
  • the sequence given in SEQ ID N ° 111 is partial, however the person skilled in the art can easily complete it in particular by using the teaching presented in example 24.
  • the undetermined sequence in SEQ ID N ° 111 was determined in a second time and the complete sequence of this orf (or ⁇ 8c) is given in SEQ ID No. 141.
  • the protein translation of this coding sequence is given in SEQ ID No. 142.
  • Example 24 is thus presented a method for cloning the or ⁇ 8c gene and to manufacture an expression vector allowing the expression of or ⁇ 8c.
  • the overexpression of the or ⁇ 8c gene in the OSC2 strain leads to an improvement in the production of spiramycins of this strain.
  • the overexpression of the or ⁇ 8c gene can be obtained by increasing the number of copies of this gene and / or by placing a promoter more active than the wild-type promoter.
  • the overexpression of the or ⁇ 8c gene is obtained by bringing a recombinant DNA construct into the microorganism, allowing the overexpression of this gene.
  • this construction of recombinant DNA increases the number of copies of the or ⁇ 8c gene and makes it possible to obtain an overexpression of the or ⁇ 8c gene.
  • the coding sequence for or ⁇ 8c can be placed under the control of a promoter more active than the wild-type promoter.
  • a promoter more active than the wild-type promoter.
  • the copy or copies of the or ⁇ 8c gene supplied are placed under the control of the ermE * promoter as is the case in the construction pSPM75 (cf. example 24).
  • Another aspect of the invention relates to a process for producing macrolides using the microorganisms described in the preceding paragraph.
  • This process consists in cultivating in a suitable culture medium a microorganism defined in the preceding paragraph, recovering the conditioned culture medium or a cell extract, separating and purifying from said culture medium or from the extract • '. cell obtained in the previous step the macrolide (s) produced.
  • the conditions of X 'culture of such microorganisms may be determined using techniques well known to ⁇ t in the art.
  • the culture medium may for example be miliefrj I MP5 or SL11 medium for Streptomyces and in particular for Streptomyces ' X ambofaciens (Pernodet et al., 1993).
  • the macrolide (s) produced can be recovered by any technique known to a person skilled in the art. Those skilled in the art may refer, for example, to the techniques taught in US patent US 3,000,785 and more particularly to the methods of extraction of spiramycins described in this patent.
  • the microorganisms used in such a process are bacteria of the genus Streptomyces.
  • the macrolide in question is spiramycin and the mutant microorganisms improved for their production in spiramycins are strains of S. ambofaciens.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a sequence and / or of a vector according to the invention for the preparation of hybrid antibiotics. Indeed, the 004/033689
  • polynucleotides according to the invention can be used to obtain microorganisms expressing one or more mutant proteins giving rise to a modification in the specificity of the substrate or also be expressed in multiple microorganisms producing antibiotics with the aim of generating hybrid antibiotics.
  • the polynucleotides according to the invention can make it possible, by transfer of genes between producing organisms, to manufacture hybrid antibiotics having pharmacologically advantageous properties (Hopwood et al, 1985a, Hopwood et al, 1985b, Hutchinson and ⁇ /., 1989).
  • the principle by which genetic engineering can lead to the production of hybrid antibiotics was first proposed by 'Hopwood (Hopwood 1981).
  • the invention also relates to the use of at least one polynucleotide and / or at least one recombinant DNA and / or at least one expression vector and / or at least one polypeptide and / or at least one host cell according to the invention.
  • invention for carrying out one or more bioconversions.
  • the invention makes it possible to construct bacterial or fungal strains in which one or more proteins according to the invention are expressed, under the control of appropriate expression signals. Such strains can then be used to carry out one or more bioconversions.
  • bioconversions can be done either using whole cells, or using acellular extracts of said cells. These bioconversions can transform a molecule into a derived form, with an enzyme of a biosynthetic pathway.
  • Carreras et al. describes the use of a strain of Saccharopolyspora erythraea and Streptomyces coelicolor for the production of new derivatives of erithromycins (Carreras et al, 2002).
  • Walczar et al. describes the use of a P450 monooxygenase from Streptomyces for the bioconversion of deacetyladriamycin (an anthracycline analog) into new anthracyclines (Walczar et al., 2001). Olonao et al.
  • this recombinant DNA is a vector.
  • the vector is chosen from bacteriophages, plasmids, phagemids, integrative vectors, fosmids, cosmids, shuttle vectors, BAC (Bacterial Artificial Chromosome) or PAC (Pl-derived Artificial Chromosome).
  • phage lambda and phage Ml 3 may be mentioned as bacteriophages.
  • plasmids mention may be made of plasmids replicating in E. coli, for example pBR322 and its derivatives, pUC18 and its derivatives, pUC19 and its derivatives, ⁇ GB2 and its derivatives (Churchward G.
  • pACYC177 access number GenBank: X06402
  • ⁇ ACYC184 GenBank access number: X06403
  • phagemids there may be mentioned by way of illustration pBluescript II and its derivatives (marketed in particular by the company Stratagene (LaJ ⁇ lla, California, USA)), pGEM-T and its derivatives (marketed by the company Promega (Madison, Wisconcin, USA) ), ⁇ ZAPII and its derivatives (sold in particular by the company Stratagene (LaJolla, California, USA)).
  • integrative vectors there may be mentioned by way of illustration, integrative vectors; ''' . ⁇ > in Streptomyces such as for example those derived from SLP1 (Kieser et al, 2000), those derived from pSAM2 (Kieser et al, 2000), the vectors using the phage integration systems PhiC31 (Kieser et al , 2000) (for example pSET152 (Bierman et al, 1992)) or VWB (Van Mellaert L, et al 1998), as well as the vectors using the integration system of IS117 (Kieser et al. 2000).
  • the fosmid pFOS1 (sold by the company New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) and its derivatives may be mentioned by way of illustration.
  • ' " - ' ⁇ As cosmids, we can cite by way of illustration the cosmid SuperCos and its derivatives ⁇ •: •; ⁇ k (sold in particular by the company Stratagene (LaJolla, California, USA)), the cosmid pWED15 (Wahl et al , 1987) and its derivatives Mention may be made, as shuttle vectors, of E.
  • coli I Streptomyces shuttle plasmids for example pIJ903 and its derivatives, the series of plasmids pUWL, pCAO106, pWHM3, pOJ446 and their derivatives (Kieser et al. 2000), the E. coli I Streptomyces shuttle BACs, such as, for example, those described in patent application WO 01/40497.
  • BAC Bacterial Artificial Chromosome
  • BAC pBeloBACU GenBank access number: U51113 As PAC (Pl-derived Artificial Chromosome)
  • the vector pCYPAC6 GenBank access number: AF 133437
  • this recombinant DNA is an expression vector.
  • E. coli can be cited by way of illustration. example, of the pET family sold by the company Stratagene (LaJolla, California, USA), the vectors of the GATEWAY family sold by the company Invitrogen (Carlsbad, California, USA), the vectors of the pBAD family sold by the company Invitrogen ( Carlsbad, California, USA), the vectors of the pMAL family sold by the company New England Bioloabs Inc.
  • the vector BacPAK6 sold by the company BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, California, USA) may be mentioned by way of illustration.
  • Another aspect of the invention relates to host cells. into which at least one recombinant DNA described in this paragraph has been introduced.
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing a polypeptide characterized in that said method comprises the following steps: a) transforming a host cell with at least one expression vector as described in the paragraph above ; b) cultivating, in an appropriate culture medium, said host cell; c) recovering the conditioned culture medium or a cell extract; d) separating and purifying from said culture medium or also from the cell extract obtained in step c), said polypeptide; 004/033689
  • the recombinant polypeptide thus produced can be purified by passage through an appropriate series of chromatography columns, according to the methods known to those skilled in the art and described for example in F. Ausubel et al (2002).
  • the “Tag-Histidine” technique which consists in adding a short poly-histidine sequence to the polypeptide to be produced, the latter being then able to be purified on a nickel column.
  • This polypeptide can also be prepared by in vitro synthesis techniques. As an illustration of such techniques, the polypeptide may be prepared using the "rapid translation System (RTS)" system, sold in particular by the company Roche Diagnostics France S.A, Meylan, France.
  • RTS rapid translation System
  • Another aspect of the invention relates to a microorganism producing at least one spiramycin, characterized in that it overexpresses:
  • SEQ ID No. 141 An example of the sequence of such a gene is given in SEQ ID No.
  • the overexpressing microorganism - a gene capable of being obtained by polymerase chain reaction (PCR) using the pair of primers with the following sequence: 5 'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N ° 138) and 5 'GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N ° 139) and as a matrix the cosmid pSPM36 or the total DNA of Streptomyces ambofaciens, more preferably it is the gene of coding sequence SEQ ID N ° 141,
  • the overexpression of said gene is obtained by transformation of said microorganism with an expression vector, quite preferably, the microorganism strain is the strain OSC2 / pSPM75 (1) or of the strain OSC2 / pSPM75 (2 ) deposited with the Collection
  • Method consists in cultivating in a suitable culture medium a microorganism defined in the preceding paragraph, recovering the conditioned culture medium or a cell extract, separating and purifying from said culture medium or from l cell extract obtained in the previous step the spiramycin (s) produced.
  • the culture conditions for such microorganisms can be determined according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the culture medium may for example be MP5 medium or SL11 medium for Streptomyces and in particular for Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993).
  • spiramycin (s) produced can be recovered by any techniques known to those skilled in the art. Those skilled in the art may refer, for example, to the techniques taught in US patent US 3,000,785 and more particularly to the methods of extraction of spiramycins described in this patent.
  • the microorganisms used in such a process are bacteria of the genus Streptomyces. More preferably, the microorganisms are strains of S. ambofaciens.
  • Another aspect of the invention relates to an expression vector characterized in that the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 47 or a polynucleotide derived therefrom due to the degeneration of the genetic code is placed under the control of a promoter allowing the expression of the protein coded by the said polynucleotide in Streptomyces ambofaciens.
  • Examples of expression vectors usable in Streptomyces have been given above.
  • such an expression vector is characterized in that it is the plasmid pSPM524 or pSPM525.
  • Another aspect of the invention relates to a strain of Streptomyces ambofaciens transformed by a vector defined in the preceding paragraph.
  • Another aspect of the invention relates to a polypeptide characterized in that, its sequence comprises the sequence SEQ ID No. 112.
  • the invention is also>: 'relating to a polypeptide characterized in that its sequence corresponds to the translated sequence of the coding sequence:
  • telomere a gene capable of being obtained by polymerase chain reaction (PCR) using the pair of primers with the following sequence: 5 'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID No. 138) and 5 'GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID No. 139) and as a matrix the cosmid pSPM36 or the total DNA of Streptomyces ambofaciens, more preferably it is the gene of coding sequence SEQ ID No. 141,
  • these polypeptides are expressed in the natural state by a bacterium of the genus Streptomyces, more preferably, these polypeptides are involved in the biosynthesis of spiramycins.
  • Another aspect of the invention relates to an expression vector allowing the expression of a polypeptide as defined in the preceding paragraph in
  • the expression vector in question is the plasmid pSPM75.
  • Figure 1 Chemical structure of spiramycins I, II and III. ; .
  • Figure 2 Cosmids used for the sequencing of the region.
  • Figure 3 Organization of a group of genes involved in the biosynthetic pathway for spiramycins.
  • FIG. 4 Proposed biosynthetic pathway for mycarosis.
  • FIG. 5 Proposed biosynthetic pathway for mycaminosis.
  • Figure 6 Proposed biosynthetic pathway for forosamine.
  • Figure 7 Preferential order of addition of sugars in the spiramycin molecule and • intermediates. , -i - f
  • Figure 8 Proposed biosynthetic pathway for methoxymalonyl in S. ambofaciens. Cettig, route is proposed by analogy with the biosynthesis of methoxymalonyl in
  • Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (Wu, K. and ⁇ /., 2000).
  • Figure 9 Steps leading to gene inactivation: A) Cloning of the target gene into a vector replicating in E. coli but not in Streptomyces;
  • Figure 11 Amplification of the excisable cassette in order to use it for a homologous recombination experiment.
  • the homologous recombination technique thanks to short homologous sequences, has been described by (Chaveroche et al, 2000).
  • the 39 or 40 deoxy-nucleotides located at the 5 ′ end of these oligonucleotides have a sequence corresponding to a sequence of the gene to be inactivated and the 20 deoxy-nucleotides located most in 3 ′ correspond to the sequence of one of the ends of the excisable cassette.
  • Figure 12 Obtaining a construct for the inactivation of a target gene using the technique described by (Chaveroche et al, 2000).
  • Figure 13 Map of plasmid pWHM3. Strepto on: origin of Streptomyces replication.
  • FIG. 14 Map of plasmid pOSV508.
  • Figure 15 Example of the structure of an excisable cassette. This consists of the ⁇ hyg cassette (Blondelet-Rouault et al, 1997) bordered by the attR and attL sites (Raynal and al, 1998), between which a recombination event will allow excision of the cassette, thanks to the expression of the xis and int genes.
  • Figure 16 Map of plasmid pBXLl 111.
  • Figure 17 Map of plasmid pBXLl 112.
  • Figure 18 Microbiological test for production of spiramycin, based on the sensitivity of a strain of Micrococcus luteus to spiramycin.
  • the strain of Micrococcus luteus used is a strain naturally sensitive to spiramycin but resistant to congocidine.
  • the different strains of Streptomyces to be tested were cultured in 500 ml Erlenmeyer flasks containing 70 ml of MP5 medium, inoculated at an initial concentration of 2.5 ⁇ 10 6 spores / ml and pushed to 27 ° C. with orbital shaking of 250 rpm. Samples of fermentation musts were taken after 48, 72 and 96 hours of culture and centrifuged. A tenth dilution of these supernatants in sterile culture medium is used for the test.
  • the indicator strain of Micrococcus luteus resistant to congocidine but sensitive to spiramycin was grown in a 12x12 cm square dish. Whatman: AA paper discs were soaked with 70 ⁇ l of the 1/10 dilution of each supernatant and placed X on the surface of the dish. Discs soaked in a solution of spiramycin of y different concentrations (2-4-8 ⁇ g / ml in MP5 culture medium) are used as standard range. The dishes are incubated at 37 ° C for 24 to 48 hours. If the disc contains spiramycin, it diffuses into the agar and inhibits the growth of the indicator strain of Micrococcus luteus.
  • This inhibition creates a “halo” around the disc, this halo reflecting the area where the strain of Micrococcus luteus did not grow.
  • the presence of this halo is therefore an indication of the presence of spiramycin and makes it possible to determine whether the strain of S. ambofaciens in question is producing or not producing spiramycin.
  • a comparison with the inhibition diameters obtained for the standard range makes it possible to obtain an indication of the quantity of spiramycin produced by this strain.
  • Figure 19 HPLC chromatogram of the filtered supernatant of the culture medium of the OSC2 strain.
  • Figure 20 HPLC chromatogram of the filtered supernatant from the culture medium of the strain SPM501.
  • Figure 21 HPLC chromatogram of the filtered supernatant of the culture medium of the strain SPM502.
  • Figure 22 HPLC chromatogram of the filtered supernatant from the culture medium of the strain SPM507.
  • Figure 23 HPLC chromatogram of the filtered supernatant from the culture medium of the strain SPM508.
  • Figure 24 HPLC chromatogram of the filtered supernatant from the culture medium of the strain SPM509.
  • Figure 25 Alignment of the Orf3 protein (SEQ ID No. 29) with the TylB protein (SEQ ID No. 29) with the TylB protein (SEQ ID No. 29)
  • Figure 26 Alignment of the MdmA protein of S. mycarofaciens (SEQ ID N ° 88) with the SrmD protein (SEQ ID N ° 16) performed thanks to the FASTA program.
  • Figure 27 Example of sequences of residual sites after excision of the excisable cassette. In bold is indicated the minimum att26 site as defined in Raynal et al.,
  • phase 1 (att1) of 33 nucleotides is presented in SEQ ID No. '
  • Figure 29 Construction of the pac-oritT cassette.
  • Figure 30 Map of the cosmid pWED2.
  • Figure 31 Schematic representation of the group of genes involved in the spiramycin biosynthesis pathway and the location of the three probes used to isolate the cosmids from the genomic DNA library of the OSC2 strain of Streptomyces ambofaciens in E. coli (cf.
  • Figure 19 Location of the inserts of the cosmids isolated from the genomic DNA library of the OSC2 strain of Streptomyces ambofaciens in E. coli (cf. example 19). New cosmid DNA library.
  • Figure 33 Under cloning of the Pstl-Pstl fragment of the cosmid pSPM36 (insert of the plasmid (pSPM58), under cloning of the Stul-Stul fragment of the cosmid pSPM36 (insert of the plasmid pSPM72) and under cloning of a EcoRl-Stul fragment (insert of the plasmid pSPM73)
  • Figure 34 Location of the open reading phases identified in the Pstl-Pstl insert of the plasmid pSPM58 and in the EcoRl-Stul insert of the plasmid pSPM73.
  • Figure 35 Overlay of the chromatograms HPLC of the filtered supernatant of the culture medium of the strain OS49.67 produced at 238 and 280nm (top) and UV spectra of the molecules eluted at 33.4 minutes and 44.8 minutes (bottom)
  • Figure 36 Molecular structure of platenolide molecules A and platenolide B.
  • Figure 37 Organization of the group of genes involved in the biosynthetic pathway for spiramycins.
  • Figure 38 Molecular structure of a biosynthesis intermediate produced by the strain SPM507.
  • Figure 39 Structure of a biosynthesis intermediate produced by a strain of S. ambofaciens of genotype orf ⁇ * :: attl ⁇ hyg + obtained from a strain ⁇ s overproducing spiramycins. The insertion of the attl ⁇ hyg + cassette into orf ⁇ * exerts a polar effect preventing the expression of or ⁇ *.
  • Figure 40 Molecular structure of the platenolide A + mycarose and platenolide B + mycarose molecules produced by the strain OS49.67
  • Figure 41 Under cloning of a Pstl-Pstl fragment of the cosmid pSPM36 (insert of the plasmid (pSPM79)), localization of the open reading phases identified in the Pstl-Pstl insert of the plasmid ⁇ SPM79 and localization of the sequence SEQ ID No. 140.
  • the genes for the spiramycin biosynthetic pathway were isolated from a genomic DNA library of Streptomyces ambofaciens.
  • This library was obtained by partial digestion of the genomic DNA of Streptomyces ambofaciens, with the restriction enzyme Bamlil. Large DNA fragments, from 35 to 45 kb on average, have been cloned into the cosmid pWED1 (Gourmelen et al, 1998) derived from the cosmid pWED15 (Wahl et al, 1987). These cosmids were introduced into E. coli using phage particles. The library thus obtained was hybridized with a probe (of sequence S ⁇ Q ID No.
  • This gene was named orfi (S ⁇ Q ID N ° 28) and was inactivated in S. ambofaciens. It has been shown that clones inactivated in the or ⁇ gene no longer produce spiramycins. This shows the implication of the or ⁇ gene or of genes located downstream in the biosynthesis of spiramycins.
  • the latter corresponds to a 1.8 kb DNA fragment containing the srmD gene.
  • the srmD gene is a gene isolated from S. ambofaciens ' capable of conferring resistance to spiramycin. Indeed, previous work had enabled the cloning of several determinants of resistance of S. ambofaciens, "conferring resistance to spiramycin to a strain of S. griseofuscus (strain sensitive to spiramycin) (Pernodet et al., 1993 ) (Pernodet et al, 1999). For the isolation of resistance genes, a cosmid library of the genomic DNA of the S.
  • ambofaciens strain had been produced in the cosmid pKC505 (Richardson MA et al., 1987). This cosmid pool had been introduced in S. griseofuscus, which is naturally sensitive to spiramycin. Five cosmids capable of conferring resistance to apramycin and spiramycin in S. griseofuscus were thus obtained.
  • pOS44.1 has in its insert the srmD gene which codes for a protein having a certain similarity with the protein coded by the mdmA gene of Streptomyces mycarofaciens and implicated in the resistance to midecamycin in this producing organism ( Hara et al, 1990, Genbank access number: A60725) ( Figure 26).
  • the third probe used to locate the biosynthesis genes for spiramycin was an insert of approximately 1.8kb comprising the srmD gene.
  • the cosmid pWED1 is derived from the cosmid pWE15 (Wahl, " ei ⁇ k al, 1987) by deletion of the 4.1 kb Hpal-Hpal fragment containing the expression module active in mammals (Gourmelen et al, 1998). was then packaged in vitro in lambda phage particles thanks to the “Packagene® Lambda DNA packaging system” system marketed by the company
  • the phage particles obtained were used to infect the SURE® strain of E. coli marketed by the company Stratagene (LaJolla, California, USA). The selection of the clones was carried out on LB + ampicillin medium (50 ⁇ g / ml) since the cosmid pW ⁇ Dl confers resistance to ampicillin.
  • the probe used for hybridization is a Nael-Nael fragment of DNA (S ⁇ Q ID No. 86) comprising a part of the tylB gene from Streptomyces fradiae. This fragment corresponds to nucleotides 2663 to 3702 of the DNA fragment described by Merson-Davies, L.A. & Cundliffe ⁇ . (Merson-Davies, L.A. & Cundliffe ⁇ ., 1994, GenBank access number: U08223), in which the coding sequence for the tylB gene corresponds to nucleotides 2677 to 3843.
  • the Nael-Nael fragment of DNA carrying a part of the tylB gene of Streptomyces fradiae (S ⁇ Q ID No. 86) was labeled with 32 P by the technique of "random priming" (Kit sold by the company Roche) and used as probe for the hybridization of 2000 bank clones, transferred to a filter.
  • the membranes used are " ',; Hybond N nylon membranes sold by the company Amersham (Amersham Biosciences, Orsay, France) and the hybridization was carried out at 55 ° C.
  • cosmids were digested independently by several enzymes (R mHI, Psil and Digestio products ns were separated on agarose gel, transferred to a nylon membrane and hybridized with the Nael-Nael DNA fragment comprising a part of the tylB gene from Streptomyces fradiae (cf. above) in the same conditions as above.
  • the four cosmids were able to be validated and one of these cosmids was more particularly selected and was named pOS49.1.
  • cosmid pOS49.1 Several fragments of the insert of the cosmid pOS49.1 have been subcloned and their sequences have been determined.
  • the cosmid pOS49.1 was digested with the enzyme S cl and it was shown by Southern blotting, under the conditions described above, that a 3.3 kb fragment contains the region hybridizing with the tylB probe.
  • This 3.3 : kb fragment was isolated by electroelution from a 0.8% agarose gel and then cloned into the vector pUC19 (GenBank access number M77789) and sequence.
  • the plasmid thus obtained was named pOS49.11.
  • the corresponding gene (the or ⁇ gene (SEQ ID No. 28)) was involved in the biosynthesis of spiramycins in S. ambofaciens
  • this gene was interrupted by an ⁇ hyg cassette (Blondelet-Rouault MH. Et al ., 991, GenBank access number: X99315).
  • the plasmid pOS49.11 was digested with the Xhol enzyme and the fragment containing the four open reading phases (two complete and two truncated, including or ⁇ in its entirety) was subcloned at the Xhol site of the vector.
  • pBC SK + marketed by the company Stratagene (LaJolla, Califormie, USA).
  • the plasmid thus obtained was named pOS49.12.
  • a PmR-BstEll fragment internal to or ⁇ was replaced by the ⁇ hyg cassette by blunt-end cloning in this last plasmid.
  • the plasmid pOS49.12 was digested with the enzymes Pmll and BstEll, the unique site of which is found in the coding sequence of the or ⁇ gene.
  • the ends of the fragment corresponding to the vector were blunt-ended by treatment with the Klenow enzyme (large fragment of DNA polymerase I).
  • the ⁇ hyg cassette was obtained by digestion with the enzyme BamHI of the plasmid pHP45 ⁇ hyg (Blondelet-Rouault et al, 1997, GenBank access number: X99315).
  • the fragment corresponding to the ⁇ hyg cassette was recovered on agarose gel and its ends were blunt-ended by treatment with the Klenow enzyme.
  • the two blunt-end fragments thus obtained (the ⁇ hyg cassette and the plasmid pOS49.12) were ligated and the ligation product was used for the transformation of E. coli bacteria.
  • the plasmid thus obtained was named pOS49.14 and contains the or ⁇ gene interrupted by the ⁇ hyg cassette.
  • the plasmid obtained (insert of the plasmid pOS49.14 cloned into the plasmid pOJ260) was named pOS49.16.
  • the latter was transferred into the strain ATCC23877 of S. ambofaciens by conjugation using the conjugative strain E. coli S17-1, as described by Mazodier et al. (Mazodier et al, 1989).
  • the E. coli S17-1 strain is derived from the E. coli 294 strain (Simon et al, 1983) (Simon, et al, 1986).
  • Transconjugating clones having the marker for resistance to hygromycin carried by the ⁇ hyg cassette and having lost the marker for resistance to apramycin carried by the vector pOJ260 could be obtained.
  • the clones are selected for their resistance to hygromycin.
  • the clones resistant to hygromycin are then subcultured respectively on medium with hygromycin (antibiotic B) and on medium with apramycin (antibiotic A) (cf. FIG. 9).
  • the clones resistant to hygromycin (HygR) and sensitive to apramycin (ApraS) are in principle those where a double recombination event has occurred and which therefore have the or ⁇ gene interrupted by the ⁇ hyg cassette.
  • the replacement of the wild-type copy of or ⁇ by the interrupted copy was verified by two successive hybridizations.
  • the total DNA of the clones obtained was digested with different enzymes, separated on agarose gel, transferred to the membrane and hybridized with a probe corresponding to the ⁇ hyg cassette (see above)) to verify the presence of the cassette in the genomic DNA of the clones obtained.
  • a second hybridization was carried out using as a probe the Xhol-Xh ⁇ l insert of the plasmid pOS49.11 containing the four open reading phases (two complete and two truncated, including or ⁇ in full).
  • Verification of the genotype can also be carried out by any method known to those skilled in the art and in particular by PCR using the appropriate oligonucleotides and sequencing of the PCR product.
  • the first probe used corresponds to a 3.7 kb BamHl-Pstl DNA fragment containing a fragment of the PKS gene (The genes corresponding to PKS were cloned by Burgett S. et al. In 1996 (US patent US 5,945,320)), orfl, or ⁇ and the start of or ⁇ , subcloned from pOS49.1 and going from a BamHI site located 1300 base pairs upstream of the EcoRI site defining position 1 of S ⁇ Q ID N ° 1, up to 'to the site
  • the second probe used corresponds to a Pstl-BamHI DNA fragment of approximately JS 2kb containing a gold / 7 and or ⁇ fragment, subcloned from pOS49.1 and going from a Pstl site located in position 6693 of S ⁇ Q ID N ° 1 to the BamHI site located in position 8714 of S ⁇ Q ID N ° 1.
  • This Pstl-BamHl fragment was cloned from pOS49.1 in the pBC SK + plamside, which made it possible to '' obtain the plasmid pOS49.76.
  • the srmD gene is a gene isolated from S. ambofaciens capable of conferring resistance to spiramycin. Indeed, previous work had allowed the cloning of several determinants of resistance of S. ambofaciens, conferring resistance to spiramycin to a strain of S. griseofuscus (strain sensitive to spiramycin) (Pernodet et al, 1993) (Pernodet and al, 1999). To isolate resistance genes, a cosmid library of the genomic DNA of the S.
  • ambofaciens strain ATCC23877 was produced in the cosmid pKC505. (Richardson MA et al, 1987).
  • the genomic DNA of the S. ambofaciens strain ATCC23877 had been partially digested with Sau3Al so as to obtain fragments of size between approximately 30 and 40 kb.
  • the genomic DNA thus digested (3 ⁇ g) had been ligated with 1 ⁇ g of pKC505 previously digested with the enzyme BamHI (Pernodet et al, 1999).
  • the ligation mixture was then packaged in vitro into phage particles.
  • the phage particles obtained were used to infect the strain of E.
  • coli HB101 (accessible in particular from the American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginia, USA), under the number 33694). About 20,000 clones of E. apramycin resistant coli had been pooled and the cosmids of these: • clones had been extracted. This cosmid pool was introduced by transformation of protoplasts into the DSM 10191 strain of S. griseofuscus (Cox KL & Baltz RH.
  • griseofuscus (Rao RN et a, 1987), which is naturally sensitive to spiramycin (cf. above).
  • the pool of plasmids corresponding to the Sau3Al fragment of ⁇ OS44.1 ligated in the vector pIJ486 (cf. above) was introduced by transformation of protoplasts in the strain DSM 10191 and the transformants were selected for their resistance to thiostrepton (due to the ter gene carried by pIJ486). Clones growing on medium containing thiostrepton were transferred to medium containing spiramycin. Several clones resistant to thiostrepton also grew on medium containing spiramycin and the plasmids of these colonies were extracted.
  • a plasmid conferring resistance and containing an insert of approximately 1.8 kb was selected and named pOS44.2.
  • This 1.8kb insert can be taken out easily thanks to a Hind ⁇ l site. and an EcoKL site present in the vector on either side of the insert.
  • This 1.8kb insert. , : HindlU-EcoRÎ was sequenced and the Resistance gene it contains was named srmDr This fragment containing the srmD gene could thus be easily subcloned into the vector pUC19 (GenBank access number M77789) opened by EcoRl -HindlU, the plasmid obtained was named pOS44.4.
  • the 1.8kb Hindlll-EcoRl insert, containing the srmD gene, of this plasmid was used as a probe to locate the biosynthesis genes of spiramycin (see below).
  • a sequence of 30,943 nucleotides starting at 5 'from an EeoRI site located in the first PKS gene and going to a BamHI site at 3' is presented in S ⁇ Q ID No. 1. This sequence corresponds to the upstream region of the genes of PKS (see Figures 2 and 3).
  • a second region of 11171 nucleotides, starting from a Pstl site in 5 'and going to a Ncol site in 3' located in the fifth gene of PKS is presented in S ⁇ Q ID ⁇ ° 2. This second region is the downstream region of the PKS genes (downstream and upstream being defined by the orientation of the 5 PKS genes all oriented in the same direction) (cf. FIGS. 2 and 3).
  • EXAMPLE 4 Analysis of the nucleotide sequences, determination of the open reading phases and characterization of the genes involved in the biosynthesis of spiramycins.
  • the genes of the region (C i upstream were named orfl, or ⁇ , or ⁇ , or ⁇ , or ⁇ , orf ⁇ , or ⁇ , or ⁇ , or ⁇ c, orflO, orfl le, orfl 2, orfl 3c, orfl4, orfl 5c, orfl ⁇ , orf 17 , orfl 8, orfl 9, or ⁇ O, or ⁇ lc, or ⁇ 2c, or ⁇ 3c, or ⁇ 4c and or ⁇ 5c (SEQ ID N ° 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62 , 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 and 84)
  • the genes of the downstream region were named orfl * c, or ⁇ * c, or ⁇ * c, or ⁇ * c, or ⁇ *, orf ⁇ *, or ⁇ * c, or ⁇ *, or ⁇ * c, or ⁇ *, or ⁇ * c, or ⁇ *
  • EXAMPLE 5 Gene Inactivation: Principle of Construction of an Interrupted Streptomyces ambofaciens Strain The methods used consist in performing a gene replacement. The target gene to be interrupted is replaced by a copy of this interrupted gene by a cassette conferring resistance to an antibiotic (for example apramycin or hygromycin), as illustrated in FIG. 9. The cassettes used are bordered on the side and others by translation termination codons in all the reading phases and by transcription terminators active in Streptomyces.
  • an antibiotic for example apramycin or hygromycin
  • the insertion of the cassette into the targeted gene ei ⁇ may or may not be accompanied by a deletion in this target gene.
  • the size of the regions flanking the cassette can range from a few hundred to several thousand base pairs.
  • the constructs necessary for the inactivation of the gene by the cassette were obtained from E. coli, the reference organism for obtaining recombinant DNA constructs.
  • the interrupted gene was obtained in a plasmid that replicates in E. coli but cannot replicate in Streptomyces.
  • constructs were then subcloned into vectors to allow transformation and inactivation of the desired gene in S. ambofaciens.
  • two plasmids were used:
  • plasmid ⁇ iHP45- ⁇ hyg (Bierman M. et al, 1992) (cf. example 2) which confers resistance to apramycin in E. coli and Streptomyces and which was used when the target gene was interrupted by a cassette conferring resistance to hygromycin.
  • - pOSK1205 (4726pb).
  • This plasmid is derived from the plasmid pBK-CMN (marketed by the company Stratagene (LaJolla, California, USA)) in which an Avril fragment containing the sequence coding for resistance to ⁇ eomycin / Kanamycin has been replaced by a sequence coding for resistance to hygromycin, while retaining the promoter P SN40.
  • the plasmid ⁇ iHP45- ⁇ hyg (Blondelet-
  • Rouault et a, 1997) was digested with the enzymes N ⁇ tl and Pflml and the fragment conferring resistance to hygromycin was subcloned at the site ⁇ 4vrII of the vector pBK-CMV after all the ends had been rendered whole frank by treatment with Klenow's enzyme.
  • the cassette which confers resistance to hygromycin is preceded by the promoter pSV40. This plasmid confers resistance to hygromycin in E. coli and Streptomyces and was used when the target gene was interrupted by a cassette conferring resistance to apramycin.
  • the plasmid carrying the gene interrupted by the cassette can then be introduced into Streptomyces ambofaciens, for example by conjugation between E. coli and Streptomyces (Mazodier P, et a, 1989).
  • This technique was used in the case where the base vector is the vector pOJ260.
  • a second technique can be used: the technique of transforming protoplasts after denaturation by alkaline treatment of AD ⁇ (Kieser, T et al, 2000), to increase the frequency of recombination as described for example by Oh & Chater (Oh & Chater, 1997). This technique has been used in the case where the basic vector is pOJ260 or pOSK1205 (see below).
  • the transformants are then selected with the antibiotic corresponding to the cassette present in the target gene (cf. FIG. 9, antibiotic B).
  • antibiotic B the antibiotic corresponding to the cassette present in the target gene
  • a mixture of clones is thus selected, among which there has been integration by one or by two recombination events.
  • clones sensitive to the antibiotic for which the resistance gene is present in the vector (outside the recombination cassette) cf. FIG. 9, antibiotic A
  • cassettes can be used for the interruption of the target genes.
  • the orf 3 gene had been interrupted by the ⁇ hyg cassette (cf. example 2.2) and it could be demonstrated that an or ⁇ :: ⁇ hyg strain no longer produced spiramycin, confirming the involvement of one or more genes from the region cloned in the biosynthesis of spiramycins (cf. example 2.2).
  • a co-transcription of ORFs .; n 1 to 7 is probable (cf. FIG. 3) and the phenotype observed (non-producer of spiramycins) may be due to the inactivation of one or more of the genes co-transcribed with or ⁇ .
  • the insert of pOS49.67 is therefore constituted by a DNA fragment of S. ambofaciens containing the orfl, or ⁇ , or ⁇ genes with the deletion in phase, or ⁇ and part of or ⁇ .
  • the vector into which this insert has been subcloned is pOJ260, the plasmid pOS49.67 therefore confers resistance to apramycin and was introduced by transformation of protoplasts into the strain OS49.16 (cf. example 2).
  • the strain OS49.16 being resistant to hygromycin, transformants hygR and apraR were obtained.
  • clones sensitive to apramycin and to hygromycin were sought.
  • apraS and hygS apraS and hygS
  • apraS and hygS hygromycin
  • the genotype of the strains thus obtained can be verified by hybridization or by PCR and sequencing of the PCR product (to verify that only a copy of or ⁇ deleted in phase is present in the genome of the clones obtained). Clones having only the copy of or ⁇ with a phase deletion were thus obtained and their genotype was verified. A clone of the (desired characteristics was more particularly selected and was named.
  • the plasmid pOS49.88 was firstly constructed.
  • the plasmid pOS49.88 is derived from the plasmid pUC19 (GenBank access number M77789) by insertion of a 3.7 kb fragment (fragment ⁇ tl-EeoRI obtained from the cosmid pSPM5), containing the end of or ⁇ , or ⁇ and the start of or ⁇ , cloned into the Pstl-EcoRl sites of pUC19.
  • the ⁇ hyg cassette (in the form of a BamHI fragment, made blunt by treatment with the Klenow enzyme) was cloned at the unique Sali site of pOS49.88 located in or ⁇ after all the ends were made blunt by treatment with the Klenow enzyme.
  • Plasmids being blunt end, two types of plasmids were obtained according to the ' direction of insertion of the cassette: pOS49.106 in which the hyg and or ⁇ genes are in the same orientation and pOS49.120 in which the hyg and or ⁇ genes are in opposite directions.
  • the insert of plasmid pOS49.106 was then subcloned into plasmid pOJ260 to give pOS49.107.
  • the plasmid pOS49.106 was digested with the enzyme AspllSl and the ends were made blunt-ended by treatment with the Klenow enzyme, this digestion product was redigested by the enzyme Pstl and the fragment containing the or ⁇ gene into which the ⁇ hyg cassette has been inserted, has been cloned j- into the vector pOJ260 (cf. above).
  • the vector pOJ260 was digested with; EcoRV and Pstl enzymes and used for ligation. This manipulation therefore makes it possible to obtain an oriented ligation since each of the two fragments is a blunt end on one side and P ⁇ tl on the other.
  • the plasmid obtained was named pOS49.107.
  • the plasmid ⁇ OS49.107 was introduced into the strain ATCC23877 of S. ambofaciens by transformation of protoplasts (Kieser, T et al, 2000). After transformation of the protoplasts, the clones are selected for their resistance to hygromycin. The clones resistant to hygromycin are then subcultured respectively on medium with hygromycin (antibiotic B) and on medium with apramycin (antibiotic A) (cf. FIG. 9). The clones resistant to hygromycin (HygR) and sensitive to apramycin (ApraS) are in principle those where a double crossing over event has occurred and which have the or ⁇ gene interrupted by the ⁇ hyg cassette.
  • the replacement of the wild-type copy of or ⁇ by the copy interrupted by the ⁇ hyg cassette was verified by Southern Blot.
  • the total DNA of the clones obtained was digested with several enzymes, separated on agarose gel, transferred to the membrane and hybridized with a probe corresponding to the ⁇ hyg cassette to verify the presence of the cassette in the genomic DNA of the clones obtained.
  • a second hybridization was carried out using as probe the Pstl-EcoRl insert containing the end of or ⁇ , or ⁇ and the start of or ⁇ with a size of approximately 3.7 kb of the plasmid pOS49.88.
  • Verification of the genotype can be carried out by any method known to a person skilled in the art and in particular by PCR using the appropriate oligonucleotides and sequencing of the PCR product.
  • OS49.107 A sample of the strain OS49.107 was deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Dondel Roux 75724 Paris Cedex 15, France, on July 10, 2002 under registration number 1 -2917.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • SRMR2 5 'TGAAGCTGGACGTCTCCTACGTCGG 3' (SEQ ID H "90)
  • This DNA fragment from the PCR was cloned into the vector pCR2.1 sold by the company Invitrogen (Carlsbad, California, USA).
  • the plasmid thus obtained was named pOS49.32.
  • the ⁇ hyg cassette (in the form of a BamHI fragment, cf. above) was cloned at the unique RstEII site internal to the fragment of the orf 10 gene, after all of the ends had been made blunt by treatment with Klenow enzyme.
  • plasmid pOS49.43 in which the genes hyg and orf 10 are in the same orientation
  • pOS49.44 in which the genes hyg and orflO are in opposite directions.
  • the insert of the plasmid pOS49.43 was transferred (in the form of an Aspl1Sl-Xbal fragment, the ends of which were made blunt-ended by treatment with the Klenow enzyme) in the EcoRV site of the plasmid pOJ260 which made it possible to '' obtain the plasmid pOS49.50.
  • the plasmid pOS49.50 containing the fragment of the orflO gene interrupted by the ⁇ hyg cassette was introduced into the strain ATCC23877 of Streptomyces ambofaciens. After transformation, the clones are selected for their resistance to hygromycin. The clones resistant to hygromycin are then subcultured respectively on medium with hygromycin (antibiotic B) and on medium with apramycin (antibiotic A) (cf. FIG. 9). The clones resistant to hygromycin (HygR) and sensitive to apramycin (ApraS) are in principle those where a double crossing over event has occurred and which have the orflO gene interrupted by the ⁇ hyg cassette.
  • Clones which possessed the marker of resistance to hygromycin carried by the cassette and which had lost the marker of resistance to apramycin carried by the vector pOJ260 were thus obtained.
  • the event of replacement of the wild copy of orflO by the interrupted copy orflO :: ⁇ hyg was verified by Southern Blot.
  • the total genomic DNA of the clones obtained was digested with several enzymes, separated on agarose gel, transferred to the membrane and hybridized with a probe corresponding to the ⁇ hyg cassette to verify the presence of the cassette in the genomic DNA.
  • a second hybridization was carried out using as a probe the 1.5 kb PCR product internal to the orf 10 gene (cf. above).
  • a clone with the expected characteristics (orflOv. ⁇ hyg) was more particularly selected and named OS49.50. It has indeed been possible to verify thanks to the two hybridizations that the ⁇ hyg cassette was indeed present in the genome of this clone and that the expected digestion profile is indeed obtained in the case of a replacement, following a double recombination event, of the wild-type gene by the copy interrupted by the ⁇ hyg cassette in the genome of this clone. Verification of the genotype can also be carried out by any method known to those skilled in the art and in particular by PCR using the appropriate oligonucleotides and sequencing of the PCR product.
  • EXAMPLE 9 Gene Inactivation: Principle of Building a Strain of Streptomyces ambofaciens Interrupted Using the “Excisable Cassettes” Technique (cf. FIGS. 9 and 10)
  • These cassettes have the advantage of being able to be excised in Streptomyces by a site-specific recombination event after having been introduced into the genome of S. ambofaciens. The aim is to inactivate certain genes in Streptomyces strains without leaving selection markers or large DNA sequences not belonging to the strain in the final strain. After excision there remains only a short sequence of about thirty base pairs (called the “scar” site) in the genome of the strain (cf. FIG. 10).
  • the implementation of this system consists, firstly, in replacing the wild copy of the target gene (thanks to two homologous recombinais ⁇ h events), cf. FIG. 9) by a construct in which an excisable cassette has been inserted into this target gene. The insertion of this cassette is accompanied by a deletion in the target gene (cf. FIG. 9). In a second step, the excision of the excisable cassette of the genome of the strain is caused.
  • the excisable cassette functions thanks to a site-specific recombination system and has the advantage of making it possible to obtain mutants of Streptomyces which ultimately do not carry a resistance gene. It also frees itself from possible polar effects on the expression of genes located downstream of the inactivated gene (s) (cf. FIG. 10).
  • the excisable cassette can be constructed using for example the ⁇ hyg cassette (Blondelet Rouault et al, 1997). This cassette was bordered by ⁇ ttR and attL sequences which normally flank the integrated copy of pSAM2 (cf. FIG. 15). The attL and attR sequences contain all the sites necessary for site- recombination.
  • the Streptomyces strain is transformed with the recombinant plasmid.
  • the transformants are then selected with the antibiotic corresponding to the cassette present in the target gene (cf. FIG. 9, antibiotic B, this is for example a selection by hygromycin if the excisable cassette is derived from the ⁇ hyg cassette ).
  • antibiotic B this is for example a selection by hygromycin if the excisable cassette is derived from the ⁇ hyg cassette ).
  • a mixture of clones is thus selected, among which there has been integration by a single or by two recombination events.
  • the strain selected above is transformed by a plasmid allowing the expression of the xis and int genes which are both necessary for site-specific recombination between the attR and attL sites.
  • This recombination results in the departure of the excisable cassette of the genome of the strain, thanks to a recombination event (cf. FIG. 10) (Raynal et a, 1998).
  • a recombination event (cf. FIG. 10) (Raynal et a, 1998).
  • Streptomyces e.g. Streptomyces derivative of the vector pWHM3 (Vara et al, 1989)
  • this allows to obtain a strain having lost the latter vector after sporulation few cycles in the absence of selection pressure.
  • plasmid pOSV508 (cf. figure; 14) which is introduced by transformation of protoplasts into the strain of S. ambofaciens i containing a gene interrupted by the excisable cassette.
  • the plasmid pOSV508 is derived from the plasmid pWHM3 (Vara J et al, l9S9) (cf. FIG. 13) in which i have been added i to 1 ⁇ xis and int genes of pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) placed under the control of the - ⁇ ptrc promoter (Amann, E. et al, 1988).
  • the xis and int genes placed under the control of the ptrc promoter were subcloned into the plasmid pWHM3 from the plasmid pOSint3 (Raynal et al, 1998) (cf. FIG. 14).
  • the introduction into the mutant strain of the plasmid pOSV508 carrying the xis and int genes of pSAM2 will allow efficient excision by site-specific recombination of the excisable cassette between the attL and attR sites flanking this cassette (Raynal A. et al, 1998 ) ( Figure 10).
  • transformants selected for their resistance to thiostrepton due to the tsr gene carried by pOSV508, those chosen have become sensitive to the antibiotic to which the presence of the cassette confers resistance (cf. FIG. 10). Excision is effective and it has been observed that more than 90% of the transformants are of this type. After one or more growth and sporulation cycles on a solid medium devoid of thiostrepton, clones are obtained which have lost the plasmid pOSV508. These clones are identifiable by their sensitivity at thiostrepton. The sequence of the deleted target gene can be verified by PCR and sequencing of the PCR product.
  • the resulting strain carries, at the level of the inactivated gene (internal deletion for example) a “scar” att site corresponding to the minimal attB site (Raynal et al, 1998), resulting from the recombination between the ⁇ ttR and attL sites.
  • This minimal attB site which remains is similar to that naturally present in the strains of Streptomyces ambofaciens, Streptomyces pristinaespiralis and Streptomyces lividans (Sezonov et al, 1997).
  • the gene that we want to inactivate can be cotranscribed with other genes located downstream. To avoid the inactivation of one of the genes having a polar effect on the expression of genes downstream in the operon, it is important to obtain a deletion in phase after excision of the cassette.
  • the excisable cassette system as described above makes it possible to meet such a requirement. Those skilled in the art can, in fact, easily construct three separate excisable cassettes, these leaving after excision a sequence of 33, 34 or 35 nucleptides respectively, without stop codon whatever the '*] reading phase. Knowing the target gene sequence and the size of the deletion; associated with the insertion of the cassette, it is possible to choose between these three excisable cassettes so that the excision leads to a deletion in phase.
  • 26 correspond to the minimal attB sequence (cf. FIG. 27).
  • two excisable cassettes were used. These two cassettes are as follows: attl ⁇ hyg + (SEQ ID No. 91) and att3 ⁇ aac- (SEQ ID No. 92), these cassettes leave 33 and 35 nucleotides respectively after excision. They respectively include the ⁇ hyg cassette or the ⁇ aac cassette, the + and - signs corresponding to the orientation of the resistance cassette.
  • These two cassettes were constructed and cloned at the EcoRV site of the pBC SK + vector, the HindIII site of which was previously deleted.
  • the plasmids obtained were named pattl ⁇ hyg + and patt3 ⁇ aac- respectively.
  • the excisable cassettes can be easily removed by digestion of the plasmid with EcoRV.
  • EXAMPLE 10 Construction of a Streptomyces ambofaciens strain interrupted in the or ⁇ gene
  • the or ⁇ gene was inactivated using the excisable cassette technique (see above).
  • the starting strain used is the Streptomyces ambofaciens OSC2 strain which is derived from the ATCC23877 strain.
  • the OSC2 strain differs from the ATCC23877 strain in that it has lost the mobile genetic element pSAM2 (Boccard et al, 1989a and b). This mobile element can be lost spontaneously during protoplastization (action of lysozyme to digest the wall; bacterial and fragment the mycelium (Kieser et al, 2000)) and the regeneration of protoplasts of the ATCC23877 strain.
  • pOSV510 s The strain ATCC23877 was transformed after protoplastization with the plasmid pOSV510.
  • the Pra promoter is a promoter repressed by the KorSA repressor, the gene encoding the latter being located within the mobile element pSAM2 (Sezonov G. et al, 2000).
  • the transformed bacteria After transformation with the plasmid pOSV510, the transformed bacteria are selected for their resistance to kanamycin (due to the aph gene carried by pOSV510).
  • Selection by kanamycin after transformation with the plasmid pOSV510 therefore makes it possible to select the clones having lost the integrative element pSAM2 (and therefore KorSA) and having the plasmid pOSV510.
  • the plasmid pOSV510 being unstable, after a few cycles of sporulation without antibiotic, isolated clones are subcultured on medium with kanamycin, on medium with hygromycin and on medium without antibiotic. Clones sensitive to kanamycin and hygromycin lost pOSV510. The loss of the pSAM2 element was verified by hybridization and PCR. A clone with the desired characteristics was selected and was named OSC2.
  • the or ⁇ gene was inactivated using the excisable cassette technique (see above and Figure 10). For this, a 4.5 kb insert whose sequence starts from the EcoRI site located in position 1 to the BamHI site located in position 4521 (S ⁇ Q ID No. 1) was subcloned at the EcoRI and BamHI sites of plasmid pUCl . 9 (GenBank access number M77789) from the cosmid pSPM5. The plasmid thus obtained was named pOS49.99.
  • This plasmid was introduced into the E. coli KS272 strain which already contained the. plasmid pKOB ⁇ G (Chaveroche et al, 2000) (cf. FIG. 12). ' ?
  • the excisable cassette att3 ⁇ aac- (SEQ ID No. 92, cf. above) was amplified by PCR using as plasmid the plasmid pOSK1102 (The plasmid pOSK1102 is a plasmid derived from the vector ⁇ GP704Not (Chaveroche et al, 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) in which the att3 ⁇ aac- cassette was cloned as an EcoRV fragment in the unique EcoRV site of pGP704Not) and using the following primers:
  • the 40 deoxy-nucleotides located at the 5 'end of these oligonucleotides have a sequence corresponding to a sequence in the target gene (or ⁇ in this case) and the 20 deoxy-nucleotides located most in 3' (shown in bold ci above) correspond to the sequence of one of the ends of the att3 ⁇ aac- excisable cassette (see Figure 11).
