ES2220938T3 - Proceso para producir antraciclinas y sus intermedios. - Google Patents
Proceso para producir antraciclinas y sus intermedios.Info
- Publication number
- ES2220938T3 ES2220938T3 ES95933446T ES95933446T ES2220938T3 ES 2220938 T3 ES2220938 T3 ES 2220938T3 ES 95933446 T ES95933446 T ES 95933446T ES 95933446 T ES95933446 T ES 95933446T ES 2220938 T3 ES2220938 T3 ES 2220938T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dna
- baselineskip
- streptomyces
- strain
- psy15
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION PERTENECE A UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR ANTRACICLINAS E INTERMEDIARIOS DE LAS MISMAS MEDIANTE LA EXPRESION EN UN HUESPED DE STREPTOMYCES EXTRAÑO DE UN FRAGMENTO DE ADN QUE SE REFIERA A LA TRAYECTORIA BIOSINTETICA DE ANTRACICLINAS Y, SI SE DESEA, LOS INTERMEDIARIOS OBTENIDOS SON CONVERTIDOS A ANTRACICLINAS O AGLICONAS DE LAS MISMAS MEDIANTE P.E., CEPAS MUTANTES DE STREPTOMYCES NO PRODUCTORAS.
Description
Proceso para producir antraciclinas y sus
intermedios.
La presente invención se refiere a un proceso
para producir antraciclinas e intermedios de las mismas mediante la
expresión en un hospedador extraño de un fragmento de ADN
relacionado con la ruta biosintética de las antraciclinas y, si se
desea, los intermedios obtenidos se convierten en antraciclinas o
agliconas de las mismas utilizando cepas mutantes no
productoras.
Los antibióticos policeturo son un grupo amplio y
variable de compuestos que están compuestos por una cadena
poli-\beta-cetometileno
[CHRO]_{4-20}. Un rasgo común de los
policeturos es su ruta biosintética, que es similar a la biosíntesis
de ácidos grasos. Katz, L. y Donadio, S. (1993) han publicado
recientemente un artículo de revisión referente a policeturos. En
cuanto a su estructura, los antibióticos del grupo de la
antraciclina son policeturos aromáticos, cuyo cuerpo estructural
común es
7,8,9,10-tetrahidro-5,12-naftacenoquinona
de fórmula general (A)
A este cuerpo estructural se unen uno o más
azúcares y otros sustituyentes. El cuerpo estructural de la molécula
a la que se unen los azúcares se denomina una aglicona. Las
antraciclinas se discuten más específicamente, por ejemplo, en el
artículo de A. Fujiwara y T. Hoshino (1986). Varias antraciclinas
son citostáticamente activas y por tanto son continuamente de
interés.
Para encontrar nuevas antraciclinas se utilizan
el examen de bacterias Streptomyces del suelo y la mutación
de las mismas. Para modificar antraciclinas conocidas se han
utilizado métodos sintéticos mediante los cuales se añaden o se
retiran grupos químicos de la aglicona o del resto azúcar. De forma
similar, se utiliza la biotransformación, en la que se modifican
moléculas en células vivas que se han producido mediante otras cepas
de producción o mediante métodos sintéticos. Algunas antraciclinas
se han producido también mediante métodos sintéticos.
La tecnología de antibiótico híbrido se ha dado a
conocer como una nueva tecnología en la preparación de nuevos
antibióticos. Se ha establecido que comprende la producción mediante
ingeniería genética de moléculas que tienen rasgos estructurales de
productos naturales de dos cepas. El proceso se describe en la
publicación de H.G. Floss: "Hybrid antibiotics - the contribution
of the new gene combinations" (1987). La tecnología de anticuerpo
híbrido proporciona una oportunidad de producción controlada de
nuevos compuestos.
La clonación de genes de actinorodina de
Streptomyces coelicolor (Hopwood et al., 1985) puede
considerarse como el trabajo pionero en el estudio de biología
molecular de antibióticos policeturo y al mismo tiempo de
estreptomicetos. En 1987, Malpartida et al. reseñaron la
hibridación de diferentes productores de policeturo con los
fragmentos de ADN actI y actIII, y después de ello se
han identificado genes del dominio policeturo sintasa (PKS) en
muchas especies de Streptomyces explotando la homología. La
secuenciación de estos genes ha mostrado que los genes están
fuertemente conservados e incluyen tres marcos de lectura abiertos,
ORF 1, 2 y 3. Los productos de estos tres genes son necesarios para
la formación del policeturo lineal unido al complejo enzimático.
