CN111349595A - 一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法 - Google Patents
一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物基因工程领域，公开了一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法。本发明提供的螺旋霉素产生菌的菌株中的Lrp基因失活(Δlrp‑SP)，菌株的保藏号为CGMCC No.16056；本发明提供的可利霉素产生菌的菌株中的Lrp基因失活(Δlrp‑BT)，菌株的保藏号为CGMCC No.16055。本发明通过使Lrp基因失活，提高了螺旋霉素和可利霉素的产量，尤其是可利霉素的主组分4”‑异戊酰螺旋霉素Ⅲ的产量和比例明显提高。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，涉及一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法，具体涉及调控基因的运作与提高抗生素产量及有效组分的方法及其应用。
背景技术
可利霉素曾用名生技霉素、必特螺旋霉素，是利用合成生物学技术，将碳霉素产生菌 (Streptomyces thermotolerans)中4”-异戊酰基转移酶基因(ist)在螺旋霉素产生菌(Streptomyces spiramyceticus F21)中进行克隆表达，获得的基因工程菌(Streptomycesspiramyceticus WSJ-1)的发酵产物[专利号：ZL971044406、ZL021487715]。可利霉素为多组分抗生素，以4”-异戊酰螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ为主组分，其中Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ组分以3位OR基团，依次为丙酰基、乙酰基、羟基而命名。可利霉素结构式如下：
可利霉素结构式
异戊酰螺旋霉素Ⅲ：R＝COCH2CH3 R′＝COCH2CH(CH3)2
异戊酰螺旋霉素Ⅱ：R＝COCH3 R′＝COCH2CH(CH3)2
异戊酰螺旋霉素Ⅰ：R＝H R′＝COCH2CH(CH3)2
可利霉素作为一类新药已近入新药审批阶段，其质量标准中规定Ⅲ组分应不低于30％。
链霉菌中存在一系列调控基因，激活或抑制其转录可以提高其次级代谢产物的生物合成，从而提高其产量(Bekker V et al.Bioengineered.2014,5(5):293-299)。亮氨酸反应蛋白 (Leucine-responsive regulatory protein,Lrp)是一类调控转录因子，通过与调控基因启动子序列的结合，激活或抑制调控基因的转录活性，调控诸多微生物的生理代谢(Peeters E et al. Archaea.2010,Article ID 750457；Unoarumhi Y et al BMC EvolBiol.2016 16(1):111)，如支链氨基酸的代谢、鞭毛的合成、毒力因子的抑制、多胺内稳态和甲醇的同化等过程(Haney SA et al. J Bacteriol.1992,174(1):108-115；Braaten BAet al.Proc Natl Acad Sci U S A.1992, 89(10):4250-4；Baek CH et al JBacteriol.2009,191(4):1278-92；Ishii Y et al.J Biosci Bioeng. 2018,125(1):67-75；Gonzalez JE et al.Metab Eng.2018 45:67-74)。然而Lrp基因在抗生素生物合成中的功能和作用至今研究报道较少，只有Liu等(Liu J.at al.Appl Microbiol Biotechnol.2017,101(14):5773-5783)在天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor中发现Lrp蛋白家族Lrp/AsnC调节因子SCO3361，其编码基因的缺少导致放线紫红素产量的明显降低，同时，在固体培养基气生菌丝和孢子的形成受到抑制，认为它是一个多效性调节因子，调控次级代谢及形态的发育(Liu J at al.Metab Eng.2017,39:29-37)；他们同时在红霉素产生菌Saccharopolyspora erythraea发现一个SACE_Lrp基因，其缺失可以提高红霉素的发酵产量(Liu J et al.Metab Eng.2017,39:29-37)。改造lrp基因提高抗生素组分产量和比例的研究至今未见报道。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法。