  • the PCR product thus obtained was used to transform the E. cpli strain containing the plasmids pKOB ⁇ G and pOS49.99 as described (Chaveroche et al, 2000) (cf. FIG. 12).
  • the bacteria were transformed by electroporation and selected for their resistance to apramycin.
  • the plasmids of the clones obtained were extracted and digested with several restriction enzymes, in order to verify that the digestion profile obtained corresponds to the profile expected if there has been insertion of the cassette (att3 ⁇ aac-) into the target gene ( or ⁇ ), i.e. if there was indeed homologous recombination between the ends of the PCR product and the target gene (Chaveroche et al,
  • plasmid derives from pOS49.99 in which or ⁇ is interrupted by the apramycin cassette (cf. FIG. 12).
  • the insertion of the cassette is accompanied by a deletion in or ⁇ , between nucleotides 211 and 492 of the coding part of or ⁇ .
  • the plasmid pSPM17 was digested with the EcoRI enzyme then the ends were made blunt by treatment with the Klenow enzyme, this digestion product was then digested with the Xbal enzyme and the insert containing the deleted or ⁇ gene was cloned into the vector pOSK1205 (cf. above).
  • the vector pOSK1205 was digested with the enzyme BamHI then the ends were made blunt end by treatment with the Klenow enzyme, this product was then digested with the enzyme Xbal, and used for the ligation with l insert obtained from pSPM17 as above.
  • This manipulation therefore makes it possible to obtain an oriented ligation since each of the two fragments is a blunt end on one side and Xbal on the other.
  • the plasmid thus obtained was named pSPM21, it carries a hygromycin resistance gene (vector part) and an insert in which the deleted or ⁇ gene is replaced by the att3 ⁇ aac- cassette.
  • the vector pSPM21 was introduced into the Streptomyces ambofaciens OSC2 strain (see above) by transformation of protoplasts (Kieser, T et al, 2000). After transformation, the clones are selected for their resistance to apramycin. The clones resistant to apramycin are then subcultured respectively on milia with apramycin (antibiotic B) and on medium with hygromycin (antibiotic A) (cf. FIG. 9). The clones resistant to apramycin (ApraR) and sensitive to hygromycin (HygS) are in principle those where a double crossing over event has occurred and which have the or ⁇ gene interrupted by the att3 ⁇ aac- cassette.
  • the strain SPM21 was deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Dondel Roux 75724 Paris Cedex 15, France, on July 10, 2002 under the registration number I-2914 .
  • the strain SPM21 was transformed by the vector pOSV508 by transformation of protoplasts to cause excision of the cassette (cf. FIG. 14).
  • the plasmid pOSV508 is derived from the plasmid pWHM3 (Vara J and ⁇ ., 1989) (cf. FIG. 13) in which the xis and int genes of pSAM2 (Boccard F.
  • the strain thus obtained and having the desired genotype was named SPM22.
  • plasmid pSPM504 For the inactivation of orfl2, orfl3c and orfl4, the same starting plasmid (pSPM504) was used to introduce a cassette of the “excisable cassette” type at different positions.
  • This plasmid has a 15.1 kb insert that corresponds to the region to or ⁇ orfl 7.
  • a 'BglII fragment of 15.1 kb derived from the digestion of the cosmid pSPM7 (see above) was clone in the plasmid pMBL18 (Nakano et al, 1995) digested with BamHI. The BamHI and BglTL ends being compatible, the plasmid pSPM502 is obtained after ligation.
  • pSPM502 The entire insert of pSPM502 was then subcloned (in the form of a HindUl / Nhel fragment) in the plasmid pOSK1205 (digested with HindlUJNhei) which made it possible to obtain the plasmid pSPM504.
  • This plasmid was introduced into the E. coli KS272 strain which already contained the plasmid pKOBEG (Chaveroche and ⁇ l, 2000) (cf. FIG. 12).
  • the excisable cassette ⁇ tt3 ⁇ c- was amplified by PCR using as plasmid the plasmid pOSKl 102 (the plasmid pOSKl 102 is a plasmid derived from the vector ⁇ GP704Not (Chaveroche and ⁇ l, 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) in which the ⁇ tt3 ⁇ c- cassette has been cloned as an EcoRV fragment in the unique EcoRV site of pGP704Not), the primers used are the following:
  • ⁇ DR8 5 'CGGGATGATCGCTTGTCCGGCGGCCGGATGCCTAGCCTCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' (S ⁇ Q ID N ° 96)
  • ⁇ DR9 5 'CCCGATCCAGAACGTCTGGTCGGTGATCAGGTCGCTGTTCATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (S ⁇ Q ID N ° 97)
  • the 40 (only 39 for ⁇ DR8) deoxy-nucleotides located at the 5 'end of these oligonucleotides have a sequence corresponding to a sequence in the gene 004/033689
  • the PCR product thus obtained was used to transform the E. coli KS272 strain containing the plasmids pKOB ⁇ G and pSPM504 (cf. above), as described by Chaveroche et al. (Chaveroche * et al, 2000) (cf. FIG. 12 for the principle, the plasmid pOS49.99 must be replaced by the plasmid pSPM504 and the plasmid obtained is no longer pSPM17 but pSPM507).
  • the bacteria were transformed by electroporation with this PCR product and the clones were selected for their resistance to apramycin.
  • the plasmids of the clones obtained were extracted and digested with several restriction enzymes, in order to verify that the digestion profile obtained corresponds to the expected profile if there has been insertion of the cassette (att3 ⁇ aac ⁇ ) into the target gene ( orfl 2), ie if there has indeed been homologous recombination between the ends of the PCR product and the target gene (Chaveroche et al, 2000).
  • the verification of the construction can also be carried out by any method known to a person skilled in the art and in particular by PCR using the appropriate oligonucleotides and sequenced? ; (] of the PCR product.
  • pSPM507 This plasmid is derived from pSPM504 in which orfl 2 is interrupted by the att3 ⁇ aac- cassette (cf. FIG. 12 The insertion of the cassette is accompanied by a deletion in the orfl 2 gene, the interruption begins at the thirtieth codon of orf 12. The last 46 codons of orfl2 remain after the cassette.
  • the vector pSPM507 was introduced into the Streptomyces ambofaciens OSC2 strain (see above) by transformation of protoplasts (Kieser, T et al, 2000). After transformation, the clones are selected for their resistance to apramycin. The clones resistant to apramycin are then subcultured respectively on medium with apramycin (antibiotic B) and on medium with hy romycin (antibiotic A) (cf. FIG. 9). The clones resistant to apramycin (ApraR) and sensitive to hygromycin (HygS) are in principle those where a double crossing over event has occurred and which have the orf 12 gene interrupted by the att3 ⁇ aac- cassette.
  • Verification of the genotype can also be carried out by any method known to those skilled in the art and in particular by PCR using the appropriate oligonucleotides and sequencing of the PCR product.
  • a clone with the expected characteristics (orfl2 :: att3 ⁇ aac-) was more particularly selected and named SPM507. It has indeed been possible to verify thanks to the two hybridizations that the att3 ⁇ aac- cassette was indeed present in the genome of this 'clone and that the digestion profile expected is indeed obtained in the case of a' replacement, following of a double recombination event, of the wild-type gene by. '> ⁇ the copy interrupted by the att3 ⁇ aac- cassette in the genome of this clone. This clone therefore has the genotype: orfl2 :: att3 ⁇ aac- and was named SPM507.
  • the att3 ⁇ aac- excisable cassette was amplified by PCR using the plasmid pOSKl 102 (see above) as matrix using the following primers:
  • EDR3 5 'ACCGGGGCGGTCCTCCCCTCCGGGGCGTCACGGCCGCGGAATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ ID N ° 98)
  • EDR4 5 'CACGCAGCGAGCCGACGCACTGATGGACGACACGATGGCCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' (SEQ ID N ° 99)
  • KS272 containing the plasmids pKOBEG and pSPM504 (cf. above), as described by '• Chaveroche et al. (Chaveroche et al, 2000) (cf. Figure 12 for the principle, the plasmid pOS49.99 must be replaced by the plasmid pSPM504 and the plasmid obtained is no longer
  • the bacteria were transformed by electroporation with the PCR product and the clones were selected for their resistance to apramycin.
  • the plasmids of the clones obtained were extracted and digested with several restriction enzymes, in order to verify that the digestion profile obtained corresponds to the profile expected if there has been insertion of the cassette (att3 ⁇ aac-) into the gene
  • pSPM508 This plasmid is derived from pSPM504 in which orfl 3c is interrupted by the apramycin cassette (cf. FIG. 12). The insertion of the cassette is accompanied by a deletion in the orfl3c gene, the interruption begins at the sixth codon of orfl3c. After the cassette, the last 3 codons of orfl3c remain.
  • the vector pSPM508 was introduced into the Streptomyces ambofaciens strain
  • OSC2 (see above) by transformation of protoplasts (Kieser, T et al, 2000). After transformation, the clones are selected for their resistance to apramycin. The clones resistant to apramycin are then subcultured respectively on medium with ; apramycin (antibiotic B) and on medium with hygromycin (antibiotic A) (cf. FIG. 9).
  • the clones resistant to apramycin (ApraR) and sensitive to hygromycin (HygS) are in principle those where a double crossing over event has occurred and which have the orfl 3c gene interrupted by the att3 ⁇ aac- cassette.
  • a clone exhibiting the expected characteristics was more particularly selected and named SPM508. It has indeed been possible to verify thanks to the two hybridizations that the att3 ⁇ aac- cassette was indeed present in the genome of this clone and that the digestion profile expected is indeed obtained in the case of a replacement, following a double recombination event, of the wild-type gene by the copy interrupted by the att3 ⁇ aac- cassette in the genome of this clone. This clone therefore has the genotype: orfl3c :: att3 ⁇ aac- and was named SPM508.
  • the att3 ⁇ aac- excisable cassette was amplified by PCR using the plasmid pOSKl 102 (see above) as matrix using the following primers:
  • EDR5 5'GGGCGTGAAGCGGGCGAGTGTGGATGTCaTGCGAGTACTCATCGCGCGCGCTTCGTTCGO 3 '(SEQ ID N ° 100)
  • EDR6 5 'CGGGAAACGGCGTCGCACTCCTCGGGGGCCGCGTCAGCCCATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ ID N ° 101)
  • the 40 deoxy-nucleotides located at the 5 'end of these oligonucleotides have a sequence corresponding to a sequence in the target gene (orfl4 in this case) and the 20 deoxy-nucleotides located most at 3' (shown in bold here). above) correspond to the sequence of one of the ends of the att3 ⁇ aac- excisable cassette (see Figure 11).
  • the PCR product thus obtained was used to transform the E. coli KS272 strain containing the plasmids pKOBEG and pSPM504 (cf. above), as described by Chaveroche et al. (Chaveroche et al, 2000) (cf. FIG. 12 for the principle, the plasmid pOS49.99 must be replaced by the plasmid pSPM504 and the plasmid obtained is no longer pSPM17 but pSPM509).
  • the bacteria were transformed by electroporation with the PCR product and the clones were selected for their resistance to apramycin.
  • the plasmids of the clones obtained were extracted and digested with several restriction enzymes, in order to verify that the digestion profile obtained corresponds to the expected profile if there has been insertion of the cassette (attS ⁇ aac-) into the target gene ( orfl 4), ie if there has indeed been homologous recombination between the ends of the PCR product and the target gene (Chaveroche et al, 2000).
  • the verification of the construction can also be carried out by any method known to a person skilled in the art and in particular by PCR using the appropriate oligonucleotides and sequencing of the PCR product. A clone whose plasmid has the expected profile has been selected
  • the vector pSPM509 was introduced into the Streptomyces ambofaciens OSC2 strain (see above) by transformation of protoplasts (Kieser, T et al, 2000). After transformation, the clones are selected for their resistance to apramycin. The clones resistant to apramycin are then subcultured respectively on medium with apramycin (antibiotic B) and on medium with hygromycin (antibiotic A) (cf. FIG. 9). The clones resistant to apramycin (ApraR) and sensitive to hygromycin (HygS) are in principle those where a double crossing over event has occurred and which have the orfl 4 gene interrupted by the att3 ⁇ aac- cassette.
  • clones were more particularly selected and the replacement of the wild-type copy of orfl4 by the copy interrupted by the cassette was verified by hybridization.
  • the total DNA of the clones obtained was digested by several enzymes, separated on agarose gel, transferred to the membrane and hybridized with a probe corresponding to the att3 ⁇ aac- cassette to verify the presence of the cassette in the genomic DNA.
  • a second hybridization was carried out using a PCR product as probe corresponding to a sequence extending over a hundred base pairs upstream and downstream of the coding sequence of orf 14. Verification of the genotype can also be carried out by any method known to those skilled in the art and in particular by PCR using appropriate oligonucleotides and sequencing of the PCR product.
  • EXAMPLE 14 Construction of a Streptomyces ambofaciens strain interrupted in the orf ⁇ * gene
  • the orf ⁇ * gene was inactivated using the excisable cassette technique (see above and Figure 10).
  • the cosmid pSPM7 was used as a matrix to amplify a fragment of the orf ⁇ * gene using the following oligonucleotides:
  • C9583 5 'CTGCAGGTGCTCCAGCGCGTCGATCT 3' (oligo sense) (SEQ ID N ° 102)
  • C9584 5 'CTGCAGACGGAGGCGGACCTGCGGCT 3' (oligo antisense) (SEQ ID N ° 103)
  • the 20 deoxy-nucleotides located at the 3 ′ end of these oligonucleotides correspond to a sequence located in the coding part of the orf ⁇ * gene (SEQ ID No. 13) and the 6 deoxy-nucleotides located most at 5 ′ correspond to the site sequence
  • the amplified DNA fragment is approximately 1.11 kb in size.
  • This PCR product is cloned into the vector pGEM-T Easy (marketed by the company Promega (Madison, Wisconcin, USA)) which made it possible to obtain the plasmid named pBXL111 (cf. FIG. 16).
  • the attl ⁇ hyg + excisable cassette was then introduced into the coding sequence of the orf ⁇ * gene.
  • the plasmid pBXL1 ll 1 was digested with the restriction enzymes SmaI and Aspl1S1 and the digestion product was treated with the enzyme Klenow.
  • This manipulation makes it possible to carry out an internal deletion of 120 bp in the coding sequence of the orf ⁇ * gene (cf. FIG. 15).
  • the attl ⁇ hyg + excisable cassette was prepared from the plasmid pattl ⁇ hyg + (cf. above) by digestion of this plasmid with EcoRV. The latter was then subcloned into the vector pBXLl l l l previously prepared as described above (Smal and AspllSl digestion then treatment with the Klenow enzyme).
  • the plasmid obtained was named pBXL112 (cf. FIG. 17).
  • the orf ⁇ * gene has a 120bp deletion and is interrupted by the attl ⁇ hyg + cassette.
  • the plasmid pBXL1112 was then digested with the enzyme Pstl (site bordering the cassette since it is present in the oligonucleotides PCR) and the Pstl insert of 3.7 kb comprising a part of orf ⁇ * interrupted by the attl ⁇ hyg + cassette was then cloned at the level Pstl site of the plasmid pOJ260 (cf. above).
  • the plasmid thus obtained was named pBXLl 113.
  • the vector pBXL1113 was introduced into the Streptomyces ambofaciens OSC2 strain (see above) by transformation of protoplasts (Kieser, T et al, 2000).
  • the clones are selected for their resistance to hygromycin.
  • the clones resistant to hygromycin are then subcultured respectively on medium with hygromycin (antibiotic B) and on medium with apramycin (antibiotic A) (cf. FIG. 9).
  • the clones resistant to hygromycin (HygR) and sensitive to apramycin (ApraS) are in principle those where a double crossing over event has occurred and which have the orf ⁇ * gene interrupted by the attl ⁇ hyg + cassette. These clones were more particularly selected and the replacement of the wild copy of orf ⁇ * by the copy interrupted by the cassette was verified by the technique of Southern blot.
  • the total DNA of the clones obtained was digested with several enzymes, separated on agarose gel, transferred to a membrane and hybridized with a probe corresponding to the hyg gene (obtained by PCR) to verify the presence of the cassette in the Genomic DNA of the clones obtained.
  • a second hybridization was carried out using as probe the Pstl-Pstl insert containing the orf ⁇ * gene, of a size of about 1.1 kb and obtained from r of the plasmid pBXLllll (cf. above and fig re 16).
  • Verification of the ⁇ genotype can also be carried out by any method known to those skilled in the art and in particular ' - ⁇ by PCR using the appropriate oligonucleotides and sequencing of the PCR product.
  • a clone with the expected characteristics (orf ⁇ * :: attl ⁇ hyg +) was more particularly selected and named SPM501. It has indeed been possible to verify thanks to the two hybridizations that the attl ⁇ hyg + cassette was indeed present in the genome of this clone and that the expected digestion profile is indeed obtained in the case of a replacement, following a double recombination event, of the wild-type gene by the copy interrupted by the attl ⁇ hyg + cassette in the genome of this clone. This clone therefore has the genotype: orf ⁇ * :: attl ⁇ hyg + and was named SPM501.
  • the strain SPM501 was deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Dondel Roux 75724 Paris Cedex 15, France, on July 10, 2002 under the registration number 1-2909 .
  • the strain SPM501 was transformed by the vector pOSV508 by transformation of protoplasts to cause excision of the cassette (cf. FIG. 14).
  • the plasmid pOSV508 is derived from the plasmid pWHM3 (Vara J et a /., 1989) (cf. FIG. 13) in which the xis and int genes of pSAM2 (Boccard F.
  • H begins at 158 codon, 40 cPdons are deleted (120pb) and the excision of the cassette 1 ⁇ ; leaves a “scar” attl sequence characteristic of 33 bp: 5 ′ ATCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3 ′ (SEQ ID No. 104).
  • the strain of Micrococcus luteus used is a strain derived from the strain DSM 1790 naturally sensitive to spiramycin (this strain is available in particular from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschweig, Germany), under the number DSM 1790), the strain used in the present test differs from the strain DSM1790 in that it is resistant to congocidine.
  • This strain is a spontaneous mutant obtained by selection on medium containing increasing doses of congocidine.
  • Such a strain was selected because Streptomyces ambofaciens produces both spiramycin and y congocidine.
  • the aim is to measure the production of spiramycin from the various strains : f; ; - ' ; obtained thanks to a microbiological test based on the sensitivity of a strain of Micrococcus luteus, it is necessary to have a strain resistant to ! ; ⁇ à; 'îf congocidine.
  • the different strains of Streptomyces to be tested were cultured in 500 ml baffled erlenmeyers (baffled erlenmeyers) containing 70 ml of MP5 medium (Pernodet et al, 1993).
  • the baffled Erlenmeyer flasks were inoculated at an initial concentration of 2.5 ⁇ 10 6 spores / ml of the different strains of S. ambofaciens and grown at 27 ° C. with orbital shaking at 250 rpm.
  • Samples of 2 ml of suspensions were taken after 48, 72 and 96 hours of culture and centrifuged.
  • the different supernatants were then frozen at -20 ° C. A dilution to a tenth of these supernatants in sterile culture medium is used for the test (cf. FIG. 18).
  • the indicator strain of Micrococcus luteus resistant to congocidin but sensitive to spiramycin was cultured in 2TY medium (Sambrook et al, 1989) containing congocidin at 5 ⁇ g / ml for 48 h at 37 ° C.
  • the optical density (OD) of the culture is measured and this culture is diluted so as to adjust the optical density to 4.
  • 0.4 ml of this preculture is diluted in 40 ml of DAM5 medium (Difco Antibiotic Medium 5, marketed by the company Difco), beforehand brought to a temperature of about 45 ° C. This medium is then poured into a 12 ⁇ 12 cm square box and left to stand at room temperature.
  • Whatman AA paper discs (cf. Gourmelen A. et al, 1998) 12 mm in diameter were soaked with 70 ⁇ l of the dilution to one tenth of each supernatant and deposited on the surface of the box. Discs soaked in a solution of spiramycin of different concentrations (2-4-8 ⁇ g / ml in MP5 culture medium) are used as standard range. The dishes are left at 4 ° C for 2 h so as to allow the diffusion of antibiotics in the agar and are then incubated at 37 ° C for 24 to 48 h.
  • the disc contains spiramycin, it diffuses into the agar and inhibits the growth of the indicator strain of Micrococcus luteus. This inhibition creates a "halo" around the disc, this halo reflecting the area where the strain of Micrococcus luteus did not grow. The presence of this halo is therefore an indication of the presence of spiramycin and makes it possible to determine whether the strain of S. ambofaciens corresponding to the disc in question is producing or not producing spiramycin. A comparison with the inhibition diameters obtained for the standard range makes it possible to obtain an indication of the quantity of spiramycin produced by this strain.
  • the or ⁇ and orf 10 genes encode proteins essential for the biosynthesis of spiramycin since the strains OS49.107 and OS49.50 have a non-producing phenotype.
  • it is the inactivation of the corresponding gene which is responsible for this non-producing phenotype, since in view of the orientation of the different orfs (cf. FIG. 3), the construction introduced does not may have a polar effect.
  • the study of strains having an excisable cassette also makes it possible to draw a certain number of conclusions with regard to the function of the interrupted genes.
  • the SPM507 strain has the genotype: orfl2 :: att3 ⁇ aac-. There is no need to excise the cassette to study the effect of inactivation of orf! 2, in view of! the orientation of the genes (cf. FIG. 3). The fact that orf! 3c is oriented in the opposite direction to orfl2 shows that these genes are not co-transcribed.
  • the use of an excisable cassette makes it possible to get rid of the selection marker at any time.
  • the phenotype of the strain SPM507 is non-producing, it can therefore be concluded that the orfl2 gene is a gene essential for the biosynthesis of spiramycin in S. ambofaciens.
  • the SPM508 strain has the genotype: orfl3c :: att3 ⁇ aac-. There is no need to excise the cassette to study the effect of inactivation of orfl 3c, given the orientation of the genes (see Figure 3). The fact that orf! 4 is oriented in the opposite direction to orf! 3c shows that these genes are not co-transcribed. The use of an excisable cassette, on the other hand, makes it possible to get rid of the selection marker at any time. The phenotype of the strain SPM508 is productive, we can therefore conclude that the orfl3c gene is not a gene essential for the biosynthesis of spiramycin in S. ambofaciens.
  • the SPM509 strain has the genotype: orfl4 :: att3 ⁇ aac-. There is no need to excise the cassette to study the effect of inactivation of orfl.4, given the orientation of the genes (see Figure 3), the fact that orflSc is oriented opposite to orfl4 shows that these genes are not co-transcribed.
  • the use of an excisable cassette makes it possible to get rid of the selection marker at any time.
  • the phenotype of the strain SPM509 is non-producer, it can therefore be concluded that the orfl 4 gene is a gene essential for the biosynthesis of spiramycin in S. ambofaciens.
  • the strain SPM21 has the genotype: or ⁇ :: att3 ⁇ aac-,
  • the phenotype of this strain is not a producer of spiramycins.
  • the orientation of the orfl to or ⁇ genes suggests that these genes are cotranscribed.
  • the phenotype observed may be due to a polar effect of the cassette introduced into or ⁇ on the expression ;; of genes located downstream in the operation.
  • the strain SPM22 has the genotype or ⁇ :: att3, -. and was obtained after excision in phase of the inserted cassette. The excision of the cassette leaves only a characteristic “scar” sequence (cf. example 10).
  • strain SPM22 also being of non-producing phenotype, it can be concluded that the or ⁇ gene is a gene essential for the biosynthesis of spiramycin in S. ambofaciens. We observe here only the effect due to the inactivation of or ⁇ .
  • the strain SPM501 has the genotype: orf ⁇ * :: attl ⁇ hyg +.
  • the phenotype of this strain is not a producer of spiramycins.
  • the or ⁇ * and orf ⁇ * genes (cf. FIG. 3) having the same orientation, the phenotype observed may be due to a polar effect of the cassette introduced into orf ⁇ * on the expression of or ⁇ *.
  • the arrangement of these genes suggests that they can be cotranscribed.
  • the strain SPM502 was obtained after excision in phase of the cassette introduced. In this strain, we only observe the effect of inactivation of orf ⁇ *.
  • This strain has the orf ⁇ * :: attl genotype (see example 14).
  • the excision of the cassette leaves only a “scar” sequence in phase (cf. example 14).
  • the strain SPM502 has a producer phenotype (this strain only produces spiramycin I, however (cf. *. Example 16)).
  • the or ⁇ * gene is a gene essential for the biosynthesis of spiramycin in S. ambofaciens, since its indirect inactivation in the strain SPM501 leads to a non-producing phenotype.
  • the orf ⁇ * gene is not a gene essential for the biosynthesis of spiramycin I in S. ambofaciens (on the other hand, it is essential for the production of spiramycin II and Ht (cf. example 16)). !
  • the different strains to be tested were each cultured in 7 erlensmeyers; j, g baffled 500 ml containing 70 ml of MP5 medium (Pernodet et al, 1993).
  • the plants were inoculated with 2.5 ⁇ 10 6 spores / ml of the different strains of S. ambofaciens and allowed to grow at 27 ° C. with orbital stirring at 250 rpm for 72 hours.
  • the cultures corresponding to the same clone are combined, optionally filtered on a pleated filter, and centrifuged for 15 min at 7000 rpm.
  • the different supernatants were then stored at -30 ° C.
  • the assays were carried out by High Performance Liquid Chromatography
  • HPLC HPLC analysis of the culture medium makes it possible to precisely determine the concentration of the three forms of spiramycin.
  • the column used (Macherey-Nagel) is filled with a Nucleosil phase of octyl grafted silica. The particle size is 5 ⁇ m and the size of the pores 100. The internal diameter of the column is 4.6mm and its length 25cm.
  • the mobile phase is a mixture of H 3 PO 4 buffer (pH2.2) and 70/30 acetonitrile (v / v) containing 6.25 g / L of NaGO 4 perchlorate.
  • the analysis is carried out in an isocratic regime with a flow rate set at 1 ml / min.
  • the column is thermoregulated at 23 ° C. Detection is ensured by UV spectrophotometry at 238nm. The sample is refrigerated at + 10 ° C and the quantification is determined from the peak area (by external calibration). Under these conditions, the retention times of spiramycin I, II and III are approximately 17 respectively; 21 and 30 minutes, as it could be verified using a commercial sample comprising the three forms of spiramycin.
  • the OSC2 strain has a spiramycin-producing phenotype. It is the parental strain used to obtain the strains having an excisable cassette
  • strains having an excisable cassette makes it possible to draw a certain number of conclusions with regard to the function of the interrupted genes.
  • Strain ; SPM507 has the genotype: orf! 2 :: att3 ⁇ aac-.
  • the phenotype of the strain SPM507 is non-producer (cf. example 15), we can therefore conclude that the orfl 2 gene is ⁇ n ' ; fi gene essential for the biosynthesis of spiramycin in S. ambofaciens.
  • This strain no longer produces spiramycins as has been verified by HPLC (cf. FIG. 22). This result confirms the essential character of the orfl 2 gene in the biosynthesis of spiramycin.
  • the SPM508 strain has the genotype: orfl3c :: att3 ⁇ aac-.
  • the phenotype of the strain SPM508 is a producer of spiramycin (cf. example 15), it can therefore be concluded that the orfl3c gene is not a gene essential for the biosynthesis of spiramycin in S. ambofaciens.
  • This strain produces spiramycin I, II and III as it was verified by HPLC (cf. FIG. 23). This result confirms that the orfl 3c gene is not a gene essential for the biosynthesis of spiramycins I, II and III in S. ambofaciens.
  • the SPM509 strain has the genotype: orfl4 :: att3 ⁇ aac-.
  • the phenotype of the strain SPM509 is non-producer, we can therefore conclude that the orfl 4 gene is a gene essential for the biosynthesis of spiramycin in S. ambofaciens. This strain no longer produces spiramycins as has been verified by HPLC (cf. FIG. 24). This result confirms the essentiality of the orfl 4 gene in the biosynthesis of spiramycin.
  • the strain SPM501 has the genotype: orf ⁇ * :: att! ⁇ hyg +.
  • the phenotype of this strain is not a producer of spiramycins. This strain does not produce p spiramycins as it has been verified by HPLC (cf. FIG. 20).
  • the ' or ⁇ * and orf ⁇ * genes (see Figure 3) having the same orientation, the observed phenotype may be due to a polar effect of the cassette introduced in orf ⁇ * on the expression of or ⁇ * in the operon. This suggests that these genes are cotranscribed.
  • the strain SPM502 was obtained by excision of the cassette introduced, producing a deletion in phase in the gold 6 * gene and restoring the expression of or ⁇ *.
  • This strain has the orf ⁇ * :: attl genotype (cf. examples 14 and 15). The excision of the cassette leaves only a “scar” att sequence in phase (cf. example 14).
  • the SPM502 strain has a spiramycin-producing phenotype. However, as has been proven by HPLC, this spuche produces only spiramycin I and does not produce 1 of spiramycin II and El (cf. FIG. 21). It can therefore be concluded from these results that the 'or ⁇ * gene is a gene essential for the biosynthesis of spiramycin in S. ambofaciens, since its indirect inactivation in the strain SPM501 leads to a phenotype which does not produce spiramycin (cf.
  • the orf ⁇ * gene is not a gene essential for the biosynthesis of spiramycin I in S. ambofaciens, since the inactivation of this gene leads to a phenotype producing spiramycin I (cf. FIG. 21). However, orf ⁇ * is essential for the production of spiramycin II and III (cf. example 16)). The orf ⁇ * gene therefore encodes an acyl transferase responsible for the modification of platenolide at position 3 (cf. FIG. 1). EXAMPLE 17 Determination of the starting point of the translation of orf 10 and improvement of the production of spiramycins
  • the or / 70 gene was identified in Streptomyces ambofaciens and was designated srmR by Geistlich et al (Geistlich, M., et al, 992% The inactivation of the orflO gene was carried out (cf. Example 8). . thus be shown that the resulting strain no longer produces spiramycin (cf. example 15) this confirms that the orflO gene is indeed involved in the biosynthesis of spiramycin the protein encoded by this gene;. is therefore essential for the biosynthesis of Spiramycins, however, the analysis of the sequence shows that two ATG codons located in the same reading phase can be used for the translation of orflO (cf. Figure 28) .One of the two possible codons (the codon most upstream) starts at position 10656 in the sequence
  • the first pair used for the amplification corresponds to the following oligonucleotides:
  • SEQ ID N ° 1) (see Figure 28).
  • the fragment obtained is approximately 2 kb in size and will hereinafter be called "gold / 70 short", it does not contain the orflO promoter.
  • This 2kb fragment was cloned into the vector pGEM-T easy to give rise to the plasmid pSPM520.
  • the second pair used for the amplification corresponds to the following oligonucleotides:
  • EDR40 5 'CCCAAGCTTGAGAAGGGAGCGGACATTCAATGCTTTGGTAAAGCAC3'
  • the pair of primers EDR41-EDR42 allows the amplification of the or / 70 gene with the two ATGs, as well as its own promoter (cf. FIG. 28).
  • This 2.8 kb fragment hereinafter called “orf 10 pro” was cloned into the vector pGEM-T easy to give rise to the plasmid pSPM522.
  • the "or 70 pro” fragment was obtained using the chromosomal DNA of the OSC2 strain as a template.
  • the "gold / 70 short” and “gold / 70 long” fragments were obtained using the DNA from the previously purified "gold 70 pro” fragment as a template.
  • the HindlYL-BamHI inserts of the plasmids pSPM520, pSPM521 and pSPM522 were then subcloned into the vector ⁇ UWL201 (plasmid derived from the plasmid pUWL199 (Wehmeier UF, 1995) in which the fragment Kpnl-BamHI of the region of the ermE promoter (cf Bibb et al., 1985, in particular FIG. 2) carrying a mutation increasing the strength of the promoter (erm ⁇ * promoter) (Bibb et al, 1994) was introduced (cf. Doumith et al, 2000)) previously digested by enzymes H dlII-iî ⁇ mHI.
  • pSPM523 (derived from pUWL201 with the form “or / 70 short” as an insert)
  • pSPM524 derived from pUWL201 with the form “gold / 70 long” as an insert
  • pSPM525 (derived ⁇ UWL201 with the form “or / 70 pro”)
  • the strain OS49.50 (strain interrupted in the or / 70 gene, cf. example 8) was transformed independently by transformation of protoplasts (Kieser, T et al, 2000) by each of the plasmids pSPM523, pSPM524 and pSPM525.
  • a negative control was also produced by transforming the strain OS49.50 with the plasmid pUWL201 without insert.
  • the clones are selected for their resistance to thiostrepton. The transformation of the clones by each of the plamides is verified by extraction of these plasmids.
  • the negative control (strain OS49.50 transformed by the plasmid pUWL201) does not produce spiramycin.
  • the plasmid pSPM523 (which contains the form "gold / short 70") is introduced to the strain OS49.50 years, no spiramycin production is observed.
  • the presence of the plasmid pSPM524 (which contains the form "or / 70 long") and of the plasmid pSPM525 (which contains the form "gold / 70 pro") restores the production of spiramycin in the host strain OS49.50.
  • the gold / 70 fragments containing the most upstream ATG restore the synthesis of spiramycin.
  • the plasmids pSPM525 and pUWL201 were similarly introduced into the strain SPM502 (cf. example 14). Thus two new strains were obtained: the strain SPM502 ⁇ UWL201, resulting from the transformation by the plasmid pUWL201 without insert, and the strain SPM502 pSPM525, resulting from the transformation by the plasmid pSPM525.
  • EXAMPLE 18 Construction of a genomic DNA library of the OSC2 strain of Streptomyces ambofaciens in E. coli in the cosmid pWED2.
  • a cosmid carrying the oriT sequence of the plasmid RK2 (which allows its introduction by conjugation into Streptomyces from an appropriate strain of E. coli) and also carrying a gene resistance to an antibiotic conferring a phenotype identifiable in Streptomyces, was built.
  • Such a cosmid containing large inserts of genomic DNA from Streptomyces ambofaciens can be used in gene inactivation experiments.
  • pac-oriT cassette (EcoRV fragment) was introduced into the cosmid pW ⁇ Dl (Gourmelen et al, 1998), derived from the cosmid pW ⁇ D15 (Wahl et a, 1987), at the unique Hpal site.
  • the pac-oriT cassette was obtained by PCR.
  • the pac gene was amplified by PCR from the plasmid pVF 10.4 (Vara et al., 1985; Lacalle et al, 1989) using as 4 '(first primer, primer A (of sequence 5'- '
  • primer C (of sequence 5'-CACGACCCCATGACGGATCTTTTCCGCTGCAT-3 '(S ⁇ Q ID No. 128)), which has at its 5' end a sequence of 12 nucleotides corresponding to a sequence downstream of the coding sequence for the pac gene (in bold) and a sequence of 20 nucleotides corresponding to the start of the oriT sequence) and as second primer, primer D (of sequence 5'-
  • the amplification product obtained with primers A and B and that obtained with primers C and D have at one of their ends a common sequence of 24 nucleotides.
  • a third PCR was performed by mixing the two amplification products obtained above and using, as primers, the primers A and D (see Figure 29, 3 -th PCR). This made it possible to obtain an amplification product corresponding to the pac + oriT assembly. This pac-oriT fragment was then cloned into the vector pG ⁇ M-T Easy (sold by the company Promega (Madison, Wisconcin, USA)), which made it possible to obtain the plasmid pGEM-T-> c-o ⁇ .
  • This cosmid facilitates the inactivation of genes in Streptomyces. Indeed, it carries the oriT sequence (which allows its introduction by conjugation into Streptomyces from an appropriate strain of E. coli) but also a gene for resistance to an antibiotic conferring a phenotype identifiable in Streptomyces. Such a cosmid containing large inserts of genomic DNA from Streptomyces ambofaciens can be used in gene inactivation experiments.
  • a cosmid derived from pWED2 containing the target gene could for example be introduced into the strain of E. coli KS272 containing the plasmid pKOBEG (cf. Chaveroche et al 2000) and a cassette will be introduced into the target gene according to the technique described by Chaveroche et al. 2000.
  • the cosmid obtained by this technique can then be introduced into an E. coli strain such as strain S 17.1 or any other strain making it possible to transfer, by conjugation, plasmids containing the oriT sequence to Streptomyces.
  • the resistance gene expressed in Streptomyces present on this new cosmid is the pac gene of Streptomyces alboniger (Vara, J et al, 1985; Lacalle et al, 1989) which codes for puromycin N-acetyl transferase and which confers resistance to puromycin .
  • Vara J et al, 1985; Lacalle et al, 1989
  • puromycin N-acetyl transferase which confers resistance to puromycin .
  • the genomic DNA of the OSC2 strain of Streptomyces ambofaciens was f
  • Cosmids from the new library of Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. example 18) covering orfl * to or / 70 * or part or all of orfl to or ⁇ 5c, or a region further upstream of V or ⁇ 5c were isolated .
  • successive hybridizations on E. coli. coli obtained according to example 18 were carried out using the following 3 probes (cf. FIG. 31):
  • the first probe used corresponds to a DNA fragment of about 0.8 kb amplified by PCR using as matrix the cosmid pSPM5 and the following primers:
  • ORF23c 5'-ACGTGCGCGGTGAGTTCG ⁇ CGTTGC-3 '(S ⁇ Q ID N ° 130) and> OR 25c: 5'-CTGAACGACGCCATCGCGGTGGTGC-3' (SEQ ID N 0 131). j:
  • the PCR product thus obtained contains a fragment of the start of Yorf23c, the entire or ⁇ 4c and the end of the or ⁇ 5c (cf. FIG. 31, probe I).
  • the second probe used corresponds to a DNA fragment of approximately 0.7 kb amplified by PCR using as matrix the total DNA of the strain S. ambofaciens ATCC23877 and the following primers:
  • ORFl * c 5 * -GACCACCTCGAACCGTCCGGCGTCA-3 '(SEQ ID N ° 132) and ORF2 * c: 5'-GGCCCGGTCCAGCGTGCCGAAGC-3' (SEQ ID N ° 133).
  • the PCR product thus obtained contains a fragment of the end of orfl * c and the beginning of 1 or ⁇ * c (cf. FIG. 31, probe II).
  • the third probe used corresponds to an EcoRl-BamHI fragment of approximately 3kb containing the orfl, or ⁇ and or ⁇ and obtained by digestion of the plasmid pOS49.99 (cf. FIG. 31, probe III). About 2000 clones of the library obtained in Example 18.2 were transferred to a filter for hybridization on colonies according to conventional techniques (Sambrook et al, 1989).
  • the first probe (cf. FIG. 31, probe I) was marked with 32 P by the “random priming” technique (Kit sold by the company Roche) and used for hybridization on 2000 clones of the bank, after transfer to filtered. Hybridization was carried out at 65 ° C in the buffer described by Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Two washes were carried out in 2x SSC, 0.1% SDS at 65 ° C, the first for 10 minutes and the second for 20 minutes and a third wash lasting 30 minutes was then carried out in 0.2X SSC, 0.1% SDS at 65 ° C. Under these hybridization and washing conditions, 20 clones among the 2000 hybrids exhibited a strong hybridization signal with the first probe.
  • pSPM36 was more particularly chosen because it was likely to contain a large region upstream of V or ⁇ 5c (cf. Figures 31 and 32).
  • the 2000 clones of the Streptomyces ambofaciens OSC2 library were hybridized with the second probe corresponding to the PCR product: ORFl * c- ORF2 * c (cf. Figure 31, probe II).
  • This hybridization made it possible to isolate cosmids whose insert is located in the region of orfl * c to orfl0 * c. Under the hybridization conditions used, 16 clones among the 2000 hybrids exhibited a strong hybridization signal with this second probe.
  • the 2000 clones of the Streptomyces ambofaciens OSC2 library were also hybridized with the third probe corresponding to the DNA fragment EcoR1-BamHI of the plasmid pOS49.99 (cf. FIG. 31 probe III).
  • This hybridization made it possible to isolate the cosmids containing the region of orfl up to Vor ⁇ and capable of containing either a large part of the PKS genes, or a large part of the orfl to or ⁇ 5c genes of the spiramycin biosynthesis pathway. . Under these hybridization conditions, 35 clones among the 2000 hybrids exhibited a strong hybridization signal with the third probe.
  • the probe of around 0.8 kb obtained by PCR with the primers ORF23c and ORF25c was also used in Southern Blot experiments on the total DNA of S. ambofaciens OSC2 digested with the enzyme Pstl. Under the conditions of hybridization described above, this probe reveals a single PstI fragment of approximately 6 kb when hybridized on the total DNA of S. ambofaciens OSC2 digested with the enzyme Pst1. There is a Pstl site at Yor ⁇ 3c (cf. SEQ ID No. 80) but no other Pstl site up to the end (BamHI site) of the known sequence (cf. SEQ ID No. 1).
  • This Pstl-BamHI fragment has a size of approximately 1.4 kb.
  • the 6 kb Pstl fragment hybridized on the total DNA of S. ambofaciens digested with the Pstl enzyme therefore contains a region of approximately 4.6 kb located upstream of or ⁇ 5c. This region is likely to contain other genes whose products are involved in the biosynthesis pathway of spiramycin. It was verified by digestion that the cosmid pSPM36 did indeed contain this 6 kb PstI fragment. This fragment was isolated from pSPM36, in order to determine the sequence further upstream of or ⁇ 5c. For this, the cosmid pSPM36 was digested with the restriction enzyme Pstl.
  • the Pstl-Pstl fragment with a size of approximately 6 kb was isolated by electroelution from a 0.8% agarose gel and then cloned into the vector pBK-CMV (4512bp) (sold by the company Stratagene (La Jolla, California, USA)).
  • the plasmid thus obtained was named pSPM58 (cf. FIG. 33) and the sequence of its insert was determined.
  • the sequence of this insert is presented in SEQ ID No. 134. However, the entire sequence has not been determined and there is a hole of approximately 450 nucleotides, the part of the sequence not determined has been noted by a succession of "N" in the corresponding sequence.
  • the approximately 0.8 kb probe obtained by PCR with the primers ORF23c and ORF25c was also used in Southern Blot experiments on the total DNA of the OSC2 strain. digested with the enzyme Stul. Under the hybridization conditions described above for this probe, this probe reveals a single Stul fragment of approximately 10 kb when hybridized on the total DNA of the OSC2 strain digested by the enzyme StwI. Given the presence of a Stul site in Yor ⁇ 3c (cf. SEQ ID No.
  • this 10 kb fragment includes the entire Pstl fragment previously studied (insert of pSPM58) and provides access to a region not yet studied of around 4 kb. (see figure 33). It was verified by digestion that the cosmid pSPM36 did indeed contain this 10 kb Stul fragment. This fragment was isolated from the cosmid pSPM36, in order to determine the sequence of the end of , or ⁇ 9 and other genes further upstream of or ⁇ 9.
  • the cosmid pSPM36 was digested with the enzyme of Stul restriction
  • the Stul-Stul fragment about 10 kb in size, was isolated by electroelution from an 0.8% agarose gel, then cloned into the vector pBK-CMV (4512bp) (sold by the Stratagene company (La Jolla, California, USA)).
  • the plasmid thus obtained was named pSPM72 (cf. FIG. 33).
  • the latter was then digested with EcoRI (EcoRI site in the insert of pSPM58) and HmdlII (Hindlll site in the multiple cloning site of the vector, immediately after the Stul site of the end of the insert) (cf. FIG. 33).
  • the EcoRI-H dlII DNA fragment thus obtained corresponds to a fragment of the insert of the plasmid pSPM72 (cf. FIG. 33) and was subcloned into the vector pBC-SK + (marketed by the company Stratagene (La Jolla , California, USA)) digested beforehand with EcoRI and HmdlII.
  • the plasmid thus obtained was named pSPM73 and the sequence of its insert was determined.
  • the sequence of this insert is presented in S ⁇ Q ID N ° 135.
  • An assembly of the sequences of the inserts of pSPM58 and pSPM73 is presented in S ⁇ Q ID N ° 106. This sequence starts from the Pstl site at Yor ⁇ 3c (cf.
  • the partial sequence of the insert of the cosmid pSPM73 obtained was analyzed using the FramePlot program (Ishikawa J & Hotta K. 1999). This made it possible to identify, among the open reading phases, the open reading phases exhibiting a codon use typical of Streptomyces. This analysis made it possible to determine that this insert includes 4 ORFs, one incomplete and three complete (cf. Figure 34).
  • the incomplete ORF corresponds to the 3 ′ part of the or ⁇ 9 coding sequence, which made it possible to complete the sequence of this gene thanks to the partial sequence of this same orf obtained during; sequencing of the insert of the plasmid pSPM58 (cf.
  • a probe (DNA fragment of 0.8 kb) corresponding to an internal sequence to or ⁇ 2c was obtained by PCR using as matrix the total DNA of the strain of Streptomyces ambofaciens and the following primers
  • KF36 5'- TTGCCGTAGCCGAGGACCAGCG-3 '(SEQ IDN ° 151) and KF37: 5'- CACATGGCCCTGGAGGACCCTG-3' (SEQIDN ° 152).
  • the PCR product thus obtained represents an internal sequence of Vor ⁇ 2c.
  • This probe was used in Southern blot experiments on the chromosomal DNA of the OSC2 strain and on the DNA of the cosmid pSPM36 digested with the Pst1 enzyme.
  • this probe Using the same hybridization conditions as those described above (cf. example X ⁇ 19.1), this probe reveals two PstI fragments of approximately 3.4kb and 2.5kb when hybridized on the total DNA of the OSC2 strain and on the DNA of the cosmid pSPM36 digested by the enzyme Pstl. Given the presence of a Pstl site in the probe used, these results can be explained.
  • the first DNA fragment which has a size of approximately 3.4 kb is a fragment whose sequence is already known in full.
  • the sequence of the 2.5 kb fragment is only partially known, over a region of 700 bp.
  • This fragment was isolated from the cosmid pSPM36 in order to determine the sequence of the end of Y or ⁇ 2c and other genes upstream of the latter.
  • the cosmid pSPM36 was digested with the restriction enzyme Pstl.
  • the Pstl-Pstl fragment with a size of approximately 2.5 kb was isolated by purification from a 0.8% agarose gel and then cloned into the vector pBK-CMV (4518bp) (marketed by the company Stratagene (La Jolla, California, USA)).
  • the plasmid thus obtained was named pSPM79 (cf. FIG. 41) and the sequence of its insert was determined.
  • the sequence of Yor ⁇ 8c SEQ ID No. 111) was not complete (cf. example 19.3). Indeed, a region of approximately 450 nucleotides could not be determined, these 450 nucleotides appear in the form of a sequence of "N" in the sequence SEQ ID No. 106.
  • the sequence of the entire region missing was determined by resequencing this region.
  • the sequence of the inserts of pSPM58 and pSPM73 was therefore determined in full.
  • the complete sequence of the coding part of Yor ⁇ 8c is presented in SEQ ID No. 141 and the protein deduced from this sequence in SEQ ID No. 142.
  • the sequence of the insert of the plasmid pSPM79 is presented in SEQ ED No. 161.
  • SEQ ID No. 140 An assembly of the sequences of the inserts of pSPM58, pSPM73 and pSPM79 is presented in SEQ ID No. 140 (cf. FIG. 41). This sequence starts from the Pstl site at Yor ⁇ 3c (cf. SEQ ID No. 80) and goes to the Pstl site at Yor ⁇ 4c (cf. FIG. 41).
  • the sequence of the insert of the plasmid pSPM79 obtained was analyzed using the FramePlot program (Ishikawa J & Hotta K. 1999). This made it possible to identify, among the open reading phases, the open reading phases exhibiting a use of codons typical of Streptomyces. This analysis made it possible to determine that this insert includes 3 ORFs, two incomplete (or ⁇ 2c and or ⁇ 4c) and one complete (or ⁇ 3) (cf. Figure 41).
  • the first incomplete ORF corresponds to the 5 'part of the coding sequence for or ⁇ 2c. This made it possible to complete the sequence of this gene thanks to the partial sequence of this same orf obtained during the sequencing of the insert of the plasmid pSPM73 (cf. example 19.4 and 19.5), all of the two sequences thus allowing obtain the complete sequence of or ⁇ 2c. (SEQ ID No. 145).
  • the "c" added in the name of the gene means for the ORF in question that the coding sequence is in the reverse orientation (cf. FIG. 41).
  • the complete orf was named or / 33 (SEQ ID N ° 147).
  • the third ORF was named or ⁇ 4c (SEQ ID No. 149).
  • the different strains to be tested were each cultivated in 7 500 ml baffled Erlenmeyer flasks containing 70 ml of MP5 medium (Pernodet et al., 1993).
  • the erlens were each cultivated in 7 500 ml baffled Erlenmeyer flasks containing 70 ml of MP5 medium (Pernodet et al., 1993). The erlens
  • the pH of the must is then adjusted to 9 with sodium hydroxide and the supernatant is extracted with methyl iso-butyryl ketone (MIBK).
  • MIBK methyl iso-butyryl ketone
  • the organic phase (MIBK) is then recovered and evaporated.
  • the dry extract is then taken up in 1 ml of acetonitrile, then diluted to 1/10 (100 ⁇ l qs 1 ml with water) before being used for the analyzes in liquid chromatography coupled with mass spectrometry (CL / SM ).
  • the samples were analyzed by CL / SM in order to determine the mass of the various products synthesized by the strains to be tested.
  • the high performance liquid chromatography column used is a Kromasil C8 150 * 4.6mmm, 5mmm, 100A column.
  • the mobile phase is a gradient consisting of a mixture of acetonitrile and a solution;, ' ; 0.05% trifluorpacetic acid aqueous, the flow rate is set at 1 ml min.
  • the temperature of the colored oven is raised to 30 ° C ⁇ ⁇ ' ⁇ ' v ; : -
  • UV detection at the column outlet was carried out at two different wavelengths: 238 nm and 280 nm.