Para una formación óptima del producto correcto codificado por los
genes de PKS son necesarios cinco ORF en la tetracenomicina (Shen y
Hutchinson, 1993). Las PKS aromáticas secuenciadas se dan en la
Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La policeturo sintasa (PKS) es un complejo
multienzimático que recuerda funcionalmente a la sintasa de ácidos
grasos de cadena larga. Los componentes separados de la PKS
actinorodina se denominan cetoacil sintasa actORF1 (KS); actORF2
homóloga de KS que puede afectar a la longitud de la cadena de
policeturo (McDaniel, R. et al., 1993); proteína portadora de
acilo actORF3 (ACP); cetoreductasa actORF5 (KR) y ciclasa/deshidrasa
actORF4, que puede ser responsable de la aromatización del primer
anillo.
La mayor parte de las antraciclinas biosintéticas
se forma mediante la fase intermedia aclavinona, después de lo cual
el compuesto se glicosila o se modifica añadiendo por ejemplo grupos
hidroxilo o metilo. Pueden ocurrir también modificaciones después de
la glicosilación. Se describen la biosíntesis de aclavinona y
antraciclinas que se forman adicionalmente a partir de ella por
ejemplo en "Advances in bioconversion of anthracycline
antibiotics" (1989) de U. Gräfe et al., y en las
referencias citadas en el mismo. La ruta biosintética de la aglicona
nogalamicina que está formada por diez acetatos es evidentemente
análoga a la biosíntesis de aclavinona (Figuras 1A y 1B).
Puede utilizarse un fragmento de ADN clonado de
Streptomyces nogalater según esta invención para combinar
diferentes fases de la ruta biosintética de antraciclinas, mediante
las que pueden producirse antraciclinas híbridas y precursores de
antraciclinas. Esto ocurre transfiriendo el fragmento de ADN clonado
a una cepa Streptomyces que produce antraciclinas o, como
alternativa, a un no productor de antraciclinas.
El fragmento de ADN de Streptomyces
nogalater que se incluye en la biosíntesis de antraciclina y que
se clona según esta invención causó la sorprendente producción de
precursores de antraciclina en S. lividans, un hospedador que
no produce antraciclinas. Basándose en las estructuras de los
compuestos obtenidos, se supuso que el fragmento de ADN incluía la
mayoría de los genes necesarios para la biosíntesis de agliconas de
antraciclina. Mediante la complementación de cepas mutantes,
analizando los productos híbridos y secuenciando los fragmentos de
ADN, los inventores han podido mostrar que el fragmento de ADN
comprende:
- -
- la actividad responsable de la elección de la unidad de inicio que define la cadena lateral de la posición 9 (productos híbridos de S. galilaeus),
- -
- los genes de policeturo sintasa,
- -
- el gen de la enzima que es necesaria para retirar el hidroxilo en posición 2 (cetoreductasa),
- -
- el gen de metiltransferasa necesario para la esterificación de ácido carboxílico,
- -
- el gen de monooxigenasa.
Este fragmento de ADN y los precursores de
antraciclina producidos por él se han utilizado adicionalmente para
producir antraciclinas híbridas.
La presente invención posibilita producir algunas
antraciclinas citostáticamente activas conocidas (auramicinas) así
como compuestos desconocidos anteriormente. El uso de la policeturo
sintasa de antraciclinas en la producción de antraciclinas híbridas
no se ha descrito anteriormente, ni el cambio de la unidad de inicio
de la síntesis de policeturo mediante la transferencia de genes a un
hospedador extraño. Además, no existe una descripción anterior de la
clonación de genes de la ruta biosintética de la nogalamicina
producida por S. nogalater, o del uso de los mismos.
La similitud de los genes biosintéticos de
antibióticos policeturo dados a conocer por Malpartida et al.