本发明通过使Lrp基因失活，提高了螺旋霉素的产量，其衍生物可利霉素的主组分-4”-异戊酰螺旋霉素Ⅲ的产量和比例也大大提高。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本实验室在螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus 1941，通过生物信息学分析发现一个 orf_5591-lrp基因，其与S.flavidovirens的Lrp/AsnC家族转录调控因子的同源性分别为93％/34 ％。通过分析S.spiramyceticus中的正调控基因orf42(srm40同源基因)和orf23(srm22同源基因)启动子区和S.thermotolerans中的正调控基因acyB2与ist基因间序列，发现均含有Lrp 的特征结合序列YAGHAWATTWTDCTR(H＝非G，W＝A或T，D＝非C)，本发明目的在于通过对lrp基因的改造提高螺旋霉素及其衍生物可利霉素的主组分-4”-异戊酰螺旋霉素Ⅲ的产量和比例。
本发明的第一目的是提供一种螺旋霉素产生菌，菌株中的Lrp基因失活，所述菌株的保藏号为CGMCC No.16056。
本发明的第二目的是提供一种可利霉素产生菌，菌株中的Lrp基因失活，所述菌株的保藏号为CGMCC No.16055。
进一步的方案，上述的螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌中，所述的Lrp基因的核苷酸序列如Seq.1所示；优选的，Lrp蛋白的氨基酸序列如Seq.2所示。
本发明的第三目的是提供一种螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌的构建方法，包括：
(1)构建用于将Lrp基因失活的重组载体，导入到螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌中；
(2)筛选获得Lrp基因失活的重组菌。
进一步的方案，以螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌基因组为模板，以完全或部分敲除 Lrp基因为原则，在适合位点设计引物，PCR扩增左右臂基因片段，克隆至敲除载体，构建重组载体，导入螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌中，通过抗性和传代筛选获得Lrp基因失活的重组菌。
本发明的第四目的是提供一种螺旋霉素产生菌在提高螺旋霉素产量中的应用，螺旋霉素产生菌中的Lrp基因失活。
本发明的第五目的是提供一种可利霉素产生菌在提高可利霉素Ⅲ组分产量中的应用，可利霉素产生菌中的Lrp基因失活。
本发明的第六目的是提供一种提高螺旋霉素和/或可利霉素Ⅲ组分产量的方法，包括：
(1)改造螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌的染色体上的Lrp基因，使Lrp基因失活；
(2)用步骤(1)中改造后的螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌进行发酵生产。
优选的方案，螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌中Lrp基因失活后，通过提高与螺旋霉素相关生物合成途径相关基因、丙氨酸生物合成途径相关基因和酰基辅酶A代谢途径相关基因的表达来提高螺旋霉素和/或可利霉素Ⅲ组分产量。
进一步的方案，改造后的螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌经过种子培养、发酵培养后，提取发酵液，获得的发酵产物经HPLC检测分析。
进一步的方案，上述的Lrp基因失活包括插入、突变、部分敲除，或者全部敲除。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明改造螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌的染色体上的Lrp基因，使Lrp基因失活，促进了与螺旋霉素相关生物合成途径相关基因的表达；丙氨酸生物合成途径相关基因的高表达，提高了螺旋霉素Ⅲ组分的前体物-丙酰基的供应；酰基辅酶A代谢途径相关基因表达的提高，促进螺旋霉素大环内酯环形成中脂肪酸链的合成。因此，提高了螺旋霉素的产量，其衍生物可利霉素的主组分-4”-异戊酰螺旋霉素Ⅲ的产量和比例也大大提高。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1.Lrp蛋白可能的3D构型；
图2是纯化后Lrp蛋白的SDS-PAGE电泳图；
其中：1：诱导前菌体2：诱导后菌体3：诱导后沉淀4：诱导后上清5：纯化后蛋白 M:Protein Maker；
图3是EMSA分析Lrp蛋白与Porf42,Porf23和Pist-acyB2启动子区的结合；