  • the mass spectrometer coupled to the chromatography column is a Simple Quadripole device sold by the company Agilent, with cone voltages at 30 and 70V.
  • the strain OS49.67 in which the or ⁇ gene is inactivated by a phase deletion does not produce spiramycins (cf. examples 6 and 15).
  • Figure 35 shows the supe ⁇ osition of HPLC chromatograms produced at 238 and 280nm (top) as well as the UV spectra of the molecules eluted at 33.4 minutes and 44.8 minutes (bottom).
  • the scan is done in scan mode, covering a mass range between 100 and 1000 Da.
  • the gain of the electro-multiplier was IV.
  • the nebulizing gas pressure was 35 psig
  • the drying gas flow rate was 12.0 min "1
  • the drying gas temperature was 350 ° C
  • the capillary voltage was
  • the mobile phase is a mixture of a solution
  • the 2 products are recovered at the outlet of the chromatographic column and isolated under the following conditions: an Oasis HLB 1 cartridge 30 mg (Waters) is conditioned sequentially with 1 ml of acetonitrile, then 1 ml of water / acetonitrile (20v / 80v) and 1ml of water / acetonitrile 80/20. The sample is then introduced and the cartridge washed successively with 1 ml of water / acetonitrile (95/5), 1 ml water / deuterated acetonitrile (95/5), then elute with 600 ⁇ l of water / deuterated acetonitrile 40/60. The recovered solution is then directly analyzed by NMR.
  • Platenolide B (Specter 9647V)
  • the strain SPM509 in which the orfl4 gene is inactivated does not produce spiramycins (cf. examples 13, 15 and 16).
  • a sample was prepared according to the method described above (see paragraph 20.1) and was analyzed by CL / SM as described above (see paragraph 20.2 and 20.3). Analysis of the biosynthesis intermediates present in the culture supernatant of the strain SPM509 cultivated in MP5 medium showed that this strain produced only form B of platenolide (“platenolide B”, cf. FIG. 36) but not form A ("Platenolide A", see Figure 36).
  • EXAMPLE 21 Interruption of the orfl 4 gene in a strain interrupted in the or ⁇ gene (OS49.67)
  • the product 4 orfl gene is essential to spiramycin biosynthesis (see X Example 13, 15 and 16: the SPM509 strain in which this gene is disrupted does ⁇ r 'r X i 1 produces more spiramycin.). Analysis of the biosynthetic intermediates present at.
  • the plasmid pSPM509 was introduced by transformation of protoplasts of the strain OS49.67 (Kieser, T et al, 2000). The inactivation of the orf! 4 gene has already been described in the case of the OSC2 strain (cf. example 13) and the same procedure was followed for the inactivation of the orf! 4 gene in the OS49.67 strain. .
  • the clones are selected for their resistance to apramycin. Clones resistant to apramycin are then subcultured respectively on medium with apramycin and on medium with hygromycin.
  • the clones resistant to apramycin (ApraR) and sensitive to hygromycin (HygS) are in principle those where a double crossing over event has occurred and in which the orfl4 gene has been replaced by a copy of orfl4 interrupted by the att3 ⁇ aac- cassette.
  • These clones were more particularly selected and the replacement of the wild copy of orfl 4 by the copy interrupted by the cassette was verified by hybridization?
  • the total DNA of the clones obtained was digested with several enzymes, separated on an agarose gel, transferred to a membrane and hybridized with a probe corresponding to the att3 ⁇ aac- cassette to verify that the gene replacement had indeed taken place. Verification of the genotype can also be carried out by any method known to those skilled in the art and in particular by PCR using the appropriate oligonucleotides and sequencing of the PCR product.
  • a clone having the expected characteristics (Aor ⁇ , orfl4 :: att3 ⁇ aac-) was more particularly selected and named SPM510. It was indeed possible to verify thanks to the two hybridizations that the att3 ⁇ aac- cassette was indeed present in the genome of • [, this clone and that the expected digestion profile is obtained in the case of a replacement i, following a double recombination event, of the wild-type gene orfl 4 by the copy interrupted by the att3 ⁇ aac- cassette in the genome of this clone.
  • the orf! 4 gene was amplified by PCR using the following pair of oligonucleotides: EDR31: 5 'CCCAAGCTTCTGCGCCCGCGGGCGTGAA 3' (SEQ ID No. 136) and EDR37: 5 'GCTCTAGAACCGTGTAGCCGCGCCCCGG 3' (SEQ ID No. 137) and as matrix the chromosomal DNA of the OSC2 strain.
  • the oligonucleotides EDR31 and EDR37 carry the Hindlll and Xbal restriction site respectively (sequence in bold).
  • the 1.2 kb fragment thus obtained was cloned into the vector pGEM-T easy (marketed by the company Promega (Madison, Wisconcin, USA)) to give rise to the plasmid pSPM515.
  • This plasmid was then digested with the restriction enzymes HindIII and Xbal.
  • the 1.2 kb Hindlll / Xbal insert obtained was cloned into the vector pUWL201 (cf. example 17.1) previously digested with the same enzymes.
  • the plasmid thus obtained was named pSPM519.
  • the plasmid pSPM519 was introduced into the strains SPM509 (cf. example 13) and SPM510 (cf. example 17) by transformation of protoplasts (Kieser, T et al, 2000). After transformation, the clones are selected for their resistance to thiostrepton.
  • the strain SPM510 transformed by the plasmid pSPM519 was named SPM510 pSPM509.
  • the plasmid pOS49.52 corresponds to a plasmid allowing the expression of the TylB protein in S. ambofaciens.
  • the coding sequence of the tylB "r gene of S. fradiae (Merson-Davies & Cundliffe, 1994, GenBank access number: U08223 (region sequence), SFU08223 (DNA sequence) and AAA21342 (protein sequence) ) was introduced into the plasmid pKC1218 (Bierman et al, 1992, Kieser et al, 2000, an E. coli strain containing this plasmid is accessible in particular from the ARS (NRRL) Agricultural Rese rch Service Culture Collection) (Peoria , Illinois, X USA), under number B-14790), and this coding sequence has also been placed under
  • the strain OS49.67 in which the or ⁇ gene is inactivated by a phase deletion does not produce spiramycins (cf. examples 6 and 15).
  • the plasmid pOS49.52 was introduced into the strain OS49.67 by transformation of protoplasts (Kieser, T et a, 2000). After transformation, the clones are selected for their resistance to apramycin. The clones are then subcultured on a medium containing apramycin. A clone was more particularly selected and was named OS49.67 pOS49.52.
  • the strain OS49.67 does not produce spiramycins (cf. examples 6 and 15). Spiramycin production of the strain
  • the or ⁇ 8c gene was amplified by PCR using a pair of oligonucleotides comprising an H ⁇ TII restriction site or a BamHI restriction site. These primers have the following sequence: KF30: 5 'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGCC 3' (SEQ ID No. 138) with an HmdlII restriction site (which is shown in bold)
  • the 1.5 kb fragment thus obtained was cloned into the vector pGEM-T easy (sold by the company Promega (Madison, Wisconcin, USA)) to give rise to the plasmid pSPM74.
  • the plasmid pSPM74 was then digested with the restriction enzymes Hindlll and BamHI and the Hindlll / BamHI insert of approximately 1.5 kb obtained was cloned into the vector pUWL201 (cf. example 17.1) previously digested with the same enzymes .
  • the plasmid thus obtained was named pSPM75, it contains the entire coding sequence of or ⁇ 8c placed under the control of the ermE * promoter.
  • the plasmid pSPM75 was introduced into the OSC2 strains by transformation of protoplasts (Kieser, T et al, 2000). After transformation of the protoplasts, the clones are selected for their resistance to thiostrepton. The clones are then subcultured on a medium containing thiostrepton and the transformation by the plasmid is verified by extraction of plasmids. Two clones were more particularly selected and named OSC2 / pSPM75 (1) and OSC2 / ⁇ SPM75 (2).
  • OSC2 / pSPM75 (2) was also analyzed by HPLC (in the same way as in Example 17.2). Analysis of the spiramycin production of the OSC2 strain was also carried out in parallel for comparison. The results of this analysis are presented in Table 44, the data are expressed in mg per liter of supernatant.
  • the results correspond to the total production of spiramycins (obtained by adding the production of spiramycin I, II and III).
  • strain OS49.107 in which the or ⁇ gene is inactivated by insertion of the; ;
  • the strain SPM507 in which the or / 72 gene is inactivated, does not produce spiramycins (cf. examples 11 and 15).
  • the orfl 2 gene would encode a 3,4 dehydratase responsible for the dehydration reaction necessary for the biosynthesis of forosamine (see Figure 6). It is therefore expected that the biosynthesis of spiramycins will be blocked at the forocidin stage (cf. FIG. 7).
  • the SPM507 strain which is not a producer of spiramycin should therefore produce forocidin.
  • a sample of supernatant of the strain SPM507 was prepared according to the method described above (cf. example 16, without extraction with MIBK) and was analyzed by CL / SM as described above (cf. paragraph 20.2 and 20.3 ). Under these conditions, the time of
  • the compound is recovered by elution with a water / acetonitrile mixture 30/70. This solution is then injected (100 ⁇ L) onto the analytical column and the fractions recovered on the Oasis HLB 1 cartridge 30 mg (Waters). Before use, the Oasis HLB 1 ce 30mg cartridges (Waters) are packaged sequentially with racetonitrile, then a water / acetonitrile mixture (20v / 80v) and a water / acetonitrile 80/20 mixture.
  • the Oasis HLB 1 cartridge 30 mg (Waters) is then washed successively with 1 ml of acetonitrile water (95/5), 1 ml of water / deuterated acetonitrile (95/5), then eluted with 600 ⁇ l of deuterated acetonitrile water 40 / 60.
  • the recovered solution is then directly analyzed by NMR.
  • the strain SPM501 has the genotype or ⁇ * :: attl ⁇ hyg +. Thanks to the polar effect 20 of the insertion of the attl ⁇ hyg + cassette into the orf ⁇ * gene, it could be determined that the orf 5 * gene is essential for the biosynthesis pathway of spiramycins. In fact, the insertion of the excisable cassette into the coding part of the orf ⁇ * gene leads to a total halt in the production of spiramycins by polar effect on the expression of the or ⁇ * gene. However, once the inserted cassette has been excised (and therefore when only the orf ⁇ * gene is inactivated, cf. examples 14 and 15), a production of spiramycin I is restored.
  • the orf 5 * gene is essential for the biosynthesis of spiramycins since its inactivation leads to a total halt in the production of spiramycins.
  • the or ⁇ * gene encodes a protein with relatively strong similarity to several O-methyltransferases.
  • the or ⁇ * gene is said to be an O-methyl transferase involved in the biosynthesis of platenolide.
  • CL / SM and NMR analysis experiments were carried out on a strain of S. ambofaciens of genotype orf ⁇ * :: attl ⁇ hyg + obtained from a strain su ⁇ roducing spiramycins.
  • a sample of the supernatant of this strain was prepared according to the method described above (cf. example 16, without extraction with MIBK) and was analyzed by CL / SM as described above (cf. paragraph 20.2 and 20.3) .
  • the column used is X an X-Terra column (Waters SAS, St-Quentin en-Yvelines, France), and the cone voltage of the spectrometer is adjusted to 380V to obtain the fragmentation of the compound analyzed. Under these conditions, a product whose retention time is approximately 13.1
  • New excisable cassettes have been built. These cassettes are very similar to the excisable cassettes already described in example 9. The main difference between the old and the new cassettes is the absence in the latter. sequences corresponding to the ends of the ⁇ inte ⁇ oson, sequences which contain a transcription terminator originating from phage T4.
  • the gene which confers resistance to an antibiotic is flanked by the sequences ⁇ ttR and attL allowing excision.
  • the resistance gene is the aac (3) IV gene which encodes an acetyltransferase which confers resistance to apramycin.
  • This gene is present in the ⁇ aac cassette (GenBank access number: X99313, Blondelet-Rouault, MH et al, 1997) and was amplified by PCR using the plasmid pOSK1102 (see above) and as primers oligonucleotides KF42 and KF43 each containing the HindIII restriction site (in bold) (AAGCTT) in 5 ′.
  • KF42 5'-AAGCTTGTACGGCCCACAGAATGATGTCAC-3 '(SEQ DD N ° 153)
  • KF43 5'-AAGCTTCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTT-3 '(SEQ ID No. 154).
  • the PCR product obtained of approximately 1 kb was cloned into the E. coli vector pGEMT> Easy giving rise to the plasmid pSPM83.
  • the vector pSPM83 was digested with the restriction enzyme HindlU.
  • the fragment 'Hirui ⁇ l-Hin ⁇ ⁇ . of the insert was isolated by purification from a 0.8% agarose gel and then cloned into the HindIII site located between the ttL and ttR sequences of the different plasmids carrying the different possible excisable cassettes (cf. example 9 and FIG. 27) so as to replace the HindIII fragment corresponding to ⁇ acc with the HindIII fragment corresponding to the aac gene alone. This made it possible to obtain the attlaac, att2aac and att3aac cassettes (depending on the desired phase, cf. example 9).
  • the or ⁇ 8c gene was inactivated using the cassette technique
  • the att3aac + excisable cassette (cf. example 28) was amplified by PCR using as plasmid the plasmid pSPMIOl (The plasmid pSPMIOl is a plasmid derived from the vector ⁇ GP704Not (Chaveroche et al, 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ,
  • sequence corresponding to a sequence in the or ⁇ 8c gene and the 26 nucleotides located most in 3 '(shown in bold and underlined above) correspond to the sequence of one of the
  • the PCR product thus obtained was used to transform the hyper-recombinant E. coli strain DY330 (Yu et al, 2000) (this strain contains the exo, bet and gam genes of phage lambda integrated into its chromosome, these genes are expressed at 42 ° C, it was used in place of the E. coli KS272 strain (Chaveroche et al, 2000)) containing the
  • cosmid pSPM36 25 cosmid pSPM36.
  • the bacteria were transformed by electroporation with this PCR product and the clones were selected for their resistance to apramycin.
  • the cosmids of the clones obtained were extracted and digested with the restriction enzyme BamHI, in order to verify that the digestion profile obtained corresponded to the expected profile if there was insertion of the cassette (att3aac +) in the or ⁇ 8c gene , i.e. if it
  • the cosmid pSPM107 was first introduced into the E. coli strain
  • DH5 ⁇ then in the Streptomyces ambofaciens OSC2 strain by transformation of protoplasts. After transformation, the clones are selected for their resistance to apramycin. The clones resistant to apramycin are then subcultured respectively on medium with apramycin (antibiotic B) and on medium with puromycin (antibiotic ; A) (cf. FIG. 9).
  • the clones resistant to apramycin (ApraR) and sensitive to puromycin (PuroS) are in principle those with a double oyer crossing event; f occurred and which have the genius ⁇ r2Sc interrupted by the att3aac + cassette.
  • a clone exhibiting the expected characteristics (or ⁇ 8c :: att3aac +) was more particularly selected and named SPM107.
  • This clone therefore has the genotype: or ⁇ 8c :: att3aac + and was named SPM107.
  • the use of an excisable cassette makes it possible to get rid of the selection marker at any time, in particular by transformation with the plasmid pOSV508.
  • EXAMPLE 30 Construction of a strain of S. ambofaciens interrupted in the or ⁇ 1 gene:
  • the 39 nucleotides located at the 5 ′ end of these oligonucleotides have a sequence corresponding to a sequence in the or ⁇ 1 gene and the 26 nucleotides located most in 3 ′ (shown in bold and underlined above) correspond to the sequence d 'one end of the att3aac + excisable cassette.
  • the PCR product thus obtained was used to transform the E. coli strain
  • KS272 containing the plasmid pKOBEG and the cosmid pSPM3, as described by
  • the clones are selected for their resistance to apramycin.
  • the clones resistant to apramycin are then subcultured respectively on medium with apramycin (antibiotic B) and on medium with puromycin (antibiotic A) (cf. FIG. 9).
  • the clones resistant to apramycin (ApraR) and sensitive to puromycin (PuroS) are in principle those where a double crossing over event has occurred and which have the or ⁇ 1 gene interrupted by the att3aac + cassette. These clones were more particularly selected and the replacement of the wild-type copy of or ⁇ 1 by the copy interrupted by the cassette was verified by hybridization.

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Abstract

La présente invention concerne l'isolement et l'identification de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse. L'invention est également relative à un procédé de production de ces polypeptides. Elle est également relative à l'utilisation de ces gènes dans le but d'augmenter les taux de production et la pureté de la spiramycine produite. L'invention concerne notamment un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III et l'utilisation d'un tel micoorganisme. L'invention a également trait à l'utilisation des gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines pour la construction de mutants pouvant conduire à la synthèse de nouveaux antibiotiques ou à des formes dérivées de spiramycines. L'invention concerne encore les molécules produites grâce à l'expression de ces gènes et des compositions pharmacologiquement actives d'une molécule produite grâce à l'expression de tels gênes

Description

POLYPEPTIDES IMPLIQUES DANS LA BIOSYNTHESE DES SPIRAMYCINES. SÉQUENCES NUCLEOTIDIOUES CODANT CES POLYPEPTIDES ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention concerne l'isolement et l'identification de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse. Elle est également relative à l'utilisation de ces gènes dans le but d'augmenter les taux de production et la pureté de la spiramycine produite.
L'invention a également trait à l'utilisation de ces gènes pour la construction de mutants pouvant conduire à la synthèse de nouveaux antibiotiques ou à des formes dérivées de spiramycines. L'invention concerne encore les molécules produites grâce à l'expression de ces gènes et enfin des compositions pharmacologiquement actives d'une molécule produite grâce à l'expression de tels gènes.
Les Streptomyces sont des bactéries filamenteuses Gram positif du sol. Elles jouent un rôle important dans la décomposition et la minéralisation des matières organiques grâce à la grande diversité des enzymes dégradatives qu'elles sécrètent. Elles présentent des phénomènes de différenciations morphologiques uniques chez les procaryotes s'accompagnant d'une différenciation métabolique caractérisée par la production de métabolites secondaires présentant une extraordinaire diversité de structures chimiques et d'activités biologiques. Parmi ces métabolites, on retrouve les spiramycines produites à l'état naturel par la bactérie Streptomyces ambofaciens,.
La spiramycine est un antibiotique de la famille des macrolides utile aussi bien en médecine vétérinaire qu'en médecine humaine. Les macrolides sont caractérisés par la présence d'un cycle lactone sur lequel sont greffés un ou plusieurs sucres. Streptomyces ambofaciens produit à l'état naturel la spiramycine I, II et III (cf. Figure 1), cependant l'activité antibiotique de la spiramycine I est nettement supérieure à celle des spiramycines II et III (Liu et al, 1999). La molécule de spiramycine I est constituée d'un macro-cycle lactonique, appelle platénolide et de trois sucres : la forosamine, le mycaminose et le mycarose (cf. Figure 1). L'activité antibiotique des spiramycines est due à une inhibition de la synthèse protéique chez les procaryotes par un mécanisme impliquant la liaison de l'antibiotique au ribosome bactérien.
» Certains composés membres de la famille des macrolides et possédant également un cycle lactone ont donné lieu à des utilisations hors du domaine des antibiotiques.
Ainsi le produit FK506 a des effets immunosuppresseurs et offre des perspectives d'application thérapeutique dans le domaine de la transplantation d'organe, de Parthrite rhumatoïde et plus généralement dans des pathologies liées à des réactions autoimmunes. D'autres macrolides comme l'avermectine ont des activités insecticides et anti-helminthiques.
De nombreuses voies de biosynthèse, concernant des antibiotiques appartenant à des classes variées ainsi que d'autres métabolites secondaires (pour une revue, Chater K. 1990), ont à ce jour déjà été étudiées chez les Streptomycètes. Cependant, la ;;;; connaissance des voies de biosynthèse des spiramycines n'est que très partielle à ce jour.
La biosynthèse des spiramycines est un processus complexe comportant de nombreuses étapes et impliquant de nombreuses enzymes (Omura et al, 1979a, Omura et al, 1979b). Les spiramycines appartiennent à la large classe des polyketides qui regroupe des molécules complexes particulièrement abondantes dans les microorganismes du sol. Ces molécules sont regroupées non pas par analogie de structure mais par une certaine similarité au niveau d'étapes de leur voie de biosynthèse. En effet, les polyketides sont produits par une série complexe de réactions mais possèdent en commun d'avoir dans leur voie de biosynthèse une série de réactions catalysées par une ou des enzymes appelées « polyketides synthases » (PKS). Chez Streptomyces ambofaciens, la biosynthèse du macro-cycle lactonique des spiramycines (platénolide) est réalisée par une série de huit modules codés par cinq gènes PKS différents (Kuhstoss S., 1996, brevet US 5,945,320). Les spiramycines sont obtenues à partir de ce cycle lactone. Cependant, les diverses étapes et enzymes impliquées dans la synthèse des sucres, ainsi que leur liaison au cycle lactone et la modification de ce cycle pour l'obtention des spiramycines restent encore inconnues à ce jour.
Le brevet US 5,514,544 décrit le clonage d'une séquence appelée srmR chez Streptomyces ambofaciens. Il est fait l'hypothèse dans ce brevet que le gène srmR code une protéine régulatrice de la transcription des gènes impliqués dans la biosynthèse des macrolides.
En 1987, Richardson et collaborateurs (Richardson et al., 1987) ont montré que la résistance à la spiramycine de S. ambofaciens est conférée par au moins trois gènes, ces derniers ont été appelés srmA, srmB et srmC. Le brevet US 4,886,757 décrit plus particulièrement la caractérisation d'un fragment d'ADN de S. ambofaciens contenant le gène srmC. Cependant la séquence de ce gène n'a pas été divulguée. En 1990, Richardson et collaborateurs (Richardson et al, 1990) ont posé l'hypothèse de l'existence de trois gènes de biosynthèse de la spiramycine proche de srmB. Le brevet US 5,098,837 rapporte le clonage de cinq gènes potentiellement impliqués dans la biosynthèse de la spiramycine. Ces gènes ont été baptisés srmD, srmE, srmF, srmG et srmH.
Une des difficultés majeures dans la production de composés tels que les spiramycines réside dans le fait que de très grands volumes de fermentation sont nécessaires à la production d'une quantité relativement faible de produit. Il est donc souhaitable de pouvoir augmenter l'efficacité de production de telles molécules afin d'en diminuer les coûts de production.
La voie de biosynthèse des spiramycines est un processus complexe et il serait souhaitable d'identifier et de supprimer les réactions parasites qui pourraient exister au cours de ce processus. Le but d'une telle manipulation est d'obtenir un antibiotique plus pur et/ou une amélioration de la productivité. A ce sujet, Streptomyces ambofaciens produit à l'état naturel la spiramycine I, II et III (cf. Figure 1), cependant l'activité antibiotique de la spiramycine I est nettement supérieure à celle des spiramycines II et III (Liu et al, 1999). Il serait donc souhaitable de pouvoir disposer de souches ne produisant que de la spiramycine I.
En raison de l'intérêt commercial des antibiotiques macrolides, l'obtention de nouveaux dérivés, notamment d'analogues de spiramycines ayant des propriétés avantageuses est intensivement recherchée. Il serait souhaitable de pouvoir générer en quantité suffisante les intermédiaires de biosynthèse de la voie de biosynthèse des spiramycines ou des dérivés des spiramycines notamment dans le but de fabriquer des antibiotiques hybrides dérivés des spiramycines.
Description générale de l'invention
La présente invention résulte du clonage de gènes dont le produit intervient dans la biosynthèse des spiramycines. L'invention concerne tout d'abord de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse.
Les gènes de la voie de biosynthèse et les séquences codantes associées ont été clones et la séquence d'ADN de chacun a été déterminée. Les séquences codantes clonées seront désignées par la suite orfI*c, orβ*c, orβ*c, orf4*c, orβ*, orfό*, orβ*c, orβ*, orβ*, orflO*, orfl, orβ, orβ, orβ, orβ, orfό, orβ, orβ, orβc, orflO, orfllc, orf!2, orfl 3c, orfI4, orfl 5c, orfl 6, orf!7, orf!8, orfl 9, orβO, orβ le, orβ2c, orβSc, orβ4c, orβ5c, orβό, orβ7, orβδc, orβ9, orβOc, orβl, orβ2c, orβ 3 et orβ4c. La fonction des protéines codées par ces séquences dans la voie de biosynthèse des spiramycines est développée dans la discussion ci-après qui est illustrée par les figures 4, 5, 6 et 8.
1) Un premier objet de l'invention concerne un polynucléotide codant un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisé en ce que la séquence dudit polynucléotide est : (a) l'une des séquences SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149,
(b) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a), (c) l'une des séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.
2) La présente invention a également pour objet un polynucléotide s'hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence à au moins l'un des polynucléotides selon le paragraphe 1) ci-dessus.
3) L'invention concerne également un polynucléotide présentant au moins 70%,
80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide comprenant au moins 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide selon le paragraphe 1) ci dessus.
4) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2) ou 3) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.
5) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2), 3) ou 4) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.
6) L'invention concerne également un polynucléotide selon le pragraphe 2), 3) ou 4) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine ayant une activité similaire à la protéine codée par le polynucléotide avec lequel il s'hybride ou il présente l'identité.
7) L'invention concerne également un polypeptide résultant de l'expression d'un polynucléotide selon le pragraphe 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus. 8) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisée en ce que la séquence dudit polypeptide est :
(a) l'une des séquences SEQ ID N° 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 et 150,
(b) l'une des séquences telles que définies en (a) excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles, (c) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a) et (b).
9) Un autre objet de l'invention concerne un polypeptide présentant au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité en acides aminés avec un polypeptide comprenant au moins 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 ou 640 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon le paragraphe 8) ci-dessus.
10) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le paragraphe 9) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.
11) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le paragraphe 9) ou 10) ci-dessus caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.
12) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide selon le pragraphe 9), 10) ou 11) ci-dessus caractérisé en ce qu'il a une activité similaire à celle du polypeptide avec lequel il partage l'identité.
13) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polynucléotide selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus. 14) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le pragraphe 13) ci-dessus caractérisé en ce que le dit ADN recombinant est compris dans un vecteur.
15) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le paragraphe 14) ci-dessus caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC ou les PAC.
16) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le pragraphe 15) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est choisi parmi pOS49.1, pOS49.11, pOSC49.12, pOS49.14, pOS49.16, pOS49.28, pOS44.1, pOS44.2, pOS44.4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, pOS49.88, pOS49.106, pOS49.120, pOS49.107, pOS49.32, pOS49.43, pOS49.44, pOS49.50, pOS49.99, pSPM17, pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPMl, pBXLllll, pBXL1112, pBXL1113, pSPM520, pSPM521, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, ; pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74, pSPM75, pSPM79, pSPM83, pSPM107, pSPM543 et pSPM106. 17) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant un polypeptide selon le pragraphe 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) ci-dessus.
18) L'invention est également relative à un système d'expression comprenant un vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides selon le paragraphe 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) ci-dessus.
19) L'invention est également relative à un système d'expression selon le paragraphe 18 ci-dessus caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression procaryotes ou les systèmes d'expression eucaryotes. 20) L'invention est également relative à un système d'expression selon le paragraphe 19) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression chez la bactérie E. coli, les sytèmes d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de levures, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de mammifères.
21) L'invention est également relative à une cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'un des pragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 13), 14), 15), 16) ou 17) ci-dessus.
22) L'invention est également relative à un procédé de production d'un polypeptide selon le paragraphe 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) ci-dessus caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a) insérer au moins un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
23) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme bloqué dans une étape de la voie de biosynthèse d'au moins un macrolide.
24) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est obtenu en inactivant la fonction d'au moins une protéine impliquée dans la biosynthèse de ce ou de ces macrolides dans un microorganisme producteur de ce ou de ces macrolide. 25) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 24) ci-dessus caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénese dans le ou les gènes codant ladite ou lesdites protéines ou par expression d'un ou de plusieurs ARN anti-sens complémentaires de l'ARN ou des ARN messagers codant ladite ou lesdites protéines. "
26) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25) ci-dessus caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénese par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénese dirigée ou par remplacement de gène.
27) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25) ou 26) ci-dessus caractérisé en ce que la ou les mutagénèses sont effectuées in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés ou par inactivation génique.
28) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26) ou 27) ci-dessus caractérisé en ce que ledit ?; microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.
29) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27) ou 28) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.
30) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27), 28) ou 29) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souche de S. ambofaciens.
31) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29) ou 30) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénese est effectuée dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus. 32) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25), 26), 27), 28), 29), 30) ou 31) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénese est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 'et 149 ;
33) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31) ou 32) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénese consiste en l'inactivation génique d'un gène comprenant une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N° 13.
34) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche choisie parmi l'une des souches déposées auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2909, 1-2911, 1-2912, 1- 2913, 1-2914, 1-2915, 1-2916 ou 1-2917.
35) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse de macrolide caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31), 32), 33) ou 34) ci dessus, b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), ledit intermédiaire de biosynthèse.
36) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'une molécule dérivée d'un macrolide caractérisé en ce que l'on prépare un intermédiaire de biosynthèse selon le procédé du paragraphe 35) ci-dessus et que l'on modifie l'intermédiaire ainsi produit. 37) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36) ci-dessus caractérisé en ce que l'on modifie ledit intermédiaire par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.
38) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36) ou 37) ci-dessus caractérisé en ce que l'on introduit dans ledit microorganisme un ou plusieurs gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat.
39) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36), 37) ou 38) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.
40) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation selon le paragraphe 36), 37), 38) ou 39) ci-dessus caractérisé en ce que le microorganisme utilisé est une souche de S. ambofaciens.
41) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et m
42) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41) ci-dessus caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de la spiramycine I mais que le gène comprenant la séquence SEQ ID N° 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N° 14 ou l'un de ses variants n'est pas exprimé ou a été rendu inactif.
43) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 42) ci-dessus caractérisé en ce que la dite inactivation est réalisée par mutagénese dans le gène codant ladite protéine ou par l'expression d'un ARN anti-sens complémentaire de l' ARN messager codant ladite protéine. 44) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 43) ci-dessus caractérisé en ce que la dite mutagénese est effectuée dans le promoteur de ce gène, dans la séquence codante ou dans une séquence non codante de manière à rendre inactive la protéine codée ou à en empêcher son expression ou sa traduction.
45) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon la revendication 43) ou 44) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénese est effectuée par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénese dirigée ou par remplacement de gène.
46) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 43), 44) ou 45) ci-dessus caractérisé en ce que la mutagénese est effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique.
47) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le ; paragraphe 41) ou 42) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorgaήisme est obtenu; en exprimant les gènes de la voie de biosynthèse de la spiramycine sans que ceux-ci ne comprennent le gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N° 14 ou l'un de ses variants.
48) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46) ou 47) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.
49) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47) ou 48) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de départ produisant les spiramycines I, II et III. 50) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48) ou 49) ci-dessus caractérisé en ce qu'il est obtenu par mutagénese dans un gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N° 14 ou l'un de ses variants ayant la même fonction.
51) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49) ou 50) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de S. ambofaciens produisant les spiramycines I, II et III, dans laquelle est effectuée une inactivation génique du gène comprenant la séquences correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
52) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de S. ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro, d'enregistrement 1-2910.
53) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de spiramycine I, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49), 50), 51) ou 52) ci-dessus,
(b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire,
(c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), la spiramycine I.
54) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus pour améliorer la production en macrolides d'un microorganisme. 55) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant producteur de macrolide caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus et/ou qu'il surexprime au moins un gène comprenant une séquence selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) ci-dessus.
56) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55) ci-dessus caractérisé en ce que la modification génétique consiste en une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés dans le but d'exprimer une ou des protéines ayant une activité supérieure ou d'exprimer un niveau plus élevé de cette ou de ces protéines.
57) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55) ci-dessus caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en augmentant le nombre de copie de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage.
58) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55) ou 57) ci-dessus caractérisé en ce que la surexpression du gène considéré est obtenue en transformant un microorganisme producteur de macrolide par une construction d'ADN recombinant selon le paragraphe 13, 14 ou 17 ci-dessus, permettant la surexpression de ce gène.
59) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57) ou 58) ci-dessus caractérisé en ce que la modification génétique est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. 60) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58) ou 59) ci-dessus caractérisé le microorganisme surexprime un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
61) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58), 59) ou 60) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactéries du genre Streptomyces.
62) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58), 59), 60) ou 61) ci-dessus caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.
63) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme mutant selon le paragraphe 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61) ou 62) ci-dessus caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souches de S. ambofaciens.
64) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de macrolides, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'un des paragraphes 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61), 62), 63) ou 64) ci-dessus,
(b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire,
(c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), le ou lesdits macrolides produits.
65) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence et/ou d'un ADN recombinant et/ou d'un vecteur selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7),
8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16) ou 17) ci-dessus pour la préparation d'antibiotiques hybrides. 66) Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un polypeptide et/ou au moins une cellule hôte selon l'un des paragraphes 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16), 17) ou 21) ci-dessus pour réaliser une ou plusieurs bioconversions.
*
67) Un autre aspect de l'invention concerne un polynucléotide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide complémentaire de l'un des polynucléotides selon le paragraphe 1), 2), 3), 4), 5), ou 6) ci-dessus.
68) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme producteur d'au moins une spiramycine caractérisé en ce qu'il surexprime :
- un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l' ADN total de Streptomyces ambofaciens,
- ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
69) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 68 ou 90 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie du genre Streptomyces.
70) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 68, 69 ou 90 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie de l'espèce Streptomyces ambofaciens.
71) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 68, 69, 70 ou 90 caractérisé en ce que la surexpression dudit gène est obtenue par transformation dudit microorganisme par un vecteur d'expression. 72) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche OSC2/pSPM75(l) ou de la souche OSC2/pSPM75(2) déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 6 octobre 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-3101.
73) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend :
- un polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens,
- ou un fragment d'au moins 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490 ou 1500 nucléotides consécutifs de ce polynucléotide.
74) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le paragraphe 73 ou 91 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur.
75) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon le paragraphe 73, 74 ou 91 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'expression.
76) Un autre aspect de l'invention concerne une cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un ADN recombinant selon l'un des paragraphes 73, 74, 75 ou 91.
77) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production d'un polypeptide caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a) transformer une cellule hôte par au moins un vecteur d'expression selon le paragraphe 75; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
78) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme 'selon le paragraphe 51 caractérisé en ce que l'inactivation génique est effectuée par délétion en phase du gène ou d'une partie du gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
79) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon l'un des paragraphes 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 78 caractérisé en ce en ce qu'il surexprime en outre :
- un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymérase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5'
AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5' ' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens,
- ou un gène dérivé de ceux-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
80) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression caractérisé en ce que le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 47 ou un polynucléotide dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression de la protéine codée par le dit polynucléotide chez Streptomyces ambofaciens.
81) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression selon le paragraphe 80 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM524 ou pSPM525. 82) Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens transformée par un vecteur selon le paragraphe 80 ou 81.
83) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon l'un des paragraphes 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 78, 79 ou 92 caractérisé en ce qu'il surexprime en outre le gène de séquence codante SEQ ID N° 47 ou d'une séquence codante dérivée de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
84) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 83 caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche SPM502 pSPM525 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 26 février 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-2977.
85) Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de spiramycine(s), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'ύή des paragraphes 68, 69, 70, 71, 72, 78, 79, 82, 83, 84, 90 ou 92,
(b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire,
(c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), les spiramycines.
86) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence comprend la séquence SEQ ID N° 112 ou la séquence SEQ ID N° 142.
87) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence correspond à la séquence traduite de la séquence codante :
- d'un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5'
AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens,
- ou d'un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
88) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression permettant , l'expression d'un polypeptide selon le paragraphe 86, 87 ou 93 chez Streptomyces . ambofaciens.
89) Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression selon le paragraphe 88 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM75.
90) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 68 caractérisé en ce que le gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase est le gène de séquence codante SEQ ID N° 141 ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
91) Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant selon lejj paragraphe 73 caractérisé en ce que le polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase est un polynucléotide de séquence SEQ ID N° 141.
92) Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme selon le paragraphe 79 caractérisé en ce que le gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase est le gène de séquence codante SEQ ID N° 141 ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
93) Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence est SEQ ID N° 142. Définitions générales
Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).
Par exemple un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présente invention le terme ORF (« Open Reading Fra e », c'est à dire cadre ouvert de lecture) a été employé pour désigner en particulier la séquence codante d'un gène.
Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence. Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO 95/04064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier polynucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G.
Le terme « gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines » comprend également les gènes régulateurs et les gènes conférant la résistance aux inicroorgaήismes ' producteurs.
On entendra par " fragment " d'un acide nucléique de référence selon l'invention, une séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à 1 ' acide nucléique de référence.
Un tel " fragment " d'acide nucléique selon l'invention peut être le cas échéant, compris dans un polynucléotide plus grand duquel il est constitutif.
De tels fragments comprennent ou alternativement consistent en, des polynucléotides de longueur allant de 8, 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900,
950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Par " fragment " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est plus courte que celle du polypeptide de référence et qui comprend sur toute la partie^ commune avec ces polypeptides de référence, une séquence en acides aminés identique.
De tels fragments peuvent, le cas échéant, être compris au sein d'un polypeptide plus grand duquel ils font partie.
De tels fragments d'un polypeptide selon l'invention peuvent avoir une longueur de 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 ou 640 acides aminés.
Par " conditions d'hybridation de forte stringence " au sens de la présente invention, on entendra des conditions d'hybridation défavorisant l'hybridation de brins d'acides nucléiques non homologues. Des conditions d'hybridations de forte stringence peuvent être par exemple décrites comme des conditions d'hybridation dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) à une température comprise entre 55°C et 65°C, de manière préférée la température d'hyridation est de 55°C, de manière encore plus préférée la températue d'hybridation est de 60°C et de manière tout à fait préférée la température d'hybridation est de 65°C, suivi d'un ou plusieurs lavages effectué en tampon 2X SSC (le tampon IX SSC correspond à une solution aqueuse 0,15M NaCl, 15 mM de citrate de sodium) à une température comprise entre 55°C et 65°C, de manière préférée cette température est de 55°C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60°C et de manière tout à fait préférée cette température est de 65°C, suivi d'un ou plusieurs lavages en tampon 0.5X SSC à une température comprise entre 55°C et 65°C, de manière préférée cette température est de 55°C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60°C et de manière tout à fait préférée cette température est de 65°C. Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'ouvrage de F. Ausubel et al (2002).
Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entendra un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynucléotide de référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagénese.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique Variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les séquences!) d'aminoacides codées par ledit acide nucléique variant.
Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant peuvent aussi résulter de substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nucléique variant par rapport aux peptides codés par l'acide nucléique de référence. En outre, des modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence d'aminoacides.
De préférence, les acides nucléiques variants selon l'invention codent des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides codés par l'acide nucléique initial. Certains acides nucléiques variants coderont ainsi des formes mutées des polypeptides dont l'étude systématique permettra de déduire des relations structure activité des protéines en question.
Par " variant " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra principalement un polypeptide dont la séquence d'acides aminés contient une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'aminoacides peuvent être indifféremment conservatives ou non conservatives.
De préférence, les polypeptides variants selon l'invention conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides initiaux.
Par polypeptide ayant " une activité similaire " à un polypeptide de référence au sens de l'invention, on entend un polypeptide ayant une activité biologique proche, mais pas nécessairement identique, de celle du polypeptide de référence tel que mesuré dans un essai biologique convenable à la mesure de l'activité biologique du polypeptide de référence.
Par " antibiotique hybride " au sens de l'invention on entend un composé, généré par la construction d'une voie de biosynthèse artificielle utilisant la technologie de PADN recombinant.
Description détaillée de l'invention
La présente invention a plus particulièrement pour objet, de nouveaux gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines et de nouveaux polypeptides impliqués dans cette biosynthèse tels que présentés dans la description détaillée ci-dessous.
Les gènes de la voie de biosynthèse ont été clones et la séquence d'ADN de ces gènes a été déterminée. Les séquences obtenues ont été analysées grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). On a identifié, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typiques de Streptomyces. Cette analyse a montré que cette région comporte 44 ORFs, localisées de part et d'autre de cinq gènes codant l'enzyme « polyketide synthase » (PKS), et présentant un usage des codons typique de Streptomyces. De part et d'autre de ces cinq gènes codant la PKS, respectivement 10 et 34 ORFs ont été identifiées en aval et en amont (l'aval et l'amont étant définis par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés ; dans le même sens) (cf. figure 3 et 37). Ainsi, les 34 phases ouvertes de lecture de ce,; type, occupant une région d'environ 41,7 kb (cf. SEQ ID N° 1 présentant une première! région de 31 kb contenant 25 ORFs et SEQ ID N° 140 présentant une région d'environ 12,1 kb dont 1,4 kb chevauchent la séquence précédente (SEQ ID N° 1) et environ 10,7 kb correspondent à la suite de la séquence, cette dernière partie d'environ 10,7 kb contenant 9 ORFs supplémentaires (dont un ORF de séquence partielle), cf. également figure 3 et 37 et ci-dessous), ont été identifiées en amont des 5 gènes codant la PKS et 10 occupant une région d'environ 11,1 kb (SEQ ID N° 2 et figure 3), ont été identifiées en aval des gènes de la PKS. Les 10 gènes situés en aval des 5 gènes PKS ont ainsi été nommés orfl *c, orβ*c, orβ*c, orβ*c, orβ* orfό* orβ*c, orβ*, orβ*, orflO* (SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 et 21). Le « c » ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N° 2 pour ces gènes). En utilisant la même nomenclature, les 34 ORFs en amont des gènes de la PKS ont été nommés orfl, orβ, orβ, orβ, orβ, orfό, orβ, orβ, orβc, orflO, orfl le, orfl2, orfl 3c, orfJ4, orfl 5c, orfl 6, orfl 7, orflδ, orfl 9, orβO, orβlc, orβ2c, orβ3c, orβ4c, orβ5c, orβό, orβ7, orβδc, orβ9, orβOc, orβl, orβ 2c, orβ 3 et orβ4c (SEQ ID N° 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149) (cf. figure 3 et 37).
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups) (ces trois programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C. et al, 1995)), (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse des spiramycines. Gènes situés en aval des gènes codant les PKS
Une représentation schématique de l'organisation de la région est présentée en figure 3. Ainsi qu'il sera démontré ci-dessous, sur les 10 gènes identifiés en aval des gènes codant les PKS 9 semblent impliqués dans la biosynthèse ou la résistance aux spiramycines. Il s'agit des 9 gènes suivants : orfl *c, orβ*c, orβ*c, orβ*c, orβ*, orfό*, orβ*c, orβ* et orβ*.
Dans le tableau 1 suivant sont présentées les références à la séquence en ADN et en acides aminés des 10 gènes identifiés en aval des 5 gènes PKS.
Tableau 1
Le « c » ajouté dans le nom du gène indique que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ED N° 2 pour ces gènes).
construction de souches mutantes et des analyses de la production en spiramycines et en intermédiaires de biosynthèse des spiramycines par ces souches mutantes.
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont tout d'abord été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD- search, COGs (Cluster of Orthologous Groups), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C. et al, 1995)). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycine. Le tableau 2 montre les protéines présentant une forte similitude avec les produits 10 gènes situés en aval des 5 gènes PKS. Tableau 2
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Des expériences d'inactivation de gènes ont été réalisées pour confirmer ces résultats. Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine, la généticine ou l'hygromycine). Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par des terminateurs de transcription actifs chez Streptomyces. L'insertion de la cassette dans le gène cible peut s'accompagner ou non d'une délétion dans ce gène cible. La taille des régions flanquant la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases. Un deuxième type de cassettes peut être utilisé poύj l'inactivation de gènes : des cassettes dites « cassettes excisables ». Ces cassettes présentent l'avantage de pouvoir être excisées chez Streptomyces par un événement de recombinaison de site spécifique après avoir été introduites dans le génome de S. ambofaciens. Le but est d'inactiver certains X gènes dans des souches de Streptomyces sans laisser dans la souche finale de marqueurs de sélection ou de grandes séquences d'ADN n'appartenant pas à la souche. Après excision il subsiste uniquement une courte séquence d'une trentaine de paires de bases (appelé site « cicatriciel ») dans le génome de la souche (cf. figure 10). La mise en oeuvre de ce système consiste, dans un premier temps, au remplacement de la copie sauvage du gène cible (grâce à deux événements de recombinaison homologue, cf. figure 9) par une construction dans laquelle une cassette excisable a été insérée dans ce gène ,; cible. L'insertion de cette cassette est accompagnée d'une délétion dans le gène cible (cf. -•>'• figure 9). Dans un deuxième temps, l'excision de la cassette excisable du génome de la souche est provoquée. La cassette excisable fonctionne grâce à un système de recombinaison site spécifique et a pour avantage de permettre l'obtention de mutants de Streptomyces ne portant finalement pas de gène de résistance. On s'affranchit également d'éventuels effets polaires sur l'expression des gènes situés en aval du ou des gènes inactivés (cf. figure 10). Les souches ainsi construites ont été testées pour leur production en spiramycines. L'inactivation des gènes orfl *c, orβ*c, orβ*c et orf4*c n'a pas été effectuée car les expériences de comparaison de séquence ont permis de déterminer que ces gènes avaient une similitude relativement importante avec des gènes impliqués dans la biosynthèse d'un antibiotique relativement proche. Ainsi, le gène orfl*c code une protéine présentant une identité de 66% (déterminée grâce au programme BLAST) avec la protéine codée par gène tylMI qui code une N-méthyltransférase impliquée dans la biosynthèse de tylosine et catalysant la 3 N-méthylation durant la production du mycaminose chez Streptomyces fradiae (Gandecha,A.R. et al, 1997 ; Numéro d'accès GenBank : CAA57473 ; Score BLAST : 287). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique relativement proche et plus particulièrement dans la biosynthèse du mycaminose suggère que le gène orfl *c code une N-methyltransférase responsable d'une N-méthylation lors de la biosynthèse de la forosamine ou du mycaminose (cf. figure 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 3).
Tableau 3
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orβ*c code une protéine présentant une relative forte similitude (35% d'identité) avec une protéine codée par le gène tylMIII codant une NDP hexose 3,4 isomerase impliquée dans la biosynthèse de la tylosine chez Streptomyces fradiae (Gandecha,A.R., et al, 1997 ; Numéro d'accès GenBank : CAA57471 ; Score BMAST : 130). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche et plus particulièrement dans la biosynthèse du mycaminose suggère fortement que le gène orβ2c code une NDP hexose 3,4 isomerase responsable d'isomérisation lors de la biosynthèse d'un des sucres de la spiramycine, éventuellement le mycaminose (cf. figure 5 et 6).
Le gène orβ*c code une protéine présentant une relative forte similitude (59% d'identité) avec une protéine codée par le gène tylMII codant une glycosyltransférase impliquée dans la biosynthèse de la tylosine chez Streptomyqes fradiae (Gandecha,A.R. et al, 1997 ; Numéro d"accès GenBank : CAA57472 ; Score BLAST : 448). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orβ3c code une glycosyltransférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 4).
Tableau 4
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orβ*c code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs crotonyl-CoA réductases. Notamment, la protéine codée par orβ*c possède une similitude importante avec une crotonyl CoA réductase de chez Streptomyces coelicolor (Redenbach,M et al, 1996 ; Numéro d'accès GenBank : NP_630556 ; Score BLAST : 772). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orβ*c code également une crotonyl-CoA réductase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 5).
Tableau 5
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul ét al, 1990).
Le gène orfό* présente une certaine similitude avec le gène mdmB présent chez Streptomyces mycarofaciens (Hara et Hutchisnson, 1992 ; numéro d'accès GenBank : A42719 ; Score BLAST : 489) producteur d'antibiotique macrolide. Chez ce producteur, le gène est impliqué dans l'acylation du cycle lactone. Le gène orfό* coderait donc une acyltransférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfό* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 6). Tableau 6
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
L'inactivation du gène orfό* a ete réalisée par une délétion/insertion en phase et il a été montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycine II et III mais uniquement de la spiramycine I (cf figure 1). Ceci confirme que le gène orβ* est bien impliqué dans la synthèse de spiramycine II et III. L'enzyme codée par ce gène est responsable de la formation de spiramycine II et III par fixation d'un groupement acétyl ou butyryl sur le carbone 3. Les souches n'exprimant plus la protéine codée par le gène orfό* sont particulièrement intéressantes puisqu'elles ne produisent plus de spiramycine II et III mais seulement de la spiramycine I. Comme il a été précisé ci-dessus, l'activité antibiotique de la spiramycine I est nettement supérieure à celle des spiramycines II et III (Un et al, 1999).
Le gène orβ* code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs O-méthyltransférase. Notamment, la protéine codée par orβ* possède une similitude importante avec une O-méthyltransférase (EC 2.1.1.-) MdmC de Streptomyces mycarofaciens (Hara & Hutchinson, 1992 ; Numéro d'accès GenBank :B42719; Score BLAST : 355). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique suggère fortement que le gène orβ* code également une O-méthyltransférase. Le gène orβ* serait impliqué dans la formation de précurseurs incorporés dans le cycle lactone. En effet, d'après les comparaisons de séquences, le produit du gène orβ* est également relativement proche de FkbG qui est responsable de la méthylation de l'hydroxymalonyl-ACP d'après (Wu et al, 2000 ; Hoffrneister et al, 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86386 ; Score BLAST : 247) (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée '? par le gène orβ* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 7).
Tableau 7
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Grâce à l'effet polaire de l'insertion d'une cassette non excisée dans le gène orfό*, il a pu être déterminé que le gène orf 5* est essentiel à la voie de biosynthèse des spiramycines. En effet, l'insertion de la cassette excisable dans la partie codante du gène orfό* entraîne un arrêt total de la production en spiramycines. Cependant, une fois que la cassette insérée a été excisée (et donc lorsque seul le gène orfό* est inactivé, cf exemples 14 et 15), on retrouve une production en spiramycine I. Ceci montre que le gène orf 5* est essentiel à la voie de biosynthèse des spiramycines puisque son inactivation entraîne un arrêt total de la production en spiramycines.