(1987) fue el punto de partida para el descubrimiento de los genes
biosintéticos de nogalamicina. El ADN total de S. nogalater
escindido por enzimas de restricción adecuadas se hibridó mediante
técnicas Southern a la sonda actI, y se obtuvieron así dos
fragmentos de ADN de hibridación. En el caso óptimo, una sonda
adecuada muestra un fragmento de ADN. Sin embargo, el uso de
hibridación cruzada se consideró posible como estrategia para
identificar los genes biosintéticos, debido a que las señales eran
fuertes.
La estrategia mediante la que se encontró el
fragmento de ADN según la invención fue la siguiente: se aisló un
fragmento homólogo del fragmento actI descrito por Malpartida
et al. (1987) de S. nogalater. Dicho fragmento
homólogo y los fragmentos de ADN flanqueantes se transfirieron a
S. lividans cepa TK24. Al mismo tiempo, se transfirieron
aproximadamente 20 kb (=kilobase, 1000 bases) en cinco fragmentos a
un hospedador extraño. De estos, un fragmento de ADN de
aproximadamente 12 kb, pSY15, causa la producción de intermedios de
nogalamicina en S. lividans. La cepa recombinante obtenida se
cultivó en un medio nutriente utilizado para productores de
antraciclina y el producto se extrajo mediante disolventes orgánicos
adecuados.
Se transfirieron fragmentos de ADN según la
invención a cepas de Streptomyces descritas en adelante en la
presente memoria así como a los mutantes H028, JH003, H061, H036 y
H039 de S. galilaeus dados en la Tabla 2, y se expresaron en
ellos. Dichos fragmentos de ADN pueden transferirse
correspondientemente a otros mutantes citados en la tabla,
dependiendo de qué tipo de productos se deseen.
Streptomyces lividans 66, cepa TK24, cepa
exenta de restricción-modificación.
Streptomyces galilaeus ATCC 31615, produce
aclacinomicina.
Mutantes de Streptomyces galilaeus ATCC
31615 (véase la Tabla 2) (Ylihonko et al., 1994)
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se produce el producto de partida para
biotransformación, el hospedador utilizado es preferiblemente S.
lividans porque no produce por sí mismo compuestos coloreados o
extraíbles en las condiciones de crecimiento utilizadas.
Cuando se produce una aglicona para
biotransformación, se utilizan preferiblemente cepas bacterianas
productoras de antraciclinas o mutantes no productores de las
mismas, lo más preferiblemente mutantes no productores de S.
galilaeus transformados con plásmido pSY15 (Fig. 3), que porta
el fragmento de ADN de 12 kb anteriormente citado.
Cuando se convierten los precursores de
antraciclina obtenidos utilizando el plásmido pSY15 en antraciclinas
o sus agliconas, se utilizan preferiblemente mutantes de S.
galilaeus, por ejemplo las cepas JH003 o H028, que no producen
aclarubicina.
Las construcciones de ADN según la presente
invención pueden construirse ligando fragmentos de ADN adecuados del
dominio como se describe a un vector adecuado. Dicho vector es
preferiblemente el plásmido pIJ486 de alto número de copias capaz de
amplificarse en diversas cepas del género Streptomyces (Ward
et al., 1986).
Para producir antraciclinas y sus precursores,
las cepas portadoras del plásmido pSY15 se hacen crecer
preferiblemente en medios de crecimiento para bacterias
Streptomyces, preferiblemente en medio E1 al que se ha
añadido tioestreptón para mantener las cepas portadoras de plásmido.
Las cepas se hacen crecer en condiciones que son ventajosas para la
cepa productora, por ejemplo en un agitador en frascos, o en un
fermentador que se agita y airea. Después de un tiempo de cultivo
adecuado, preferiblemente después de 2-7 días, se
aíslan los productos según los métodos descritos para metabolitos
bacterianos, preferiblemente por ejemplo extrayendo con un
disolvente adecuado, por ejemplo tolueno o cloroformo. Los
compuestos extraídos se purifican con métodos adecuados, por ejemplo
utilizando cromatografía en columna.