其中：C1:Porf42-Lrp复合物；C2:Porf23-Lrp复合物；C3:Pist-acyB2-Lrp复合物；N:非特异性DNA对照(pQE9载体上的序列)；
图4是△lrp-SP变株的PCR验证；
其中：1:S.spiramyceticus 1941原株；2:Δlrp-SP变株；M：DNA marker
图5是HPLC检测检测结果图；
其中，A.△lrp-SP变株发酵产物螺旋霉素SP含量的HPLC检测；
B.△lrp-BT变株发酵产物可利霉素BT的HPLC检测；
图6是△lrp-SP变株的qPCR分析；
其中：横坐标：comp4553_c0_seq2基因与大环内酯类抗生素生物合成途径相关；comp9112_c0_seq1基因与丙氨酸生物合成途径相关；comp8771_c0_seq1基因与酰基辅酶A代谢途径相关；
纵坐标：基因表达定量分析相对值。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
Lrp蛋白在大肠杆菌中表达与纯化
利用引物lrp-F和lrp-R(见表1)，以S.spiramyceticus 1941原株(唐莉等,生物工程学报1991,124-131)总DNA为模板进行PCR获得Lrp基因片段，克隆至pQE9载体(购自上海君瑞生物技术有限公司)，其N端与His6标签融合，构建pQE9-lrp重组质粒。然后将其转化E.coli BL21(DE3)(北京全式金生物技术有限公司)，转化子在LB培养基中培养，以 0.5mMIPTG16℃诱导表达8-10h。融合His6标签的Lrp蛋白用Ni2+-NTA柱(QIAGEN) 进行纯化。Lrp蛋白可能的3D构型如图1所示，纯化蛋白用SDS-PAGE检测，结果如图2 所示。
表1实验中所用的引物
实施例二
通过凝胶迁移或电泳迁移分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)，检测Lrp蛋白与调控基因ist-acyB2、orf42(srm40同源基因)和orf23(srm22同源基因)启动子区的结合。
利用相应引物进行PCR(见表1)，分别获得ist-acyB2基因间、orf42和orf23启动子区序列片段。取0.4ng DNA与不同浓度(0.4、1.0、2.0ng)Lrp蛋白进行反应，反应在20μL含10mM Tris-Cl(pH 7.5)，50mM NaCl，1mM EDTA，4mM DTT,5％(v/v)甘油溶液中进行，以0.1ng/μL pQE9载体上的部分序列作为对照DNA和300μg/mL乙酰化牛血清白蛋白为对照，室温反应20min，取10μL在5％聚丙酰胺凝胶Tris-硼酸-EDTA 缓冲液(pH8.7)电泳，以GelRed溶液(BioTium)染色20min，用水洗两次，凝胶影像系统(Tanon)进行扫描。
结果表明Lrp蛋白可分别与ist-acyB2、orf42和orf23的启动子区结合(图3)，说明Lrp 蛋白是一类转录调控因子。推测Lrp蛋白能调控螺旋霉素(BT)或可利霉素(SP)生物合成中的正调控基因acyB2、orf42和orf23，从而影响BT或SP的生物合成途径。
实施例三
构建lrp基因缺失螺旋霉素产生菌△lrp-SP变株
为了研究Lrp对螺旋霉素调控基因的作用及其对螺旋霉素生物合成的影响，我们利用CRISPR-cas9链霉菌基因编辑系统(Huanget al.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2015, 47(4):231-243)和重叠PCR方法使Lrp基因被删除327bp。利用设计的lrp-AF、lrp-109LysR 引物，lrp-109LysF、lrp-AR引物分别扩增Lrp基因的左右臂1.3kb和1.0kb DNA片段，经重叠PCR使两个片段连接，并经XbaI and HindⅢ酶切位点克隆至pKCcas9dO载体(Huang, et al.,Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2015,47(4):231-243)，获得重组载体pKC-lrpLR。
将构建的重组载体转化到S.spiramyceticus 1941中，通过传代和抗性筛选出突变株，经 PCR和测序验证，结果如图4所示，证明Lrp基因被成功截短，以此成功构建了△lrp-SP变株。
本申请构建的△lrp-SP变株为缺失Lrp基因的螺旋霉素产生菌，分类命名为Streptomyces spiramyceticus，并于2018年7月4日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.16056。
本实施例所采用的方法仅为了说明本发明的内容，而不限于本发明，为了实施本发明，本领域技术人员可以应用分子生物学通用技术，以螺旋霉素和可利霉素产生菌基因组为模板，以破坏Lrp基因结构为原则，在适合位点设计两对引物，PCR扩增左右臂基因片段，克隆至载体，构建重组载体，以基因同源重组形式导入产生菌，获得Lrp基因破坏变株。