Le gène orβ* code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs O-méthyltransférase. Le gène orβ* serait une O-méthyl transférase impliquée soit directement dans la synthèse du platénolide, soit dans la synthèse d'un précurseur^ méthylé (méthoxymalonyl, voir figure 8) incorporé dans le platénolide par la PKS. Pour vérifier cette hypothèse, des expériences d'analyse CL/SM et de RMN ont été conduites sur une souche de S. ambofaciens de génotype : orfό*::àttlΩhyg+. Dans cette souche le gène orβ* n'est pas exprimé à cause de l'effet polaire de l'insertion, dans le gène orfό*, de la cassette qui contient des terminateurs de transcription (cf. exemple 27). Il a été montré que cette souche produit une molécule dont le spectre UN a une allure similaire
l'hypothèse du rôle de orβ* dans la biosynthèse des spiramycines. En outre, le produit correspondant à la spiramycine sans le groupement méthyle présente une très faible activité microbologique (plus faible d'un facteur 10) par rapport à la spiramycine non modifiée, lorsque testée sur le microorganisme Micrococcus luteus.
Le gène orβ*c code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens, ce dernier codant une protéine impliquée dans la résistance à la midécamycine chez cet organisme producteur (Hara et al, 1990 ; Numéro d'accès GenBank : A60725 ; Score BLAST : 380). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique suggère fortement que le gène orβ*c code également une protéine impliquée dans la résistance à la spiramycine. Plus particulièrement, l'enzyme codée par le gène orβ*c possède une activité méthyltransferase et est impliquée dans la résistance à la spiramycine chez Streptomyces ambofaciens. Il a été démontré que ce gène confère une résistance de type MLS I, résistance dont on sait qu'elle est due à la mono- méthylation en position A2058 de l'ARN ribosomal 23 S (Pernodet et al, 1996). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ*c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 8).
Tableau 8
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus. ;;." élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orβ* code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de type transporteur ABC chez Streptomyces griseus (Campelo, 2002, Numéro d'accès GenBank : CAC22119 ; Score BLAST : 191). Cette similitude avec une protéine de type transporteur ABC suggère fortement que le gène orβ* code également une protéine de type transporteur ABC pouvant être impliquée dans la résistance à la spiramycine. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 9). Tableau 9
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et a , 1990).
Le gène or/9* code une protéine présentant une relative forte similitude avec uiιé, protéine de type transporteur ABC chez Streptomyces griseus (Campelo, 2002, Numéro; ; d'accès GenBank : CAC22118 ; Score BLAST : 269). Cette similitude avec une protéine de type transporteur ABC suggère fortement que le gène orβ* code également une protéine de type transporteur ABC pouvant être impliquée dans la résistance à la spiramycine. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ* présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 10).
Tableau 10
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orflO* code une protéine présentant une relative forte similitude avec une protéine de fonction inconnue. Cependant des gènes similaires à orflO* sont retrouvés au milieu de plusieurs groupes de gènes impliqués dans la biosynthèse d'antibiotiques. Ainsi un gène proche de orflO* est retrouvé chez S. coelicolor (Redenbach et al, 1996, numéro d'accès GenBank : NP_627432, score BLAST : 109). Un gène proche (CouY) est également retrouvé chez S. rishiriensis (Wang et al, 2000, numéro d'accès GenBank : AAG29779, score BLAST 97).
Gènes situés en amont des gènes codant les PKS ; ..-',
Dans là séquence d'ADN située en amont des gènes codant les PKS (l'aval et ; ': l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 3), 34 ORFs ont été identifiées (cf. ci-dessus). Ainsi, les 34 phases ouvertes de lecture de ce type, occupant une région d'environ 41,7 kb (cf. SEQ ID N° 1 présentant une première région de 31 kb contenant 25 ORFs et SEQ ID N° 140 présentant une région d'environ 12,1 kb dont 1,4 kb chevauchent la séquence précédente (SEQ ID N° 1) et environ 10,7 kb correspondent à la suite de la séquence), cette dernière partie d'environ 10,7 kb contenant 9 ORFs supplémentaires (dont un ORF de séquence partielle), cf. également figure 3 et 37 et ci-dessous). Une représentation schématique de l'organisation de la région est présentée en figure 3 et 37. Les 34 gènes identifiés ont été nommés : orfl, orβ, orβ, orβ, orβ, orfό, orβ, orβ, orβc, orflO, orfl le, orfl 2, orfl 3c, orfl4, orfl 5c, orfl 6, orfl 7, orfl 8, orfl 9, orβO, orβ le, orβ2c, orβ3c, orβ4c, orβSc, orβό, orβ 7, orβ8c, orβ9, orβOc, orβl, orβ2c, orβ 3 et orβ4c. Dans le tableau 11 suivant sont présentées les références à la séquence en ADN et en acides aminés des 34 gènes identifiés en amont des 5 gènes PKS.
Tableau 11
41
Le « c » ajouté dans le nom du gène indique que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 140 pour ces gènes).
Lorsque plusieurs séquences protéiques sont indiquées pour une seule orf, les protéines correspondantes sont issues de plusieurs sites possibles de démarrage de la traduction. Dans le but de déterminer la fonction des polypeptides identifiés dans le tableau 11 ci-dessus, trois types d'expériences ont été menées : la comparaison de l'identité des séquences identifiées avec des séquences de fonctions connues, des expériences d'inactivation de gènes et des analyses de la production en spiramycines de ces souches mutantes.
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont tout d'abord été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD- search, COGs (Cluster of Orthologous Groups), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C. et al, 1995)), (cf. ci- dessus). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycine. Le tableau 12 montre les protéines présentant une forte similitude avec les 34 gènes situés en amont des 5 gènes PKS. Tableau 12
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990). 45
Des expériences d'inactivation de gènes ont été réalisées pour confirmer ces résultats. Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine ou l'hygromycine). Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par des terminateurs de transcription actifs chez Streptomyces. L'insertion de la cassette dans' le gène cible peut s'accompagner ou non d'une délétion dans ce gène cible. La taille des régions flanquant la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases. Un deuxième type de cassettes peut être utilisé pour l'inactivation de gènes : des cassettes dites « cassettes excisables » (cf. ci dessus). Les souches ainsi construites ont été testées pour leur production en spiramycines.
Le gène orfl code une protéine présentant une relative forte similitude avec
protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orfl code également une cytochrome P450. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 13).
Tableau 13
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orβ code une protéine présentant une relative forte similitude avec une dTDP-6-deoxy-3,4-keto-hexulose isomerase de Aneuήnïbacillus thermoaerophilus (Pfoestl,A. et al, 2003, Numéro d'accès GenBank : AAO06351 ; Score BLAST : 118). Cette similitude suggère fortement que le gène orβ code une isomerase responsable de la réaction d'isomérisation nécessaire à la biosynthèse d'un des sucres présents dans là molécule de spiramycine, ce sucre pouvant être le mycarose (cf. figure 5). L'inactivation du gène orβ a été réalisée. Il a pu être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orβ est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines.
Le gène orβ code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs aminotransférases. Notamment, la protéine codée par orβ possède une similitude importante avec une aminotransférase de Streptomyces antibioticus impliquée dans la biosynthèse de l'oléandomycine (Draeger,G., et al, 1999 ; Numéro d'accès GenBank : AAF59939 ; Score BLAST : 431). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orβ code une 3 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse d'un des sucres aminés des spiramycines (cf. figure 5). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ 004/033
47
présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 15).
Tableau 15
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990). "
L'inactivation du gène orβ a été réalisée. Il a ainsi pu être montré que la souche ' ;; résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orβ est biéή;i|f impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines. La production de spiramycines peut être complémentée par l'expression de la protéine TylB de S. fradiae (cf exemple 23). Ceci démontre que le gène orβ code une 3 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse du mycaminose (cf. figure 5). Comme le mycaminose est le premier sucre à être fixé sur le platénolide, il est attendu que la souche interrompue dans orβ (OS49.67) accumule du platénolide.
Les intermédaires de biosynthèse de la souche interrompue dans le gène orβ ont été étudiés (cf. exemple 20). Ces expériences ont permis de démontrer que cette souche produit deux formes de platénolide : le platénolide A et le platénolide B, la structure déduite de ces deux molécules est présentée en figure 36. Cette souche produit également du platénolide A + mycarose et du platénolide B + mycarose (cf. exemple 20 et figure 40). Ces composés comportent un sucre mais ne comportent pas de mycaminose. De plus si on les compare à de la spiramycine (cf. figure 1), ces composés comportent du mycarose à la place du mycaminose. Ces résultats sont en accord avec l'implication du produit du gène orβ dans la biosynthsèe du mycaminose et son rôle en tant que 3 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse du mycaminose (cf. figure 5). On peut remarquer que la spécificité de glycosylation ne semble pas absolue puisque l'on trouve des molécules avec le mycarose fixé à la position noramalement occupée par le mycaminose (cf. figure 40).
Le gène orβ code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs NDP-glucose synthétases. Notamment, la protéine codée par otβ possède une similitude importante avec une alpha-D-glucose- 1 -phosphate thymidylyltransférase de Streptomyces venezuelae (Xue Y et α/.,1998 ; Numéro d'accès GenBank : AAC68682 ; Score BLAST 404). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de '- biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orβ code une ^ NDP-glucose syntéthase responsable de la synthèse du NDP-glucose nécessaire à lai ;, biosynthèse des trois sucres atypiques incorporés dans la molécule de spiramycine (cfe î figure 4, 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 16).
Tableau 16
004/033
49
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orβ code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glucose déshydratases. Notamment, la protéine codée par orβ possède une similitude importante avec une dTDP-glucose 4,6-déshydratase de Streptomyces tenebrarius (Li,T.B. et al, 2001 ; Numéro d'accès GenBank : AAG18457, Score BLAST : 476). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orβ code une NDP glucose déshydratase nécessaire à la biosynthèse des trois sucres atypiques incorporés; , dans la molécule de spiramycine (cf figuré 4, 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par Je fait que la protéine codée par le gène orβ présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 17).
Tableau 17
50
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orfό code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs thioestérases. Notamment, la protéine codée par orfό possède une similitude importante avec une thioesterase de Streptomyces avermitilis (Omura,S. et al., 2001 ; .. Numéro d'accès GenBank : BAB69315 ; Score BLAST : 234). Cette similitude avec une X protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère ff fortement que le gène orβ code également uαe ^ tMpestàa^é Cette hypothèse est étayée f f par le fait que la protéine codée par le gène orfό présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 18).
Tableau 18
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orβ code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose déshydratases. Notamment, la protéine codée par orβ possède une similitude importante avec une dNTP hexose 2,3 -déshydratase (codée par lé gène TylCNI) de Streptomyces fradiae impliquée dans la biosynthèse de la tylosine (Merson- Davies,L.A. et a , 1994 ; Numéro d'accès GenBank : AAF29379 ; Score BLAST : 461). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orβ code également une hexose 2-3 déshydratase nécessaire à la biosynthèse de deux sucres atypiques incorporés dans la molécule de spiramycine (cf. figure 4 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 19).
Tableau 19
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul ét al, 1990). 004/033
52
Le gène orβ code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs aminotransférases. Notamment, la protéine codée par orβ possède une similitude importante avec une aminotransférase probablement impliquée dans la biosynthèse de la forosamine chez Saccharopolyspora spinosa (Waldron,C. et al, 2001 ; Numéro d'accès GenBank : AAG23279 ; score BLAST : 465). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche, suggère fortement que le gène orβ code une 4 amino-transférase responsable de la réaction de transamination nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 20).
Tableau 20
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
L'inactivation du gène orβ a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orβ est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines. La validation de l'hypothèse du rôle joué par le produit du gène orβ dans la biosynthèse de la forosamine est apportée par le fait qu'un mutant incativé pour le gène orβ produit de la forocidine, ce mutant est donc bloqué au stade de la forocidine et ne produit pas de néo-spiramycine (cf. figure 7 et exemple 25). Ces résultats sont en 00
53
accord avec une implication du produit du gène orβ dans la biosynthèse de forosamine (cf. figure 6).
Le gène orβc a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné srmXpwc Geistlich et al (Geistlich,M., et al, 1992). La similitude de la protéine codée par ce gène avec plusieurs méthyltransférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que le gène or9c code une méthyltransferase responsable de la réaction de méthylation nécessaire à la biosynthèse du mycaminose ou de la forosamine (cf. figure 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβc présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 21).
Tableau 21
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al., 1990).
Le gène orflO a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné .srmR par Geistlich et al. (Geistlich,M., et al, 1992). La protéine codée par ce gène est impliquée dans la régulation de la voie de biosynthèse des spiramycines chez Streptomyces ambofaciens. L'inactivation du gène orflO a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orflO est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. La protéine codée par ce gène est donc bien essentielle à la biosynthèse des spiramycines.
D'autre part ; le point de démarrage de la traduction de orflO a été déterminé et il a pu être montré que la surexpression de ce gène entraine une amélioration de la production en spiramycines. Le site de démarrage de la traduction correspond à un ATG situé en amont de l'ATG proposé par Geistlich et al. (Geistlich,M., et al, 1992). Il a en outre été démontré que cette extrémité 5' est esentielle à la fonction de OrflO puisqu'un messager tronqué en 5' est inactif (cf. exemple 17). Pour obtenir l'effet recherché sur la production en spiramycines, il est donc essentiel que la surexpression de orflO soit réalisée en prenant garde de ne pas exprimer un messager tronqué en 5' de orflO.
Le gène orfl le a déjà été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné srmB par Geistlich et al (Geistlich,M. et al, 1992) et Schoner et al (Schoner B et a , 1992). La protéine codée par ce gène est impliquée dans la résistance à la spiramycine chez Streptomyces ambofaciens et est un transporteur de type ABC.
Le gène or72 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose déshydratases. Notamment, la protéine codée par orfl 2 possède une similitude importante avec une NDP -hexose 3,4-déshydratase codée par le gène UrdQ de Streptomyces fradiae et impliquée dans la biosynthèse de l'urdamycine (Hoffineister,D. et al, 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF72550 ; Score BLAST : 634). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique proche suggère fortement que le gène orfl 2 code une 3,4 déshydratase responsable de la réaction de déshydratation nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl 2 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 22). 004/033689
55
Tableau 22
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
L'inactivation du gène or/12 a été réalisée. Il a pu être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orfl 2 est bien impliqué dans la biosynthèse de la spiramycine. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse de la spiramycine. La validation de l'hypothèse du rôle joué par Orfl 2 dans la biosynthèse de la forosamine est apportée par le fait qu'un mutant incativé pour le gène orfl 2 ne produit plus de forosamine. Il produit cependant une faible quantité de forocidine. Ce mutant est donc bloqué au stade de la forocidine et ne produit pas de néo-spiramycine (cf. figure 7 et exemple 26). Ce mutant produit en outre un composé de structure présentée en figure 38. Ce dernier composé comporte deux sucres, le mycaminose et le mycarose mais ne comporte pas de forosamine. De plus si on le compare à la structure de la spiramycine (cf. figure 1), ce composé comporte le sucre mycarose à la place attendue de la 5 forosamine. Ces résultats sont en accord avec l'implication du produit du gène or/72 ' dans la biosynthsèe de la forosamine (cf. figure 6). On peut remarquer que la spécificité de glycosylation n'est pas absolue puisque l'on observe des molécules dans lesquelles le mycarose est fixé à la position normalement occupée par la forosamine (voir figure 38).
Le gène orfl 3c code une protéine présentant une relative forte similitude avec une 0 protéine de fonction inconnue chez Streptomyces coelicolor. Cette protéine a été nommée SC4H2.17 (numéro d'accès GeneBank : T35116 ; Score BLAST : 619). La protéine codée par le gène orfl 3c présente également une forte similitude avec d'autres protéines d'autres organismes (cf. tableau 23).
Tableau 23
5 * une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990). Aucune fonction précise n'a été assignée aux protéines proches de celle codée par orfl 3c. L'inactivation du gène orfl 3c a été réalisée dans le but d'étudier la fonction de ce gène dans la voie de biosynthèse des spiramycines chez Streptomyces ambofaciens. Il a pu être montré que la souche résultante produit des spiramycines. Ceci indique que le gène orfl 3c n'est pas essentiel à la biosynthèse des spiramycines et qu'il n'est pas essentiel à la survie de la bactérie. L'enzyme codée par ce gène n'est donc pas responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines.
Le gène orfl 4 code une protéine présentant une relative forte similitude avec une réductase putative (Redenbach,M., et α/.,1996 ; Bentley et a , 2002 ; numéro d'accès GenBank : CAB90862 ; Score BLAST : 147).
L'inactivation du gène orfl.4 a été réalisée. H a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orfl4 est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc bien responsable d'une étape de bioconversion essentielle à la biosynthèse des spiramycines. Les interrnédaires de biosynthèse de la souche interrompue dans le ιë% orfl4 ont été étudiés (cf. exemple 20). Ces expériences ont permis de démontrer que cette souche produit du platénolide A mais ne produit pas de platénolide B (cf. figure 36).
Le gène orfl5c code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs cétoréductases. Notamment, la protéine codée par orfl 5c possède une similitude importante avec une 3-cétoréductase chez Streptomyces antibioticus (Numéro d'accès GenBak : T51102, Score BLAST : 285). Cette similitude suggère fortement que le gène orfl 5c code une 3 céto-réductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl 5c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 24). 58
Tableau 24
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orflό code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs isomérases. Notamment, la protéine codée par orflό possède une similitude importante avec une NDP hexose 3,4 isomerase chez Streptomyces fradiae (Gandecha et al., 1997 ; Numéro d'accès GenBak : CAA57471, Score BLAST : 209). Cette similitude suggère fortement que le gène orflό code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un des sucres de la spiramycine (cf. figure 5 et 6). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orflό présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 25). Tableau 25
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orfl 7 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glycosyl transférases. Notamment, la protéine codée par orfl 7 possède une similitude importante avec une glycosyl transférase de Streptomyces venezuelae (Xue,Y. i et α/.,1998 ; Numéro d'accès ^ GenBank : AAC68677 ; score BLAST : 400).' La similitude de la protéine codée par le gène orfl 7 avec plusieurs glycosyl transférases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code également une glycosyl transférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl 7 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 26).
Tableau 26
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orfl 8 code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs glycosyl transférases. Notamment, la protéine codée par orfl 8 possède une similitude importante avec une glycosyl transférase de Streptomyces rishiriensis (Wang et al,20Q0 ; Numéro d'accès GenBank : AAG29785 ; score BLAST : 185). La similitude de la protéine codée par le gène orfl8 avec plusieurs glycosyl transférases impliquées dans la voie dé tώsyntjièse aufrës antibiotiques: proches suggère fortement que ce gène code également une glycosyl transférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène or/18 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 27).
Tableau 27
004/033689
61
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul étal, 1990).
Le gène or/79 code une protéine présentant une relative forte similitude avec . plusieurs cétoréductases. Notamment, la protéine codée par orfl 9 possède une similitude > importante avec une NDP-hexose 4-cétoréductase (TylCIV) de Streptomyces fradiae : ; (Bâte et α/.,2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAD41822 ; score BLAST : 266). La . :;, similitude de la protéine codée par le gène or/19 avec cette cétpréductase impliquée dans'ff la voie de biosynthèse d'un antibiotique proche suggère fortement que ce gène " codé ^ également une 4-cétoréductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orfl 9 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 28).
Tableau 28
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* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orβO code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose réductases. Notamment, la protéine codée par orβO possède une similitude importante avec le gène EryBII de Saccharopolyspora erythraea qui code une dTDP-4-céto-L-6-déoxy-hexose 2,3-réductase (Summers,R.G., et al., 991), Numéro d'accès GenBank : AAB84068 ; Score BLAST : 491). La similitude de la protéine codée!: par le gène or/20 avec plusieurs hexose réductases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une 2-3 réductase responsable de la réaction de réduction nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβO présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 29).
Tableau 29
63
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orβlc code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs hexose méthyltransférases. Notamment, la protéine codée par orβlc possède une similitude importante avec le gène TylCIII de Streptomyces fradiae qui code une
méthyltransferase responsable de la réaction de méthylation nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβlc présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 30).
Tableau 30
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* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orβ2c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gène fkbH de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui code une enzyme impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K. et α/.,2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86387 ; Score BLAST : 463). La similitude de la protéine codée par le gène orβ2c avec cette protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre macrolide proche suggère fortement que ce gène code également une enzyme impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl chez Streptomyces ambofaciens (cf. figure 8).
Le gène or/23c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la,
« ' protéine codée par le gène fkbl de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K. et al, 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86388 ; Score BLAST 387). La similitude de la protéine codée par le gène orβ 3c avec plusieurs acyl CoA déshydrogénases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ 3c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 31). 004/033
65
Tableau 31
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orβ4c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gène fkbJ de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui , ' -:, coderait la protéine de liaison du groupement acyl (Acyl Carrier Protein (ACP)) ',,y- impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K., et al, 2000 ; Numéro d'accès GenBank : ÀAJF86389 ; Score BLAST : 87). La siώilitude de la protéine 'cόà ξli. par le gène or/24c avec cette protéine impliquées dans la voie de biosynthèse d'un autre macrolide proche suggère fortement que ce gène code une protéine impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl chez Streptomyces ambofaciens (cf. figure 8).
Le gène orβ5c code une protéine présentant une relative forte similitude avec la protéine codée par le gène βbK de Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus qui code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (Wu,K., et al, 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAF86390 ; score BLAST : 268). La similitude de la protéine codée par le gène orβ5c avec plusieurs acyl CoA déshydrogénases impliquées dans la voie de biosynthèse d'autres antibiotiques proches suggère fortement que ce gène code une acyl CoA déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse du méthoxymalonyl (cf. figure 8). Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ5c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 32). 66
Tableau 32
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orβό code une protéine présentant une identité de 65% (déterminée grâce au programme BLAST) avec la protéine codée par le gène tylCV qui code une mycarosyl transférase impliquée dans la biosynthèse de tylosine chez Streptomyces fradiae (Bate,N. et al, 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAD41824, Score BLAST : 471). Plus particulièrement, TylCV est une glycosyl-transférase liant la molécule de mycarose lors de la synthèse de la tylosine. Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique relativement proche et plus particulièrement dans le transfert du mycarose, suggère que le gène orβό code une glycosyl transférase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβό présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 33). 67
Tableau 33
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
Le gène orβ 7 code une protéine présentant une identité de 70% (déterminée grâce au programme BLAST) avec la protéine codée par le gène tylCVII qui code une NDP- hexose 3,5- (ou 5-) epimérase impliquée dans la biosynthèse de tylosine chez ;. Streptomyces fradiae (Bate,N . et ,ύf ., 2000 ; Numéro d'accès GenBank : AAD41825j Score BLAST : 243)^ Plus pa^cuiierement, TylCVII est une hexose 3,5- (ou 5-j ' ï epimérase impliquée dans la biosynthèse du mycarose. Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un autre antibiotique relativement proche et plus particulièrement dans la biosynthèse du mycarose, suggère que le gène orβ7 code une epimérase. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ 7 présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 34). Une analyse des séquences proches obtenues grâce au programme BLAST suggère fortement que le gène orβ7 code une 5 epimérase responsable de la réaction d'épimérisation nécessaire à la biosynthèse du mycarose (cf. figure 4). 68
Tableau 34
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
La séquence d"Orβ8c a dans un premier temps été déterminée de manière partielle, i: puisque la séquence d'une région d'environ 450 paires de bases n'a été déterminée qu'après reséquençage (cette région est symbolisée par des «N » dans la séquence incomplète SEQ ID N° 106). La séquence partielle de cette ORF (SEQ ID N° 111) a néanmoins été utilisée pour l'analyse avec les différents programmes informatiques comme expliqué ci-dessus. Il a ainsi pu être déterminé que le gène orβ8c code une protéine présentant une identité de 64% sur la séquence déterminée (SEQ ID N° 112, qui est la séquence partielle de la protéine Orf28c) (déterminée grâce au programme
BLAST) avec la protéine codée par le gène acyB2 qui code une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse de carbomycine chez Streptomyces thermotolerans
(Arisawa,A., et al, 1993 ; Numéro d'accès GenBank : JC2032, Score BLAST : 329). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'un antibiotique relativement proche suggère que le gène orβ8c code une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse des spiramycines. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ8c présente également une forte similitude avec la protéine TylR qui est une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse de tylosine chez Streptomyces fradiae (Bate,N. et al, 1999; Numéro d'accès GenBank : AAF29380, Score BLAST : 167).
Le gène orβ8c a pu être amplifié grâce à des oligonucléotides situés de part et 5 d'autre de la séquence non déterminée et sous clone dans un vecteur d'expression. Il a pu ainsi être démontré que la surexpression du gène orβ8c augmente significativement la production en spiramycines de la souche OSC2 (cf. exemple 24). Ceci démontre que la surexpression de orβ8c conduit à une augmentation de la production en spiramycines \[ et confirme son rôle en tant que régulateur de la voie de biosynthèse des spiramycines.
10 La séquence partielle d'orfl8c a été complétée par la suite et la région manquante d'environ 450 paires de bases a été déterminée (cf. SEQ ID N° 140 et SEQ ID N° 141). La séquence complète de cette ORF (SEQ ID N° 141) a été utilisée pour l'analyse avec les différents programmes informatiques comme expliqué ci-dessus. Il a ainsi pu être ï déterminé que le gène orf28c code une protéine présentant une identité de 69% sur la ; ;
15 séquence déterminée (SEQ ID N° 142, qui est la séquence complète de la protéine
:-u Or£28c) (déterminée grâce au programme BLÂST) avec la protéine codée par le gèηé' acyB2 qui code une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse de carbomycine chez Streptomyces thermotolerans (Arisawa,A., et al, 1993 ; Numéro d'accès GenBank : JC2032, Score BLAST : 451). Cette similitude avec une protéine impliquée
20 dans la régulation de la biosynthèse d'un antibiotique relativement proche suggère que le gène orβ8c code une protéine régulatrice impliquée dans la biosynthèse des spiramycines. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ8c présente également une forte similitude avec la protéine TylR qui est une protéine régulatrice impliquée dans la régulation de la biosynthèse de tylosine chez Streptomyces
25 fradiae (Bate,N. et al, 1999; Numéro d'accès GenBank : AAF29380, Score BLAST : 224). Les résultats de la surexpression de ce gène (cf. exemple 24) confirment son rôle en tant que régulateur de la voie de biosynthèse des spiramycines. 004/033689
70
L'inactivation du gène orβ8c a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orβ8c est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines et est essentiel à la biosynthèse des spiramycines. Ces résultats associés aux résultats de la surexpression de ce gène (cf. exemple 24) sont en accord avec un rôle d'activateur essentiel à la biosynthèse des spiramycines d'Orf28c.
Le gène orβ9 code une protéine présentant une identité de 31% (déterminée grâce au programme BLAST) avec une probable glycosyl hydrolase localisée dans le groupe , de gènes impliqué dans la biosynthèse de soraphen A (un antifongique de la classe dés polyketides) chez Sorangium cellulosum (Ligon,J., et al, 2002 ; Numéro d'accès GenBank : AAK19890, Score BLAST : 139). Cette similitude avec une protéine impliquée dans la voie de biosynthèse d'une molécule relativement proche suggère que le gène or/29 code une protéine ayant une activité glycosyl hydrolase. Cette hypothèse; ; est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ9 présente une forte similitude X- avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 35). , ; , Une analyse de la séquence de la protéine codée par orβ9 grâce au prpgramme CD search (cf. ci-dessus) suggère également que le gène or/29 code une glycosyl hydrolase! ''-•
Tableau 35
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et a , 1990).
L'analyse de la séquence protéique déduite de Vorβ9 par le programme SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (Nielsen,H., et a , 1997) montre que cette 004/033689
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protéine possède une séquence signal C-terminale avec un site de coupure prédit entre les positions 30 et 31 (QSA/QA). On peut prédire que cette protéine est extra-cellulaire. Elle pourrait, en temps que glycosyl-hydrolase, avoir un rôle dans la réactivation de la spiramycine inactivé par glycosylation par les glycosyl-transferases GimA et/ou GimB (Gourmelen et al, 1998).
Le gène orβOc code une protéine présentant une identité de 31% (déterminée grâce au programme BLAST) avec une epimérase de sucre-nucléoside-diphosphate de Corynebacterium glutamicum (Numéro d'accès GenBank : NP 600590, Score BLAST : . 89). Cette similitude suggère que le gène orβOc code une epimérase. Cette hypothèse est étayée par le fait qu'une analyse de la séquences grâce au programme CD-search (cf. ci- dessus) suggère également que le gène orβOc code une epimérase.
VorβOc présente deux codons d'initiations possibles (cf. SEQ ID N° 115) qui donnent deux protéines possibles de 345 et 282 acides aminés respectivement (SEQ ID N° 116 et 117). Toutefois, l'usage des codons est typique de Streptomyces seulement à 'J/' partir du deuxième ATG de plus, la séquence protéique déduite de la séquence entre le | premier ATG et le deuxième né s'alite pas avec les séquences proches identifiées,' l,|| alors que la séquence protéique la plus courte (à partir du 2eme ATG : SEQ ID N° 144) s'aligne bien avec le début de ces protéines. On peut donc en déduire que le deuxième ATG est le bon codon d'initiation et que la séquence de cet orf est donc celui présenté en SEQ ID N° 143 qui une fois traduit corespond à la protéine de séquence SEQ ID N° 144.
Le gène orβl code une protéine présentant une identité de 52% (déterminée grâce au programme BLAST) avec une oxidoréductase chez Streptomyces coelicolor (Numéro d'accès GenBank : NP_631148, Score BLAST : 261). Cette similitude suggère que le gène orβl code une réductase. Cette hypothèse est étayée par le fait qu'une analyse de la séquences grâce au programme CD-search (cf. ci-dessus) suggère également que le gène orβl code une réductase. Cette hypothèse est également étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβl présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 36).
Tableau 36
* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé 5 (Altschul et al, 1990).
L'inactivation du gène orβl a été réalisée. Il a pu ainsi être montré que la souche • résultante ne produit plus de spiramycines. Ceci confirme que le gène orβl est bien - impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. L'enzyme codée par ce gène est donc g bien responsable d'une étape de bioconvérsiori essentielle à la biosynthèse des ? . 10 spiramycines.
La séquence d,orβ2c a tout d'abord été déterminée de manière partielle (cf. exemple 19), puisque la séquence codante en 5' n'a été déterminée que dans un second temps. La séquence partielle de cette orf (SEQ ID N° 120) a néanmoins été utilisée pour l'analyse avec les différents programmes informatiques comme expliqué ci-dessus. Il a
15 ainsi pu être déterminé que le gène orβ2c code une protéine présentant une identité de 47% sur la séquence déterminée (SEQ ID N° 121, qui est la séquence partielle de la protéine Orf32c) (déterminée grâce au programme BLAST) avec une protéine régulatrice de la famille GntR chez Streptomyces coelicolor (Numéro d'accès GenBank : NP_625576, Score BLAST : 229). Cette similitude suggère que le gène orβ2c code un
20 régulateur transcriptionel de la famille GntR. Cette hypothèse est étayée par le fait que la 73
protéine codée par le gène orβ2c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes.
La séquence partielle LVorβ2c a été complétée par la suite et la région manquante a été déterminée (cf. SEQ ID N° 140 et SEQ ID N° 145). La séquence complète de cette orf code une protéine présentant une identité de 44% (déterminée grâce au programme
BLAST) avec une protéine régulatrice de la famille GntR chez Streptomyces avermitilis (Numéro d'accès GenBank : NP_824604, Score BLAST : 282). Cette similitude suggère que le gène orβ2c code un régulateur transcriptionel de la famille GntR. Cette hypothèse est étayée par le fait que la protéine codée par le gène orβ2c présente une forte similitude avec d'autres protéines de fonction similaire chez d'autres organismes (cf. tableau 37).
Tableau 37
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* une plus grande similitude de séquence est associée à un score BLAST plus élevé (Altschul et al, 1990).
L'inactivation du gène orβ2c a été réalisée dans le but d'étudier la fonction de ce gène dans la voie de biosynthèse des spiramycines chez Streptomyces ambofaciens. Il a pu être montré que la souche résultante produit des spiramycines. Ceci indique que le gène orβ2c n'est pas essentiel à la biosynthèse des spiramycines et qu'il n'est pas essentiel à la survie de la bactérie.
Le gène orβ 3 code une protéine présentant une identité de 49% (déterminée grâc X au programme BLAST) avec une protéine hypothétique de Xanthomonas campestris (Numéro d'accès GenBank : NP_635564, Score BLAST : 54).
La séquence d,orβ4c est partielle. En effet, les comparaisons effectuées entre le produit de cette orf et les banques de données suggèrent que la partie C-terminale de cette protéine n'est pas dans le produit déduit de la séquence nucléotidique et donc que } cette orf serait plus longue et continuerait en dehors de la région séquencée. La séquence <.'ii;f partielle de cette ORF a néanmoins été utilisée pour l'analyse avec les différerifs H programmes informatiques comme expliqué ci-dessus. Il a ainsi pu être déterminé que le '" -V< gène orβ 4c code une protéine présentant une identité de 91% sur la séquence déterminée (SEQ ID N° 150, qui est la séquence partielle de la protéine Orf34c) (déterminée grâce au programme BLAST) avec une arabinofuranosidase de chez . Streptomyces coelicolor (Bentley et al, 2002; Numéro d'accès GenBank : NP_630049, Score BLAST : 654). Chez S. coelicolor le gène codant cette arabinofuranosidase ne semble pas impliqué dans la biosynthèse de métabolite secondaire. Chez S. ambofaciens, ce gène n'est donc probablement pas impliqué dans la biosynthèse de spiramycine.
La présente invention a également pour objet des polynucléotides s'hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence à au moins l'un des polynucléotides de séquence SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30,
34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109,
111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. Préférentiellement, cesdit polynucléotides sont isolés à partir d'une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines impliquées dans la biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces polynucléotides codent une protéine ayant une activité similaire à la protéine codée par les polynucléotides avec lesquels ils s'hybrident. Les conditions d'hybridation de forte stringence peuvent être définies comme des conditions d'hybridation défavorisant l'hybridation de brins d'acides nucléiques non homologues. Des conditions d'hybridations de forte stringence peuvent être par exemple décrites comme des : ..; conditions d'hybridation dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) à une température comprise entre 55°C et 65°C, de manière préférée la température d'hyridation est de 55°C, de manière encore plus préférée la températue
0.5X SSC à une température comprise entre 55°C et 65°C, de manière préférée cette température est de 55°C, de manière encore plus préférée cette températue est de 60°C et de manière tout à fait préférée cette température est de 65°C. Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'ouvrage de F.Ausubel et al, 2002.
L'invention concerne également un polynucléotide ayant au moins 70%, de façon plus préférée 80%, de façon plus préférée 85%, de façon encore plus préférée 90%, de façon encore plus préférée 95% et de manière tout à fait préférée 98% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide comprenant au moins 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique, ou un polynucléotide de séquence complémentaire. Préférentiellement, ces dits polynucléotides sont isolés à partir d'une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines impliquées dans la biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces polynucléotides codent des protéines ayant des activités similaires aux protéines codées par les polynucléotides avec lesquels ils présentent l'identité. De façon tout à fait préférée, un polynucléotide selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, , ' ? 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou w | polynucléotide de séquence mpl*èmèntaire. '-ïfi'%
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus, par exemple ceux du package FASTA (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être déterminé à l'aide du logiciel LFASTA (Chao K.-M. et al., 1992) ou LALIGN (Huang X. et Miller W., 1991). Les programmes LFASTA et LALIGN font partie du package FASTA. LALIGN retourne les alignements locaux optimaux : ce programme est plus rigoureux, mais aussi plus lent que LFASTA.
Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide résultant de l'expression d'une séquence d'acide nucléique telle que définie ci-dessus. Préférentiellement, les polypeptides selon l'invention présentent au moins 70%, de façon plus préférée 80%, de façon plus préférée 85%, de façon encore plus préférée 90%, de façon encore plus préférée 95% et de manière tout à fait préférée 98% d'identité en acides aminés avec un polypeptide comprenant au moins 10, 15, 20, 30 à 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 ou 640 acides aminés consécutifs d'un polypeptide ' choisi parmi SEQ ID N° 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, • 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 et 150, ou l'une de ces séquences excepté que tout au long de ladite séquence un ou H;/;, plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles ou l'un des variant de ces séquences. Préférentiellement les polypeptides selon l'invention sont exprimés à l'état naturel par une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polypeptides sont impliqués dans la biosynthèse d'un macrolide et encore plus préférentiellement, ces polypeptides ont une
65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 et 150, ou l'une de ces séquences excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés sans en affecter les propriétés fonctionnelles ou l'un des variant de ces séquences. De façon tout à fait préférée, un polypeptide selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des séquences polypeptidiques SEQ ID N° 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 et 150.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus, par exemple ceux du package FASTA (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être déterminé à l'aide du logiciel LFASTA (Chao K.-M. et a , 1992) ou LALIGN (Huang X. et Miller W., 1991), en utilisant les paramètres par défaut tel que défini par le centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France. Les programmes LFASTA et LALIGN font partie du package FASTA. LALIGN retourne les alignements locaux optimaux : ce programme est plus rigoureux, mais aussi plus lent que LFASTA.
Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant comprenant au moins un polynucléotide tel que décrit ci-dessus. Préférentiellement ; cet ADN recombinant est un vecteur. Encore plus préférentiellement, le vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, , les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ou les PAC (Pl-derived Artificial Chromosome). A titre illustratif on peut citer comme , bactériophages le phage lambda et le phage M13. Comme plasmides on peut citer les ; plasmides se répliquant chez E. coli pμr exemple pBR322 et ses dérivés, pUC18 et ses ;ij , dérivés, pUC19 et ses dérivés, pGB2 et ses dérivés (Churchward G. et al, 1984), ρACYC177 (numéro d'accès GenBank : X06402) et ses dérivés, ρACYC184 (numéro d'accès GenBank : X06403) et ses dérivés. On peut également citer les plasmides se répliquant chez Streptomyces comme par exemple pIJlOl et ses dérivés, pSG5 et ses dérivés, SLP1 et ses dérivés, SCP2* et ses dérivés (Kieser et al. 2000). Comme phagemides on peut citer à titre illustratif pBluescript II et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), pGEM-T et ses dérivés (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)), λZAPII et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)). Comme vecteurs intégratifs on peut citer à titre illustratif, les vecteurs intégratifs chez Streptomyces comme par exemple ceux dérivés de SLP1 (Kieser et al, 2000), ceux dérivés de pSAM2 (Kieser et al, 2000), les vecteurs utilisant les systèmes d'intégration des phages PhiC31 (Kieser et al, 2000) (par exemple pSET152 (Bierman et al, 1992)) ou de VWB (Van Mellaert L, et al. 1998), ainsi que les vecteurs utilisant le système d'intégration de IS117 (Kieser et al. 2000). Comme fosmides on peut citer à titre illustratif le fosmide pFOSl (commercialisé par la société New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) et ses dérivés. Comme cosmides on peut citer à titre illustratif le cosmide SuperCos et ses dérivés (commercialisés notamment par la
5 société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), le cosmide pWED 15 (Wahl et al, 1987) et ses dérivés. Comme vecteurs navettes on peut citer à titre illustratif les plasmides navettes E.. coli I Streptomyces comme par exemple pIJ903 et ses dérivés, la série des plasmides pUWL, pC AO 106, ρWHM3 , pO 446 et leurs dérivés (Kieser et al. 2000), les BAC navettes E. coli I Streptomyces comme par exemple ceux décrits dans la demande ;•
10 de brevet WO 01/40497. Comme BAC (Bacterial Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le BAC pBeloBACl l (numéro d'accès GenBank :U51113). Comme PAC (Pl-derived Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le vecteur pCYPACό (numéro d'accès GenBank : AF133437). De façon tout à fait préférée, un i vecteur selon l'invention est choisi parmi ρOS49.1, pOS49.11, ρOSC49.12, ρOS49.14, :;
15 pOS49.16, pOS49.28, pOS44.1, pOS44.2, pOS44.4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67,H
• m pOS49.88, pOS49.106, pOS49.120, pOS49.107, pOS49.32, pOS49.43, pOS49.44j |
, } -.).. pOS49.50, pO$49.99, pSPM17, ; SPM21; #3PM502, pSPM504, pSPM507, pSPM50ffj§ pSPM509, pSPMl, pBXLll l l, pBXL1112, pBXL1113, pSPM520, pSPM52Ï, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35,
20 pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74, pSPM75, pSPM79, pSPM83, pSPM107, pSPM543 et pSPM106.
Un autre aspect de l'invention concerne un système d'expression comprenant un 25 vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides tels que décrits ci-dessus dans un système biologique. Les vecteurs d'expression selon l'invention comprennent une séquence d'acide nucléique codant un ou plusieurs polypeptides tels que décrits ci-dessus et peuvent être destinés à l'expression des différents polypeptides selon l'invention dans diverses cellules hôtes 30 bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer les systèmes d'expression procaryote comme les systèmes d'expression chez la bactérie E. coli, les sytèmes d'expression eucaryotes, comme le système d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de levures, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de mammifères, notamment des cellules humaines. Les vecteurs d'expression utilisables dans de tels systèmes sont bien connus de l'homme du métier, en ce qui concerne les cellules procaryotes, on peut citer à titre illustratif les vecteurs d'expression chez E. coli par exemple, de la famille pΕT . commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), les vecteurs de la i ;; famille GATEWAY commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pBAD commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pMAL commercialisés par la société New England Bioloabs Inc. (Beverly, Massachussetts, USA), les vecteurs d'expression inductibles par le rhamnose cités dans la publication Wilms B et al, 2001 et leurs dérivés, on peut également citer les vecteurs d'expression chez Streptomyces ;!; comme par exemple les vecteurs ρIJ4123, pIJ6021, pPM927, ρANT849, pANT 850. - X pANT 851, ρANT1200, pANT1201, pANT1202 et leurs dérivés (Kieser et al, 2000). ;|jJ En ce qui concerne les cellules de levures, on peut citer à titre illustratif le vecteur pESC commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). En ce qui concerne le système d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes on peut citer à titre illustratif le vecteur BacPAK6 commercialisé par la société BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, Californie, USA). En ce qui concerne les cellules de mammifères, on peut citer à titre illustratif des vecteurs comprenant le promoteur des gènes précoces du virus CMV (Cytomegalovirus) (par exemple le vecteur pCMV et ses dérivés commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), ou le promoteur des gènes immédiats (S V40 early promoter) du virus simien vacuolisant SV40 (par exemple le vecteur pSG5 commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA).
L'invention est également relative à un procédé de production d'un polypeptide tel que décrit ci-dessus ledit procédé comprenant les étapes suivantes: 004/033689
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a) insérer un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié
b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a) ;
c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, par exemple par sonication ou par choc osmotique ;
d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ;
e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans FΛusubel et al (2002). On peut citer à titre illustratif la technique du « Tag-Histidine », qui consiste à ajouter une courte séquence poly-histidine au polypeptide à produire, ce dernier pouvant ensuite être; purifié sur colonne de nickel. Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques de synthèse in vitro. A titre illustratif de telles techniques, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé grâce au système « rapid translation System (RTS)», commercialisé notamment par la société Roche Diagnostics France S.A, Meylan, France.
Un autre aspect de l'invention concerne des cellules hôtes dans laquelle a été introduit au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'invention.
Un autre aspect de l'invention concerne des microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse d'au moins un macrolide. L'intérêt réside d'une part dans l'étude de la fonction des protéines mutées et d'autre part dans la réalisation de microorganismes produisant des intermédiaires de biosynthèse. Ces intermédiaires peuvent être modifiés, éventuellement après séparation, soit par ajout de composants particuliers dans les milieux de production, soit par introduction dans les microorganismes ainsi mutés d'autres gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat. Ces intermédiaires peuvent ainsi être modifiés par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique. Les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides peuvent être obtenus en inactivant la fonction d'une ou plusieurs protéines impliquées dans la biosynthèse de ce ou de ces macrolides dans des microorganismes producteurs de ce ou de ces macrolide. Selon la ou les protéines inactivées, on pourra ainsi obtenir : , des microorganismes bloqués dans les différentes étapes de la voie de biosynthèse de ce ou de ces macrolides. L'inactivation de cette ou de ces protéines peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par mutagénese dans le ou les gènes codant ladite ou lesdites protéines ou par l'expression d'un ou de plusieurs ARN anti-sens complémentaires de l'ARN ou des ARN messagers codant ladite ou lesdites protéines. La mutagénese peut, par exemple, être effectuée par irradiation, par i action d'agent chimique mutagène, par mutagénese dirigée, par remplacement de gène, ]; ,: ou toute autre méthode connue *' j'Êomme du métier. Les conditions convenables'^ d'une telle mutagénese peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans les ouvrages de Kieser, T et al (2000) et Ausubel et al., (2002). La mutagénese peut être effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique. Cette mutagénese peut être effectuée dans un gène comprenant une séquence telle que décrite ci-dessus. Préférentiellement, les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides sont des bactéries du genre Streptomyces. Plus préférentiellement, l'inactivation de la fonction d'une ou plusieurs protéines impliquées dans la biosynthèse du ou des macrolides en question est effectuée par mutagénese. Encore plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches de S. ambofaciens. Plus préférentiellement, la mutagénese est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149. De façon préférée, la ou les mutagénèses sont effectuées par inactivation génique. De façon tout à fait préférée, la mutagénese consiste en l'inactivation génique d'un gène comprenant une séquence correspondant à la séquence SEQ BD N° 13.
A titre illustratif, les microorganismes suivants peuvent être cités à titre d'exemple de tels microorganismes : OS49.16 (orβ:: Ωhyg, cf. exemple 2), OS49.67 (orβdélétion en phase, cf. exemple 6), OS49.107 (orβ:: Ωhyg, cf. exemple 7), OS49.50 (orfl 0:: Ωhyg, cf. exemple 8), SPM21 (orβ::att3Ωaac-, cf. exemple 10), SPM22 (orβ::att3 délétion en phase, cf. exemple 10), SPM501 (orfό*::attlΩhyg+, cf. exemple 14), SPM502 (orfό*::attl délétion en phase, cf. exemple 14), SPM507 . (orfl2::att3Ωaac-, cf. exemple 11), SPM508 (orfl3c::att3Ωaac-, cf. exemple 12), SPM509 (orfl4::att3Ωaac-, cf. exemple 13), SPM107 (orβ8c::att3aac+, cf. exemple ; 29), SPM543 (orβl::att3aac+, cf. exemple 30), SPM106 (orβ2c::att3aac+, cf. exemple 31). '. Èà
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse de macrolide utilisant les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides, tels que décrits ci-dessus. Le procédé consiste à cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme bloqué dans une étape de la voie de biosynthèse de macrolides, tels que décrits ci-dessus, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, par exemple par sonication ou par choc osmotique, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente, ledit intermédiaire de biosynthèse. Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al, 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. (2000) en ce qui concerne la culture des Streptomyces. L'intermédiaire produit peut être récupéré par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une molécule dérivée d'un macrolide utilisant les microorganismes bloqués dans une étape de la voie de biosynthèse de ce macrolide, tels que décrits ci-dessus. Le procédé consiste à obtenir un intermédiaire de biosynthèse selon le procédé ci-dessus et à modifier l'intermédiaire ainsi produit, éventuellement après séparation du milieu de culture. Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al, 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. Les intermédiaires produits peuvent être modifiés, éventuellement après séparation, soit par ajout de composants appropriés dans les milieux de production, soit par introductiph dans les microorganismes d'autres gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat. Ces intermédiaires peuvent ainsi être modifiés par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique. Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches de S. ambofaciens.
L'invention est également relative à un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III. Ce microorganisme comprend l'ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de la spiramycine I mais ne produit pas de spiramycine II et III car le gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N° 14 ou l'un de ses variants n'est pas exprimé ou a été rendu inactif. L'inactivation de cette protéine peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par mutagénese dans le gène codant ladite protéine ou par l'expression d'un ARN anti-sens complémentaire de l'ARN messager codant ladite protéine, étant entendu que si l'expression de orβ* est affectée par cette manipulation, il sera nécessaire de procéder à une autre modification pour que le gène orβ* soit correctement exprimé. La mutagénese peut être effectuée dans la séquence codante ou dans une séquence non codante de manière à rendre inactive la protéine eodée ou à en empêcher son expression ou sa traduction. La mutagénese peut être effectuée par mutagénese dirigée, par remplacement de gène ou toute autre méthode connue de l'homme du métier. Les conditions convenables d'une telle mutagénese peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans les ouvrages de Kieser, T et al (2000) et Ausubel et al, 2002. La mutagénese peut être effectuée in vitro ou in situ, par suppression, substitution, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le gène considéré ou par inactivation génique. Le microorganisme peut être également obtenu en exprimant les gènes de la, voie de biosynthèse de la spiramycine sans que ceux-ci ne comprennent le gène comprenant la séquence SEQ ID N° 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du X code génétique et codant un .x poxly-pe .pt •id • e. de . s -éque .n.c •e.-•= S-E -Q , LD . N . ° . - 14 ou . l'un de s xésW' variants. Préférentiellement, le microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces. Plus préférentiellement, le microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III est obtenu à partir d'un microorganisme de départ produisant les spiramycines I, II et III. Encore plus préférentiellement, le microorganisme est obtenu par mutagénese dans un gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N° 14 ou l'un de ses variants ayant la même fonction. Encore plus préférentiellement, cette mutagénese est effectuée par inactivation génique. De manière préférée le microorganisme est obtenu à partir d'une souche de S. ambofaciens produisant les spiramycines I, II et III dans laquelle est effectuée une inactivation génique du gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. De manière tout à fait préférée, l'inactivation génique est effectuée par délétion en phase du gène ou d'une partie du gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. A titre illustratif, la souche SPM502 (orfό*::attl, cf. exemple 14) peut être citée comme un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III.