Los precursores de antraciclina se convierten en
antraciclinas en cepas productoras naturales de antraciclinas o
mutantes de las mismas. Se obtienen así compuestos similares a los
producidos naturalmente por la cepa, que tienen metilo en su
posición 9 e hidrógeno en su posición 2. En las biotransformaciones,
se utiliza lo más adecuadamente auramicinona producida por una cepa
de S. galilaeus portadora del plásmido pSY15 como compuesto
de partida, o éster metílico del ácido nogalónico producido por una
cepa portadora del mismo plásmido que no produce naturalmente
antraciclinas. En las biotransformaciones, se utilizan lo más
preferiblemente mutantes no productores de cepas de producción de
antraciclina, por ejemplo mutantes H028 o JH003. La
biotransformación se efectúa lo más preferiblemente cultivando una
cepa en un medio de producción líquido adecuado, por ejemplo en
medio E1, y añadiendo precursores de antraciclina en cantidades
adecuadas. Después de un tiempo adecuado, por ejemplo 6 a 48 horas,
lo más preferiblemente 16 a 32 horas, las antraciclinas así formadas
se extraen.
Las cepas utilizadas para transformación (véase
también la Tabla 2) se describen a continuación.
TK24 es una cepa de S. lividans que
en las condiciones de crecimiento utilizadas no produce metabolitos
secundarios coloreados. En otras condiciones de crecimiento, produce
actinorodina, que es un antibiótico muy diferente de las
antraciclinas. La cepa no produce ni antraciclinas ni sus
precursores. Cuando se caracterizaron los productos de TK24/pSY15
basándose en el espectro de RMN, se obtuvo el compuesto I como
producto primario, que es posiblemente un intermedio de la
biosíntesis de antraciclina (véase el esquema I).
H028 es un mutante de Streptomyces
galilaeus que no produce como tal antraciclinas o sus
precursores. Sin embargo, esta cepa puede utilizarse en
biotransformaciones para convertir precursores de antraciclina en
productos similares a la aclarubicina. Cuando se caracterizaron los
productos de H028/pSY15, se encontró que esta cepa produce
auramicinona (compuesto II), que es una aglicona de antraciclina
similar a la aclavinona, así como auramicinas que son glicósidos de
auramicinona, por ejemplo el compuesto III. Cuando se hidrolizan
auramicinas se obtiene auramicinona, lo que muestra también que los
compuestos producidos son glicósidos de auramicinona. La
auramicinona es un precursor útil de antraciclinas, cuando se
producen nuevas antraciclinas mediante biotransformación. Se ha
descrito que las auromicinas son antraciclinas citostáticas que
tienen un posible uso en quimioterapia del cáncer. El uso de
H028/pSY15 para la producción de éstas es nuevo.
H061 es un mutante de Streptomyces
galilaeus que produce ácido
2-OH-aclanónico. Esto es debido
evidentemente a una mutación que evita la retirada del hidroxilo en
posición 2. H061/pSY15 produce aclavinona, auramicinona y sus
glicósidos similares a la aclarubicina. Según el resultado, pSY15
complementa la mutación de H061 y comprende por tanto el gen que
codifica la deshidroxilasa en posición 2. Esto es útil en la
producción de nuevos compuestos híbridos cuando se transforman a una
cepa cuyos productos tienen naturalmente un grupo hidroxilo o metoxi
en posición 2.
Basándose en los resultados, pSY15 es útil en la
producción de precursores de antraciclinas en cepas que no producen
naturalmente antraciclinas, o cuando se producen antraciclinas
híbridas en cepas que producen antraciclinas, o en mutantes de las
mismas. Con ello, la formación de la cadena lateral de la posición 9
puede afectarse de modo que las cepas que proporcionan una cadena
lateral de dos carbonos en esta posición producen compuestos que
tienen una cadena lateral de un carbono en dicha posición. Las
posibles cepas que producen antraciclinas que pueden modificarse de
este modo son por ejemplo S. galilaeus, S. peucetius y S.
purpurascens. Los precursores de antraciclina producidos de
este modo son útiles para producir nuevas antraciclinas mediante
biotransformaciones. pSY15 puede transferirse también a una cepa que
produce normalmente compuestos que tienen un grupo hidroxilo o
metoxi en la posición 2. Así, se obtienen compuestos que tienen
hidrógeno en esta posición. pSY15 posibilita también producir la
auramicinona previamente descrita y sus glicósidos mediante el nuevo
método.