实施例四
构建Lrp基因缺失可利霉素产生菌Δlrp-BT株
为了使△lrp-SP变株可以合成可利霉素，我们将pSET-ermE*p-ist质粒(张家瑚等,生物工程学报,2014,30(9):1390–1400)转化△lrp-SP变株，并同时转化原株S.spiramyceticus 1941，获得Lrp基因缺失的可利霉素产生菌△lrp-BT及其对照株S.spiramyceticus 1941-BT。
本申请构建的△lrp-BT变株为缺失Lrp基因的可利霉素产生菌，分类命名为Streptomyces spiramyceticus，并于2018年7月4日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.16055。
本发明也可以直接在可利霉素产生菌(ZL97104440.6,ZL021487711.5)中，采用实施例三中所述的通用方法破坏Lrp基因，获得Δlrp-BT株。
实施例五：
△lrp-SP和△lrp-BT变株发酵产物产量及组分检测
将变株及原株对照株孢子，接种于30ml/250ml摇瓶中，使用TSB(Kieser T etal.2000, PracticalStreptomyces genetics,P412)培养基，种子28℃培养48h，然后进行30℃发酵培养 6d。取适量发酵培养基，10000rpm，离心10min，定量取上清进行乙酸乙酯萃取。萃取后沉淀用等量乙腈溶解，经0.22μm有机相滤膜过滤后，进行HPLC检测。检测条件：安捷伦高效液相色谱仪(1200Series)，色谱柱为YMC-Triart C18，5μm，4.6mm×250mm，流动相为100％乙腈：10mM的醋酸铵(pH 8.0)＝1:1，流速为1mL/min，检测波长232nm。以峰面积定量分析SP和BT的组分含量。
对△lrp-SP和△lrp-BT变株和S.spiramyceticus 1941和1941-BT原株进行发酵提取后 HPLC检测，结果见图5，液相分析峰面积数据见表2。
表2 SP和BT组分的HPLC检测数据
从结果中可以发现△lrp-SP变株中SP产量由原株的76.3％提高至81.5％，而SPⅢ所占比例比S.spiramyceticus 1941有大幅度的提高，由原株的24.4％提高至33.0％。提高1.37倍。△lrp-BT变株中ISP的总产量比S.spiramyceticus 1941-BT变株中高，由原株的17.7％提高至 18.9％，而ISPⅢ所占的比例显著提高，由原株的4.2％提高至8.4％，ISPⅢ组分产量提高了 2倍，两种变株的结果一致，有力地证实破坏Lrp蛋白结构域能提高Ⅲ组分产量的论证。
实施例六
△lrp-SP变株中氨基酸的含量检测
为了检测破坏lrp基因对氨基酸代谢的影响，本实施例对△lrp-SP变株与S.spiramyceticus 1941对照株进行了氨基酸检测。检测方法：(1)制备标准曲线：采用氨基酸混标溶液作为外标。(2)取微生物100mg于5mL管中，加入5颗钢珠，液氮冻存5min，放入高通量组织研磨仪中，70Hz 1min。加入1600μL(1:50)稀盐酸，然后涡旋振荡30s，加入400μL50ppm 正缬氨酸(50μg/mL)作为内标，涡旋振荡30s，放入超声波机室温处理30min，添加750μL 氯仿，涡旋振荡1min，在12000rpm，4℃离心10min，取上清液500μL，转移到一个新的1.5mL离心管中，样品用真空离心浓缩仪浓缩。加入90μL甲氧基溶液(15mg/mL，溶于吡啶)涡旋振荡30s，在37℃条件下反应2h，最后加入60μL BSTFA试剂(含1％三甲基氯硅烷)，37℃条件下反应90min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液加入到检测瓶中，检测设备为Agilent7890A/5975C气-质联用仪。(3)色谱检测氨基酸的条件：色谱柱HP-5MS 毛细管柱(5％phenyl methyl silox：30mx250μm i.d.，0.25-μm；agilent J&W scientific，Folsom，CA)；分流进样，进样量1μL，分流比20:1。进样口温度250℃；离子源温度230℃；接口温度250℃，四极杆温度150℃。程序升温起始温度70℃；保持2min，以10℃/min升至 300℃，保持5min。总运行时间为30min，载气为氦气，载气流速1mL/min，溶剂延迟4min。 MS条件：电子轰击离子(EI)源，全扫和SIM扫描方式，电子能量70eV。
将与螺旋霉素生物合成相关的主要氨基酸含量数据结果列入表3，发现在△lrp-SP变株胞内支链氨基酸(Val、Leu和Ile)的含量比S.spiramyceticus 1941原株明显降低。
表3△lrp-SP变株与S.spiramyceticus 1941胞内氨基酸含量比较
实施例七
△lrp-SP变株螺旋霉素生物合成相关基因表达qPCR检测