L'invention est également relative à un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce en ce qu'il surexprime en outre : - un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, plus préférentiellement il s'agit du gène de séquence codante SEQ ID N° 141, .:
- ou un gène dérivé de ceux-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. ; -ffë
Un exemple de séquence d'un tel gène est donné en SEQ ID N° 111 (ADN), cependant cette séquence est partielle puisqu'elle ne comprend pas la partie 3' de la séquence codante correspondante. La traduction en protéine de cette partie de séquence codante est donnée en SEQ ID N° 112. L'homme du métier pourra aisément la compléter notamment en utilisant l'enseignement présenté dans l'exemple 24. La séquence indéterminée dans SEQ ID N° 111 a été déterminée dans un second temps et la séquence complète de cette orf (orβ 8c) est donnée en SEQ ID N° 141. La traduction en protéine de cette séquence codante est donnée en SEQ ID N° 142. Il est présenté dans l'exemple 24 une méthode pour cloner le gène orβ8c et pour fabriquer un vecteur d'expression permettant l'expression de orβ 8c. Il est également montré dans cet exemple que la surexpression du gène orβ8c dans la souche OSC2 conduit à l'amélioration de la production en spiramycines de cette souche. La surexpression du gène orβ8c peut être obtenue en augmentant le nombre de copies de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. De façon préférée, la surexpression dudit gène est obtenue en apportant dans le microorganisme une construction d'ADN recombinant, permettant la surexpression de ce gène. De façon préférée, cette construction d'ADN recombinant augmente le nombre de copie dudit gène et permet d'obtenir une surexpression dudit gène. Dans cette construction d'ADN recombinant, la séquence codante du gène peut être placée sous le contrôle d'un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. On peut citer à titre d'illustration le promoteur ptrc actif chez Streptomyces ambofaciens (Amann, E. et al, 1988) ainsi que le promoteur ermE*. Ainsi, de façon préférée, la ou les copies du gène orβ8c apportée sont placées sous le contrôle du promoteur ermE* comme c'est le cas dans la construction pSPM75 (cf. exemple 24).
L'invention est également relative à un microorganisme produisant de la \; spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce en ce qu'il surexprime en outre le gène de séquence codante SEQ ID N° 47 ou d'une séquence codante dérivée de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. Préférentiellement, ce microorganisme est caractérisé en ce qu'il s'aj^ de la souche SPM502 pSPM525 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 26 février 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-2977.
L'invention est également relative à un procédé de production de spiramycine I, le procédé consiste à cultiver dans un milieu de culture approprié un microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de spiramycine II et III tel que décrit ci-dessus, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente la spiramycine I. Les conditions de culture de tel microorganisme pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al, 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. La spiramycine I produite peut être récupérée par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'invention pour améliorer la production en macrolides d'un microorganisme. Ainsi, l'invention concerne un microorganisme mutant producteur de macrolide caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique dans au moins un gèήè ]'-' comprenant une séquence telle que définie ci-dessus et/ou qu'elle surexprime au moins un gène comprenant une séquence telle que définie ci-dessus. La modification génétique peut consister en une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés dans le but d'exprimer une ou des '-. : protéines ayant une activité supérieure ou d'exprimer un niveau plus élevé de cette ou de ''-i ces protéines. La surexpression du gène considéré peut être obtenue en augmentant le g; nombre de copies de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le prompteur
• ' - - ."'.î'H'i-Wiu'* sauvage. On peut citer à titre d'illustration le promoteur ptrc actif chez Streptomyces ' ambofaciens (Amann, E. et al, 1988) ainsi que le promoteur ermE* (Bibb et al, 1985),
(Bibb et al, 1994). Ainsi la surexpression du gène considéré peut être obtenue en apportant dans un microorganisme producteur du macrolide considéré une construction d'ADN recombinant selon l'invention, permettant la surexpression de ce gène. En effet, certaines étapes de la biosynthèse des macrolides sont limitantes et si l'on exprime une ou plusieurs protéines plus actives ou un niveau d'expression plus important de la ou des protéines sauvages impliquées dans ces étapes limitantes, on peut améliorer la production du ou des macrolides concernés. Une augmentation du taux de production de la tylosine a par exemple été obtenue chez Streptomyces fradiae par duplication du gène codant une methyl transférase limitante convertissant la macrocine en tylosine (Baltz R, 1997). L'obtention de l'expression d'une protéine plus active peut être obtenue notamment par mutagénese, l'homme du métier pourra par exemple se référer à ce sujet à l'ouvrage de F.Ausubel et al (2002). Préférentiellement, ces microorganismes mutants améliorés pour leur production en macrolides sont des bactéries du genre Streptomyces. Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes dans lesquels sont effectuées la ou les mutagénèses sont des souches de S. ambofaciens. Plus préférentiellement, la modification génétique est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences . dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. De façon ' préférée, le microorganisme surexprime un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou : l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la . dégénérescence du code génétique. De façon préférée, le microorganisme surexprime le gène comprenant une séquence correspondant à SEQ ID N° 111 ou 141, ou l'un de ses % variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence μj|$jj code génétique. La séquence donnée en SEQ ID N° 111 est partielle, cependant l'homme du métier pourra aisément la compléter notamment en utilisant l'enseignement présenté dans l'exemple 24. La séquence indéterminée dans SEQ ID N° 111 a été déterminée dans un second temps et la séquence complète de cette orf (orβ8c) est donnée en SEQ ID N° 141. La traduction en protéine de cette séquence codante est donnée en SEQ ID N° 142. Il est ainsi présenté l'exemple 24 une méthode pour cloner le gène orβ8c et pour fabriquer un vecteur d'expression permettant l'expression de orβ8c. II est également montré dans cet exemple que la surexpression du gène orβ8c dans la souche OSC2 conduit à l'amélioration de la production en spiramycines de cette souche. La surexpression du gène orβ8c peut être obtenue en augmentant le nombre de copies de ce gène et/ou en plaçant un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. De façon préférée, la surexpression du gène orβ8c est obtenue en apportant dans le microorganisme une construction d'ADN recombinant, permettant la surexpression de ce gène. De façon préférée, cette construction d'ADN recombinant augmente le nombre de copie du gène orβ 8c et permet d'obtenir une surexpression du gène orβ 8c. Dans cette construction d'ADN recombinant, la séquence codante de orβ 8c peut être placée sous le contrôle d'un promoteur plus actif que le promoteur sauvage. On peut citer à titre d'illustration le promoteur ptrc actif chez Streptomyces ambofaciens (Amann, E. et al, 1988) ainsi que le promoteur ermE*. Ainsi, de façon préférée, la ou les copies du gène orβ8c apportée sont placées sous le contrôle du promoteur ermE* comme c'est le cas dans la construction pSPM75 (cf. exemple 24).
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production de macrolides utilisant les microorganismes décrits au paragraphe précédent. Ce procédé consiste à cultiver dans un milieu de culture approprié un microorganisme défini dans le paragraphe précédent, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait • '. cellulaire obtenu à l'étape précédente le ou les macrolides produits. Les conditions de X ' culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien t in¬ connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le miliéfrj I MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces 'X ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. Le ou les macrolides produits peuvent être récupérés par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet. Préférentiellement, les microorganismes utilisés dans un tel procédé sont des bactéries du genre Streptomyces. Plus préférentiellement, le macrolide en question est la spiramycine et les microorganismes mutants améliorés pour leur production en spiramycines sont des souches de S. ambofaciens.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence et/ou d'un vecteur selon l'invention pour la préparation d'antibiotiques hybrides. En effet, les 004/033689
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polynucléotides selon l'invention peuvent servir à l'obtention de microorganismes exprimant une ou plusieurs protéines mutantes donnant lieu à une modification dans la spécificité du substrat ou encore être exprimés dans de multiples microorganismes producteurs d'antibiotiques dans le but de générer des antibiotiques hybrides. Ainsi les polynucléotides selon l'invention peuvent permettre, par transfert des gènes entre mieroorganismes producteurs, de fabriquer des antibiotiques hybrides ayant des propriétés pharmacologiquement intéressantes (Hopwood et al, 1985a, Hopwood et al, 1985b, Hutchinson et α/.,1989). Le principe par lequel l'ingénierie génétique peut conduire à la production d'antibiotiques hybrides a été tout d'abord proposé par ' Hopwood (Hopwood 1981). Il a ainsi été proposé que les enzymes participant à la biosynthèse d'antibiotiques acceptent souvent des substrats reliés structurellement, mais différents de leur substrat naturel. Il est généralement admis (Hopwood 1981, Hutchinson 1988, Robinson 1988) que les enzymes codées par les gènes de la voie de biosynthèse d'antibiotiques ont une spécificité de substrat moins stricte que les enzymes
(Hutchinson 1988). En utilisant cet enseignement, l'homme du métier pourra construire des microorganismes exprimant une ou plusieurs protéines mutantes donnant lieu à une modification dans la spécificité du substrat dans le but de générer des antibiotiques hybrides.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un polypeptide et/ou au moins une cellule hôte selon l'invention pour réaliser une ou plusieurs bioconversions. Ainsi l'invention permet de construire des souches bactériennes ou fongiques dans lesquelles on exprime, sous le contrôle de signaux d'expression appropriés, une ou plusieurs protéines selon l'invention. De telles souches peuvent alors être utilisées pour réaliser une ou des bioconversions. Ces bioconversions peuvent se faire soit à l'aide de cellules entières, soit à l'aide d'extraits acellulaires des dites cellules. Ces bioconversions peuvent permettre de transformer une molécule en une forme dérivée, avec une enzyme d'une voie de biosynthèse. Par exemple, Carreras et al. décrit l'utilisation de souche de Saccharopolyspora erythraea et de Streptomyces coelicolor pour la production de nouveau dérivés d'érithromycines (Carreras et al, 2002). Walczar et al. décrit l'utilisation d'une P450 mono-oxygénase de Streptomyces pour la bioconversion de désacétyladriamycine (un analogue de l'anthracycline) en de nouvelles anthracyclines (Walczar et al., 2001). Olonao et al. décrit l'utilisation d'une souche de Streptomyces lividans modifiée pour la bioconversion de rhodomycinone- epsilon en rhodomycine D (Olonao et al, 1999). L'homme du métier pourra appliquer ce principe à tout intermédiaire de biosynthèse.
L'invention concerne également un ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend :
- un polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, plus préférentiellement il s'agit d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N° 141,
- ou un fragment d'au moins 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490 ou 1500 nucléotides consécutifs de ces polynucléotides. Préférentiellement ; cet ADN recombinant est un vecteur. Encore plus préférentiellement, le vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ou les PAC (Pl-derived Artificial Chromosome). A titre illustratif on peut citer comme bactériophages le phage lambda et le phage Ml 3. Comme plasmides on peut citer les plasmides se répliquant chez E. coli par exemple pBR322 et ses dérivés, pUC18 et ses dérivés, pUC19 et ses dérivés, ρGB2 et ses dérivés (Churchward G. et al, 1984), pACYC177 (numéro d'accès GenBank : X06402) et ses dérivés, ρACYC184 (numéro d'accès GenBank : X06403) et ses dérivés. On peut également citer les plasmides se répliquant chez Streptomyces comme par exemple pIJlOl et ses dérivés, pSG5 et ses dérivés, SLP1 et ses dérivés, SCP2* et ses dérivés (Kieser et al. 2000). Comme phagemides on peut citer à titre illustratif pBluescript II et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJ©lla, Californie, USA)), pGEM-T et ses dérivés (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)), λZAPII et ses dérivés (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)). Comme vecteurs intégratifs on peut citer à titre illustratif, les vecteurs intégratifs ;' ' '.}> chez Streptomyces comme par exemple ceux dérivés de SLP1 (Kieser et al, 2000), ceux dérivés de pSAM2 (Kieser et al, 2000), les vecteurs utilisant les systèmes d'intégration des phages PhiC31 (Kieser et al, 2000) (par exemple pSET152 (Bierman et al, 1992)) ou de VWB (Van Mellaert L, et al 1998), ainsi que les vecteurs utilisant le système d'intégration de IS117 (Kieser et al. 2000). Comme fosmides on peut citer à titre illustratif le fosmide pFOSl (commercialisé par la société New England Bioloabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) et ses dérivés. ':"-' β Comme cosmides on peut citer à titre illustratif le cosmide SuperCos et ses dérivés ι •:•; ^ k (commercialisés notamment par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)), le cosmide pWED15 (Wahl et al, 1987) et ses dérivés. Comme vecteurs navettes on peut citer à titre illustratif les plasmides navettes E. coli I Streptomyces comme par exemple pIJ903 et ses dérivés, la série des plasmides pUWL, pCAO106, pWHM3, pOJ446 et leurs dérivés (Kieser et al 2000), les BAC navettes E. coli I Streptomyces comme par exemple ceux décrits dans la demande de brevet WO 01/40497. Comme BAC (Bacterial Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le BAC pBeloBACU (numéro d'accès GenBank :U51113). Comme PAC (Pl-derived Artificial Chromosome) on peut citer à titre illustratif le vecteur pCYPAC6 (numéro d'accès GenBank : AF 133437). Plus préférentiellement, cet ADN recombinant est un vecteur d'expression. Les vecteurs d'expression utilisables dans différents systèmes d'expression sont bien connus de l'homme du métier, en ce qui concerne les cellules procaryotes, on peut citer à titre illustratif les vecteurs d'expression chez E. coli par exemple, de la famille pET commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), les vecteurs de la famille GATEWAY commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pBAD commercialisés par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA), les vecteurs de la famille pMAL commercialisés par la société New England Bioloabs Inc. (Beverly, Massachussetts, USA)/ les vecteurs d'expression inductibles par le rhamnose cités dans la publication Wilms B et al, 2001 et leurs dérivés, on peut également citer les vecteurs d'expression chez Streptomyces comme par exemple les vecteurs pIJ4123, pIJ6021, pPM927, pANT849, pANT 850, pANT 851, pANT1200, pANT1201, pANT1202 et leurs dérivés (Kieser et al, 2000). En ce qui concerne les cellules de levures, on peut citer à titre illustratif le vecteur pESC commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). En ce qui concerne le système d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes on peut citer à titre illustratif le vecteur BacPAK6 commercialisé par la société BD Biosciences Clontech, (Palo Alto, Californie, USA). En ce qui concerne les cellules de mammifères, on peut citer à titre illustratif des vecteurs comprenant le promoteur des gênés précoces du virus CMV (Cytomegalovirus) (par exemple le vecteur pCMV et ;= • ses dérivés commercialisés par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA), ou le promoteur des gènes immédiats (SV40 early promoter) du virus simien vacuolisant SV40 (par exemple le vecteur pSG5 commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). Un autre aspect de l'invention concerne des cellules hôtes dans laquelle a été introduit au moins un ADN recombinant décrit dans ce paragraphe.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production d'un polypeptide caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a) transformer une cellule hôte par au moins un vecteur d'expression tel que décrit dans le paragraphe ci-dessus; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; 004/033689
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e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Le polypeptide recombinant ainsi produit peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F. Ausubel et al (2002). On peut citer à titre illustratif la technique du « Tag-Histidine », qui consiste à ajouter une courte séquence poly-histidine au p lypeptide à produire, ce dernier pouvant ensuite être purifié sur colonne de nickel. Ce polypeptide peut également être préparé par les techniques de synthèse in vitro. A titre illustratif de telles techniques, le polypeptide , pourra être préparé grâce au système « rapid translation System (RTS)», commercialisé notamment par la société Roche Diagnostics France S.A, Meylan, France.
Un autre aspect de l'invention concerne un microorganisme producteur d'au moins une spiramycine caractérisé en ce qu'il surexprime :
-un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' '. AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) GGATCCCGCGACGOACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, plus préférentiellement il s'agit du gène de séquence codante SEQ ID N° 141, - ou un gène dérivé de ceux-ci en raison de la dégénérescence du code génétique. Un exemple de séquence d'un tel gène est donné en SEQ ID N° 111 (ADN), cependant cette séquence est partielle puisqu'elle ne comprend pas la partie 3' de la séquence codante correspondante. La traduction en protéine de cette partie de séquence codante est donnée en SEQ ID N° 112. L'homme du métier pourra aisément la compléter notamment en utilisant l'enseignement présenté dans l'exemple 24. Il est ainsi présenté dans cet exemple une méthode pour cloner le gène orβ8c et pour fabriquer un vecteur d'expression permettant l'expression de orβ 8c. Il est également montré dans cet exemple que la surexpression du gène orβ8c dans la souche OSC2 conduit à l'amélioration de la production en spiramycines de cette souche. De façon préférée, le microorganisme surexprimant - un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, plus préférentiellement il s'agit du gène d© séquence codante SEQ ID N° 141,
- ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique est une bactérie du genre Streptomyces, de manière encore plus préférée, il s'agit d'une bactérie de l'espèce Streptomyces ambofaciens. De façon préférée, la surexpression dudit gène est obtenue par transformation dudit microorganisme par un vecteur d'expression, de manière tout à fait préféré, la souche de microorganisme est la souche OSC2/pSPM75(l) ou de la souche OSC2/pSPM75(2) déposée auprès de la Collection
spiramycine(s) utilisant les micrόorganismes décrits au paragraphe précédent. Ce'?;?: procédé consiste à cultiver dans un milieu de culture approprié un microorganisme défini dans le paragraphe précédent, récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape précédente le ou les spiramycines produites. Les conditions de culture de tels microorganismes pourront être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Le milieu de culture pourra par exemple être le milieu MP5 ou le milieu SL11 pour les Streptomyces et notamment pour Streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). L'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage de Kieser et al. 2000 en ce qui concerne la culture des Streptomyces. Le ou les spiramycines produites peuvent être récupérés par toutes techniques connues de l'homme du métier. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, aux techniques enseignées dans le brevet américain US 3,000,785 et plus particulièrement aux méthodes d'extraction des spiramycines décrites dans ce brevet. Préférentiellement, les microorganismes utilisés dans un tel procédé sont des bactéries du genre Streptomyces. Plus préférentiellement, les microorganismes sont des souches de S. ambofaciens.
Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression caractérisé en ce que le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 47 ou un polynucléotide dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression de la protéine codée par le dit polynucléotide chez Streptomyces ambofaciens. Des exemples de vecteurs d'expression utilisables chez Streptomyces ont été donnés ci-dessus. Préférentiellement un tel vecteur d'expression est caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM524 ou pSPM525.
Un autre aspect de l'invention concerne une souche de Streptomyces ambofaciens transformée par un vecteur défini dans le paragraphe précédent.
Un autre aspect de l'invention concerne un polypeptide caractérisé en ce que , sa séquence comprend la séquence SEQ ID N° 112. L'invention est également >:' relative à un polypeptide caractérisé en ce que sa séquence correspond à la séquence traduite de la séquence codante :
- d'un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, plus préférentiellement il s'agit du gène de séquence codante SEQ ID N° 141,
-ou d'un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
Préférentiellement ces polypeptides sont exprimés à l'état naturel par une bactérie du genre Streptomyces, plus préférentiellement, ces polypeptides sont impliqués dans la biosynthèse des spiramycines. Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression permettant l'expression d'un polypeptide tel que défini dans le paragraphe précédent chez
Streptomyces ambofaciens. Des exemples de vecteurs d'expression utilisables chez
Streptomyces ont été donnés ci-dessus. Préférentiellemnt, le vecteur d'expression en question est le plasmide pSPM75.
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Structure chimique des spiramycines I, II et III. ; .
Figure 2 : Cosmides utilisés pour le séquençage de la région.
Figure 3 : Organisation d'un groupe de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des spiramycines.
Figure 4 : Voie de biosynthèse proposée du mycarose.
Figure 5 : Voie de biosynthèse proposée du mycaminose.
Figure 6 : Voie de biosynthèse proposée de la forosamine.
Figure 7 : Ordre préférentiel d'ajout des sucres dans la molécule de spiramycine et • intermédiaires. , -i - f
Figure 8 : Voie de biosynthèsè proposée du méthoxymalonyl chez S. ambofaciens. Cettig , voie est proposée par analogie avec la biosynthèse du méthoxymalonyl chez
Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (Wu,K. et β/.,2000).
Figure 9 : Etapes conduisant à l'inactivation d'un gène: A) Clonage du gène cible dans un vecteur se répliquant chez E. coli mais pas chez Streptomyces;
B) Insertion de la cassette de résistance dans le gène cible (par clonage ou recombinaison entre courtes séquences identiques);
C) Introduction du plasmide chez Streptomyces ambofaciens (par transformation ou conjugaison avec E. coli) et sélection des clones ayant intégré la cassette puis criblage de clones ayant perdu la partie vecteur pour avoir un remplacement de gène;
D) Région du chromosome de la souche mutante dans laquelle le gène cible est inactivé par remplacement de gène. Figure 10 : Etapes optionnelles suivant l'inactivation d'un gène selon la méthode décrite en figure 9, pouvant être conduites si une cassette excisable a été employée pour interrompre le gène cible :
E) Introduction dans la souche mutante du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 dont les produits vont permettre l'excision efficace par recombinaison spécifique de sites entre les séquences attL et attR bordant la cassette;
F) Obtention de clones ayant perdu la cassette excisable et sensibles à l'antibiotique à laquelle la cassette conférait la résistance; G) Après croissance et sporulation sur milieu solide sans antibiotique le plasmide pOSV508 est perdu à haute fréquence. On peut ainsi obtenir des clones sensibles au thiostrepton dans lesquels le gène cible contient une délétion en phase. La séquence du gène cible délété peut être contrôlée par amplification PCR et séquençage du produit PCR.
Figure 11 : Amplification de la cassette excisable dans le but de l'utiliser pour une expérience de recombinaison homologue. La technique de recombinaison homologue , grâce à de courtes séquences homologues a été décrite par (Chaveroche et al, 2000). Les 39 ou 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence du gène à inactiver et les 20 déoxy- nucléotides situés le plus en 3' correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable.
Figure 12 : Obtention d'une construction pour l'inactivation d'un gène cible grâce à la technique décrite par (Chaveroche et al, 2000).
Figure 13 : Carte du plasmide pWHM3. Strepto on : origine de réplication Streptomyces.
Figure 14 : Carte du plasmide pOSV508.
Figure 15 : Exemple de structure d'une cassette excisable. Celle-ci est constituée de la cassette Ωhyg (Blondelet-Rouault et al, 1997) bordée des sites attR et attL (Raynal et al, 1998), entre lesquels un événement de recombinaison permettra l'excision de la cassette, grâce à l'expression des gènes xis et int. Figure 16 : Carte du plasmide pBXLl 111. Figure 17 : Carte du plasmide pBXLl 112. Figure 18 : Test microbiologique de production de spiramycine, basé sur la sensibilité d'une souche de Micrococcus luteus à la spiramycine. La souche de Micrococcus luteus utilisée est une souche naturellement sensible à la spiramycine mais résistante à la congocidine. Les différentes souches de Streptomyces à tester ont été cultivées en erlenmeyers de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5, inoculés à une concentration initiale de 2.5 106 spores/ml et mises à pousser à 27°C sous agitation orbitale de 250 rpm. Des prélèvements de moûts de fermentation ont été réalisés après 48, 72 et 96 heures de culture et centrifugés. Une dilution au dixième de ces surnageants dans du milieu de culture stérile est utilisée pour le test. La souche indicatrice de Micrococcus luteus résistante à la congocidine mais sensible à la spiramycine (Gourmelen et al, 1998) a été cultivée dans une boîte carrée de 12x12 cm. Des disques en papier Whatman : AA ont été imbibés de 70 μl de la dilution au dixième de chaque surnageant et déposés X sur la surface de la boîte. Des disques imbibés d'une solution de spiramycine de y différentes concentrations (2-4-8 μg/ml dans du milieu de culture MP5) sont utilisés comme gamme étalon. Les boîtes sont incubées à 37°C pendant 24 à 48h. Si le disque contient de la spiramycine, celle-ci diffuse dans l'agar et inhibe la croissance de la souche indicatrice de Micrococcus luteus. Cette inhibition crée un « halo » autour du disque, ce halo reflétant la zone où la souche de Micrococcus luteus n'a pas poussé. La présence de ce halo est donc une indication de la présence de spiramycine et permet de déterminer si la souche de S. ambofaciens en question est productrice ou non productrice de spiramycine. Une comparaison avec les diamètres d'inhibition obtenus pour la gamme étalon permet d'obtenir une indication de la quantité de spiramycine produite par cette souche.
Figure 19 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche OSC2. Figure 20 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM501.
Figure 21 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM502. Figure 22 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM507.
Figure 23 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM508.
Figure 24 : Chromatogramme CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche SPM509.
Figure 25 : Alignement de la protéine Orf3 (SEQ ID N° 29) avec la protéine TylB (SEQ
ID N° 87) de S. fradiae réalisé grâce au programme FASTA.
Figure 26 : Alignement de la protéine MdmA de S. mycarofaciens (SEQ ID N° 88) avec la protéine SrmD (SEQ ID N° 16) réalisé grâce au programme FASTA. Figure 27 : Exemple de séquences des sites résiduels après excision de la cassette excisable. En gras est indiqué le site att26 minimum tel que défini dans Raynal et al.,
1998. La séquence de la phase 1 (attl) de 33 nucléotides est présentée en SEQ ID N° '
104, la séquence de la phase 2 (att2) de 34 nucléotides est présentée en SEQ ID N° 105, la séquence de la phase 3 (att3) de 35 nucléotides est présentée en SEQ ID N° 95.Figure 28 : Représentation schématique du gène orflO, localisation des amorces PCR utlisées et construction obtenue avec chaque couple d'amorces.
Figure 29 : Construction de la cassette pac-oritT.
Figure 30 : Carte du cosmide pWED2.
Figure 31 : Représentation schématique du groupe de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des spiramycines et de la localisation des trois sondes utilisées pour isoler les cosmides de la banque d'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E. coli (cf. exemple 19).Figure 32 : Localisation des inserts des cosmides isolés de la banque d'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E. coli (cf. exemple 19). Nouvelle banque d'ADN cosmidique.Figure 33 : Sous clonage du fragment Pstl-Pstl du cosmide pSPM36 (insert du plasmide (pSPM58), sous clonage du fragment Stul-Stul du cosmide pSPM36 (insert du plasmide pSPM72) et sous clonage d'un fragment EcoRl- Stul (insert du plasmide pSPM73). Figure 34 : Localisation des phases ouvertes de lecture indentifiées dans l' insert Pstl- Pstl du plasmide pSPM58 et dans l'insert EcoRl-Stul du plasmide pSPM73. ' Figure 35 : Superposition des chromatogrammes CLHP du surnageant filtré du milieu de culture de la souche OS49.67 réalisés à 238 et 280nm (haut) et spectres UV des molécules élues à 33,4 minutes et 44,8 minutes (bas). Figure 36 : Structure moléculaire des molécules platénolide A et platénolide B.
Figure 37 : Organisation du groupe de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des spiramycines.
Figure 38 : Structure moléculaire d'un intermédiaire de biosynthsèe produit par la souche SPM507. Figure 39 : Structure d'un intermédiaire de biosynthsèse produit par une souche de S. ambofaciens de génotype orfό*::attlΩhyg+ obtenue à partir d'une souche ^s surproduisant les spiramycines. L'insertion ide la cassette attlΩhyg+ dans orfό* exerce ;;î un effet polaire empêchant l'expression de orβ*. Figure 40 : Structure moléculaire des molécules platénolide A + mycarose et platénolide B + mycarose produites par la souche OS49.67
Figure 41 : Sous clonage d'un fragment Pstl-Pstl du cosmide pSPM36 (insert du plasmide (pSPM79)), localisation des phases ouvertes de lecture indentifiées dans l'insert Pstl-Pstl du plasmide ρSPM79 et localisation de la séquence SEQ ID N° 140.
La présente invention est illustrée à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
En résumé, les gènes de la voie de biosynthèse des spiramycines ont été isolés à partir d'une banque d'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens. Cette banque a été obtenue par digestion partielle de l'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens, par l'enzyme de restriction Bamlil. De larges fragments d'ADN, de 35 à 45 kb en moyenne, ont été clones dans le cosmide pWEDl (Gourmelen et al, 1998) dérivé du cosmide pWED15 (Wahl et al, 1987). Ces cosmides ont été introduits chez E. coli grâce à des particules phagiques. La banque ainsi obtenue a été hybridée avec une sonde (de séquence SΕQ ID N° 86) correspondant à une partie du gène tylB de S. fradiae (Merson- Davies & Cundliffe, 1994, numéro d'accès GenBank : U08223). Après hybridation, un cosmide sur les 4 s'hybridant avec la sonde a été plus particulièrement sélectionné. Ce cosmide nommé pOS49.1 a ensuite été digéré par Sacl et un fragment de 3,3 kb contenant la région s'hybridant avec la sonde a été sous clone dans le vecteur pUC19 et séquence. Quatre phases ouvertes de lectures ont été identifiées et l'une d'entre elles , code une protéine (SΕQ ID N° 29) présentant de fortes similitudes de séquence avec la ff protéine TylB de S. fradiae (SΕQ ÏD N° 87) (cf. figure 25). Ce gène a été nommé orfi (SΕQ ID N° 28) et a été inactivé chez S. ambofaciens. Il a pu être démontré que les clones inactivés dans le gène orβ ne produisent plus de spiramycines. Ceci montre l'implication du gène orβ ou de gènes situés en aval dans la biosynthèse des spiramycines.
Une fois cette confirmation obtenue, une plus grande région du cosmide pOS49.1 a été séquencée, de part et d'autre du fragment S cl précédemment étudié. Ainsi, à partir du cosmide pOS49.1, la séquence d'une région comportant sept phases ouvertes de lecture entières et deux autres incomplètes, situées de part et d'autre de ces sept phases ouvertes complètes, a pu être obtenue. Grâce à une recherche dans les bases de données, il a pu être montré que l'une des phases ouvertes de lecture incomplète correspondait au locus srmG (région codant une enzyme appelée « polyketide synthase » (PKS)). Les gènes correspondants ont été clones par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320). Par ailleurs, les autres phases ouvertes de lecture, les sept ORFs entières nommées : orfl, orβ, orβ, orβ, orβ, orfό, orβ (SEQ ID N° 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40) et le début de la huitième ORF nommé orβ (séquence SEQ ID N° 43) n'ont pas été retrouvées dans les bases de données.
Dans un deuxième temps et dans le but de cloner d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, d'autres cosmides comportant des fragments du génome de S. ambofaciens dans cette même région ont été isolés. Pour cela une nouvelle série d'hybridations sur colonies a été effectuée en utilisant trois sondes. La première sonde correspond à un fragment d'ADN de 3,7kb contenant orfl, orβ et le début de orβ, sous clone à partir de pOS49.1. La deuxième sonde correspond à un fragment de 2 kb d'ADN contenant une partie de orβ et une partie de orβ et sous clone à partir de pOS49.1. Une troisième sonde a également été utilisée. Cette dernière correspond à un fragment d'ADN de 1.8 kb contenant le gène srmD. Le gène srmD est un gène isolé de S. ambofaciens ' capable de conférer la résistance à la spiramycine. En effet, des travaux antérieurs avaient permis le clonage de plusieurs déterminants de résistance de S. ambofaciens, » conférant la résistance à la spiramycine à une souche de S. griseofuscus (souche sensible j { à la spiramycine) (Pernodet et al., 1993) (Pernodet et al, 1999). Pour l'isolement de gènes de résistances, une banque cosmidique de l'ADN génomique de la souche S. ambofaciens avait été réalisée dans le cosmide pKC505 (Richardson MA et al., 1987). Ce pool de cosmides avait été introduit chez S. griseofuscus, naturellement sensible à la spiramycine. Cinq cosmides capables de conférer la résistance à l'apramycine et la spiramycine chez S. griseofuscus avaient ainsi été obtenus. Parmi ces 5 cosmides, un cosmide nommé pOS44.1 possède dans son insert le gène srmD qui code une protéine présentant une certaine similitude avec la protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens et impliquée dans la résistance à la midécamycine chez cet organisme producteur (Hara et al, 1990, numéro d'accès Genbank : A60725) (figure 26). La troisième sonde utilisée pour localiser les gènes de biosynthèse de spiramycine a été un insert d'environ 1.8kb comprenant le gène srmD. Ces trois sondes ont été utilisées pour hybrider la banque d'ADN génomique décrite ci-dessus et ont permis de choisir deux cosmides (pSPM7 et pSPM5) susceptibles de contenir les inserts les plus longs et n'ayant pas de bandes communes. Le cosmide pSMP5 hybridait avec la première et la deuxième sonde, mais n'hybridait pas avec la troisième sonde, alors que le cosmide pSPM7 hybridait avec la troisième sonde seulement. Ces deux cosmides ont été séquences en totalité par la technique du séquençage en aveugle (« shotgun sequencing »). Les séquences des inserts de ces deux cosmides : pSPM7 et pSPM5 ont pu être assemblées car bien que ne se chevauchant pas, chacun des inserts comprenait une séquence connue à l'une de ses extrémités. En effet, J. chacun de ces inserts comportait un fragment de la séquence d'un des gènes codant une enzyme appelée « polyketide synthase » (PKS). Ces 5 gènes ont été clones par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320) (cf. figure 2). Ainsi, il a pu être déterminé une séquence unique d'ADN génomique de S. ambofaciens. Une séquence de 30943 nucléotides partant, en 5', d'un site EcόRl situé dans le premier gène PKS et :; allant jusqu'à un site Bamϋl en 3' est présentée en SEQ E) N° 1. Cette séquence J ; correspond à la région amont des gènes de la PKS (cf. figure 2 et 3). Une deuxième.;!;! région de 11171 nucléotides, partant d'un site Pstl en 5' et allant jusqu'à un site Bs ξ en 3' situé dans le cinquième gène de la PKS est présentée en SEQ ID N° 2. Cette région est la région aval des gènes de la PKS (l'aval et l'amont étant définis par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figures 2 et 3).
Dans un troisième temps et dans le but de cloner d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, d'autres cosmides comportant des fragments du génome de S. ambofaciens dans cette même région ont été isolés (cf. exemple 18 et 19). EXEMPLE 1 : Construction d'une banque d'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens chez E. coli
1.1. Extraction de l'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens.
5 ' La souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens (accessible notamment auprès de l' American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginie, USA), sous le numéro 23877) a été cultivée en milieu YEME (Yeast Extract-Malt Extract) ((Kieser, T, et al.,2000) et l'ADN génomique de cette souche a été extrait et purifié selon les techniques standards de lyse et précipitation (Kieser T. et al, 2000).
10 1.2. Construction de la banque d'ADN génomique
L'ADN génomique de la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens tel .!•:,, qu'isolé ci-dessus a été digéré partiellement par l'enzyme de restriction BamHl -dér manière à obtenir des fragments d'ADN de taille comprise entre environ 35 et 45 lώ X
S i : Ces fragments ont été clones dans le cosmide pWEDl (Gourmelen et a , 1998) digéré||ξ;
'„'. '• • .- ' • - . ' : '' - • •• • .•'.'" '-, "' ' : ' :-r- .;' '-''-v ' ' ' " "".:-^^
15 au préalable par BamHl. Le cosmide pWEDl est dérivé du cosmide pWE15 (Wahl, "eiψk al, 1987) par délétion du fragment Hpal-Hpal de 4.1 kb contenant le module d'expression actif chez les mammifères (Gourmelen et al, 1998). Le mélange de ligation a ensuite été encapsidé in vitro dans des particules de phages lambda grâce au système « Packagene® Lambda DNA packaging system » commercialisé par la société
20 Promega en suivant les recommandations du fabriquant. Les particules phagiques obtenues ont été utilisées pour infecter la souche SURE® d'E. coli commercialisée par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). La sélection des clones a été effectuée sur milieu LB + ampicilline (50 μg/ml) puisque le cosmide pWΕDl confère la résistance à l' ampicilline.
25 EXEMPLE 2 : Isolement et caractérisation de gènes impliqués dans la biosynthèse de spiramycines chez Streptomyces ambofaciens
2.1 Hybridation sur colonie des clones d'E. coli de la banque génomique de Streptomyces ambofaciens ATCC23877
Environ 2000 clones d'E. coli de la banque obtenue ci-dessus, ont été transférés sur filtre pour hybridation sur colonies. La sonde utilisée pour l'hybridation est un fragment Nael-Nael d'ADN (SΕQ ID N° 86) comportant une partie du gène tylB de Streptomyces fradiae. Ce fragment correspond aux nucléotides 2663 à 3702 du fragment d'ADN décrit par Merson-Davies, L.A. & Cundliffe Ε. (Merson-Davies, L.A. & Cundliffe Ε., 1994, numéro d'accès GenBank : U08223), dans lequel la séquence codante du gène tylB correspond aux nucléotides 2677 à 3843.
Le fragment Nael-Nael d'ADN portant une partie du gène tylB de Streptomyces fradiae (SΕQ ID N° 86) a été marquée au 32P par la technique du « random priming » (Kit commercialisé par la société Roche) et utilisé comme sonde pour l'hybridation des 2000 clones de la banque, transférés sur filtre. Les membranes utilisées sont des"',; membranes nylon Hybond N commercialisées par la société Amersham (Amersham Biosciences, Orsay, France) et l'hybridation a été effectuée à 55°C dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Un lavage a été effectué en 2X SSC à 55°C pendant 15 minutes et deux lavages successifs en 0.5X SSC ont ensuite été effectués à 55°C, d'une durée de 15 minutes chacun. Dans ces conditions d'hybridation et de lavage, 4 clones parmi les 2000 hybrides présentaient un fort signal d'hybridation. Ces 4 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 μg/ml) et les 4 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline standard (Sambrook et al, 1989). Il a ensuite été vérifié que l'hybridation était bien due à un fragment d'ADN présent dans l'insert de ces quatre cosmides. Pour cela, les cosmides ont été digérés indépendamment par plusieurs enzymes (R mHI, Psil et Sαcl). Les produits de digestions ont été séparés sur gel d'agarose, transférés sur membrane Nylon et hybrides par le fragment Nael-Nael d'ADN comportant une partie du gène tylB de Streptomyces fradiae (cf. ci-dessus) dans les mêmes conditions que ci-dessus. Les quatres cosmides ont pu être validés et un de ces cosmides a été plus particulièrement retenu et a été nommé pOS49.1.
2.2 Vérification de l'implication de la région identifiée et séquençage de l'insert du cosmide pOS49.1
Plusieurs fragments de l'insert du cosmide pOS49.1 ont été sous-clonés et leurs séquences ont été déterminées. Le cosmide pOS49.1 a été digéré par l'enzyme S cl et il a été montré par Southern blot, dans les conditions décrites précédemment, qu'un , fragment de 3,3 kb contient la région s'hybridant avec la sonde tylB. Ce fragment de 3,3 : kb a été isolé par électroélution à partir d'un gel d'agarose 0.8% puis clone dans le vecteur pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) et séquence. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.11. Quatre phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces ont pu être identifiées dans ce fragment (deux complètes et deux tronquées), grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Des comparaisons de séquences grâce au programme FASTA (cf.. (Pearson W. R J . & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessible notamment auprès du centie de ressources INFOBIOGEN, Evry, France) ont permis de montrer que la protéine X déduite de l'une de ces 4 phases ouvertes de lecture présente de fortes similitudes de séquence avec la protéine TylB (SEQ ID N° 87; Numéro d'accès GenBank : U08223) de S.fradiae (cf. figure 25). Cette protéine a été nommée Orf3 (SEQ ID N° 29).
Dans le but de tester si le gène correspondant (le gène orβ (SEQ ID N° 28)) était impliqué dans la biosynthèse des spiramycines chez S. ambofaciens, ce gène a été interrompu par une cassette Ωhyg (Blondelet-Rouault M-H. et al., 991, numéro d'accès GenBank : X99315). Pour cela, le plasmide pOS49.11 a été digéré par l'enzyme Xhol et le fragment contenant les quatre phases ouvertes de lecture (deux complètes et deux tronquées, dont orβ en entier) a été sous-cloné au niveau du site Xhol du vecteur pBC SK+ commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Califormie, USA). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.12. Dans le but d'inactiver orβ, un fragment PmR- BstEll interne à orβ a été remplacé par la cassette Ωhyg par clonage bout franc dans ce dernier plasmide. Pour cela, le plasmide pOS49.12 a été digéré par les enzymes Pmll et BstEll dont le site unique se trouve dans la séquence codante du gène orβ. Les extrémités du fragment correspondant au vecteur ont été rendues bouts francs par un traitement par l'enzyme de Klenow (grand fragment de la DNA polymerase I). La cassette Ωhyg a été obtenue par digestion par l'enzyme BamHl du plasmide pHP45 Ωhyg (Blondelet-Rouault et al, 1997, numéro d'accès GenBank : X99315). Le fragment correspondant à la cassette Ωhyg a été récupéré sur gel d'agarose et ses extrémités ont été rendues bouts francs par un traitement par l'enzyme de Klenow. Les deux fragments bouts francs ainsi obtenus (la cassette Ωhyg et le plasmide pOS49.12) ont été ligués et le produit de ligation a été utilisé pour la transformation de bactéries E. coli. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.14 et contient le gène orβ interrompu par la cassette Ωhyg.
L'insert du plasmide pOS49.14, sous la forme d'un fragment Xhόl-Xhol dont les extrémités ont été rendues non cohésives par un traitement par l'enzyme de Klenow, a été clone au niveau du site EcoRV du plasmide pOJ260 (le plasmide pOJ260 est un plasmide conjugatif capable de se répliquer chez E. coli mais incapable de se répliquer > chez S. ambofaciens (Bierman M et al, 1992). Ce plasmide confère la résistance à l'apramycine chez E. coli et Streptomyces). Le plasmide obtenu (insert du plasmide pOS49.14 clone dans le plasmide pOJ260) a été nommé pOS49.16. Ce dernier a été transféré dans la souche ATCC23877 de S. ambofaciens par conjugaison à l'aide de la souche conjugative E. coli S17-1, comme décrit par Mazodier et al. (Mazodier et al, 1989). La souche E. coli S17-1 est dérivée de la souche E. coli 294 (Simon et al, 1983) (Simon, et al, 1986). Des clones transconjugants possédant le marqueur de résistance à l'hygromycine porté par la cassette Ωhyg et ayant perdu le marqueur de résistance à l'apramycine porté par le vecteur pOJ260 ont pu être obtenus. Pour cela, après conjugaison, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de recombinaison s'est produit et qui possèdent donc le gène orβ interrompu par la cassette Ωhyg. Le remplacement de la copie sauvage de orβ par la copie interrompue a été vérifié par deux hybridations successives. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par différentes enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybride avec une sonde correspondant à la cassette Ωhyg (cf. ci-dessus)) pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique les clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde l'insert Xhol-Xhόl du plasmide pOS49.11 contenant les quatre phases ouvertes de lecture (deux complètes et deux tronquées, dont orβ en entier). La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un des clones orβ:: Ωhyg ainsi obtenu et dont le génotype a été vérifié, a été choisi et a été appelé OS49.16.
La production en spiramycine du clone OS49.16 ainsi obtenu a été testée grâce au test de production décrit plus bas (cf. exemple 15). Il a ainsi pu être démontré que cette souche ne produit plus de spiramycine, confirmant l'implication de orβ et/ou des gènes situés en aval comme par exemple orβ dans la biosynthèse des spiramycines. ' !X
Une fois cette confirmation obtenue, une plus grande région du cosmide pOS49.1 a été séquencée, de part et d'autre du fragment Sαcl précédemment étudié. Ainsi, à partir du cosmide pOS49.1, la séquence d'une région comportant sept phases ouvertes de lecture entières et deux autres incomplètes, situées de part et d'autre de ces sept phases ouvertes complètes, a pu être obtenue. Grâce à une recherche dans les bases de données, il a pu être montré que l'une des phases ouvertes de lecture incomplète correspondait au locus srmG (région codant une enzyme appelée « polyketide synthase » (PKS)). Les gènes correspondants ont été clones par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320). Par ailleurs, les autres phases ouvertes de lecture: les sept ORFs entières nommées : orfl, orβ, orβ, orβ, orβ, orfό, orβ (SEQ ID N° 23, 25, 28, 30, 34, 36 et 40) et le début de la huitième ORF nommée orβ (la séquence entière de cette orf est donnée en SEQ ID N° 43) n'ont pas été retrouvées dans les bases de données. EXEMPLE 3 : Isolement et caractérisation d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse de spiramycines chez Streptomyces ambofaciens
Dans un deuxième temps et dans le but de cloner d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, d'autres cosmides comportant des fragments du génome de S. ambofaciens dans cette même région ont été isolés. Pour cela il a été procédé à une nouvelle série d'hybridations sur colonies en utilisant trois sondes :
- La première sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN BamHl-Pstl de 3,7kb contenant un fragment du gène de la PKS (Les gènes correspondant à la PKS ont été clones par Burgett S. et al. en 1996 (Brevet américain US 5,945,320)), orfl, orβ et le début de orβ, sous clone à partir de pOS49.1 et allant d'un site BamHl situé 1300 paires de bases en amont du site EcoRI définissant la position 1 de SΕQ ID N° 1, jusqu'au site
- La deuxième sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN Pstl-BamHl d'environ JS 2kb contenant un fragment d'or/7 et d'orβ, sous clone à partir de pOS49.1 et allant d'un site Pstl situé en position 6693 de SΕQ ID N° 1 jusqu'au site BamHl situé en position 8714 de SΕQ ID N° 1. Ce fragment Pstl-BamHl a été sous clone à partir de pOS49.1 dans le plamside pBC SK+, ce qui a permis d'obtenir le plasmide pOS49.76.
- Une troisième sonde a également été utilisée. Cette dernière correspond à un fragment d'ADN de 1.8kb EcoRl-Hindïïl contenant le gène srmD. Le gène srmD est un gène isolé de S. ambofaciens capable de conférer la résistance à la spiramycine. En effet, des travaux antérieurs avaient permis le clonage de plusieurs déterminants de résistance de S. ambofaciens, conférant la résistance à la spiramycine à une souche de S. griseofuscus (souche sensible à la spiramycine) (Pernodet et al, 1993) (Pernodet et al, 1999). Pour isoler des gènes de résistance, une banque cosmidique de l'ADN génomique de la souche S. ambofaciens ATCC23877 avait été réalisée dans le cosmide pKC505 (Richardson MA et al, 1987). Pour cela l'ADN génomique de la souche S. ambofaciens ATCC23877 avait été digéré partiellement par Sau3Al de manière à obtenir des fragments de taille comprise entre environ 30 et 40 kb. L'ADN génomique ainsi digéré (3μg) avait été ligué avec lμg du pKC505 préalablement digéré par l'enzyme BamHl (Pernodet et al, 1999). Le mélange de ligation avait ensuite été encapsidé in vitro dans des particules phagiques. Les particules phagiques obtenues avaient été utilisées pour infecter la souche d'E. coli HB101 (accessible notamment auprès de l' American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginie, USA), sous le numéro 33694). Environ 20000 clones d'E. coli résistant à l'apramycine avaient été poolés et les cosmides de ces :• clones avaient été extraits. Ce pool de cosmides avait été introduit par transformation de protoplastes dans la souche DSM 10191 de S. griseofuscus (Cox KL & Baltz RH. 1984), naturellement sensible à la spiramycine (Rao RN et al, 1987, cette souche est disponible notamment auprès de la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures .: (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), ; (Braunschweig, Allemagne), sous le numéro DSM 10191). Les transformants avaient été ';: sélectionnés sur un milieu contenant de l'apramycine. 1300 des clones poussant sur,, i milieu contenant de l'apramycine avaient été transférés sur milieu contenant 5μg ml de: - spiramycine. Plusieurs clones résistants à l'apramycine avaient également poussé sur : milieu contenant de la spiramycine et les cosmides de ces colonies avaient été extraits et utilisés pour transformer E. coli et S. griseofuscus (Pernodet et al, 1999). Cinq cosmides capables de conférer la résistance à l'apramycine à E. coli et la co-résistance à l'apramycine et la spiramycine chez S. griseofuscus avaient ainsi été obtenus. Parmi ces 5 cosmides, il a été déterminé qu'un cosmide nommé pOS44.1 possède dans son insert un gène (SΕQ ID N° 15) qui code une protéine (SΕQ ID N° 16) présentant une certaine similitude avec une protéine codée par le gène mdmA de Streptomyces mycarofaciens (SΕQ ID N° 88), ce gène a été nommé srmD (cf. alignement présenté en figure 26 réalisé grâce au programme FASTA (cf.. (Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Pour isoler le déterminant de résistance contenu dans le plasmide pOS44.1, celui- ci a été digéré partiellement par l'enzyme de restriction Sau3Al de manière à obtenir des fragments de taille d'environ 1,5 à 3 kb, ces fragments ont été ligués dans le vecteur pIJ486 linéarisé par l'enzyme BamHl (Ward et al, 1986). Un plasmide a été sélectionné pour sa capacité à conférer la résistance à la spiramycine chez la souche DSM 10191 de S. griseofuscus (Rao RN et a , 1987), naturellement sensible à la spiramycine (cf. ci- dessus). Pour cela, le pool de plasmides correspondant aux fragment Sau3Al de ρOS44.1 ligués dans le vecteur pIJ486 (cf. ci-dessus), a été introduit par transformation de protoplastes dans la souche DSM 10191 et les transformants ont été sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton (due au gène ter porté par pIJ486). Les clones poussant sur milieu contenant du thiostrepton ont été transférés sur milieu contenant de la spiramycine. Plusieurs clones résistants au thiostrepton ont également poussé sur milieu contenant de la spiramycine et les plasmides de ces colonies ont été extraits. Un plasmide conférant la résistance et contenant un insert d'environ 1.8kb a été sélectionné et nommé pOS44.2. Cet insert de 1.8kb peut être sorti facilement grâce à un site Hindïïl , . et un site EcoKL présents dans le vecteur de part et d'autre de l'insert. Cet insert de 1.8kb . ,: HindlU-EcoRÎ a été séquence et le gène de Résistance qu'il renferme a été nommé srmDr Ce fragment contenant le gène srmD a ainsi pu être facilement sous-cloné dans le vecteur pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) ouvert par EcoRl-HindlU, le plasmide obtenu a été nommé pOS44.4. L'insert de 1.8kb Hindlll-EcoRl, contenant le gène srmD, de ce plasmide a été utilisé comme sonde pour localiser les gènes de biosynthèse de spiramycine (cf. ci-dessous).