A continuación se describen las realizaciones
detalladas de la invención en forma de ejemplos de aislamiento del
fragmento de ADN de S. nogalater cepa ATCC 27451, producción
de precursores de nogalamicina en S. lividans cepa TK24,
producción de auramicinona en el mutante H028 y su modificación a
antraciclinas en el mutante JH003. Además, se describe la expresión
de los fragmentos de ADN según la invención en los mutantes de la
cepa de S. galilaeus, así como los compuestos producidos por
estas cepas.
Se caracterizaron los productos principales de
las cepas TK24/pSY15, JH003/pSY15, H028/pSY15 y H061/pSY15.
Fig. 1A Antraciclinas producidas por cepas de
Streptomyces y precursores identificados de las mismas
(molécula de partida: propionato). Los números de las cepas mutantes
de S. galilaeus productoras de los intermedios se dan entre
paréntesis.
Fig. 1B Antraciclinas producidas por cepas de
Streptomyces que tienen acetato como molécula de partida.
Fig. 2 Mapa de restricción del fragmento de ADN
continuo de 12 kb clonado del genoma de S. nogalater. La
figura da a conocer también los insertos contenidos en los plásmidos
pSY obtenidos. Se ha utilizado el plásmido pIJ486 en la preparación
de los vectores pSY. Basándose en las comparaciones de secuencia, se
han obtenido las siguientes funciones para los marcos de lectura
abiertos mostrados en la figura: 1=
cetoacilsintasa-aciltransferasa, 2= factor
controlador de la longitud de cadena, 3= proteína de transferencia
de acilo; A y B= genes regulatorios, C= monooxigenasa; D=
metiltransferasa, E= cetoreductasa.
Fig. 3 Estructura del plásmido pSY15.
Fig. 4 Espectro de RMN del compuesto I.
Fig. 5 Espectro de RMN de auramicinona.
Fig. 6 Espectro de RMN de
auramicinona-rodosamina-desoxifucosa.
Fig. 7 Espectro de RMN de
auramicinona-rodinosa-desoxifucosa
Se utilizó la cepa Streptomyces nogalater
ATCC 27451 como donante de genes. Las cepas bacterianas de
Streptomyces utilizadas en este trabajo como hospedadores se
enumeran anteriormente. Los tratamientos de ADN de S.
nogalater se efectuaron en E. coli cepa
XL1-Blue (recA1, endA1, gyrA96,
thi-1, hsdR17, supE44, relA1,
lac, [FproAB, lacIZ\DeltaM15, TnIO
(tet^{2})] (Stratagene Cloning Systems, California). Las cepas
E. coli GM2163 (E. coli Genetic Stock Center,
Departamento de Biología, 255 OML, Universidad de Yale, New Haven,
EE.UU.) y LE392 (Promega) se utilizaron preparando el banco de genes
y amplificando el ADN de fago.
En E. coli, se utilizaron los plásmidos
pUC18/pUC19 (Pharmacia Biotech), y en cepas de Streptomyces
se utilizó el plásmido pIJ486 (Ward et al., 1987; obtenido
del Prof. Hopwood, John Innes Centre, RU).
Por litro: caldo de triptona-soja
Oxoid en polvo, 30 g.
YEME Hopwood et al., 1985, pág.
239)
Por litro: extracto de levadura (Difco), 3 g;
bacto-peptona (Difco), 5 g; extracto de malta
(Oxoid), 3 g; glucosa, 10 g y sacarosa, 340 g. Después de someter a
autoclave, se añaden 2 ml de solución estéril de MgCl_{2} 2 M y 25
ml de glicina al 20%.
SGYEME como YEME, pero la cantidad de
sacarosa fue de 110 g por litro. Para preparar protoplastos, la
cantidad de glicina al 20% varía de 12 ml a 50 ml por litro
dependiendo de la cepa utilizada.
YM-agar agar de extracto
de malta levadura Bacto, medio ISP 2, Difco, 38 g/litro.
ISP4 medio Bacto ISP 4, Difco, 37 g/l.
R2YE Hopwood et al. (1985, pág.
236)
LB Sambrook et al. (1989, 3:
A.1)
E1 Por litro: glucosa, 20 g; almidón 20 g;
Farmamedia, 5 g; extracto de levadura, 2,5 g; K_{2}HPO4\cdot3
H_{2}O, 1,3 g; MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O, 1 g; NaCl, 3 g,
CaCO_{3}, 3 g. Se añade agua corriente hasta 1 litro y se ajusta
el pH a 7,4.