利用qPCR验证与螺旋霉素相关生物合成途径相关的comp4553_c0_seq2基因、丙氨酸生物合成途径相关的comp9112_c0_seq1基因与酰基辅酶A代谢途径相关的comp8771_c0_seq1 基因的表达情况，实时定量PCR采用Light Cycler 96(Roche)仪器进行检测。相应菌株在TSB 液体培养基中生长60h，菌体经离心收集菌丝体并用P-Buffer洗涤两次。利用细菌总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取，DNAaseI(北京全式金生物技术有限公司)去除总RNA中残留的DNA，通过StarScript II First-strand cDNA Synthesis Kit(GenStar康润生物)试剂盒将总RNA进行反转录合成cDNA，再利用qPCR检测试剂盒(Faststart Essential DNA Green Master，Roche)进行基因表达的定量检测。反应条件：
退火温度根据引物Tm值不同适度调整
熔解条件:
95℃ 10s
65℃ 60s
97℃ 1s
结果见图6，显示与对照株相比，在△lrp-SP变株中comp8771_c0_seq1基因表达量提高了5.72倍，comp9112_c0_seq1基因表达量提高了11.47倍，comp4553_c0_seq2基因表达量提高了6.34倍。
利用qPCR证实Lrp基因的缺失，促进了与螺旋霉素相关生物合成途径相关基因的表达；丙氨酸生物合成途径相关基因的高表达，提高了螺旋霉素Ⅲ组分的前体物-丙酰基的供应；酰基辅酶A代谢途径相关基因表达的提高，促进螺旋霉素大环内酯环形成中脂肪酸链的合成，由此可以从理论上证明Lrp基因与螺旋霉素生物合成特别是其Ⅲ组分合成相关。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (10)
1.一种螺旋霉素产生菌，其特征在于，菌株中的Lrp基因失活，所述菌株的保藏号为CGMCC No.16056。
2.一种可利霉素产生菌，其特征在于，菌株中的Lrp基因失活，所述菌株的保藏号为CGMCC No.16055。
3.根据权利要求1所述的螺旋霉素产生菌，或者权利要求2所述的可利霉素产生菌，其特征在于，所述的Lrp蛋白的氨基酸序列如Seq.2所示；
优选的，Lrp基因的核苷酸序列如Seq.1所示。
4.一种螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌的构建方法，其特征在于，包括：
(1)构建用于将Lrp基因失活的重组载体，导入到螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌中；
(2)筛选获得Lrp基因失活的重组菌。
5.根据权利要求4中所述的构建方法，其特征在于，以螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌基因组为模板，以完全或部分敲除Lrp基因为原则，在适合位点设计引物，PCR扩增左右臂基因片段，克隆至敲除载体，构建重组载体，导入螺旋霉素产生菌和/或可利霉素产生菌中，通过抗性和传代筛选获得Lrp基因失活的重组菌。
6.一种螺旋霉素产生菌在提高螺旋霉素产量中的应用，其特征在于，螺旋霉素产生菌中的Lrp基因失活。
7.一种可利霉素产生菌在提高可利霉素Ⅲ组分产量中的应用，其特征在于，可利霉素产生菌中的Lrp基因失活。
8.一种提高螺旋霉素和/或可利霉素Ⅲ组分产量的方法，其特征在于，包括：
(1)改造螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌的染色体上的Lrp基因，使Lrp基因失活；
(2)用步骤(1)中改造后的螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌进行发酵生产；
优选的，螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌中Lrp基因失活后，通过提高与螺旋霉素相关生物合成途径相关基因、丙氨酸生物合成途径相关基因和酰基辅酶A代谢途径相关基因的表达来提高螺旋霉素和/或可利霉素Ⅲ组分产量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，改造后的螺旋霉素产生菌或可利霉素产生菌经过种子培养、发酵培养后，提取发酵液，获得的发酵产物经HPLC检测分析。
10.根据权利要求1所述的螺旋霉素产生菌，或权利要求2中的可利霉素产生菌，或权利要求4所述的构建方法，或权利要求6或7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于，Lrp基因失活包括插入、突变、部分敲除，或者全部敲除。
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