Un échantillon d'une souche Escherichia Coli DH5α contenant le plasmide pOS44.4 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2918.
Environ 2000 clones de la banque, obtenus ci-dessus (cf. exemple 1), ont été transférés sur filtre pour hybridation sur colonies selon les techniques classiques (Sambrook et al, 1989). Les trois sondes décrites ci-dessus ont été marquées au 32P par la technique du « random priming » (Kit commercialisé par Roche) et utilisées pour l'hybridation des 2000 clones de la banque, transférés sur filtre. L'hybridation a été effectuée à 65°C dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Un lavage a été effectué en 2X SSC à 65°C pendant 15 minutes et deux lavages successifs ont ensuite été effectués en 0.5X SSC à 65°C, d'une durée de 15 minutes chacun. Dans ces conditions d'hybridation et de lavage, 16 clones parmi les 2000 hybrides présentaient un fort signal d'hybridation avec au moins une des sondes. Cependant, aucun cosmide n'hybridait avec les trois sondes. Les 16 cosmides ont été extraits et digérés par l'enzyme de restriction BamHl. La comparaison des profils de restriction de ces différents cosmides entre eux, a conduit à choisir deux cosmides susceptibles de contenir les inserts les plus longs de la région et n'ayant pas de bandes communes. Ainsi deux cosmides l'un nommé pSPM5 et l'autre pSPM7 ont été choisis. Le cosmide pSPM5
aveugle (« shotgun sequencing »). Les séquences des inserts de ces deux cosmides : pSPM7 et pSPM5 ont pu être assemblées car bien que ne se chevauchant pas, chacun des inserts comprenait une séquence connue à l'une de ses extrémités. En effet, chacun de ces inserts comportait un fragment de la séquence d'un des gènes codant une enzyme appelée «polyketide synthase » (PKS). Ces 5 gènes ont été clones par Burgett S. et al en 1996 (Brevet américain US 5,945,320) (cf. figure 2). Ainsi, il a pu être déterminé une séquence unique d'ADN génomique de S. ambofaciens. Une séquence de 30943 nucléotides partant en 5' d'un site EeoRI situé dans le premier gène PKS et allant jusqu'à un site BamHl en 3' est présentée en SΕQ ID N° 1. Cette séquence correspond à la région amont des gènes de la PKS (cf. figure 2 et 3). Une deuxième région de 11171 nucléotides, partant d'un site Pstl en 5' et allant jusqu'à un site Ncol en 3' situé dans le cinquième gène de la PKS est présentée en SΕQ ID Ν° 2. Cette deuxième région est la région aval des gènes de la PKS (l'aval et l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 2 et 3).
EXEMPLE 4 : Analyse des séquences nucléotidiques, détermination des phases ouvertes de lecture et caractérisation des gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.
Les séquences obtenues ont été analysées grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cette région comporte 35 ORFs localisées de part et d'autre de cinq gènes codant l'enzyme «polyketide synthase » (PKS). Respectivement 10 et 25 ORFs ont été identifiées en aval et en amont de ces gènes (l'aval et l'amont étant défini par l'orientation des 5 gènes de PKS tous orientés dans le même sens) (cf. figure 3). Ainsi, les 25 phases ouvertes de lecture de ce type, occupant une région d'environ 31 kb (SEQ ID N° 1 et figure 3) ont été identifiées en amont des 5 gènes codant la PKS et 10 occupant une région d'environ 11,1 kb (SEQ ID -r-
* iX N° 2 et figure 3), ont été identifiées en aval des gènes de la PKS. Les gènes de la région (C i amont ont été nommés orfl, orβ, orβ, orβ, orβ, orfό, orβ, orβ, orβc, orflO, orfl le, orfl 2, orfl 3c, orfl4, orfl 5c, orflό, orf 17, orfl 8, orfl 9, orβO, orβlc, orβ2c, orβ3c, orβ4c et orβ5c (SEQ ID N° 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 et 84). Les gènes de la région aval ont été nommés orfl*c, orβ*c, orβ*c, orβ*c, orβ*, orfό*, orβ*c, orβ*, orβ*, orflO* (SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 et 21). Le « c » ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (le brin codant est donc le brin complémentaire de la séquence donnée en SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2 pour ces gènes) (cf. figure 3).
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups) (ces trois programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990), BEAUTY (Worley K. C. et al, 1995)), (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycine.
EXEMPLE 5 : Inactivation de gène : principe de la construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue Les méthodes utilisées consistent à effectuer un remplacement de gène. Le gène cible à interrompre est remplacé par une copie de ce gène interrompue par une cassette conférant la résistance à un antibiotique (par exemple l'apramycine ou l'hygromycine), comme l'illustre la figure 9. Les cassettes utilisées sont bordées de part et d'autre par des codons de terminaison de la traduction dans toutes les phases de lecture et par des terminateurs de transcription actifs chez Streptomyces.
L'insertion de la cassette dans le gène ciblé eiή s'accompagner ou non d'une délétion dans ce gène cible. La taille des régions flanquant la cassette peut aller de quelques centaines à plusieurs milliers de paires de bases.
Les constructions nécessaires à l'inactivation du gène par la cassette ont été obtenues chez E. coli, organisme de référence pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant. Le gène interrompu a été obtenu dans un plasmide se répliquant chez E. coli mais ne pouvant pas se répliquer chez Streptomyces.
Les constructions ont ensuite été sous-clonées dans des vecteurs pour permettre la transformation et l'inactivation du gène voulu chez S. ambofaciens. Pour cela, deux plasmides ont été utilisés :
- pOJ260 (Bierman M. et al, 1992) (cf. exemple 2) qui confère la résistance à l'apramycine chez E. coli et Streptomyces et qui a été employé quand le gène cible a été interrompu par une cassette conférant la résistance à l'hygromycine. - pOSK1205 (4726pb). Ce plasmide dérive du plasmide pBK-CMN (commercialisé par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA)) dans lequel un fragment Avril contenant la séquence codant la résistance à la Νéomycine/Kanamycine a été remplacé par une séquence codant la résistance à l'hygromycine, tout en conservant le promoteur P SN40. Pour cela, le plasmide \iHP45-Ωhyg (Blondelet-
Rouault et a , 1997) a été digéré par les enzymes Nσtl et Pflml et le fragment conférant la résistance à l'hygromycine a été sous-cloné au niveau du site ^4vrII du vecteur pBK-CMV après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow. Dans pOSK1205, la cassette qui confère la résistance à l'hygromycine est précédée du promoteur pSV40. Ce plasmide confère la résistance à l'hygromycine chez E. coli et Streptomyces et a été employé quand le gène cible a été interrompu par une cassette conférant la résistance à l'apramycine.
Le plasmide portant le gène interrompu par la cassette peut ensuite être introduit chez Streptomyces ambofaciens, par exemple par conjugaison entre E. coli et Streptomyces (Mazodier P, et a , 1989). Cette technique a été utilisée dans le cas où le vecteur de base est le vecteur pOJ260. Une deuxième technique peut être utilisée : la technique de la transformation de protoplastes après dénaturation par traitement alcalin de l'ADΝ (Kieser, T et al, 2000), pour augmenter la fréquence de recombinaison comme décrit par exemple par Oh & Chater (Oh & Chater, 1997). Cette technique a été utilisée dans le cas où le vecteur de base est pOJ260 ou pOSK1205 (cf. ci-dessous). Les transformants sont ensuite sélectionnés avec l'antibiotique correspondant à la cassette présente dans le gène cible (cf. figure 9, antibiotique B). On sélectionne ainsi un mélange de clones parmi lesquels il y a eu intégration par un seul ou par deux événements de recombinaison. Dans un deuxième temps on recherche les clones sensibles à l'antibiotique pour lequel le gène de résistance est présent dans le vecteur (hors de la cassette de recombinaison) (cf. figure 9, antibiotique A). On peut ainsi sélectionner les clones pour lesquels il y a eu en principe deux événements de recombinaison aboutissant au remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette. Ces étapes sont schématisées figure 9.
Plusieurs cassettes peuvent être utilisées pour l'interruption des gènes cibles. On peut par exemple utiliser la cassette Ωhyg qui confère la résistance à l'hygromycine (Blondelet-Rouault et al, 1997, numéro d'accès GenBank : X99315).
EXEMPLE 6 : Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue en phase dans le gène orβ
Le gène orf 3 avait été interrompu par la cassette Ωhyg (cf. exemple 2.2) et il a pu être démontré qu'une souche orβ:: Ωhyg ne produit plus de spiramycine, nfirmant l'implication d'un ou plusieurs gènes de la région clonée dans la biosynthèse des spiramycines (cf. exemple 2.2). Au vu de leur orientation, une cotranscription des ORFs.; n 1 à 7 est probable (cf. figure 3) et le phénotype observé (non producteur de spiramycines) peut être dû à l'inactivation d'un ou plusieurs des gènes co-transcrits avec orβ. Pour confirmer l'implication de orβ dans la biosynthèse de spiramycines, une nouvelle inactivation du gène orβ a été effectuée, cette dernière étant réalisée en phase. Pour cela, un fragment Dralïl interne à orβ de 504 paires de bases a été délété. Un fragment d'ADN obtenu à partir de pOS49.1, allant du site EcoRI situé en position 1 (SΕQ ID N° 1) jusqu'au site Sacl situé en position 5274 (SΕQ ID N° 1) et qui comporte une délétion entre les deux sites Dralïl aux positions 2563 et 3067 (504 nucléotides retirés) a été clone dans le plasmide pOJ260 (Bierman M. et al., 1992). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.67.
L'insert de pOS49.67 est donc constitué par un fragment d'ADN de S. ambofaciens contenant les gènes orfl, orβ, orβ avec la délétion en phase, orβ et une partie de orβ. Le vecteur dans lequel cet insert a été sous-cloné est pOJ260, le plasmide pOS49.67 confère donc la résistance à l'apramycine et a été introduit par transformation de protoplastes dans la souche OS49.16 (cf. exemple 2). La souche OS49.16 étant résistante à l'hygromycine, des transformants hygR et apraR ont été obtenus. Après deux passages de tels clones sur milieu non sélectif, les clones sensibles à l'apramycine et à l'hygromycine (apraS et hygS) ont été recherchés. Dans certains de ces clones, on s'attend en effet à ce qu'un événement de recombinaison entre séquences homologues conduise au remplacement de la copie de orβ interrompue par la cassette Ωhyg (contenu dans le génome de la souche OS49.16) par la copie de orβ avec la délétion en phase présente sur le vecteur. Les clones résultant de cette recombinaison sont attendus comme apraS et hygS après l'élimination des séquences du vecteur. Le génotype des souches ainsi obtenues peut être vérifié par hybridation ou par PCR et séquençage du produit de PCR (pour vérifier que seule une copie de orβ délétée en phase est présente dans le génome des clones obtenus). Des clones n'ayant que la copie de orβ avec une délétion en phase ont ainsi été obtenus et leur génotype a été vérifié. Un clone présentant les ( caractéristiques recherchées a été plus particulièrement sélectionné et a été nommé .
Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2916.
EXEMPLE 7 : Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orβ
Pour réaliser l'inactivation du gène orβ, une construction dans laquelle la cassette Ωhyg a été introduite dans la séquence codante de orβ a été obtenue. Pour cela, le plasmide pOS49.88 a tout d'abord été construit. Le plasmide pOS49.88 est dérivé du plasmide pUC19 (numéro d'accès GenBank M77789) par insertion d'un fragment de 3.7 kb (fragment Λtl-EeoRI obtenu à partir du cosmide pSPM5), contenant la fin de orβ, orβ et le début de orβ, clone dans les sites Pstl-EcoRl de pUC19. La cassette Ωhyg (sous forme d'un fragment BamHl, rendu bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow) a été clonée au niveau du site unique Sali de pOS49.88 situé dans orβ après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow.
Le clonage étant bout franc, deux types de plasmides ont été obtenus selon le' sens d'insertion de la cassette : pOS49.106 dans lequel les gènes hyg et orβ sont dans la même orientation et pOS49.120 dans lequel les gènes hyg et orβ sont dans des orientations opposées. L'insert du plasmide pOS49.106 a ensuite été sous-cloné dans le plasmide pOJ260 pour donner pOS49.107. Pour cela, le plasmide pOS49.106 a été digéré par l'enzyme AspllSl et les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow, ce produit de digestion a été redigéré par l'enzyme Pstl et le fragment contenant le gène orβ dans lequel la cassette Ωhyg a été insérée, a été clone j- dans le vecteur pOJ260 (cf. ci dessus). Pour cela, le vecteur pOJ260 a été digéré par les ; enzymes EcoRV et Pstl et utilisé pour la ligâtion. Cette manipulation permet donc ^ l d'obtenir une ligâtion orientée puisque chacun des deux fragments est bout franc d'uii r 1 côté et P^tl de l'autre. Le plasmide obtenu a été nommé pOS49.107.
Le plasmide ρOS49.107 a été introduit dans la souche ATCC23877 de S. ambofaciens par transformation de protoplastes (Kieser, T et al, 2000). Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orβ interrompu par la cassette Ωhyg. Le remplacement de la copie sauvage de orβ par la copie interrompue par la cassette Ωhyg a été vérifié par Southern Blot. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybride avec une sonde correspondant à la cassette Ωhyg pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde l'insert Pstl-EcoRl contenant la fin de orβ, orβ et le début de orβ d'une taille d'environ 3,7 kb du plasmide pOS49.88. La vérification du génotype peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séqifençage du produit de PCR.
Un clone orβv.Ωhyg a été choisi et nommé OS49.107. Un échantillon de la souche OS49.107 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2917.
EXEMPLE 8 : Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orflO
utilisant comme matrice, l'ADN génomique de S. ambofaciens et les amorces suivantes
SRMRl : 5' CTGCCAGTCCTCTCCCAGCAGTACG 3' (SEQ ID N" 89)
SRMR2 : 5' TGAAGCTGGACGTCTCCTACGTCGG 3' (SEQ ID H" 90)
Ce fragment d'ADN issu de la PCR a été clone dans le vecteur pCR2.1 commercialisé par la société Invitrogen (Carlsbad, Californie, USA). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.32. La cassette Ωhyg (sous forme d'un fragment BamHl, cf. ci-dessus) a été clonée au niveau du site unique RstEII interne au fragment du gène orf 10, après que toutes les extrémités aient été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow. Le clonage étant bout franc, deux types de plasmides ont été obtenus selon le sens d'insertion de la cassette : pOS49.43 dans lequel les gènes hyg et orf 10 sont dans la même orientation et pOS49.44 dans lequel les gènes hyg et orflO sont dans des orientations opposées. L'insert du plasmide pOS49.43 a été transféré (sous forme d'un fragment AspllSl-Xbal dont les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow) dans le site EcoRV du plasmide pOJ260 ce qui a permis d'obtenir le plasmide pOS49.50. Le plasmide pOS49.50 contenant le fragment du gène orflO interrompu par la cassette Ωhyg a été introduit dans la souche ATCC23877 de Streptomyces ambofaciens. Après transformation, les clones^ sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orflO interrompu par la cassette Ωhyg. Des clones qui possédaient le marqueur de résistance à l'hygromycine porté par la cassette et qui avaient perdu le marqueur de résistance à l'apramycine porté par le vecteur pOJ260 ont ainsi été obtenus. L'événement de remplacement de la copie sauvage de orflO par la copie interrompue orflO::Ωhyg a été vérifié par Southern Blot. Ainsi, l'ADN génomique total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybride avec une sonde correspondant à la cassette Ωhyg pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde le produit PCR de 1,5 kb interne au gène orf 10 (cf. ci-dessus).
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orflOv.Ωhyg) a été plus particulièrement sélectionné et nommé OS49.50. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette Ωhyg était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette Ωhyg dans le génome de ce clone. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. EXEMPLE 9 : Inactivation de gènes : principe de la construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue selon la technique des « cassettes excisables » (cf. Figure 9 et 10)
»
Un deuxième type de cassettes peut être utilisé pour l'inactivation de gènes : les cassettes dites « cassettes excisables ». Ces cassettes présentent l'avantage de pouvoir être excisées chez Streptomyces par un événement de recombinaison spécifique de site après avoir été introduites dans le génome de S. ambofaciens. Le but est d'inactiver certains gènes dans des souches de Streptomyces sans laisser dans la souche finale de marqueurs de sélection ou de grandes séquences d'ADN n'appartenant pas à la souche. Après excision il subsiste uniquement une courte séquence d'environ une trentaine de paires de bases (appelé site « cicatriciel ») dans le génome de la souche (cf. figure 10).
La mise en oeuvre de ce système consiste, dans un premier temps, au remplacement de la copie sauvage du gène cible (grâce à deux événements de recombinaisόh > ) homologue, cf. figure 9) par une construction dans laquelle une cassette excisable a été insérée dans ce gène cible. L'insertion de cette cassette est accompagnée d'une délétion dans le gène cible (cf. figure 9). Dans un deuxième temps, l'excision de la cassette excisable du génome de la souche est provoquée. La cassette excisable fonctionne grâce à un système de recombinaison spécifique de site et a pour avantage de permettre l'obtention de mutants de Streptomyces ne portant finalement pas de gène de résistance. On s'affranchit également d'éventuels effets polaires sur l'expression des gènes situés en aval du ou des gènes inactivés (cf. figure 10).
L'emploi de cassettes excisables a été décrit et utilisé chez de nombreux organismes dont les cellules de mammifère, de levures et chez E. coli (Bayley et a , 1992 ; Brunelli et Pall, 1993 ; Camilli et al, 1994 ; Dale et Ow, 1991 ; Russell et al, 1992; Lakso et al,
1992). Ces cassettes excisables utilisent toutes la recombinase spécifique de site Cre agissant sur les sites lox. Ce système de recombinaison provient du bactériophage PI. Pour la construction d'un système de type « cassette excisable » chez Streptomyces, il a été tiré partie du système de recombinaison spécifique de site décrit pour l'élément génétique mobile pSAM2 de Streptomyces ambofaciens (Boccard et al, 1989a et b). Le système mis en place consiste dans un premier temps à construire un vecteur recombinant comportant le gène à interrompre dans lequel est insérée une cassette excisable. L'insertion dans le gène Cible de la cassette excisable s'accompagne d'une délétion dans le gène cible. Elle peut être réalisée par clonage en utilisant des sites de restriction présents dans le gène cible ou par recombinaison entre de courtes séquences identiques comme décrit par exemple par Chaveroche et al (Chaveroche MK et a , 2000). La cassette excisable peut être construite en utilisant par exemple la cassette Ωhyg (Blondelet Rouault et al, 1997). Cette cassette a été bordée par des séquences αttR et attL qui flanquent normalement la copie intégrée de pSAM2 (cf. figure 15). Les séquences attL et attR contiennent tous les sites nécessaires à la recombinaison site- . spécifique permettant l'excision de pSAM2 ou de tout fragment d'ADN situé entre ces deux régions (Sezonov et al, 1997, Raynal et /.,1998). La construction d'une telle . cassette n'est évidemment pas limitée à l'utilisation d'une cassette Ωhyg, mais d'autres.;!;; cassettes de résistances peuvent servir de base à la construction de cette cassettte (par - ; exemple la cassette Ωaac ou Ωvph (Blondelet Rouault et al, 1997)).
Après l'obtention de cette construction, la souche de Streptomyces est transformée avec le plasmide recombinant. Les transformants sont ensuite sélectionnés avec l'antibiotique correspondant à la cassette présente dans le gène cible (cf. figure 9, antibiotique B, il s'agit par exemple d'une sélection par l'hygromycine si la cassette excisable dérive de la cassette Ωhyg). On sélectionne ainsi un mélange de clones parmi lesquels il y a eu intégration par un seul ou par deux événements de recombinaison. Dans un deuxième temps on recherche les clones sensibles à l'antibiotique pour lesquels le gène de résistance est présent dans le vecteur (hors de la cassette de recombinaison)
(cf. figure 9, antibiotique A). On peut ainsi sélectionner les clones pour lesquel il y a eu en principe deux événements de recombinaison aboutissant au remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette. Ces étapes sont schématisées figure 9, le génotype des clones ainsi obtenus est vérifié par Southern blot et une souche présentant les caractéristiques voulues (le remplacement du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette excisable) est sélectionnée.
Dans un deuxième temps, la souche sélectionnée ci-dessus, est transformée par un plasmide permettant l'expression des gènes xis et int qui sont tous deux nécessaires à la recombinaison spécifique de site entre les sites attR et attL. Cette recombinaison entraîne le départ de la cassette excisable du génome de la souche, grâce à un événement de recombinaison (cf. figure 10) (Raynal et a , 1998). Il est intéressant de choisir le vecteur portant les gènes xis et int parmi les vecteurs relativement instables chez ;: Streptomyces (par exemple dérivé du vecteur Streptomyces pWHM3, (Vara et al, ; 1989)), ceci permet d'obtenir une souche ayant perdu ce dernier vecteur après quelques cycles de sporulation en absence de pression de sélection.
Pour exciser la cassette, on peut par exemple utiliser le plasmide pOSV508 (cf. figure ; 14) qui est introduit par transformation de protoplastes dans la souche de S. ambofaciens i contenant un gène interrompu par la cassette excisable. Le plasmide pOSV508 est dérivé $ du plasmide pWHM3 (Vara J et al,l9S9) (cf. figure 13) dans lequel ont été ajoutés i à1 § gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) placés sous le contrôle du -} promoteur ptrc (Amann, E. et al, 1988). Les gènes xis et int placés sous le contrôle du promoteur ptrc ont été sous clones dans le plasmide pWHM3 à partir du plasmide pOSint3 (Raynal et al, 1998) (cf. figure 14). L'introduction dans la souche mutante du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 va permettre l'excision efficace par recombinaison spécifique de site de la cassette excisable entre les sites attL et attR flanquant cette cassette (Raynal A. et al, 1998) (figure 10). Parmi les transformants, sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'antibiotique auquel la présence de la cassette confère la résistance (cf. figure 10). L'excision est efficace et il a été observé que plus de 90% des transformants sont de ce type. Après un ou plusieurs cycles de croissance et sporulation sur un milieu solide dépourvu de thiostrepton, on obtient des clones ayant perdu le plasmide pOSV508. Ces clones sont repérables par leur sensibilité au thiostrepton. La séquence du gène cible délété peut être vérifiée par PCR et séquençage du produit PCR.
Finalement, la souche résultante porte au niveau du gène inactivé (délétion interne par exemple) un site att « cicatriciel » correspondant au site attB minimal (Raynal et al, 1998), issu de la recombinaison entre les sites αttR et attL. Ce site attB minimal qui subsiste est semblable à celui présent naturellement dans les souches de Streptomyces ambofaciens, Streptomyces pristinaespiralis et Streptomyces lividans (Sezonov et al, 1997).
Le gène que l'on veut inactiver peut être cotranscrit avec d'autres gènes situés en aval. Pour éviter que l'inactivation d'un des gènes ait un effet polaire sur l'expression des gènes en aval dans l'opéron, il est important d'obtenir une délétion en phase après excision de la cassette. Le système des cassettes excisables tel que décrit ci-dessus permet de répondre à une telle exigence. L'homme du métier pourra, en effet, aisément construire trois cassettes excisables distinctes, celles-ci laissant après excision une séquence de 33, 34 ou 35 nucléptides respectivement, sans codon stop quelle que soit la '* ] phase de lecture. Connaissant la séquence du gène cible et la taille de la délétion ; associée à l'insertion de la cassette, il est possible de choisir entre ces trois cassettes excisables de façon à ce que l'excision conduise à une délétion en phase. Sur les 33, 34 ou 35 nucléotides rajoutés, 26 correspondent à la séquence attB minimale (cf. figure 27). Dans le cas de la présente demande, deux cassettes excisables ont été utilisées. Ces deux cassettes sont les suivantes : attlΩhyg+ (SEQ ID N° 91) et att3Ωaac- (SEQ ID N° 92), ces cassettes laissent respectivement 33 et 35 nucléotides après excision. Elles comportent respectivement la cassette Ωhyg ou la cassette Ωaac, les signes + et - correspondant à l'orientation de la cassette de résistance. Ces deux cassettes ont été construites et clonées au niveau du site EcoRV du vecteur pBC SK+ dont le site Hindlll a été suprimé au préalable. Les plasmides obtenus ont été nommés pattlΩhyg+ et patt3Ωaac- respectivement. Les cassettes excisables peuvent être facilement sorties par une digestion du plasmide par EcoRV. EXEMPLE 10 : Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orβ
L'inactivation du gène orβ a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus). La souche de départ utilisée est la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 qui dérive de la souche ATCC23877. Cependant, la souche OSC2 diffère de la souche ATCC23877 en ce qu'elle a perdu l'élément génétique mobile pSAM2 (Boccard et al, 1989a et b). Cet élément mobile peut être perdu de manière spontanée au cours de la protoplastisation (action du lysozyme pour digérer la paroi ;, bactérienne et fragmenter le mycélium (Kieser et al, 2000)) et de la régénération des protoplastes de la souche ATCC23877. Pour sélectionner les clones ayant perdu l'élément pSAM2, il a été mis en place un crible, basé sur la répression du gène pra par le répresseur de transcription KorSA (Sezonov et al, 1995) (Sezonov G. et al, 2000). <> Pour cela, un fragment d'ADN contenant le promoteur du gène pra placé en amont du .;' ;. gène aph (conférant la résistance à la kanamycine et dépourvu de son propre promoteur) }.-.-• a été clone dans le vecteur instable ρWHM3Hyg, ce dernier dérivant du plasmidej;- ;;
. 'ÀiiΛ r pWHM3 (Vara et al., 1989) dans lequel le gène tsr a été remplacé par le gène ' $$κ $ (conférant la résistance à l'hygromycine). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé s pOSV510. La souche ATCC23877 a été transformée après protoplastisation par le plasmide pOSV510. Le promoteur Pra est un promoteur réprimé par le répresseur KorSA, le gène codant ce dernier étant situé au sein de l'élément mobile pSAM2 (Sezonov G. et al, 2000). Après transformation par le plasmide pOSV510, les bactéries transformées sont sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine (due au gène aph porté par pOSV510). Les clones ayant perdu l'élément intégratif pS AM2 ont perdu le répresseur KorSA et le promoteur Pra n'est donc plus réprimé et permet l'expression du gène de résistance à la kanamycine aph. Une sélection par la kanamycine après transformation par le plasmide pOSV510 permet donc de sélectionner les clones ayant perdu l'élément intégratif pSAM2 (et donc KorSA) et possédant le plasmide pOSV510. Le plasmide pOSV510 étant instable, après quelques cycles de sporulation sans antibiotique, des clones isolés sont repiqués sur milieu avec kanamycine, sur milieu avec hygromycine et sur milieu sans antibiotique. Les clones sensibles à la kanamycine et à l'hygromycine ont perdu pOSV510. La perte de l'élément pSAM2 a été vérifiée par hybridation et PCR. Un clone présentant les caractéristiques souhaitées a été sélectionné et a été nommé OSC2.
Un échantillon de la souche OSC2 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I- 2908.
L'inactivation du gène orβ a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus et figure 10). Pour cela, un insert de 4,5 kb dont la séquence part du site EcoRI situé en position 1 jusqu'au site BamHl situé en position 4521 (SΕQ ID N° 1) a été sous-cloné au niveau des sites EcoRI et BamHl du plasmide pUCl.9 (numéro d'accès GenBank M77789) à partir du cosmide pSPM5. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pOS49.99.
Ce plasmide a été introduit dans la souche E. coli KS272 qui contenait déjà, le . plasmide pKOBΕG (Chaveroche et al, 2000) (cf. figure 12). ' ?
En parallèle, la cassette excisable att3Ωaac- (SEQ ID N° 92, cf. ci dessus) a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (Le plasmide pOSK1102 est un plasmide dérivé du vecteur ρGP704Not (Chaveroche et al, 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) dans lequel la cassette att3Ωaac- a été clonée comme un fragment EcoRV dans le site unique EcoRV de pGP704Not) et à l'aide des amorces suivantes :
ORF2A
5 ' CCCGCGCGGCAGCCTCTCCGTGATCGAGTCCGGCGTGACCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG-3 ' (SΕQ ID N° 93) ORF2B
5' GCTCCGTGCGTCATGCAGGAAGGTGTCGTAGTCGCGGTAGATCTGCCTCTTCGTCCCGAA-3 ' (SΕQ ID N° 94) Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (orβ dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Ωaac- (cf. figure 11).
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. cpli contenant les plasmides pKOBΕG et pOS49.99 comme décrit (Chaveroche et al, 2000) (cf. figure 12). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation et sélectionnées pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Ωaac-) dans le gène cible (orβ), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al,
plasmide dérive de pOS49.99 dans lequel orβ est interrompue par la cassette apramycine (cf. figure 12). L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans orβ, entre les nucléotides 211 et 492 de la partie codante de orβ.
Le plasmide pSPM17 a été digéré par l'enzyme EcoRI puis les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow, ce produit de digestion a été ensuite digéré par l'enzyme Xbal et l'insert contenant le gène orβ délété a été clone dans le vecteur pOSK1205 (cf. ci dessus). Pour cela, le vecteur pOSK1205 a été digéré par l'enzyme BamHl puis les extrémités ont été rendues bout franc par traitement à l'enzyme de Klenow, ce produit a été ensuite digéré par l'enzyme Xbal, et utilisé pour la ligâtion avec l'insert obtenu à partir de pSPM17 comme ci-dessus. Cette manipulation permet donc d'obtenir une ligâtion orientée puisque chacun des deux fragments est bout franc d'un côté et Xbal de l'autre. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM21, il porte un gène de résistance à l'hygromycine (partie vecteur) et un insert dans lequel le gène orβ délété est remplacé par la cassette att3Ωaac-.
Le vecteur pSPM21 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al, 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milie avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orβ interrompu par la cassette att3Ωaac-. Ces clones ont été sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orβ par la copie interrompue par la cassette a été vérifié. La présence de la cassette att3Ωaac- a été vérifiée par PCR sur colonie. Une hybridation a également été effectuée. Pour cela, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybride avec une sonde de 3 kb correspondant à un fragment EcoRI- BamHÎ de l'insert du plasmide pOS49.99 (cf. ci-dessus). La vérification du génotype ; peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et '' notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues a été sélectionné et nommé
SPM21. Il a pu être vérifié grâce à la PCR et à l'hybridation que la cassette att3Ωaac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Ωaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orβ::att3Ωaac-.
Un échantillon de la souche SPM21 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I- 2914. La souche SPM21 a été transformée par le vecteur pOSV508 par transformation de protoplastes pour provoquer l'excision de la cassette (cf. figure 14). Le plasmide pOSV508 est dérivé du plasmide pWHM3 (Vara J et α .,1989) (cf. figure 13) dans lequel il a été ajouté les gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al, 1989b) placé sous le contrôle du promoteur ptrc (Amann, E. et al, 1988) (cf. figure 14). L'introduction dans la souche SPM21 du plasmide pOSV508 portant les gènes xis et int de pSAM2 permet l'excision efficace par recombinaison spécifique de site de la cassette excisable entre les sites attL et attR flanquant cette cassette (Raynal A. et a , 1998) (figure 10). Parmi les transformants sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'apramycine dont le gène de résistance est porté par la cassette att3Ωaac-, l'excision entraîne en effet la perte de ce gène de résistance (cf. figure 10). Le plasmide pOSV508 est instable et après deux passages successifs sur milieu sans antibiotique des clones isolés sont repiqués sur ; milieu avec thiostrepton et sur milieu sans thiostrepton. Les clones sensibles au ;' =:. thiostrepton ont perdu pOSV508. H a été vérifié que l'excision de la cassette aboutit bien ' • •; , à une délétion en phase dans le gène orβ par PCR et séquençage du produit PCR, ^i l'excision de la cassette laissé en effet une séquence '« cicatricielle » att3 caractéristique % (qui est similaire au site attB d'origine après recombinaison entre les sites attL et attR) :
5' ATCGCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3' (SEQ ID N° 95).
La souche ainsi obtenue et possédant le génotype voulu (orβ::att3) a été nommée SPM22.
Un échantillon de la souche SPM22 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement I- 2915. 004/033689
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EXEMPLE 11 : Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfl2
Pour l'inactivation de orfl2, orfl3c et orfl4 un même plasmide de départ (pSPM504) a été employé pour introduire à différentes positions une cassette de type « cassette excisable ». Ce plasmide possède un insert de 15,1 kb qui correspond à la région de orβ à orfl 7. Pour construire ce plasmide un' fragment BgHl de 15,1 kb provenant de la digestion du cosmide pSPM7 (cf. ci-dessus) a été clone dans le plasmide pMBL18 (Nakano et al, 1995) digéré par BamHl. Les extrémités BamHl et BglTL étant compatibles, on obtient après ligâtion, le plasmide pSPM502. La totalité de l'insert de pSPM502 a ensuite été sous-cloné (sous forme d'un fragment HindUl/Nhel) dans le plasmide pOSK1205 (digéré par HindlUJNheï) ce qui a permis d'obtenir le plasmide pSPM504.
Ce plasmide a été introduit dans la souche E. coli KS272 qui contenait déjà le plasmide pKOBEG (Chaveroche et αl, 2000) (cf. figure 12).
En parallèle, la cassette excisable αtt3Ωααc- à été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSKl 102 (le plasmide pOSKl 102 est un plasmide dérivé du vecteur ρGP704Not (Chaveroche et αl, 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) dans lequel la cassette αtt3Ωααc- a été clonée comme un fragment EcoRV dans le site unique EcoRV de pGP704Not), les amorces utilisées sont les suivantes :
ΕDR8 : 5' CGGGATGATCGCTTGTCCGGCGGCCGGATGCCTAGCCTCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3 ' (SΕQ ID N° 96)
ΕDR9 : 5 ' CCCGATCCAGAACGTCTGGTCGGTGATCAGGTCGCTGTTCATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3 ' (SΕQ ID N° 97)
Les 40 (seulement 39 pour ΕDR8) déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène 004/033689
133
cible (orfl 2 dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Ωaac- (cf. figure 11).
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli KS272 contenant les plasmides pKOBΕG et pSPM504 (cf. ci-dessus), comme décrit par Chaveroche et al. (Chaveroche* et al, 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49.99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM507). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par ce produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Ωaac~) dans le gène cible (orfl 2), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al, 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençagié ? ;(] du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été sélectionné et le plasmide correspondant a été nommé pSPM507. Ce plasmide dérive de pSPM504 dans lequel orfl 2 est interrompue par la cassette att3Ωaac- (cf. figure 12). L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orfl 2, l'interruption commence au niveau du trentième codon de orf 12. Il reste après la cassette les 46 derniers codons de orfl2.
Le vecteur pSPM507 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al, 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hy romycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orf 12 interrompu par la cassette att3Ωaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orfl 2 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybride avec une sonde correspondant à la cassette att3Ωaac- pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un fragment d'ADN obtenu par PCR et correspondant à une très large partie de la séquence codante du gène or 72.
La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orfl2::att3Ωaac-) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM507. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3Ωaac- était bien présente dans le génome de ce ' clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un ' remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par .'> η la copie interrompue par la cassette att3Ωaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orfl2::att3Ωaac- et a été nommé SPM507. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl2, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). En effet, le fait que orfl3c soit orienté en sens opposé à orfl 2 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment, notamment par transformation par le plasmide pOSV508. Un échantillon de la souche SPM507 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2911. EXEMPLE 12 : Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfl3c
La cassette excisable att3Ωaac- a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSKl 102 (cf. ci-dessus) à l'aide des amorces suivantes :
EDR3 : 5' ACCGGGGCGGTCCTCCCCTCCGGGGCGTCACGGCCGCGGAATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3 ' (SEQ ID N° 98)
EDR4 : 5' CACGCAGCGAGCCGACGCACTGATGGACGACACGATGGCCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' (SEQ ID N° 99)
10
Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (orfl 3 c dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) ' correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Ωaac- (cf. =. 15 figure 11). N
: Y Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. cόliX
KS272 contenant les plasmides pKOBEG et pSPM504 (cf. ci-dessus), comme décrit par ' • Chaveroche et al. (Chaveroche et al, 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49.99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus
20 pSPM17 mais pSPM508). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par le produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3Ωaac-) dans le gène
25 cible (orfl 3c), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al, 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été sélectionné
30 et le plasmide correspondant a été nommé pSPM508. Ce plasmide dérive de pSPM504 dans lequel orfl 3c est interrompue par la cassette apramycine (cf. figure 12). L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orfl3c, l'interruption commence au niveau du sixième codon de orfl3c. Il reste après la cassette les 3 derniers codons de orfl3c.
Le vecteur pSPM508 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens
OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al, 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec ; apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orfl 3c interrompu par la cassette att3Ωaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orfl3c par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré .; sur membrane et hybride avec une sonde correspondant à la cassette att3Ωaac- pό if | vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une : deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un produit de PCR correspondant à une séquence débordant d'une centaine de paires de base en amont et en aval de la séquence codante de orfl 3c. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orfl 3c: :att3Ωaac-) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM508. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3Ωaac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Ωaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orfl3c::att3Ωaac- et a été nommé SPM508. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl3c, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que orfl 4 soit orienté en sens opposé à orfl3c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Un échantillon de la souche SPM508 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2912.
EXEMPLE 13 Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfl4
La cassette excisable att3Ωaac- a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSKl 102 (cf. ci-dessus) à l'aide des amorces suivantes :
EDR5 : 5'GGGCGTGAAGCGGGCGAGTGTGGATGTCaTGCGAGTACTCATCGCGCGCGCTTCGTTCGO 3 ' (SEQ ID N° 100)
EDR6 : 5 ' CGGGAAACGGCGTCGCACTCCTCGGGGGCCGCGTCAGCCCATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3 ' (SEQ ID N° 101)
Les 40 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène cible (orfl4 dans le cas présent) et les 20 déoxy-nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3Ωaac- (cf. figure 11).
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli KS272 contenant les plasmides pKOBEG et pSPM504 (cf. ci-dessus), comme décrit par Chaveroche et al. (Chaveroche et al, 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49.99 doit être remplacé par le plasmide pSPM504 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM509). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par le produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les plasmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (attSΩaac-) dans le gène cible (orfl 4), c'est à dire si il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible (Chaveroche et al, 2000). La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR. Un clone dont le plasmide possède le profil attendu a été sélectionné
Le vecteur pSPM509 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al, 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec hygromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orfl 4 interrompu par la cassette att3Ωaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orfl4 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybride avec une sonde correspondant à la cassette att3Ωaac- pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un produit de PCR correspondant à une séquence débordant d'une centaine de paires de base en amont et en aval de la séquence codante de orf 14. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orfl4::att3Ωaac-) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM509. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3Ωaac- était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3Ωaac- dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orfl4::att3Ωaac- et a été nommé SPM509. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl.4, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que orflSc soit orienté en sens opposé à or/14 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de [ i sélection à tout moment. Un échantillon de la souche SPM509 a été déposé auprès dé ;la ; Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2913.
EXEMPLE 14: Construction d'une souche de Streptomyces ambofaciens interrompue dans le gène orfό*
L'inactivation du gène orfό* a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables (cf. ci-dessus et figure 10). Pour cela, le cosmide pSPM7 a été utilisé comme matrice pour amplifier un fragment du gène orfό* grâce aux oligonucléotides suivants :
C9583 : 5' CTGCAGGTGCTCCAGCGCGTCGATCT 3' (oligo sens) (SEQ ID N° 102) C9584 : 5' CTGCAGACGGAGGCGGACCTGCGGCT 3' (oligo antisens) (SEQ ID N° 103)
Les 20 déoxy-nucléotides situés à l'extrémité 3' de ces oligonucléotides correspondent à une séquence située dans la partie codante du gène orfό* (SEQ ID N° 13) et les 6 déoxy-nucléotides situés les plus en 5' correspondent à la séquence d'un site
Pstl permettant de faciliter le clonage par la suite. Le fragment d'ADN amplifié fait une taille d'environ 1,11 kb. Ce produit de PCR est clone dans le vecteur pGEM-T Easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)) ce qui a permis d'obtenir le plasmide nommé pBXLl 111 (cf. figure 16).
La cassette excisable attlΩhyg+ a ensuite été introduite dans la séquence codante du gène orfό*. Pour cela, le plasmide pBXLl ll l a été digéré par les enzymes de restriction Smal et AspllSl et le produit de digestion a été traité par l'enzyme de Klenow. Cette manipulation permet de réaliser une délétion interne de 120 pb dans la séquence codante du gène orfό* (cf. figure 15). De plus, de part et d'autre des sites de restrictions, il reste respectivement 511 pb et 485 pb de la séquence de orfό* qui permettront la recombinaison homologue pour l'inactivation du gène orfό*. La cassette ' excisable attlΩhyg+ a été préparée à partir du plasmide pattlΩhyg+ (cf. ci-dessus) par digestion de ce plasmide par EcoRV. Cette dernière a ensuite été sous-clonée dans le vecteur pBXLl l l l préalablement préparé comme décrit ci-dessus (digestion Smal et AspllSl puis traitement à l'enzyme de Klenow). Le plasmide obtenu a été nommé pBXLl 112 (cf. figure 17). Dans cette construction, le gène orfό* comporte une délétion de 120pb et est interrompu par la cassette attlΩhyg+.
Le plasmide pBXL1112 a été ensuite digéré par l'enzyme Pstl (site bordant la cassette puisque présent dans les oligonucléotides PCR) et l'insert Pstl de 3.7 kb comprenant une partie de orfό* interrompu par la cassette attlΩhyg+ a ensuite été clone au niveau du site Pstl du plasmide pOJ260 (cf. ci-dessus). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pBXLl 113. Le vecteur pBXL1113 a été introduit dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. ci-dessus) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al, 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. Les clones résistants à l'hygromycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec hygromycine (antibiotique B) et sur milieu avec apramycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'hygromycine (HygR) et^sensibles à l'apramycine (ApraS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orfό* interrompu par la cassette attlΩhyg+. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orfό* par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par la technique du Southern blot. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybride avec une sonde correspondant au gène hyg (obtenu par PCR) pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde l'insert Pstl-Pstl contenant le gène orfό*, d'une taille d'environ 1,1 kb et obtenu à partir r du plasmide pBXLllll (cf. ci-dessus et fig re 16). La vérification du génotype pêμ également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment '-\ par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et séquençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orfό*::attlΩhyg+) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM501. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette attlΩhyg+ était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette attlΩhyg+ dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orfό*::attlΩhyg+ et a été nommé SPM501. Un échantillon de la souche SPM501 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2909. La souche SPM501 a été transformée par le vecteur pOSV508 par transformation de protoplastes pour provoquer l'excision de la cassette (cf. figure 14). Le plasmide pOSV508 est dérivé du plasmide pWHM3 (Vara J et a/., 1989) (cf. figure 13) dans lequel les gènes xis et int de pSAM2 (Boccard F. et al, 1989b) placés sous le contrôle du promoteur ptrc (Amann, E. et al, 1988) ont été ajoutés (cf. figure 14). L'introduction dans la souche SPM501 du plasmide pOSV508 portant leè- gènes xis et int de pSAM2 permet l'excision efficace par recombinaison site spécifique de la cassette excisable entre les sites attL et αttR flanquant cette cassette (Raynal A. et al, 1998) (figure 10). Parmi les transformants, sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton due au gène tsr porté par pOSV508, on choisit ceux devenus sensibles à l'hygromycine dont le gène de résistance est porté par la cassette attlΩhyg+, l'excision entraîne en effet la perte de ce gène de résistance (cf. figure 10). Le plasmide pOSV508 est instable et après deux passages successifs sur milieu sans antibiotique des clones isolés sont repiqués sur milieu avec thiostrepton et sur milieu sans thiostrepton. Les clones sensibles au thiostrepton ont perdu pOSV508. Il a été vérifié que l'excision de la cassette a bien eu lieu en phase dans le gène orfό* par PCR et séquençage dμ produit PCR. L'interruption ;H commence au 158 codon, 40 cPdons sont délétés (120pb) et l'excision de la cassette 1^; laisse une séquence « cicatricielle » attl caractéristique de 33pb : 5' ATCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3' (SEQ ID N° 104).
La souche ainsi obtenue et possédant le génotype voulu (orfό*::attl) a été nommée SPM502.
Un échantillon de la souche SPM502 a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2910. EXEMPLE 15 : Analyse des souches de Streptomyces ambofaciens interrompue dans les gènes orβ, orβ, orβ, orflO, orfl2, orfl3c, orfl4, orfό*
Pour tester la production en spiramycine des diverses souches obtenues, un test microbiologique basé sur la sensibilité d'une souche de Micrococcus luteus a été mis au point (cf. (Gourmelen A. et al., l99S)). La souche de Micrococcus luteus utilisée est une souche dérivée de la souche DSM 1790 naturellement sensible à la spiramycine (cette souche est disponible notamment auprès de la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschweig, Allemagne), sous le numéro DSM 1790), la souche utilisée dans le présent test diffère de la souche DSM1790 en ce qu'elle est résistante à la congocidine. Cette souche est un mutant spontané obtenu par sélection sur milieu contenant des doses croissantes de congocidine. Une telle souche a été sélectionnée du fait que Streptomyces ambofaciens produit à la fois de la spiramycine et de la y congocidine. Le but étant de doser la production en spiramycine des diverses souches :f ; ;-'; obtenues grâce à un test microbiologique basé sur la sensibilité d'une souche de l Micrococcus luteus, il est nécessaire de disposer d'une souche résistante à !;ïà;'îf congocidine.
Les différentes souches de Streptomyces à tester ont été cultivées dans des erlenmeyers à baffles (erlenmeyers chicanés) de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al, 1993). Les erlenmeyers chicanés ont été inoculés à une concentration initiale de 2.5 106 spores/ml des différentes souches de S. ambofaciens et mises à pousser à 27°C sous agitation orbitale de 250 rpm. Des prélèvements de 2 ml de suspensions ont été réalisés après 48, 72 et 96 heures de culture et centrifugés. Les différents surnageants ont ensuite été congelés à -20°C. Une dilution au dixième de ces surnageants dans du milieu de culture stérile est utilisée pour le test (cf. figure 18).
La souche indicatrice de Micrococcus luteus résistante à la congocidine mais sensible à la spiramycine a été cultivée dans du milieu 2TY (Sambrook et al, 1989) contenant de la congocidine à 5 μg/ml pendant 48h à 37°C. La densité optique (DO) de la culture est mesurée et cette culture est diluée de façon à ajuster la densité optique à 4. 0,4 ml de cette pré-culture est dilué dans 40 ml de milieu DAM5 (Difco Antibiotic Médium 5, commercialisé par la société Difco), préalablement porté à une température d'environ 45°C. Ce milieu est ensuite coulé dans une boîte carrée de 12x12 cm et laissé à reposer à température ambiante.
»
Une fois le milieu refroidi et solidifié, des disques en papier Whatman AA (cf. Gourmelen A. et al, 1998) de 12 mm de diamètre ont été imbibés de 70 μl de la dilution au dixième de chaque surnageant et déposés sur la surface de la boîte. Des disques imbibés d'une solution de spiramycine de différentes concentrations (2-4-8 μg/ml dans du milieu de culture MP5) sont utilisés comme gamme étalon. Les boîtes sont laissées à 4°C pendant 2 h de façon à permettre la diffusion des antibiotiques dans l'agar puis sont incubées à 37°C pendant 24 à 48h.
Si le disque contient de la spiramycine, celle-ci diffuse dans l'agar et inhibe la croissance de la souche indicatrice de Micrococcus luteus. Cette inhibition crée un « halo » autour du disque, ce halo reflétant la zone où la souche de Micrococcus luteus , n'a pas poussé. La présence de ce halo est donc une indication de la présence de spiramycine et permet de déterminer si la souche de S. ambofaciens correspondant au disque en question est productrice ou non productrice de spiramycine. Une comparaison avec les diamètres d'inhibition obtenus pour la gamme étalon permet d'obtenir une indication de la quantité de spiramycine produite par cette souche.
Les différentes souches décrites dans les exemples précédents ont été utilisées dans ce test pour détecter leur production en spiramycine. Les résultats obtenus ont été regroupés dans le Tableau 38. Tableau 38
Ces résultats permettent de tirer un certain nombre de conclusions en ce qui concerne la fonction des différents gènes impliqués dans la biosynthèse de la spiramycine. Ainsi le gène orβ est essentiel à la biosynthèse de la spiramycine. En effet une inactivation en phase dans ce gène conduit à une souche (OS49.67, (cf. exemple 6)) ne produisant plus de spiramycine. L'inactivation en phase permet d'écarter l'hypothèse d'une éventuelle influence de la cassette introduite sur l'expression des gènes situés en aval de orβ.
De même,- les gènes orβ et orf 10 codent des protéines essentielles à la biosynthèse de la spiramycine puisque les souches OS49.107 et OS49.50 ont un phénotype non producteur. De plus, dans ces deux dernières souches, c'est bien l'inactivation du gène correspondant qui est responsable de ce phénotype non producteur, puisqu'au vu de l'orientation des différentes orfs (cf. figure 3), la construction introduite ne peut avoir d'effet polaire.
L'étude des souches possédant une cassette excisable permet également de tirer un certain nombre de conclusion en ce qui concerne la fonction des gènes interrompus. La souche SPM507 possède le génotype : orfl2::att3Ωaac-. H est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orf!2, au vu de ! l'orientation des gènes (cf. figure 3). Le fait que orf!3c soit orienté en sens opposé à orfl2 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM507 est non producteur, on peut donc en conclure que le gène orfl2 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.
La souche SPM508 possède le génotype : orfl3c::att3Ωaac-. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl 3c, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). Le fait que orf!4 soit orienté en sens opposé à orf!3c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d 'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM508 est producteur, on peut donc en conclure que le gène orfl3c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.
La souche SPM509 possède le génotype : orfl4::att3Ωaac-. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orfl.4, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3), le fait que orflSc soit orienté en sens opposé à orfl4 montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment. Le phénotype de la souche SPM509 est non producteur, on peut donc en conclure que le gène orfl 4 est un gène essentiel à la biosynthèsè de la spiramycine chez S. ambofaciens.
La souche SPM21 possède le génotype : orβ::att3Ωaac-, Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cependant, l'orientation des gènes orfl à orβ (cf. figure 3) laisse penser que ces gènes sont cotranscrits. Aussi, le phénotype observé peut être dû à un effet polaire de la cassette introduite dans orβ sur l'expression ;; de gènes situés en aval dans ï'opérόn. La souche SPM22 possède le génotype orβ::att3, -. et a été obtenue après excision en phase de la cassette introduite. L'excision de la cassette laisse seulement une séquence « cicatricielle » caractéristique (cf. exemple 10). La souche SPM22 étant également de phénotype non producteur, on peut en conclure que le gène orβ est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. On observe ici uniquement l'effet dû à l'inactivation de orβ.
La souche SPM501 possède le génotype : orfό*::attlΩhyg+. Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cependant, les gènes orβ* et orfό* (cf. figure 3) ayant la même orientation, le phénotype observé peut être dû à un effet polaire de la cassette introduite dans orfό* sur l'expression de orβ*. La disposition de ces gènes laisse penser qu'ils peuvent être cotranscrits. Pour répondre à cette question, la souche SPM502 a été obtenue après excision en phase de la cassette introduite. Dans cette souche, on observe uniquement l'effet de l'inactivation de orfό*. Cette souche possède le génotype orfό*::attl (cf. exemple 14). L'excision de la cassette laisse seulement une séquence « cicatricielle » en phase (cf. exemple 14). La souche SPM502 possède un phénotype producteur (cette souche ne produit cependant que de la spiramycine I (cf*. exemple 16)). On peut donc conclure que le gène orβ* est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens, puisque son inactivation indirecte dans la souche SPM501 conduit à un phénotype non producteur. Par contre ; le gène orfό* n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine I chez S. ambofaciens (par contre il est essentiel à la production de spiramycine II et Ht (cf. exemple 16)). !
EXEMPLE 16. Dosage de la production des spiramycines I, II et III dans les souches mutantes obtenues
Les différentes souches à tester ont été cultivées chacune dans 7 erlensmeyers ;j,g chicanés de 500 mL contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al, 1993). Les értéi&Éj ont été inoculés par 2.5 106 spores/ml des différentes souches de S. ambofaciens et mises à pousser à 27°C sous agitation orbitale de 250 rpm pendant 72 heures. Les cultures correspondant au même clone sont rassemblées, éventuellement filtrées sur filtre plissé, et centrifugées 15 min à 7000 tr/min. Les différents surnageants ont ensuite été stockés à -30°C.
Les dosages ont été effectués par Chromatographie Liquide à Haute Performance
(CLHP) par appariement d'ions. L'analyse CLHP du milieu de culture permet de déterminer précisément la concentration des trois formes de spiramycine. La colonne utilisée (Macherey-Nagel) est remplie avec une phase Nucleosil de silice greffée octyle. La granulométrie est de 5μm et la taille des pores 100Â. Le diamètre interne de la colonne est de 4,6mm et sa longueur 25cm. La phase mobile est un mélange de tampon H3PO4 (pH2,2) et d'acétonitrile 70/30 (v/v) contenant 6,25g/L de perchlorate de NaGO4. L'analyse est réalisée en régime isocratique avec un débit fixé à 1 ml/min. La colonne est thermorégulée à 23 °C. La détection est assurée par spectrophotométrie UV à 238nm. L'échantillon est réfrigéré à +10°C et la quantification est déterminée à partir de l'aire des pics (par étalonnage externe). Dans ces conditions, les temps de rétention de la spiramycine I, II et III sont respectivement d'environ 17; 21 et 30 minutes, comme il a pu être vérifié grâce à un échantillon commercial comprenant les trois formes de spiramycine.
La souche OSC2 possède un phénotype producteur de spiramycine. C'est la souche parentale utilisée pour l'obtention des souches possédant une cassette excisable
(cf. exemple 15). Cette souche a donc été utilisée comme témoin positif de production des trois formes de spiramycine. Cette souche produit bien les trois formes de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 19).
L'étude des souches possédant une cassette excisable permet de tirer un certain nombre de conclusions en ce qui concerne la fonction des gènes interrompus. La souche ; SPM507 possède le génotype : orf!2::att3Ωaac-. Le phénotype de la souche SPM507 est non producteur (cf. exemple 15), on petit donc en conclure que le gène orfl 2 est μn'; fi gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche ne produit plus de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 22). Ce résultat confirme le caractère essentiel du gène orfl 2 dans la biosynthèse de la spiramycine.
La souche SPM508 possède le génotype : orfl3c::att3Ωaac-. Le phénotype de la souche SPM508 est producteur de spiramycine (cf. exemple 15), on peut donc en conclure que le gène orfl3c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche produit de la spiramycine I, II et III comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 23). Ce résultat confirme que le gène orfl 3c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse des spiramycines I, II et III ches S. ambofaciens.
La souche SPM509 possède le génotype : orfl4::att3Ωaac-. Le phénotype de la souche SPM509 est non producteur, on peut donc en conclure que le gène orfl 4 est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Cette souche ne produit plus de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 24). Ce résultat confirme Pessentialité du gène orfl 4 dans la biosynthèse de la spiramycine.
La souche SPM501 possède le génotype : orfό*::att!Ωhyg+. Le phénotype de cette souche est non producteur de spiramycines. Cette souche ne produit pjus de spiramycines comme il a été vérifié par CLHP (cf. figure 20). Cependant, les' gènes orβ* et orfό* (cf. figure 3) ayant la même orientation, le phénotype observé peut être dû à un effet polaire de la cassette introduite dans orfό* sur l'expression de orβ* dans l'opéron. Ceci laisse penser que ces gènes sont cotranscrits. Pour répondre à cette question, la souche SPM502 a été obtenue par excision de la cassette introduite, produisant une délétion en phase dans le gène or 6* et restaurant l'expression de orβ*. Cette souche possède le génotype orfό*::attl (cf. exemple 14 et 15). L'excision de la cassette laisse seulement une séquence att « cicatricielle » en phase (cf. exemple 14). La souche SPM502 possède un phénotype producteur de spiramycine. Cependant, comme il a été prouvé par CLHP, cette spuche ne produit que de la spiramycine I et ne produit pas 1 de spiramycine II et El (cf. figure 21). On peut donc conclure de ces résultats que le gène ' orβ* est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens, puisque son inactivation indirecte dans la souche SPM501 conduit à un phénotype non producteur de spiramycine (cf. figure 20). Par contre ; le gène orfό* n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine I chez S. ambofaciens, puisque l'inactivation de ce gène conduit à un phénotype producteur de spiramycine I (cf. figure 21). Cependant, orfό* est essentiel à la production de spiramycine II et III (cf. exemple 16)). Le gène orfό* code donc bien une acyl-transférase responsable de la modification du platénolide à la position 3 (cf. figure 1). EXEMPLE 17 : Détermination du point de démarrage de la traduction de orf 10 et amélioration de la production en spiramycines
17.1 Construction des plasmides pSPM523, pSPM524 et pSPM525 :
Le gène or/70 a été identifié chez Streptomyces ambofaciens et a été désigné srmR par Geistlich et al (Geistlich, M., et al, 992% L'inactivation du gène orflO a été réalisée (cf. exemple 8). Il a pu ainsi être montré que la souche résultante ne produit plus de spiramycines (cf. exemple 15). Ceci confirme que le gène orflO est bien impliqué dans la biosynthèse des spiramycines. La protéine codée par ce gène ; : est donc bien essentielle à la biosynthèse des spiramycines. Cependant, l'analyse de la séquence montre que deux codons ATG situés dans la même phase de lecture peuvent être utilisés pour la traduction de orflO (cf. Figure 28). Un des deux codons possible (le codons le plus en amont) démarre à la position 10656 de la séquence
Dans le but de déterminer le site de démarrage de la traduction, trois constructions comportant trois formes d'orflO ont été réalisées. Ces dernières ont été obtenues par PCR en utilisant des oligonucléotides comportant soit un site de restriction H dlII soit un site de restriction BamHl.
Le premier couple utilisé pour l'amplification correspond aux oligonucléotides suivants :
EDR39 :
5 'CCCAAGCTTGAGAAGGGAGCGGACATTCATGGCCCGCGCCGAACGC3 ' (SEQ ID N° 122) (le site Hindlll figure en gras)
EDR42 :
5'CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3'
(SEQ ID N° 123) (le site BamHl figure en gras) Le couple d'amorces EDR39-EDR42 permet l'amplification d'un fragment d'or 70 comportant l'ATG situé le plus en 3' (position 10809 dans la séquence donnée en
SEQ ID N° 1) (cf. Figure 28). Le fragment obtenu fait une taille d'environ 2 kb et sera appelé par la suite "or/70 court", il ne contient pas le promoteur de orflO. Ce fragment de 2kb a été clone dans le vecteur pGEM-T easy pour donner naissance au plasmide pSPM520.
Le deuxième couple utilisé pour l'amplification correspond aux oligonucléotides suivants :
EDR40 : 5 'CCCAAGCTTGAGAAGGGAGCGGACATTCAATGCTTTGGTAAAGCAC3 '
(SEQ ID N° 124) (le site Hindlll figure en gras)
EDR42 :
5'CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3'
(SEQ ID N° 123) (le site BamHl figure en gras) Le couple d'amorces EDR40-EDR42 permet l'amplification d'un fragment d'orflO comportant l'ATG situé le plus en 5' (position 10656 dans la séquence donnée en
SEQ ID N° 1) (cf. Figure 28). Ce fragment de 2,2 kb appelé par la suite "orflO long" a été clone dans le vecteur pGEM-T easy pour donner naissance au plasmide pSPM521, ce plasmide ne contient pas le promoteur de or/70. Le troisième couple utilisé pour l'amplification correspond aux oligonucléotides suivants :
EDR41 :
5 '-CCCAAGCTTTCAAGGAACGACGGGGTGGTCAGTCAAGT-3 '
(SEQ ID N° 125) (le site Hindlll figure en gras) EDR42 :
5'CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3'
(SEQ ID N° 123) (le site R mHI figure en gras)
Le couple d'amorces EDR41-EDR42 permet l'amplification du gène or/70 avec les deux ATG, ainsi que son propre promoteur (cf. Figure 28). Ce fragment de 2,8 kb appelé par la suite "orf 10 pro" a été clone dans le vecteur pGEM-T easy pour donner naissance au plasmide pSPM522.
Le fragment "or 70 pro" a été obtenu en utilisant comme matrice l'ADN chromosomique de la souche OSC2. Les fragments "or/70 court" et "or/70 long" ont quant à eux été obtenus en utilisant comme matrice l'ADN du fragment "or 70 pro" préalablement purifié.
Les inserts HindlYL-BamHl des plasmides pSPM520, pSPM521 et pSPM522 ont ensuite été sous-clonés dans le vecteur ρUWL201 (plamside dérivé du plasmide pUWL199 (Wehmeier UF, 1995) dans lequel le fragment Kpnl-BamHl de la région du promoteur de ermE (cf. Bibb et al., 1985, notamment figure 2) portant une mutation augmentant la force du promoteur (promoteur ermΕ*) (Bibb et al, 1994) a été introduit (cf. Doumith et al, 2000)) préalablement digéré par les enzymes H dlII-iîαmHI. Ainsi, il a été obtenu trois plasmides : pSPM523 (dérivé du pUWL201 avec la forme "or/70 court" comme insert), pSPM524 (dérivé du pUWL201 avec la forme "or/70 long" comme insert) et pSPM525 (dérivé ρUWL201 avec la forme "or/70 pro") (Figure 28).
17.2 Transformation de la souche OS49.50 par les constructions pSPM523, pSPM524 et pSPM525 :
La souche OS49.50 (souche interrompue dans le gène or/70, cf. exemple 8) a été transformée indépendamment par transformation de protoplastes (Kieser, T et al, 2000) par chacun des plasmides pSPM523, pSPM524 et pSPM525. Un témoin négatif a également été réalisé en transformant la souche OS49.50 par le plasmide pUWL201 sans insert. Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au au thiostrepton. La transformation des clones par chacun des plamides est vérifiée par extraction de ces plasmides. Ainsi quatre nouvelles souches ont été obtenues : la souche OSC49.50 pUWL201, issue de la transformation par le plasmide pUWL201 sans insert, la souche OSC49.50 pSPM523, issue de la transformation par le plasmide pSPM523, la souche OSC49.50 pSPM524, issue de la transformation par le plasmide pSPM524 et enfin la souche OS49.50 ρSPM525, issue de la transformation par le plasmide ρSPM525.
La production de spiramycines de chacune de ces quatre souches a été testée par CLHP. Pour cela, les différentes souches de Streptomyces à tester ont été cultivées dans des erlenmeyers à baffles (erlenmeyers chicanés) de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et α/.,*1993). Lorsque la souche contient le plasmide pUWL201 ou l'un de ses dérivés, il est ajouté 5 μg/ml de thiostrepton. Les erlenmeyers chicanés ont été inoculés à une concentration initiale de 2.5 10 spores/ml des différentes souches de S. ambofaciens et les cultures ont été incubées à 27°C sous agitation orbitale de 250 φm pendant 96 heures. Les cellules ont ensuite été séparées du milieu par centrifugation et le surnageant a été analysé par CLHP (cf. exemple 16) pour déterminer la quantité de spiramycine produite. Grâce à un échantillon étalon et à la mesure de l'air des pics, il a été possible de déterminer la quantité de chacune des spiramycines produites par ces souches. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 39, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant. Les résultats" correspondent à la production totale en spiramycines (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et lu).
Tableau 39. Production en spiramycines des souches dérivées de OS49.50, (résultats exprimés en mg/1).
Comme le montre les résultats donnés dans le tableau 39, le témoin négatif (souche OS49.50 transformée par le plasmide pUWL201) ne produit pas de spiramycine. Lorsque le plasmide pSPM523 (qui contient la forme "or/70 court" ) est introduit d'ans la souche OS49.50, aucune production de spiramycine n'est observée. 5 En revanche, la présence du plasmide pSPM524 (qui contient la forme "or/70 long") et du plasmide pSPM525 (qui contient la forme "or/70 pro") restaure la production de spiramycine dans la souche hôte OS49.50. Ainsi, seuls les fragments de or/70 contenant l'ATG le plus en amont permettent de restaurer la synthèse de spiramycine.
Dans le but de confirmer ces résultats, le plasmide pSPM521 (plasmide
10 pGEM-T easy contenant la forme "or/70 long") a été digéré par l'enzyme de , . restriction Xhol (cette enzyme possède un site unique dans ce plasmide, localisé entre • ' les deux ATG (cf. Figure 28)). Les extrémités Xhol ont ensuite été rendues bout franc ,; jg
; ; par traitement à l'enzyme de Klenow. Le plasmide a alors été refermé sur lui-même ;; :^ par action de la T4 DNA ligase pour donner naissance au plasmide pSPM527. Si 15 l'ATG le plus en amont (position 10656 dans la séquence donnée en SEQ ID N° 1) est bien utilisé comme site d'initiation de la traduction, ce traitement entraînera un décalage du cadre de lecture au niveau du site .Λ^ol et aura pour effet la production d'une protéine ne présentant pas d'activité activatrice. Par contre si l'initiation de la traduction a lieu au niveau de l'ATG plus en aval (position 10809 dans la séquence 20 donnée en SEQ ID N° 1), ce traitement devrait avoir peu ou pas d'effet sur l'expression de OrflO (compte tenu de la localisation du point de démarrage de la transcription) et aucun effet sur la protéine produite.
L'insert BamHl-Hindlll de pSPM527 a ensuite été sous-cloné dans le vecteur pUWL201 pour donner naissance au plasmide pSPM528. Ce plasmide a été introduit
25 dans la souche OS49.50 et un clone possédant le plasmide voulu a plus particulièrement été sélectionné. La production de spiramycine de la souche résultante a ensuite été testée par CLHP (Cf. exemple 16 et ci-dessus). Contrairement à ce qui avait été observé avec le plasmide pSPM524 (cf. tableau 39), la présence du plasmide pSPM528 dans la souche OS49.50 ne rétablit pas la production de spiramycine. Ceci confirme que le démarrage de la traduction du gène orflO est 5 l'ATG situé le plus en aval (ATG 1 cf. Figure 28).
»
17.3 Amélioration de la production en spiramycines de la souche OSC2 de S. ambofaciens :
Afin de tester l'effet de la surexpression du gène or/70 sur la production de spiramycines, les plasmides pSPM523, pSPM524, pSPM525 et pSPM528 ont été
10 introduits dans la souche OSC2. Pour cela, des protoplastes de la souche OSC2 ont été transformés (Kieser, T et al, 2000) indépendamment par chacun des plasmides pSPM523, pSPM524, pSPM525 et ρSPM528. Un témoin négatif a également été réalisé en transformant la souche OSC2 par le plasmide pUWL201 sans insert. Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au au thiostrepton. Ainsi cinq nouvelles souches ont été obtenues : la souche OSC2 pUWL201, issue de la transformation par le plasmide pUWL201 sans insert, la souche OSC2 pSPM523, issue de la transformation par le plasmide pSPM523, la souche OSC2 pSPM524, issue de la transformation par le plasmide pSPM524, la souche OSC2 pSPM525, issue de la transformation par le plasmide pSPM525 et
20 enfin la souche OSC2 pSPM528, issue de la transformation par le plasmide pSPM528. La production en spiramycines de ces souches a alors été analysée par CLHP (de la même manière que dans l'exemple 17.2). L'analyse de la production en spiramycine de la souche OSC2 a également été effectée en parallèle pour comparaison. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 40, les
25 données sont exprimées en mg par litre de surnageant. Les résultats correspondent à la production totale en spiramycines (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et III). Tableau 40. Production en spiramycines des souches dérivées de OSC2, (résultats exprimés en mg/1).
Ainsi, il est observé que la présence du plasmide pSPM524 ou du plasmide pSPM525 augmente significativement la production en spiramycines de la souche
OSC2. Ceci démontre bien que la surexpression de OrflO a un effet positif sur la production en spiramycines. Le plasmide pSPM528 n'a par contre pas d'effet sur la production en spiramycines.
Les plasmides pSPM525 et pUWL201 ont de la même manière été introduit dans la souche SPM502 (cf. exemple 14). Ainsi deux nouvelles souches ont été obtenues : la souche SPM502 ρUWL201, issue de la transformation par le plasmide pUWL201 sans insert, et la souche SPM502 pSPM525, issue de la transformation par le plasmide pSPM525.
Un échantillon de la souche SPM502 pSPM525 (cette souche contient le plasmide pSPM525, cf. ci-dessus) a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 26 février 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-2977.
La production en spiramycines des souches SPM502 ρUWL201 et SPM502 pSPM525 a été analysée par CLHP (de la même manière que dans l'exemple 17.2). L'analyse de la production en spiramycines de la souche SPM502 a également été effectée en parallèle pour comparaison. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 41, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant. Les résultats correspondent à la production en spiramycine I. En effet, aucune de ces souches ne produit de spiramycine π et m.
Tableau 41. Production en spiramycine I des souches dérivées de SPM502, ' (résult ts i exprimés en mg/1). îiil
Ainsi, il a pu être observé que la surexpression du gène orflO dans la souche SPM502 augmente de façon importante la production de spiramycine I. EXEMPLE 18 : Construction d'une banque d'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E. coli dans la cosmide pWED2.
18.1 Construction du cosmide pWED2 :
Dans le but de faciliter l'inactivation de gènes chez Streptomyces, un cosmide portant la séquence oriT du plasmide RK2 (ce qui permet son introduction par conjugaison dans Streptomyces à partir d'une souche appropriée de E. coli) et portant également un gène de résistance à un antibiotique conférant un phénotype repérable chez Streptomyces, a été construit. Un tel cosmide contenant de grands inserts d'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens peut être utilisé dans des expériences d'inactivation de gènes.
Pour construire ce vecteur, une cassette pac-oriT (fragment EcoRV) a été introduite dans le cosmide pWΕDl (Gourmelen et al, 1998) , dérivé du cosmide pWΕD15 (Wahl et a , 1987), au niveau du site unique Hpal. La cassette pac-oriT a été obtenue par PCR. Pour cela, le gène pac a été amplifié par PCR à partir du plasmide pVF 10.4 (Vara et al., 1985; Lacalle et al, 1989) en utilisant comme 4 '( première amorce, l'amorce A (de séquence 5'-'
CCAGTAGATATCCCGCCAACCCGGAGCTGCAC-3' (SΕQ ID N° 126), le site de restriction EcoRV a été souligné et la séquence en gras de 20 nucléotides correspond à une région en amont du promoteur du gène pac) et comme deuxième amorce, l'amorce B (de séquence 5'-
GAAAAGATCCGTCATGGGGTCGTGCGCTCCTT-3' (SΕQ ID N° 127), qui comporte à son extrémité 5' une séquence de 12 nucléotides correspondant au début de la séquence oriT (souligné double) et une séquence de 20 nucléotides (en gras) correspondant à la fin du gène pac (cf. Figure 29, lere PCR). Le gène oriT a quant à lui été amplifié par PCR à partir du plasmide pPM803
(Mazodier,P. et al, 1989) en utilisant comme première amorce, l'amorce C (de séquence 5'-CACGACCCCATGACGGATCTTTTCCGCTGCAT-3' (SΕQ ID N° 128)), qui comporte à son extrémité 5' une séquence de 12 nucléotides correspondant à une séquence en aval de la séquence codante du gène pac (en gras) et une séquence de 20 nucléotides correspondant au début de la séquence oriT) et comme deuxième amorce, l'amorce D (de séquence 5'-
GAGCCGGATATCATCGGTCTTGCCTTGCTCGT-3' (SEQ ID N° 129)) qui comporte le site de restriction EcoRV (souligné simple) et une séquence de 20 nucléotides correspondant à la fin de la séquence oriT (souligné double) (cf. Figure 29, 2ième pcR)
Le produit d'amplification obtenu avec les amorces A et B et celui obtenu avec les amorces C et D ont à une de leur extrémité, une séquence commune de 24 nucléotides. Une troisième PCR a été réalisée en mélangeant les deux produits d'amplification obtenus précédemment et en utilisant comme amorces, les amorces A et D (cf. figure 29, 3lème PCR). Ceci a permis d'obtenir un produit d'amplification correspondant à l'ensemble pac+oriT. Ce fragment pac-oriT a alors été clone dans le vecteur pGΕM-T Easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)), ce qui a permis d'obtenir le plasmide pGEM-T- > c-oπ . L'insert de ce "; plasmide a ensuite été sous clone dans le cosmide pWEDl. Pour cela le plasmide; GEM-pac-oriT a été digéré par l'enzyme EcoRV et l'insert EcoRV contenant:^ l'ensemble pac+oriT a été inséré dans le cosmide pWΕDl ouvert au préalable pàr-i X l'enzyme Hpal. Le cosmide ainsi obtenu a été baptisé pWΕD2 (cf. Figure 30).
Ce cosmide permet de faciliter l'inactivation de gènes chez Streptomyces. En effet, il porte la séquence oriT (ce qui permet son introduction par conjugaison dans Streptomyces à partir d'une souche appropriée de E. coli) mais également un gène de résistance à un antibiotique conférant un phénotype repérable chez Streptomyces. Un tel cosmide contenant de grands inserts d'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens peut être utilisé dans des expériences d'inactivation de gènes.
Ainsi un cosmide dérivé de pWED2 contenant le gène cible pourra par exmeple être introduit dans la souche de E. coli KS272 contenant le plasmide pKOBEG (cf. Chaveroche et al 2000) et une cassette sera introduite dans le gène cible selon la technique décrite par Chaveroche et al. 2000. Le cosmide obtenu par cette technqiue (cosmide dans lequel le gène cible est inactivé), pourra ensuite être introduit dans une souche de E. coli telle que la souche S 17.1 ou toute autre souche permettant de transférer par conjugaison des plasmides contenant la séquence oriT vers Streptomyces.
Après conjugaison entre E. coli et Streptomyces, des clones de Streptomyces dans lesquelles la copie sauvage du gène cible aura été remplacée par la copie interrompue pourront être obtenues comme décrit darîs l'exemple 2.
Le gène de résistance exprimé chez Streptomyces présent sur ce nouveau cosmide est le gène pac de Streptomyces alboniger (Vara, J et al, 1985 ; Lacalle et al, 1989) qui code la puromycine N-acétyl transférase et qui confère la résistance à la puromycine. Lors d'expériences d'inactivation de gène, on cherchera les clones dans lesquels un double événement de recombinaison aura eu lieu. Ces clones auront éliminer le cosmide pWΕD2 et seront donc redevenus sensibles à la puromycine.
18.2 Construction d'une banque d'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens chez E. coli dans le cosmide pWΕD2 ,
L'ADN génomique de la souche OSC2 de Streptomyces ambofaciens a été f
,,f digéré partiellement par l'enzyme dé restriction BamHl de manière à obtenir des fragments d'ADN de taille comprise entre environ 35 et 45 kb. Ces fragments ont ensuite été clones dans le cosmide pWΕD2, ce dernier ayant été au préalable digéré par
BamHl, puis traité par la phosphatase alcaline. Le mélange de ligâtion a ensuite été encapsidé in vitro dans des particules de phages lambda grâce au système « Packagene® Lambda DNA packaging System » commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA) en suivant les recommandations du fabriquant. Les particules phagiques obtenues ont été utilisées pour infecter la souche SURE® d'E. coli commercialisée par la société Stratagene (LaJolla, Californie, USA). La sélection des clones a été effectuée sur milieu LB + ampicilline (50 μg/ml), le cosmide pWΕD2 conférant la résistance à l' ampicilline. EXEMPLE 19 : Isolement de cosmides de la nouvelle banque couvrant la région de la voie de biosynthèse des spiramycines. Sous clonage et sequençage de fragments de ces cosmides.
19.1 Hybridation sur colonies de la banque génomique de Streptomyces ambofaciens OSC2 :
Des cosmides de la nouvelle banque de Streptomyces ambofaciens OSC2 (cf. exemple 18) couvrant les orfl * à or/70* ou une partie ou la totalité des orfl à orβ 5c, ou une région plus en amont de V orβ 5c ont été isolés. Pour cela, des hybridations successives sur les colonies d'E. coli obtenues selon l'exemple 18 ont été réalisées en utilisant les 3 sondes suivantes (cf. figure 31):
- La première sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN d'environ 0,8kb amplifié par PCR en utilisant comme matrice le cosmide pSPM5 et les amorces suivantes :
ORF23c : 5'-ACGTGCGCGGTGAGTTCGÇCGTTGC-3' (SΕQ ID N° 130) et > OR 25c : 5'-CTGAACGACGCCATCGCGGTGGTGC-3' (SEQ ID N0 131). j:
Le produit de PCR ainsi obtenu contient un fragment du début de Yorf23c, l'orβ4c en entier et la fin de 'orβ 5c (cf. figure 31 , sonde I).
- La deuxième sonde utilisée correspond à un fragment d'ADN d'environ 0,7kb amplifié par PCR en utilisant comme matrice l'ADN total de la souche S. ambofaciens ATCC23877 et les amorces suivantes :
ORFl*c : 5*-GACCACCTCGAACCGTCCGGCGTCA-3' (SEQ ID N° 132) et ORF2*c : 5'-GGCCCGGTCCAGCGTGCCGAAGC-3' (SEQ ID N° 133). Le produit de PCR ainsi obtenu contient un fragment de la fin de l 'orfl *c et du début de 1 'orβ*c (cf. figure 31, sonde II).
- La troisième sonde utilisée correspond à un fragment EcoRl-BamHl d'environ 3kb contenant les orfl, orβ et orβ et obtenu par digestion du plasmide pOS49.99 (cf. figure 31, sonde III). Environ 2000 clones de la banque obtenue dans l'exemple 18.2 ont été transférés sur filtre pour hybridation sur colonies selon les techniques classiques (Sambrook et al, 1989).
La première sonde (cf. figure 31 , sonde I) a été marquée au 32P par la technique du « random priming » (Kit commercialisé par la société Roche) et utilisées pour l'hybridation sur 2000 clones de la banque, après transfert sur filtre. L'hybridation a été effectuée à 65°C dans le tampon décrit par Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Deux lavages ont été effectués en 2x SSC, 0,1% SDS à 65°C, le premier pendant 10 minutes et le deuxième pendant 20 minutes et un troisième lavage d'une durée de 30 minutes a ensuite été effectué en 0.2X SSC, 0,1% SDS à 65°C. Dans ces conditions d'hybridation et de lavage, 20 clones parmi les 2000 hybrides présentaient un fort signal d'hybridation avec la première sonde. Ces 20 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 μg/ml) et les 20 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline (Sambrook et al, 1989) puis ils ont été digérés par l'enzyme de restriction ] ' BamHl. Les produits de digestions ont ensuite été séparés sur gel d'agarose, transférés i\ r( \Φ, sur membrane de Nylon et hybrides par la première sonde (cf. ci-dessus : le produit de * j PCR ORF23c-ORF25c, sonde I) dans les mêmes conditions que ci-dessus. Douze cosmides possédaient un fragment BamHl hybridant fortement avec la sonde utilisée. Ces 12 cosmides ont été nommés pSPM34, pSPM35, ρSPM36, pSPM37, ρSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44 et pSPM45. Les profils, après digestion par BamHl, de ces 12 cosmides ont été comparés entre eux et avec celui du cosmide pSPM5. De plus des expériences d'amplification par PCR en utilisant différentes amorces correspondant à différents gènes déjà identifiés dans la région orfl- orβ5c ont permis de positionner l'insert de certains de ces cosmides les uns par rapport aux autres et de déterminer également la localisation de ces inserts dans la région orfl- orβ5c déjà connue (cf. Figure 32). Le cosmide pSPM36 a plus particulièrement été choisi car il était susceptible de contenir une grande région en amont de V orβ 5c (cf. Figure31 et 32). Dans un deuxième temps, et en utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus, les 2000 clones de la banque de Streptomyces ambofaciens OSC2 ont été hybrides avec la deuxième sonde correspondant au produit de PCR : ORFl*c- ORF2*c (cf. figure 31, sonde II). Cette hybridation a permis d'isoler des cosmides dont l'insert est situé dans la région de orfl*c à orfl0*c. Dans les conditions d'hybridation utilisés, 16 clones parmi les 2000 hybrides présentaient un fort signal d'hybridation avec cette deuxième sonde. Ces 16 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 μg/ml) et les 16 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline (Sambrook et al, 1989) puis ils ont été digérés par l'enzyme de restriction BamHl. Les profils de digestion (après digestion par BamHl) de ces 16 cosmides ont été comparés entre eux et avec celui du cosmide pSPM7. Des expériences d'amplication par PCR avec les amorces ORFl*c et ORF2*c ont permis de choisir deux cosmides qui renfermaient bien les gènes orfl*c et orβ*c et dont les profils possédaient des bandes communes mais ' aussi des bandes différentes. De plus d'autres expériences d'amplification par PCR en • '•,: utilisant différentes amorces correspondant à différents gènes déjà identifiés dans la" -l région orfl*c à brfl0*c ont permis de positionner l'insert de ces cosmides les uns pa i; rapport aux autres et dé déterininer également la localisation de ces inserts dans la région ? orfl*c à orfl0*c déjà connue (cf. Figure 32). Les deux cosmides plus particulièrement sélectionnés ont été nommés pSPM47 et ρSPM48 (cf. Figure 32).
En utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus, les 2000 clones de la banque de Streptomyces ambofaciens OSC2 ont également été hybrides avec la troisième sonde correspondant au fragment d'ADN EcoRl-BamHl du plasmide pOS49.99 (cf. figure 31 sonde III). Cette hybridation a permis d'isoler les cosmides contenant la région de l'orfl jusqu'à Vorβ et susceptibles de contenir soit une grande partie des gènes des PKS, soit une grande partie des gènes orfl à orβ 5c de la voie de biosynthèse des spiramycines. Dans ces conditions d'hybridation, 35 clones parmi les 2000 hybrides présentaient un fort signal d'hybridation avec la troisième sonde. Ces 35 clones ont été cultivés en milieu LB+ ampicilline (50 μg/ml) et les 35 cosmides correspondants ont été extraits par lyse alcaline (Sambrook et al, 1989) puis digérés par l'enzyme de restriction BamHl. Les profils, après digestion par BamHl, de ces 35 cosmides ont été comparés entre eux et avec celui du cosmide pSPM5. De plus des expériences d'amplification par PCR en utilisant différentes amorces correspondant à différents gènes déjà identifiés dans la région orfl à orβ 5c ont permis de vérifier que ces cosmides renfermaient bien des inserts provenant de la région orfl à orβ5c et de positionner les inserts de ces cosmides les uns' par rapport aux autres et par rapport à la la région orfl à orβ 5c déjà connue (cf. Figure 32). Cinq cosmides ont été plus particulièrement sélectionnés, ils ont été nommés pSPM50, pSPM51, pSPM53, pSPM55 etpSPM56 (cf. Figure 32).
19.2 Sous clonage et sequençage d'une partie de l'insert du cosmide pSPM36.
La sonde d'environ 0,8 kb obtenue par PCR avec les amorces ORF23c et ORF25c (cf. ci-dessus et figure 31, sonde T) a également été utilisée dans des expériences de Southern Blot sur l'ADN total de S. ambofaciens OSC2 digéré par l'enzyme Pstl. Dans les conditions d'hybridation décrite ci-dessus, cette sonde révèle un fragment unique Pstl d'environ 6 kb lorsque hybride sur l'ADN total de S. ambofaciens OSC2 digéré par ' l'enzyme Pstl. H existe un site Pstl au niveau de Yorβ3c (cf. SEQ ID N° 80) mais aucun autre site Pstl jusqu'à l'extrémité (site BamHl) de la séquence connue (cf. SEQ ID N° 1). Ce fragment Pstl-BamHl a une taille d'environ 1.4 kb. Le fragment Pstl de 6 kb hybride sur l'ADN total de S. ambofaciens digéré par l'enzyme Pstl contient donc une région d'environ 4,6 kb située en amont de orβ 5c. Cette région est susceptible de contenir d'autres gènes dont les produits sont impliqués dans la voie de biosynthèse de la spiramycine. Il a été vérifié par digestion que le cosmide pSPM36 contenait bien ce fragment Pstl de 6 kb. Ce fragment a été isolé à partir de pSPM36, dans le but de déterminer la séquence plus en amont de orβ5c. Pour cela, le cosmide pSPM36 a été digéré par l'enzyme de restriction Pstl. Le fragment Pstl-Pstl d'une taille d'environ 6kb a été isolé par électroélution à partir d'un gel d'agarose 0.8% puis clone dans le vecteur pBK-CMV (4512bp) (commercialisé par la société Stratagene (La Jolla, Californie, USA)). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM58 (cf. Figure 33) et la séquence de son insert a été déterminée. La séquence de cet insert est présentée en SEQ ID N° 134. Toutefois, toute la séquence n'a pas été déterminée et il subsite un trou d'environ 450 nucléotides, la partie de la séquence non déterminée a été notée par une succession de « N » dans la séquence correspondante.
19.3 Analyse des nouvelles séquences nucléotidiques, détermination des phases 5 ouvertes de lecture et caractérisation des gènes impliqués dans la biosynthèse des spiramycines.
La séquence de l'insert du cosmide ρSPM58 obtenue a été analysée grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des
10 codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cet insert comporte 4 nouvelles ORFs en amont de Yorβ5c (cf. figure 34). Ces gènes ont été nommés orβό (SEQ ID N° 107), orβ7 (SEQ ID N° 109), orβ8c (SEQ ID N° 111, la séquence de cette orf n'a pas été déterminée complètement puisqu'un trou d'environ 450 nucléotide subsite lors du sequençage de l'insert de pSPM58, ces 450 nucléotides
,15 figurent sous la forme d'une sére de « N » daμ$ la séquence SEQ ID N° 111) et or/29 (là i séquence de cette dernière orf était incomplète dans cette insèrt). Lé « c » ajouté dans lé ;!' nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (cf. figure 34).
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été 20 comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD-search, (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990) (ce programme est accessible 25 notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycines. 19.4 Sous clonage et sequençage d'une autre partie de l'insert du cosmide pSPM36.
La sonde d'environ 0,8 kb obtenue par PCR avec les amorces ORF23c et ORF25c (cf. ci-dessus et figure 31, sonde I) a également été utilisée dans des expériences de Southern Blot sur l'ADN total de la souche OSC2 digéré par l'enzyme Stul. Dans les conditions d'hybridation décrite ci-dessus pour cette sonde, cette sonde révèle un fragment unique Stul d'environ 10 kb lorsque hybride sur l'ADN total de la souche OSC2 digéré par l'enzyme StwI. Compte tenu de la présence d'un site Stul dans Yorβ3c (cf. SEQ ID N° 80) et de la localisation de ce site par rapport au site Pstl, ce fragment de 10 kb inclut la totalité du fragment Pstl précédemment étudié (insert de pSPM58) et permet d'avoir accès à une région non encore étudiée d'environ 4 kb. (cf figure 33). Il a été vérifié par digestion que le cosmide pSPM36 contenait bien ce fragment Stul de 10 kb. Ce fragment a été isolé à partir du cosmide pSPM36, dans le but de déterminer la séquence de la fin d,orβ9 et d'autres gènes plus en amont de orβ 9. Pour cela, le cosmide pSPM36 a été digéré par l'enzyme de restriction Stul Le fragment Stul-Stul , d'une taille d'environ 10 kb a été isolé par électroélution à partir d'un gel d'agarose^ , 0.8% puis clone dans le vecteur pBK-CMV (4512bp) (commercialisé par la société Stratagene (La Jolla, Californie, USA)). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM72 (cf. Figure 33). Ce dernier a ensuite été digéré par EcoRI (site EcoRI dans l'insert de pSPM58) et HmdlII (site Hindlll dans le site de clonage multiple du vecteur, immédiatement après le site Stul de l'extrémité de l'insert) (cf. Figure 33). Le fragment d'ADN EcoRI-H dlII ainsi obtenu, correspond à un fragment de l'insert du plasmide pSPM72 (cf. figure 33) et a été sous-cloné dans le vecteur pBC-SK+ (commercialisé par la société Stratagene (La Jolla, Californie, USA)) digéré au préalable par EcoRI et HmdlII. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM73 et la séquence de son insert a été déterminée. La séquence de cet insert est présentée en SΕQ ID N° 135. Un assemblage des séquences des inserts de pSPM58 et pSPM73 est présenté en SΕQ ID N° 106. Cette séquence part du site Pstl au niveau de Yorβ3c (cf. SΕQ ID N° 80) et va jusqu'au site Stul au niveau de Yorβ2c (cf. figure 34). La séquence de Yorβ8c (SΕQ ID N° 111), n'étant pas complète (cf. exemple 19.3), une région d'environ 450 nucléotides n'est pas séquencée, ces 450 nucléotides figurent sous la forme d'une série de « N » dans la séquence SEQ ID N° 106).
19.5 Analyse des nouvelles séquences nucléotidiques, détermination des phases 5 ouvertes de lecture et caractérisation des gènes impliqués dans la biosynthèsè des spiramycines.
La séquence partielle de l'insert du cosmide pSPM73 obtenue a été analysée grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage 10 des codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cet insert comporte 4 ORFs, une incomplètes et trois complètes (cf. figure 34). L'ORF incomplète correspond à la partie 3' de la séquence codante de orβ9 ce qui à permis de compléter la séquence de ce gène grâce à la séquence partielle de ce même orf obtenue lors du ; sequençage de l'insert du plasmide pSPM58 (cf. exemple 19.2 et 19.3), l'ensemble des v 15 deux séquences à ainsi permis d'obtenir la séquence complète de or/29. Les 4 gènes ont -j;;l •*"" ainsi été nόhinies orf2 (SEQ BD N° 113), ωβOc (SEQ ID N0 115), orβl (SEQ © #;S|? 118) et orβ 2c (SEQ ID N° 120). Le « c » ajouté dans le nom du gène signifiant pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (cf. figure 34).
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture (SEQ ID N° 20 114 pour orβ9, SEQ ID N° 116 et 117 pour orβOc, SEQ ID N° 119 pour orβl et SEQ ID N° 121 pour orβ 2c) ont été comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al, 1990) (Altschul et al, 1997), CD-search, (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), 25 FASTA ((Pearson W. R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990) (ce programme est accessible notamment auprès du centre de ressources INFOBIOGEN, Evry, France). Ces comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits de ces gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycines.
19.6 Sous clonage et sequençage d'une troisième partie de l'insert du cosmide pSPM36. » Une sonde (fragment d'ADN de 0,8 kb) correspondant à une séquence interne à orβ2c a été obtenue par PCR en utilisant comme matrice l'ADN total de la souche de Streptomyces ambofaciens et les amorces suivantes
KF36: 5'- TTGCCGTAGCCGAGGACCAGCG-3' (SEQ IDN° 151) et KF37: 5'- CACATGGCCCTGGAGGACCCTG-3' (SEQIDN° 152).
Le produit PCR ainsi obtenu représente une séquence interne de Vorβ2c. Cette sonde à été utilisée dans des expériences de Southern Blot sur l'ADN chromosomique de la souche OSC2 et sur l'ADN du cosmide pSPM36 digérés par l'enzyme Pstl. En.,' utilisant les mêmes conditions d'hybridation que celles décrites ci-dessus (cf. exemple X\ 19.1), cette sonde révèle deux fragments Pstl d'environ 3,4kb et 2,5kb lorsque hybridée sur l'ADN total de la souche OSC2 et sur l'ADN du cosmide pSPM36 digérés par l'enzyme Pstl. Compte tenu de la présence d'un site Pstl dans la sonde utilisée on peut expliquer ces résultats. Le premier fragment d'ADN qui a une taille d'environ 3,4kb est un fragment dont la séquence est déjà connue en totalité. La séquence du fragment de 2,5 kb n'est connue que partiellement, sur une région de 700 pb. Ce fragment, a été isolé à partir du cosmide pSPM36 dans le but de déterminer la séquence de la fin de Y orβ 2c et d'autres gènes en amont de ce dernier. Pour cela, le cosmide pSPM36 a été digéré par l'enzyme de restriction Pstl. Le fragment Pstl-Pstl d'une taille d'environ 2,5kb a été isolé par purification à partir d'un gel d'agarose 0.8% puis clone dans le vecteur pBK- CMV (4518bp) (commercialisé par la société Stratagene (La Jolla, Californie, USA)). Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM79 (cf. Figure 41) et la séquence de son insert a été déterminée. La séquence de Yorβ8c (SEQ ID N° 111) n'était pas complète (cf. exemple 19.3). En effet, une région d'environ 450 nucléotides n'avait pas pu être déterminée, ces 450 nucléotides figurent sous la forme d'une sére de « N » dans la séquence SEQ ID N° 106. La séquence de la totalité de la région manquante a été déterminée par reséquençage de cette région. La séquence des inserts de pSPM58 et pSPM73 a donc été déterminée en entier. La séquence complète de la partie codante de Yorβ8c est présentée en SEQ ID N° 141 et la protéine déduite de cette séquence en SEQ ID N° 142. La séquence de l'insert du plasmide pSPM79 est présentée en SEQ ED N° 161.
Un assemblage des séquences des inserts de pSPM58, pSPM73 et pSPM79 est présentée en SEQ ID N° 140 (cf. figure 41). Cette séquence part du site Pstl au niveau de Yorβ3c (cf. SEQ ID N° 80) et va jusqu'au site Pstl au niveau de Yorβ4c (cf. figure 41).
19.7 Analyse des nouvelles séquences nucléotidiques. détermination des phases ouvertes de lecture et caractérisation des gènes pouvant être impliqués dans la r , biosynthèsè des spiramycines. ? -;
La séquence de l'insert du plasmide pSPM79 obtenue a été analysée grâce au programme FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Ceci a permis d'identifier, parmi les phases ouvertes de lecture, les phases ouvertes de lecture présentant un usage des codons typique de Streptomyces. Cette analyse a permis de déterminer que cet insert comporte 3 ORFs, deux incomplètes (orβ2c et orβ4c) et une complète (orβ3) (cf. figure 41).
La première ORF incomplète correspond à la partie 5' de la séquence codante de orβ2c. Ceci a permis de compléter la séquence de ce gène grâce à la séquence partielle de cette même orf obtenue lors du sequençage de l'insert du plasmide pSPM73 (cf. exemple 19.4 et 19.5), l'ensemble des deux séquences à ainsi permis d'obtenir la séquence complète de orβ2c. (SEQ ID N° 145). Le « c » ajouté dans le nom du gène signifie pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (cf. figure 41). L' orf complète a été nommée or/33 (SEQ ID N° 147). La troisième ORF a été nommée orβ4c (SEQ ID N° 149). Le « c » ajouté dans le nom du gène signifie pour l'ORF en question que la séquence codante est dans l'orientation inverse (cf. figure 5 37). Les comparaisons effectuées entre le produit de cette orf et les banques de données suggèrent que la partie C-terminale de cette protéine n'est pas dans le produit déduit dé la séquence nucléotidique et donc que cette orf serait plus longue et continuerait en dehors de la région séquencée.
Les séquences protéiques déduites de ces phases ouvertes de lecture ont été
10 comparées avec celles présentes dans différentes bases de données grâce à différents programmes : BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, (ces deux programmes sont accessibles notamment auprès du National Center for
Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. ;!
R & D. J. Lipman, 1988) et (Pearson W. R., 1990) (ce programmé est accessible"; '/;
15
~lx notamment auprès du centre de' ressources INFOBIOGEN, Evry, France). C ûeks là'Hi ι.τ comparaisons ont permis de formuler des hypothèses sur la fonction des produits dé ces i' gènes et d'identifier ceux susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de spiramycines.
20 EXEMPLE 20 : Analyse de la production d'intermédiaires de biosynthèse de spiramycines :
20.1 Préparation des échantillons :
Les différentes souches à tester ont été cultivées chacune dans 7 erlenmeyers chicanés de 500 ml contenant 70 ml de milieu MP5 (Pernodet et al., 1993). Les erlens
25 ont été inoculés par 2.5 106 spores/ml des différentes souches de S. ambofaciens et mises à pousser à 27°C sous agitation orbitale de 250 m pendant 96 heures. Les cultures correspondant au même clone sont rassemblées, éventuellement filtrées sur filtre plissé, et centrifugées 15 min à 7000 tr/min.
Le pH du moût est ensuite ajusté à 9 avec de la soude et le surnageant est extrait par de la méthyl iso-butyryl cétone (MIBK). La phase organique (MIBK) est alors récupérée et évaporée. L'extrait sec est ensuite repris dans 1ml d'acétonitrile, puis dilué au 1/10 (lOOμl qsp 1ml avec de l'eau) avant d'être utilisé pour les analyses en chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (CL/SM).
20.2 Analyse des échantillons en CL/SM :
Les échantillons ont été analyés en CL/SM dans le but de déterminer la masse des différents produits synthétisés par les souches à tester.
La colonne de chromatographie liquide haute performance utilisée est une colonne Kromasil C8 150*4,6mmm, 5mmm, 100Â.
La phase mobile est un gradient constitué d'un mélange d'acétonitrile et d'une solution ;,'; aqueuse d'acide trifluorpacétique à 0.05%, le, débit est fixé à 1 ml min. La températurejy,|J du four colorme est mamtenύe à 30°C^ ^ ' ^ ' v ; : -
La détection UV en sortie de la colonne a été effectuée à deux longueurs d'onde différentes : 238 nm et 280 nm.
Le spectrométre de masse couplé à la colonne de chromatographie est un appareil Simple Quadripole commercialisé par la société Agilent, avec des tensions de cône à 30 et à 70V.
20.3 Analyse des intermédiaires de biosynthèse produits par la souche OS49.67 :
La souche OS49.67 dans laquelle le gène orβ est inactivé par une délétion en phase ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 6 et 15). Un échantillon a été préparé selon la méthode décrite ci-dessus (cf. paragraphe 20.1) et a été analysé par CL/SM comme décrit ci-dessus (cf. le paragraphe 20.2). Plus particulièrement, l'analyse par chromatographie a été réalisée en gradient de solvant avec comme phase mobile : 20% d'acétonitrile du temps T=0 à 5min puis montée linéaire à 30% à T=35 minutes, suivie d'un palier jusqu'à T=50 minutes.
Dans ces conditions, deux produits ont plus particulièrement été observés : un
5 absorbant à 238 nm (temps de rétention de 33.4 min) et un absorbant à 280 nm (temps de rétention de 44.8 min) (cf. figure 35). La figure 35 montre la supeφosition des chromatogrammes CLHP réalisés à 238 et 280nm (haut) ainsi que les spectres UV des molécules élues à 33,4 minutes et 44,8 minutes (bas).
Les conditions d'analyses en spéctrométrie de masse couplée étaient les suivantes
10 : le balayage se fait en mode scan, couvrant une gamme de masse comprise entre 100 et 1000 Da. Le gain de l' électro-multiplicateur était de IV. Concernant la source électrospray, la pression du gaz de nébulisation était de 35 psig, le débit du gaz séchant de 12.0 min"1, la température du gaz séchant de 350°C, la tension du capilaire était
J- ï* •
Afin d'obtenir la structure, les produits mentionnés ci-dessus ont été isolés et purifiés dans les conditions suivantes : la phase mobile est un mélange d'une solution
20 aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0.05% et d'acétonitrile 70/30 (v/v). La chromatographie est réalisée en régime isocratique avec un débit fixé de 1 ml/min. Dans ces conditions, les temps de rétention des 2 produits sont respectivement de 8 et 13.3 minutes. De plus dans ce cas, l'échantillon préparé (cf. paragraphe 20.1) n'est pas dilué dans l'eau avant injecton de lOμl.
25 Les 2 produits sont récupérés à la sortie de la colonne chromatographique et isolés dans les conditions suivantes : une cartouche Oasis HLB 1 ce 30mg (Waters) est conditionnée séquentiellement par 1 ml d'acétonitrile, puis 1 ml d'eau/acétonitrile (20v/80v) et 1ml d'eau/acétonitrile 80/20. L'échantillon est ensuite introduit et la cartouche lavée successivement par 1 ml d'eau/acétonitrile (95/5), 1ml d'eau/acétonitrile deutéré (95/5), puis éluée avec 600μl d'eau/acétonitrile deutéré 40/60. La solution récupérée est ensuite directement analysée en RMN.
Les spectres RMN obtenus pour ces deux composés sont les suivants : - Premier produit élue: Platénolide A: (Spectre 9646V)
Spectre IH dans CD3CN -(déplacements chimiques en ppm): 0,90 (3 H, t, J=6Hz), 0,93 (3H, d, J=5Hz), 1,27 (3H-, d, J=5Hz), entre 1,27 et 1,40 (3H, m), 1,51 (IH, m), 1,95 (IH, m), 2,12 (IH, m), 2,30 (IH, d, J=12Hz), 2,50 (IH, d, J=llHz), 2,58 (IH, dd, J=9 et 12 Hz), 2,96 (IH, d, J=7Hz), 3,43 (3H, s), 3,70 (IH, d, J=9Hz), 3,86 (IH, d, J=7Hz), Λ, 4,10 (IH, m), 5,08 (IH, m), 5,58 (IH, dt, J=3 et 12Hz), 5,70 (IH, dd, J=8 et 12 Hz), 6,05 (IH, dd, J=9 et 12 Hz), 6,24 (IH, dd, J=9 et 12Hz).
-Deuxième produit élue: Platénolide B: (Spectre 9647V)
Spectre IH dans CD3CN (déplacements chimiques en ppm): 0,81 (3H, t, J=6Hz), 0,89 j (IH, m), 1,17 (3H, d, J=5Hz), 1,30 (4H, m), 1,47 (2H, m), 1,61 (IH, t, J=10Hz), 2,20 'f ;
(IH, m), 2,38 (IH, d, J=13Hz), 2,52 (IH, m), 2,58 (IH, m), 2,68 (IH, dd, J=8 et 13Hzj || 3,10 (IH, d, J=7Hz), 3,50 (3H, s), 3,6\ (IH, d, J=8flz), 3,82 (IH, d, J=7Hz), 5,09 (lï ?p m), 6,20 (IH, m), 6,25 (IH, dd, J=9 et 12 Hz), 6,58 (IH, d, J=12 Hz), 7,19 (IH, dd, J=9 et 12Hz).
Ces expériences ont ainsi permis de déterminer la structure de ces deux composés. Le premier produit élue est le platénolide A et le deuxième est le platénolide B, la structure déduite de ces deux méolécules est présentée en figure 36.
II a également pu être déterminé grâce à la technique de CL/SM associée à la
RMN, dans des conditions légèremment différentes de celles décrites précédemment mais dont la mise au point est bien connue de l'homme du métier, que la souche OS49.67 produit en plus du platénolide A et B un dérivé de ces deux composés. Il s'agit du platénolide A+mycaorse et du platénolide B+mycarose (la strucutre de ces deux composés est présenté en figure 40). Les résultats de l'analyse du moût de la souche OS49.67 sont présentés tableau 42.
Tableau 42. Les résultats de l'analyse CL/SM du moût de la souche OS49.67
20.4 Analyse des intermédiaires de biosynthèsè produits par la souche SPM509 :
La souche SPM509 dans laquelle le gène orfl4 est inactivé (orfl4::att3Ωaac-) ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 13, 15 et 16). Un échantillon a été préparé selon la méthode décrite ci-dessus (cf. paragraphe 20.1) et a été analysé par CL/SM comme décrit ci-dessus (cf. le paragraphe 20.2 et 20.3). L'analyse des intermédiaires de biosynthèse présents dans le surnageant de culture de la souche SPM509 cultivée en milieu MP5 a montré que cette souche ne produisait que la forme B du platénolide (« platénolide B », cf. figure 36) mais pas la forme A (« platénolide A », cf. figure 36).
10 EXEMPLE 21: Interruption du gène orfl 4 dans une souche interrompue dans le gène orβ (OS49.67)
Le produit du gène orfl 4 est indispensable à la biosynthèse des spiramycines (cf. X exemple 13, 15 et 16 : la souche SPM509 dans laquelle ce gène est interrompu ne .^ r ' r X i 1 produit plus de spiramycines). L'analyse des intermédiaires de biosynthèsè présents àèâ .
"•"' 15 le surnageant de culture de Ta souche SPM509 cultivée en milieu MP5 a montré que X cette souche ne produisait que la forme B du platénolide mais pas la forme A (cf. exemple 20). Une des hypothèses pouvant expliquer cette observation est que le produit de orfl 4 soit impliqué dans la conversion de la forme B du platénolide en forme A par une étape enzymatique de réduction. Pour tester cette hypothèse, le gène orf!4 a été 20 inactivé dans un mutant ne produisant plus de spiramycine, mais produisant les formes A et B du platénolide. C'est le cas de la souche OS49.67 (cf. exemple 6 et 20) dans laquelle le gène orβ est inactivé par une délétion en phase (Aorβ). Pour inactiver le gène orfl 4 dans cette souche le plasmide pSPM509 a été introduit par transformation de protoplastes de la souche OS49.67 (Kieser, T et al, 2000). L'inactivation du gène orf!4 25 a déjà été décrite dans le cas de la souche OSC2 (cf. exemple 13) et il a été procédé de la même manière pour l'inactivation du gène orf!4 dans la souche OS49.67. Après transformation par le plasmide pSPM509, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine et sur milieu avec hygromycine. Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à l'hygromycine (HygS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et dans lesquels le gène orfl4 a été remplacé par une copie de orfl4 interrompue par la cassette att3Ωaac-. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orfl 4 par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation? Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybride avec une sonde correspondant à la cassette att3Ωaac- pour vérifier que le remplacement de gène avait bien eu lieu. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et sequençage du produit PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (Aorβ, orfl4::att3Ωaac-) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM510. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3Ωaac- était bien présente dans le génome de •[, ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un i remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage orfl 4 par la copie interrompue par la cassette att3Ωaac- dans le génome de ce clone.
EXEMPLE 22 : Complémentation fonctionnelle de l'interruption du gène orfl4
22.1 Construction du plasmide pSPM519 :
Le gène orf!4 a été amplifié par PCR en utilisant le couple d'oligonucléotides suivant : EDR31 : 5' CCCAAGCTTCTGCGCCCGCGGGCGTGAA 3' (SEQ ID N° 136) et EDR37 : 5' GCTCTAGAACCGTGTAGCCGCGCCCCGG 3' (SEQ ID N° 137) et comme matrice l'ADN chromosomique de la souche OSC2. Les oligonucléotides EDR31 et EDR37 portent respectivement le site de restriction Hindlll et Xbal (séquence en gras). Le fragment de 1 ,2 kb ainsi obtenu a été clone dans le vecteur pGEM-T easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)) pour donner naissance au plasmide pSPM515. Ce plasmide a ensuite été digéré par les enzymes de restriction Hindlll et Xbal. L'insert Hindlll/Xbal de 1,2 kb obtenu a été clone dans le vecteur pUWL201 (cf. exemple 17.1) préalablement digéré par les mêmes enzymes. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM519.
22.1 Transformation des souches SPM5*09 et SPM510 par le plasmide PSPM519 :
Le plasmide pSPM519 a été introduit dans les souches SPM509 (cf. exemple 13) et SPM510 (cf. exemple 17) par transformation de protoplastes (Kieser, T et al, 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton.
surnageants de culture ont ensuite été analysés par CLHP (cf. exemp e 16 et 17). Lés résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 43, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant. Les résultats correspondent à la production totale en spiramycines (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et III). Il a été observé que la présence du vecteur pSPM519 dans la souche SPM509 restaure la production de spiramycines (cf. tableau 43).
Tableau 43. Production en spiramycines de la souche SPM509 transformée par le vecteur pSPM519, (résultats exprimés en mg/1 de surnageant).
La souche SPM510 transformée par le plasmide pSPM519 a été nommée SPM510 pSPM509.
EXEMPLE 23 : Complémentation fonctionnelle de l'interruption du gène orβ par le gène tylB de S. fradiae
23.1 Construction du plasmide pOS49.52 :
Le plasmide pOS49.52 correspond à un plasmide permettant l'expression de la , , protéine TylB chez S. ambofaciens. Pour le construire, la séquence codante du gène tylB "r de S. fradiae (Merson-Davies & Cundliffe, 1994, numéro d'accès GenBank : U08223 (séquence de la région), SFU08223 (séquence ADN) et AAA21342 (séquence protéique)) a été introduite dans le plasmide pKC1218 (Bierman et al, 1992, Kieser et al, 2000, une souche de E. coli contenant ce plasmide est accessible notamment auprès de l'ARS (NRRL) Agricultural Rese rch Service Culture Collection) (Peoria, Illinois, X USA), sous le numéro B- 14790). De plus cette séquence codante à été placée sous le
_ :_: ?x£ contrôle du promoteur ermE* (cf ci-dessus, nptώhment exemple 17.1, Bibb étal., T9 j$||i R Biibbhb e ett a all., Ï 1G9-C9v4iY) • . - ': ' •'• - • ' • > I
23.1 Transformation de la souches OS49.67 par le plasmide pOS49.52 :
La souche OS49.67 dans laquelle le gène orβ est inactivé par une délétion en phase ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 6 et 15). Le plasmide pOS49.52 a été introduit dans la souche OS49.67 par transformation de protoplastes (Kieser, T et a , 2000). Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones sont ensuite repiqués sur un milieu contenant de l'apramycine. Un clone a été plus particulièrement sélectionné et a été nommé OS49.67 pOS49.52.
Comme il a été démontré ci-dessus, la souche OS49.67 ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 6 et 15). La production en spiramycines de la souche
OS49.67 transformée par le vecteur pOS49.52 a été analysée par la technique décrite dans l'exemple 15. Il a ainsi pu être démontré que cette souche possède un phénotype producteur de spiramycines. Ainsi la protéine TylB permet la complémentation fonctionnelle de l'interruption du gène orβ.
EXEMPLE 24 : Amélioration de la production en spiramycines par surexpression du gène orβ8c
24.1 Construction du plasmide pSPM75 :
Le gène orβ 8c a été amplifié par PCR en utilisant un couple d' oligonucléotides comportant un site de restriction H αTII ou un site de restriction BamHl. Ces amorces ont la séquence suivante : KF30 : 5 ' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3 ' (SEQ ID N° 138) avec un site de restriction HmdlII (qui figure en gras)
comme matrice le cosmide pSPM36 (cf. ci-dessus). Le fragment de 1,5 kb ainsi obtenu a été clone dans le vecteur pGEM-T easy (commercialisé par la société Promega (Madison, Wisconcin, USA)) pour donner naissance au plasmide pSPM74. Le plasmide pSPM74 a ensuite été digéré par les enzymes de restriction Hindlll et BamHl et l'insert Hindlll/BamHl d'environ 1,5 kb obtenu a été sous clone dans le vecteur pUWL201 (cf. exemple 17.1) préalablement digéré par les mêmes enzymes. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pSPM75, il contient l'ensemble de la séquence codante de orβ8c placée sous le contrôle du promoteur ermE*.
24.2 Transformation de la souche OSC2 par le plasmide pSPM75 :
Le plasmide pSPM75 a été introduit dans les souches OSC2 par transformation de protoplastes (Kieser, T et al, 2000). Après transformation des protoplastes, les clones sont sélectionnés pour leur résistance au thiostrepton. Les clones sont ensuite repiqués sur un milieu contenant du thiostrepton et la transformation par le plasmide est vérifiée par extraction de plasmides. Deux clones ont plus particulièrement été sélectionnés et nommés OSC2/pSPM75(l) et OSC2/ρSPM75(2).
Un échantillon de la souche OSC2/pSPM75(2) a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 6 octobre 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-3101.
Afin de tester l'effet de la surexpression du gène orβ8c sur la production de - spiramycines, la production en spiramycines des clones OSC2/pSPM75(l) et OSC2/pSPM75(2) a été testée par la technique décrite dans l'exemple 15. L'analyse de la production en spiramycines de la souche OSC2 a également été effectée en parallèle
OSC2/pSPM75(2) a également été analysée par CLHP (de la même manière que dans l'exemple 17.2). L'analyse de la production en spiramycines de la souche OSC2 a également été effectée en parallèle pour comparaison. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 44, les données sont exprimées en mg par litre de surnageant.
Les résultats correspondent à la production totale en spiramycines (obtenue en additionnant la production en spiramycine I, II et III).
Tableau 44. Production en spiramycines des souches dérivées de OSC2 transformé par pSPM75, (résultats exprimés en mg/1).
Ainsi, il est observé que la présence du plasmide pSPM75 augmente significativement la production en spiramycines de la souche OSC2. Ceci démontre bien que la surexpression de or/28c a un effet positif sur la production en spiramycines.
EXEMPLE 25 : Analyse de la production d'intermédiaires de biosynthèse de spiramycines d'une souche inactivée dans le gène orβ :
La souche OS49.107, dans laquelle le gène orβ est inactivé par insertion de la ; ;
On s'attend donc à ce que la biosynthèse des spiramycines soit bloquée au stade de la forocidine (cf. figure 7). La souche OS49.107 qui est non productrice de spiramycine devrait donc produire de la forocidine.
Un échantillon de surnageant de la souche OS49.107 a été préparé selon la méthode décrite ci-dessus (cf. exemple 16, sans extraction au MIBK) et a été analysé par CL/SM comme décrit ci-dessus (cf. le paragraphe 20.2 et 20.3). En mode SIM, la masse 558 relative à l'ion moléculaire de la forocidine a été sélectionné et plusieurs pics ont été détectés. La présence de composés de masse 558 est compatible avec l'hypothèse du rôle de orf8 dans synthèse de forosamine. EXEMPLE 26 : Analyse de la production d'intermédiaires de biosynthèse de spiramycines d'une souche inactivée dans le gène or/72 :
La souche SPM507, dans laquelle le gène or/72 est inactivé, ne produit pas de spiramycines (cf. exemple 11 et 15). Le gène orfl 2 coderait une 3,4 déshydratase responsable de la réaction de déshydratation nécessaire à la biosynthèse de la forosamine (cf. figure 6). On s'attend donc à ce que la biosynthèse des spiramycines soit bloquée au stade de la forocidine (cf. figure 7). La souche SPM507 qui est non productrice de spiramycine devrait donc produire de la forocidine.
Un échantillon de surnageant de la souche SPM507 a été préparé selon la méthode décrite ci-dessus (cf. exemple 16, sans extraction au MIBK) et a été analysé par CL/SM comme décrit ci-dessus (cf. le paragraphe 20.2 et 20.3). Dans ces conditions, le temps de
con tions, un pro uit absorbant à 238 nm a plus particulièrement été observé (temps rétention de 17,1 min). L'analyse en LC/SM a permis de déterminer la masse de ce composé qui est de 744,3 g/mole ([M+H]+=744,3 produit majoritaire). Afin d'obtenir la structure, le produits mentionné ci-dessus a été isolé et purifié dans les conditions décrites précédemment (cf. paragraphe 20.1) ). La phase organique (MIBK) est alors récupérée et évaporée. L'extrait sec est repris avec de l'eau et extrait avec de l'heptane. La solution aqueuse est ensuite extraite par fixation sur une cartouche Oasis HLB 1 g (Waters SAS, St-Quentin en- Y vélines, France). Le composé est récupéré par élution avec un mélange eau/acétonitrile 30/70. Cette solution est ensuite injectée (lOOμL) sur la colonne analytique et les fractions récupérées sur cartouche Oasis HLB 1 ce 30mg (Waters). Avant utilisation, les cartouches Oasis HLB 1 ce 30mg (Waters) sont conditionnées séquentiellement par de racétonitrile, puis un mélangeeau/acétonitrile (20v/80v) et un mélanged'eau/acétonitrile 80/20. La cartouche Oasis HLB 1 ce 30mg (Waters) est ensuite lavée successivement par 1 ml d'eau acétonitrile (95/5), 1ml d'eau/acétonitrile deutéré (95/5), puis éluée avec 600μl d'eau acétonitrile deutéré 40/60. La solution récupérée est ensuite directement analysée en RMN.
5 Le spectre RMN obtenu pour ce composé est le suivant (Spectre RMN 19312 V) :
*
Spectre lH .dans CD3CN/D2O (déplacements chimiques en ppm): 0,92 (3H, d, J=6Hz), 1,10 (IH, m), 1,14 (3H, s), 1,17 (3H, d, J=6Hz), 1,22 (3H, d, J=6Hz), 1,25 (3H, d, J=6Hz), 1,40 (IH, m), 1,75 (IH, dd, J=12 et 2Hz), 1,81 (IH, m), 1,90 (IH, d, J=12Hz), 2,05 (IH, m), 2,12 (3H, s), 2,15 (IH, m), 2,35 (2H, m), 2,45 (6H, s large), 2,53 (IH, m), 10 2,64 (IH, dd, J=12 et 9Hz), 2,80 (IH, dd, J=9 et 16Hz), 2,95 (IH, d, J=8Hz), 3,23 (2H, m), 3,34 (IH, d, J=7Hz), 3,45 (3H, s), 3,49 (IH, m), 3,93 (IH, dd, J=7 et 3Hz), 4,08 (IH, m), 4,37 (IH, d, J=6Hz), 4,88 (IH, m), 5,05 (2H, m), 5,65 (2H, m), 6,08 (IH, dd, J=8 et 12Hz), 6,40 (IH, dd, J=12 et 9Hz), 9,60(1H, s).
Ces expériences ont ainsi permis de déterminer la structure de ce composé, celle::H;. ci est présentée en figure 38. ' i lfl
EXEMPLE 27 : Analyse de la production d'intermédiaires de biosynthèse de spiramycines d'une souche inactivée dans le gène orβ* :
La souche SPM501 possède le génotype orβ*::attlΩhyg+. Grâce à l'effet polaire 20 de l'insertion de la cassette attlΩhyg+ dans le gène orfό*, il a pu être déterminé que le gène orf 5* est indispensable à la voie de biosynthèse des spiramycines. En effet, l'insertion de la cassette excisable dans la partie codante du gène orfό* entraîne un arrêt total de la production en spiramycines par effet polaire sur l'expression du gène orβ*. Cependant, une fois que la cassette insérée a été excisée (et donc lorsque seul le gène 25 orfό* est inactivé, cf exemples 14 et 15), on restaure une production de spiramycine I. Ceci démontre que le gène orf 5* est indispensable à la biosynthèse des spiramycines puisque son inactivation entraîne un arrêt total de la production en spiramycines. Le gène orβ* code une protéine présentant une relative forte similitude avec plusieurs O-méthyltransférases. Le gène orβ* serait une O-méthyl transférase impliquée dans la biosynthèse du platénolide. Pour vérifier cette hypothèse, des expériences d'analyse CL/SM et de RMN ont été conduites sur une souche de S. ambofaciens de génotype orfό*::attlΩhyg+ obtenue à partir d'une souche suφroduisant les spiramycines.
Un échantillon du surnageant de cette souche a été préparé selon la méthode décrite ci-dessus (cf. exemple 16, sans extraction au MIBK) et a été analysé par CL/SM comme décrit ci-dessus (cf. le paragraphe 20.2 et 20.3). Toutefois, la colonne utilisée est X une colonne X-Terra (Waters SAS, St-Quentin en-Yvelines, France), et la tension de cône du spectromètre est réglée à 380V pour obtenir la fragmentation du composé analysé. Dans ces conditions, un produit dont le temps de rétention est d'environ 13,1
Par un test microbioogique effectué sur une souche sensible de M. luteus (cf. exemple 15 et figure 18) il a été démontré que la molécule intermédiaire (spiramycine moins groupement méhyle dont la structure est présentée en figure 39) produite par la souche orfό* ::Ωatthyg+ est beaucoup moins active (d'un facteur 10) que la spiramycine d'origine avec le groupement méthyl en position 4.
EXEMPLE 28 : Construction de nouvelles « cassettes excisables » :
De nouvelles cassettes excisables ont été construites. Ces cassettes sont très semblables aux cassettes excisables déjà décrites dans l'exemple 9. La différence principale entre les anciennes et les nouvelles cassettes est l'absence dans ces dernières des séquences correspondant aux extrémités de l'inteφoson Ω, séquences qui contiennent un terminateur de transcription provenant du phage T4.
Dans les cassettes sans terminateur, le gène qui confère la résistance à un antibiotique est flanqué des séquences αttR et attL permettant l'excision. Le gène de résistance est le gène aac(3)IV qui code une acétyltransferase qui confère la résistance à l'apramycine. Ce gène est présent dans la cassette Ωaac (numéro d'accès GenBank : X99313, Blondelet-Rouault, M.H. et al, 1997) et a été amplifié par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pOSK1102 (cf. ci-dessus) et comme amorces les oligonucléotides KF42 et KF43 contenant chacun le site de restriction HindlU (en gras)(AAGCTT) en 5'.
KF42: 5'-AAGCTTGTACGGCCCACAGAATGATGTCAC-3' (SEQ DD N° 153) et
KF43: 5'-AAGCTTCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTT-3' (SEQ ID N° 154). Le produit PCR obtenu d'environ lkb a été clone dans le vecteur E. coli pGEMT > Easy donnant naissance au plasmide pSPM83.
Le vecteur pSPM83 a été digéré par l'enzyme de restriction HindlU. Le fragment ' HiruiΩl-Hinά π. de l'insert a été isolé par purification à partir d'un gel d'agarose 0,8% ' puis clone dans le site Hindlll situé entre les séquences ttL et ttR des différents plasmides portant les différentes cassettes excisables possibles (cf. exemple 9 et figure 27) de façon à remplacer le fragment Hindlll correspondant à Ωacc par le fragment Hindlll correspondant au gène aac seul. Ceci a permit d'obtenir les cassettes attlaac, att2aac et att3aac (selon la phase souhaitée, cf. exemple 9). Selon l'orientation du gène aac par rapport aux séquences αttL et cttR, on distingue attlaac+, attlaac-, att2aac+, att2aac-, att3aac+ et att3aac- (selon les mêmes conventions que celles adoptées dans l'exemple 9). EXEMPLE 29 : Construction d'une souche de S. ambofaciens interrompue dans le gène orβ8c :
L'inactivation du gène orβ8c a été réalisée grâce à la technique des cassettes
5 excisables. La cassette excisable att3aac+ (cf. exemple 28) a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pSPMIOl (Le plasmide pSPMIOl est un plasmide dérivé du vecteur ρGP704Not (Chaveroche et al, 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ,
1988) dans lequel la cassette att3aac+ a été clonée comme un fragment EcoRV dans le site unique EcoRV de pGP704Not) et à l'aide des amorces suivantes :
10 KF32:
5' CAACCGCTTGAGCTGCTCCATCAACTGCTGGGCCGAGGTATCGCGCGCG
CTTCGTTCGGGACGAA 3' (SEQ ID N° 155)
séquence correspondant à une séquence dans le gène orβ8c et les 26 nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras et soulignés ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des
20 extrémités de la cassette excisable att3aac+
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli hyper- recombinante DY330 (Yu et al, 2000) (cette souche contient les gènes exo, bet et gam du phage lambda intégrés dans son chromosome, ces gènes sont exprimés à 42°C, elle a été utilisée à la place de la souche E.coli KS272 (Chaveroche et al, 2000)) contenant le
25 cosmide pSPM36. Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par ce produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les cosmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par l'enzyme de restriction BamHl, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspondait au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3aac+) dans le gène orβ8c, c'est à dire s'il
30 y avait bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible. La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et sequençage du produit de PCR. Un clone dont le cosmide possède le profil attendu a été sélectionné et le cosmide correspondant a été nommé pSPM107. Ce cosmide est un dérivé de pSPM36 dans lequel orβ 8c est interrompue par la cassette att3aac+. L'insertion de la cassette- s'accompagne d'une délétion dans le gène orβ 8c, l'interruption commence au niveau du 28ème codon de orf28c II reste après la cassette les 137 derniers codons de orf28c.
Le cosmide pSPM107 a dans un premier temps été introduit dans la souche E. coli
DH5α puis dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 par transformation de protoplastes. Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec puromycine (antibiotique ; A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à la puromycine (PuroS) sont en principe ceux où un double événement de crossing oyer; f s'est produit et qui possèdent lé génie σr2Sc interrompu par la cassette att3aac+. ,ÇèS' f clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orβ8c par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybride avec une sonde correspondant à la cassette att3aac+ pour vérifier la présence de la cassette au locus attendu dans l'ADN génomique des clones obtenus. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et sequençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orβ8c::att3aac+) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM107. Ce clone possède donc le génotype : orβ8c::att3aac+ et a été nommé SPM107. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orβ 8c, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). En effet, le fait que orβ9 soit orienté en sens opposé à orβ8c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment, notamment par transformation par le plasmide pOSV508.
Afin de tester l'effet de l'extinction du gène orβ8c sur la production de
5 spiramycines, la production en spiramycines de la souche SPM107 a été testée par la technique décrite dans l'exemple 15. Il a ainsi pu être démontré que cette souche possède un phénotype non producteur de spiramycines. Ceci démontre que le gène orβ 8c est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.
10 EXEMPLE 30 : Construction d'une souche de S. ambofaciens interrompue dans le gène orβl :
GCTTCGTTCGGGACGAA 3' (SEQ ID N° 157)
20 EDR72:
5 ' GCCAGCACCTCGTCCAGCTGCTCGACGGAACTCACCCCCATCTGCCTCT TCGTCCCGAAGCAACT 3' (SEQ ID N° 158)
Les 39 nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une 25 séquence correspondant à une séquence dans le gène orβl et les 26 nucléotides situés le plus en 3' (figurés en gras et soulignés ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3aac+.
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli
KS272 contenant le plasmide pKOBEG et le cosmide pSPM3 , comme décrit par
30 Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (cf. figure 12 pour le principe, le plasmide pOS49.99 doit être remplacé par le cosmide pSPM36 et le plasmide obtenu n'est plus pSPM17 mais pSPM543). Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par ce produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les cosmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par plusieurs enzymes de restriction, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion.de la cassette (att3aac+) dans le gène orβl, c'est à dire s'il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible. La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en ; utilisant les oligonucléotides appropriés et sequençage du produit de PCR. Un clone dont le cosmide possède le profil attendu a été sélectionné et le cosmide correspondant a été nommé pSPM543. Ce cosmide est un dérivé de pSPM36 dans lequel orβl est interrompue par la cassette att3aac+ (cf. figure 12). L'insertion de la cassette
transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec puromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à la puromycine (PuroS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orβl interrompu par la cassette att3aac+. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orβl par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré sur membrane et hybride avec une sonde correspondant à la cassette att3aac+ pour vérifier la présence de la cassette au locus attendu dans l'ADN génomique des clones obtenus. Une deuxième hybridation a été effectuée en utilisant comme sonde un fragment d'ADN obtenu par PCR et correspondant à une très large partie de la séquence codante du gène orβl.
La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et sequençage du produit de PCR.
Un clone présentant les caractéristiques attendues (orβl::att3aac+) a été plus particulièrement sélectionné et nommé SPM543. Il a pu en effet être vérifié grâce aux deux hybridations que la cassette att3aac+ était bien présente dans le génome de ce clone et que l'on obtient bien le profil de digestion attendu dans le cas d'un remplacement, à la suite d'un double événement de recombinaison, du gène sauvage par la copie interrompue par la cassette att3aac+ dans le génome de ce clone. Ce clone possède donc le génotype : orβl::att3aac+ et a été nommé SPM543. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orβl, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). En effet, le fait que orβ2c soit orienté en sens opposé à orβl montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment, notamment par transformation par le plasmide pOSV508.
Afin de tester l'effet de l'extinction du gène orβl sur la production de spiramycines, la production en spiramycines de la souche SPM543 a été testée par la technique décrite dans l'exemple 15. Il a ainsi pu être démontré que cette souche possède un phénotype non producteur de spiramycines. Ceci démontre que le gène orβl est un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens.
EXEMPLE 31 Construction d'une souche de S. ambofaciens interrompue dans le gène orβ2c :
L'inactivation du gène orf32c a été réalisée grâce à la technique des cassettes excisables. La cassette excisable att3aac+ a été amplifiée par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pSPMIOl et à l'aide des amorces suivantes : KF52:
5' GATCCGCCAGCCTCACGTCACGCCGCGCCGCCTCCCTGACATCGCGCGC GCTTCGTTCGGGACGAA 3' (SEQ ID N° 159). et KF53: 5' GAGGCGGACGTCGGTACGCGGTGGGAGCCGGAGTTCGACAATCTGCCTC TTCGTCCCGAAGCAACT 3' (SEQ ID N° 160).
Les 40 nucléotides situés à l'extrémité 5' de ces oligonucléotides comportent une séquence correspondant à une séquence dans le gène orβ2c et les 26 nucléotides situés le plus en 3' (figuré en gras et soulignés ci-dessus) correspondent à la séquence d'une des extrémités de la cassette excisable att3aac+.
Le produit de PCR ainsi obtenu a été utilisé pour transformer la souche E. coli hyper-recombinante DY330 (Yu et al, 2000) contenant le cosmide pSPM36. Ainsi, les bactéries ont été transformées par électroporation par ce produit de PCR et les clones ont été sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les cosmides des clones obtenus ont été extraits et digérés par l'enzymes de restriction BamHl, dans le but de vérifier que le profil de digestion obtenu correspond au profil attendu s'il y a eu insertion de la cassette (att3aac+) dans le gène orβ2c, c'est à dire s'il y a bien eu recombinaison homologue entre les extrémités du produit PCR et le gène cible. La vérification de la construction peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés et sequençage du produit de PCR. Un clone dont le cosmide possède le profil attendu a été sélectionné et le cosmide correspondant a été nommé pSPMIOό. Ce cosmide est un dérivé de pSPM36 dans lequel orβ 2c est interrompue par la cassette att3aac+. L'insertion de la cassette s'accompagne d'une délétion dans le gène orβ2c, l'interruption commence au niveau du 112ème codon de orβ 2c. Il reste après la cassette les 91 derniers codons de orβ2c.
Le cosmide pSPM106 a dans un premier temps été introduit dans la souche E. coli DH5α puis, dans la souche Streptomyces ambofaciens OSC2 par transformation. Après transformation, les clones sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les clones résistants à l'apramycine sont ensuite repiqués respectivement sur milieu avec apramycine (antibiotique B) et sur milieu avec puromycine (antibiotique A) (cf. figure 9). Les clones résistants à l'apramycine (ApraR) et sensibles à la puromycine (PuroS) sont en principe ceux où un double événement de crossing over s'est produit et qui possèdent le gène orβ2c interrornpu par la cassette att3aac+. Ces clones ont été plus particulièrement sélectionnés et le remplacement de la copie sauvage de orβ2c par la copie interrompue par la cassette a été vérifié par hybridation. Ainsi, l'ADN total des clones obtenus, a été digéré par plusieurs enzymes, séparé sur gel d'agarose, transféré 'Y. ': sur membrane et hybride avec une sonde correspondant à la cassette att3aac+ pour vérifier la présence de la cassette dans l'ADN génomique des clones obtenus. La vérification du génotype peut également être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier et notamment par PCR en utilisant les oligonucléotides appropriés : et sequençage du produit de PCR. "-Xi:.
'•" : -- X{-
*. - .*, '*' #: Un clone présentant les caractéristiques attendues (orβ2c::att3aac+) a été plus, particulièrement sélectionné. Ce clone possède donc le génotype : orβ2c::att3aac+ 'et a |t été nommé SPM106. Il est inutile de procéder à l'excision de la cassette pour l'étude de l'effet de l'inactivation de orβ2c, au vu de l'orientation des gènes (cf. figure 3). En effet, le fait que or/33 soit orienté en sens opposé à orβ2c montre que ces gènes ne sont pas co-transcrits. L'utilisation d'une cassette excisable permet en revanche d'avoir la possibilité de se débarrasser du marqueur de sélection à tout moment, notamment par transformation par le plasmide pOSV508.
Afin de tester l'effet de l'extinction du gène orβ2c sur la production de spiramycines, la production en spiramycines de la souche SPM106 a été testée par la technique décrite dans l'exemple 15. Il a ainsi pu être démontré que cette souche possède un phénotype producteur de spiramycines. Ceci démontre que le gène orβ2c n'est pas un gène essentiel à la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens. Liste des constructions décrites dans la présente demande
Liste des abréviations : Am : Ampicilline ; Hyg: Hygromycine ; Sp : Spiramycine ; Ts : Thiostrepton ; Cm : Chloramphénicol. Kn : Kanamycine, Apra : apramycine.
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Dépôt de matériel biologique
Les organismes suivants ont été déposés le 10 juillet 2002 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.
5 - Souche OSC2 sous le numéro d'enregistrement 1-2908.
- Souche SPM501 sous le numéro d'enregistrement 1-2909.
- Souche SPM502 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.
- Souche SPM507 sous le numéro d'enregistrement 1-2911.
- Souche SPM508 sous le numéro d'enregistrement 1-2912.
10 - Souche SPM509 sous le numéro d' enregistrement 1-2913.
- Souche OS49.67 sous le numéro d'enregistrement 1-2916.
- Souche OS49.107 sous le numéro d'enregistrement 1-2917.
15 - Souche Escherichia coli DH5α contenant le plasmide pOS44.4 sous le numéro d'enregistrement 1-2918.
Les organismes suivants ont été déposés le 26 février 2003 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.
20 - Souche SPM502 pSPM525 sous le numéro d'enregistrement 1-2977. Les organismes suivants ont été déposés auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 6 octobre 2003 selon les dispositions du Traité de Budapest .
- Souche OSC2/pSPM75(2) sous le numéro d' enregistrement 1-3101.
Toutes les publications et brevets cités sont incoφorés à la présente demande par référence.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Polynucléotide codant un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisé en ce que la séquence dudit polynucléotide est : (a) l'une des séquences SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28,
30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149,
(b) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a),
(c) l'une des séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.
2. Polynucléotide s'hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence à au moins l'un des polynucléotides selon la revendication 1.
600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 ou 1900 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide selon la revendication 1.
4. Polynucléotide selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.
5. Polynucléotide selon la revendication 2, 3 ou 4 caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.
6. Polynucléotide selon la revendication 2, 3, 4 ou 5 caractérisé en ce qu'il code une protéine ayant une activité similaire à la protéine codée par le polynucléotide avec lequel il s'hybride ou il présente l'identité.
7. Polypeptide résultant de l'expression d'un polynucléotide selon la revendication 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
8. Polypeptide impliqué dans la biosynthèse des spiramycines caractérisée en ce que la séquence dudit polypeptide est :
(a) l'une des séquences SEQ ID N° 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 et 150,
(b) l'une des séquences telles que définies en (a) excepté que tout au long de ladite séquence un ou plusieurs acides aminés ont été substitués, insérés ou délétés ; sans en affecter les propriétés fonctionnelles,
(c) l'une des séquences constituées par les variants des séquences (a) et (b).
9. Polypeptide présentant au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou ;98% ^J d'identité en acides aminés avec un polypeptide comprenant au moins 10, 15, 20, 30 à X' :- ' 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 ou 640 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon la revendication 8.
10. Polypeptide selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'une bactérie du genre Streptomyces.
11. Polypeptide selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce qu'il code une protéine impliquée dans la biosynthèse d'un macrolide.
12. Polypeptide selon la revendication 9, 10 ou 11 caractérisé en ce qu'il a une activité similaire à celle du polypeptide avec lequel il partage l'identité.
13. ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
14. ADN recombinant selon la revendication 13 caractérisé en ce que le dit ADN recombinant est compris dans un vecteur.
15. ADN recombinant selon la revendication 14 caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi les bactériophages, les plasmides, les phagemides, les vecteurs intégratifs, les fosmides, les cosmides, les vecteurs navettes, les BAC ou les PAC.
16. ADN recombinant selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi pOS49.1, pOS49.11, pOSC49.12, pOS49.14, pOS49.16, pOS49.28, pOS44.1, pOS44.2, pOS44.4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, pOS49.88, pOS49.106,
pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPM515, pSPM519, pSPM74, pSPM75, pSPM79, pSPM83, pSPM107, pSPM543 et pSPM106.
17. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant un polypeptide selon la revendication 7, 8, 9, 10,
11 ou 12.
18. Système d'expression comprenant un vecteur d'expression approprié et une cellule hôte permettant l'expression d'un ou plusieurs polypeptides selon la revendication 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.
19. Système d'expression selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression procaryotes ou les systèmes d'expression eucaryotes.
', 20. Système d'expression selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les systèmes d'expression chez la bactérie E. coli, les sytèmes d'expression baculovirus permettant une expression dans des cellules d'insectes, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de levures, les sytèmes d'expression permettant une expression dans des cellules de mammifères.
21. Cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4, 5, 6, 13, 14, 15, 16 ou 17.
22. Procédé de production d'un polypeptide selon la revendication 7, 8, 9, 10, ( r 11 ou 12 caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: ' [, a) insérer au moins un acide nucléique codant ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
23. Microorganisme bloqué dans une étape de la voie de biosynthèse d'au moins un macrolide.
24. Microorganisme selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il est obtenu en inactivant la fonction d'au moins une protéine impliquée dans la biosynthèse de ce ou de ces macrolides dans un microorganisme producteur de ce ou de ces macrolide.
25. Microorganisme selon la revendication 24 caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénese dans le ou les . gènes codant ladite ou lesdites protéines ou par expression d'un ou de plusieurs ARN anti-sens complémentaires de l'ARN ou des ARN messagers codant ladite ou lesdites protéines.
26. Microorganisme selon la revendication 25 caractérisé en ce que l'inactivation de cette ou de ces protéines est effectuée par mutagénese par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénese dirigée ou par remplacement de gène.
27. Microorganisme selon la revendication 25 ou 26 caractérisé en ce que la pu ' ^, '1 les mutagénèses sont effectuées in vitro ou in situ, par suppression, substitutiόi délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés ou par inactivation génique.
28. Microorganisme selon la revendication 23, 24, 25, 26 ou 27 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.
29. Microorganisme selon la revendication 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.
30. Microorganisme selon la revendication 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souche de S. ambofaciens.
31. Microorganisme selon la revendication 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 caractérisé en ce que la mutagénese est effectuée dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'une des revendication 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
32. Microorganisme selon la revendication 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31 caractérisé en ce. que la mutagénese est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, ' 141, 143, 145, 147 et 149.
33. Microorganisme selon la revendication 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 caractérisé en ce que la mutagénese consiste en l'inactivation gémque d'un gène comprenant une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N° 13.
34. Soμche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit d'unèj ï i souche choisie parmi : l'une des souches déposées auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2909, 1-2911, 1-2912, 1-2913, 1-2914, 1-2915, 1-2916 ou 1-2917 - la souche SPM510.
35. Procédé de préparation d'un intermédiaire de biosynthèse de macrolide caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'une des revendications 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34, b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire, c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), ledit intermédiaire de biosynthèse.
36. Procédé de préparation d'une molécule dérivée d'un macrolide caractérisé en ce que l'on prépare un intermédiaire de biosynthèse selon le procédé de la revendication 35 et que l'on modifie l'intermédiaire ainsi produit.
5 37. Procédé de préparation selon la revendication 36 caractérisé en ce que l'on modifie ledit intermédiaire par voie chimique, biochimique, enzymatique et/ou microbiologique.
38. Procédé de préparation selon la revendication 36 ou 37 caractérisé en ce -y" 10 que l'on introduit dans ledit microorganisme un ou plusieurs gènes codant des protéines susceptibles de modifier l'intermédiaire en s'en servant comme substrat.
41. Microorganisme produisant de la spiramycine I mais ne produisant pas de 20 spiramycine II et III.
42. Microorganisme selon la revendication 41 caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de la spiramycine I mais que le gène comprenant la séquence SEQ ID N° 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences
25 dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N° 14 ou l'un de ses variants n'est pas exprimé ou a été rendu inactif.
43. Microorganisme selon la revendication 42 caractérisé en ce que la dite 30 inactivation est réalisée par mutagénese dans le gène codant ladite protéine ou par l'expression d'un ARN anti-sens complémentaire de l'ARN messager codant ladite protéine.
44. Microorganisme selon la revendication 43 caractérisé en ce que la dite mutagénese est effectuée dans le promoteur de ce gène, dans la séquence codante ou dans une séquence non codante.de manière à rendre inactive la protéine codée ou à en empêcher son expression ou sa traduction.
45. Microorganisme selon la revendication 43 ou 44 caractérisé en ce que la mutagénese est effectuée par irradiation, par action d'agent chimique mutagène, par mutagénese dirigée ou par remplacement de gène.
46. Microorganisme selon la revendication 43, 44 ou 45 caractérisé en ce que la mutagénese et/ou addition génique,
47. Microorganisme selon la revendication 41 ou 42 caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu en exprimant les gènes de la voie de biosynthèse de la spiramycine sans que ceux-ci ne comprennent le gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N° 14 ou l'un de ses variants.
48. Microorganisme selon la revendication 41, 42, 43, 44, 45, 46 ou 47 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactérie du genre Streptomyces.
49. Microorganisme selon la revendication 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 ou 48 caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de départ produisant les spiramycines I, II et III.
50. Microorganisme selon la revendication 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49 caractérisé en ce qu'il est obtenu par mutagénese dans un gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'un de ses variants ou l'une des
5 séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique et codant un polypeptide de séquence SEQ ID N° 14 ou l'un de ses variants ayant la même fonction.
51. Microorganisme selon la revendication 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 10 50 caractérisé en ce que ledit microorganisme est obtenu à partir d'une souche de S. ambofaciens produisant les spiramycines I, II et III, dans laquelle est effectuée une inactivation génique du gène comprenant la séquences correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
15
52. Souche de S. ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souch&fîâ*
, ."'. ''.•- Λl : déposée auprès de la Collection Nationale de Qiltures de Microorganismes (CNCJM);Ï? ? le 10 juillet 2002 sous le numéro d'enregistrement 1-2910.
20 53. Procédé de production de spiramycine I, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'une des revendications 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 52,
(b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire,
25 (c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), la spiramycine I.
54. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 pour améliorer la production en macrolides d'un microorganisme. 30 4/033689
224
55. Microorganisme mutant producteur de macrolide caractérisé en ce qu'il possède une modification génétique dans au moins un gène comprenant une séquence selon l'une des revendication 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 et/ou qu'il surexprime au moins un gène comprenant une séquence selon l'une des revendication 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
56. Microorganisme mutant selon la'revendication 55 caractérisé en ce que la modification génétique consiste en une suppression, une substitution, une délétion et/ou une addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés dans le but d'exprimer une ou des protéines ayant une activité supérieure ou d'exprimer un niveau plus élevé de cette ou de ces protéines.
57. Microorganisme mutant selon la revendication 55 caractérisé en ce que la
microorganisme producteur de macrolide par une construction d'ADN recombinant selon la revendication 13, 14 ou 17, permettant la surexpression de ce gène.
59. Microorganisme mutant selon la revendication 55, 56, 57 ou 58 caractérisé en ce que la modification génétique est effectuée dans un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
60. Microorganisme mutant selon la revendication 55, 56, 57, 58 ou 59 caractérisé le microorganisme surexprime un ou plusieurs gènes comprenant une des séquences correspondant à une ou plusieurs des séquences SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 et 149, ou l'un de ses variants ou l'une des séquences dérivées de celles-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
61. Microorganisme mutant selon la revendication 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une bactéries du genre Streptomyces.
62. Microorganisme mutant selon la revendication 55, 56, 57, 58, 59, 60 ou 61 caractérisé en ce que le macrolide est la spiramycine.
63. Microorganisme mutant selon la revendication 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 ou 62 caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souches de S. ambofaciens.
64. Procédé de production de macrolides, caractérisé en ce qu'il comprend les .g wj étapes suivantes : - ;' - v ' ;'t ff
(a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'une des revendications 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ou 64, (b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire,
(c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), le ou lesdits macrolides produits.
65. Utilisation d'une séquence et/ou d'un ADN recombinant et/ou d'un vecteur selon l'une des revendication 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 pour la préparation d'antibiotiques hybrides.
66. Utilisation d'au moins un polynucléotide et/ou au moins un ADN recombinant et/ou au moins un vecteur d'expression et/ou au moins un polypeptide et/ou au moins une cellule hôte selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 16, 17 ou 21 pour réaliser une ou plusieurs bioconversions.
67. Polynucléotide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide complémentaire de l'un des polynucléotides selon la revendication 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.
68. Microorganisme producteur d'au moins une spiramycine caractérisé en ce qu'il surexprime :
-un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase (PCR) en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5'
GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens,
-ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
69. Microorganisme selon la revendication ,68 ou 90 caractérisé en ce qμ'i ï s'agit d'une bactérie du genre StrepiotήycësX'
70. Microorganisme selon la revendication 68, 69 ou 90 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie de l'espèce Streptomyces ambofaciens.
11. Microorganisme selon la revendication 68, 69, 70 ou 90 caractérisé en ce que la surexpression dudit gène est obtenue par transformation dudit microorganisme par un vecteur d'expression.
72. Souche de Streptomyces ambofaciens caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche OSC2/pSPM75(l) ou de la souche OSC2/pSPM75(2) déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, le 6 octobre 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-3101.
73. ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend : un polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5'
AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5'
GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens, ou, un fragment d'au moins 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490 ou 1500 nucléotides consécutifs de ce polynucléotide.
74. ADN recombinant selon la revendication 73 ou 91 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur.
75. ADN recombinant selon la revendication 73, 74 ou 91 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'expression.
76. Cellule hôte dans laquelle a été introduit au moins un ADN recombinant selon l'une des revendications 73, 74, 75 ou 91.
77. Procédé de production d'un polypeptide caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a) transformer une cellule hôte par au moins un vecteur d'expression selon la revendication 75; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir de l'extrait cellulaire obtenu à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
78. Microorganisme selon la revendication 51 caractérisé en ce que l'inactivation génique est effectuée par délétion en phase du gène ou d'une partie du gène comprenant la séquence correspondant à SEQ ID N° 13 ou l'une des séquences dérivées de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
79. Microorganisme selon l'une des revendications 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 78 caractérisé en ce en ce qu'il surexprime en outre : - un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase en utilisant le couple d'amorces de séquence suivante : 5' AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou PADN total de Streptomyces ambofaciens, ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
80. Vecteur d'expression caractérisé en ce que le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 47 ou un polynucléotide dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression de la protéine codée par le dit polynucléotide chez Streptomyces ambofaciens.
81. Vecteur d'expression selon la revendication 80 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM524 ou pSPM525.
82. Souche de Streptomyces ambofaciens transformée par un vecteur selon la revendication 80 ou 81.
83. Microorganisme selon l'une des revendications 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 78, 79 ou 92 caractérisé en ce qu'il surexprime en outre le gène de séquence codante SEQ ID N° 47 ou d'une séquence codante dérivée de celle-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
84. Microorganisme selon la revendication 83 caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche SPM502 pSPM525 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 4/033689
229
75724 Paris Cedex 15, France, le 26 février 2003 sous le numéro d'enregistrement 1-2977.
85. Procédé de production de spiramycine(s), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver, dans un milieu de culture approprié, un microorganisme selon l'une des revendications 68, 69, 70, 71,J2, 78, 79, 82, 83, 84, 90 ou 92,
(b) récupérer le milieu de culture conditionné ou un extrait cellulaire,
(c) séparer et purifier à partir dudit milieu de culttire ou encore à partir de . l'extrait cellulaire obtenu à l'étape b), les spiramycines.
86. Polypeptide caractérisé en ce que sa séquence comprend la séquence SEQ
ID N° 112 ou la séquence SEQ ID N° 142.
87. Polypeptide caractérisé eμ ce que sa séquence correspond à la séquence . traduite de la séquence codante : ; :?) ^
- d'un gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par; :!!« polymerase (PCR) en utilisant , l couplé d'amorces de séquence suivante': •; .5' ;|f f§ff AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) et 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) et comme matrice le cosmide pSPM36 ou l'ADN total de Streptomyces ambofaciens,
-ou d'un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
88. Vecteur d'expression permettant l'expression d'un polypeptide selon la revendication 86, 87 ou 93 chez Streptomyces ambofaciens.
89. Vecteur d'expression selon la revendication 88 caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pSPM75.
90) Microorganisme selon la revendication 68 caractérisé en ce que le gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase est le gène de 4/033689
230
séquence codante SEQ ID N° 141 ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la dégénérescence du code génétique.
91) ADN recombinant selon la revendication 73 caractérisé en ce que le polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase est un polynucléotide de séquence SEQ ID N° 141.
92) Microorganisme selon la recendication 79 caractérisé en ce que le gène susceptible d'être obtenu par amplification en chaîne par polymerase est le gène de séquence codante SEQ ID N° 141 ou un gène dérivé de celui-ci en raison de la : dégénérescence du code génétique.
93) Polypeptide caractérisé en ce que sa séquence est SEQ ID N° 142.
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