TE tampón Tris-HCl, pH 8:
10 mM, EDTA, pH 8: 10 mM
20 x SSC Por litro: NaCl, 175,3 g; citrato
de sodio, 88,2 g. El pH se ajusta a 7 con NaOH.
Se prepara una solución básica 50 x que contiene
5 g de Ficoll; poli(vinilpirrolidona), 5 g; BSA (seroalbúmina
bovina), 5 g. Se añade agua destilada hasta 500 ml y se esteriliza
mediante filtración.
Se cultivaron micelios de S. nogalater
(ATCC 27451) durante aproximadamente 3 días en 50 ml de medio
TSB, al que se había añadido glicina al 0,5% a 28ºC agitando
vigorosamente. Se sedimentaron los micelios y se desechó el
sobrenadante. Se suspendió el sedimento en 10 ml de tampón de lisis
(15% de sacarosa, Tris 25 mM, pH 8,0, EDTA 25 mM y 5 mg/ml de
lisozima) y se incubó durante 15 minutos a 37ºC. Se añadieron 1 mg
de proteinasa K y 1 ml de SDS al 10% con agitación. Se incubó la
mezcla de una vez durante 15 min a 70ºC. Se enfrió posteriormente el
sedimento lisado en hielo, se añadió 1 ml de acetato de sodio 3 M
(pH 6,0) y se mantuvo durante unos pocos minutos en baño de hielo.
Se añadieron 5 ml de fenol equilibrado con Tris 0,1 M y se agitó
volteando el tubo. Se centrifugaron las fases separándolas y la fase
acuosa se extrajo adicionalmente con 5 ml de cloroformo.
Posteriormente, se precipitó el ADN añadiendo 10 ml de isopropanol.
Se enrolló cuidadosamente el ADN alrededor de una pipeta Pasteur
cerrada a la llama, se lavó sumergiéndolo en etanol al 70% y se
liberó el ADN sobre la pared del tubo. Se disolvió el ADN en 5 ml de
tampón TE y se trató con ARNasa (25 \mul de ARNasa 10 mg/ml exenta
de ADNasa) durante aproximadamente 30 minutos a 37ºC. Se repitieron
las extracciones de fenol y cloroformo. Se volvió a precipitar
posteriormente el ADN con isopropanol y se lavó como anteriormente.
Finalmente, se disolvió el ADN en 1 ml de tampón TE y se utilizó
para etapas posteriores.
La sonda actI fue el fragmento
BglII de 0,8 kb obtenido del plásmido pIJ2345, y la sonda
acm el fragmento BamHI de 3 kb obtenido del plásmido
pACM5 (Niemi et al., 1994). Los plásmidos se aislaron a
escala mini (serie de reactivos Magic Minipreps de Promega) y se
aislaron los fragmentos de sonda mediante electroforesis preparativa
en gel de agarosa después de digerirlos primero con BglII y
con BamHI, respectivamente. Las sondas se marcaron después
con 50 \muCi de [\alpha^{32}-P]CTP
mediante translación de muesca (serie de reactivos de translación de
muesca de Boehringer Mannheim).
Las preparaciones de ADN total aisladas como se
describe anteriormente se digirieron con enzima EcoRI y se
fraccionaron con electroforesis en gel de agarosa. El ADN
fraccionado se transfirió del gel a membrana Hybond N (Amersham)
utilizando el aparato Vacugene (LKB 2016, Pharmacia LKB
Biotechnology) según las instrucciones de uso. El ADN se fijó a la
membrana incubando durante 3 minutos con luz UV.
Las membranas de hibridaron en 10 ml de solución
de hibridación (1% de SDS, NaCl 1 M, solución de Denhardt 5 x, ADN
portador desnaturalizado 100 \mug/ml (ADN de timo de ternero,
Boehringer Mannheim) a 65ºC en una estufa de hibridación
(HB-1D Hybridiser, Techne) durante aproximadamente 6
horas, después de lo cual se añadieron al menos 100 ng de ADN de
sonda marcado al tubo de hibridación y la incubación se continuó
adicionalmente aproximadamente 12 h. Después de esto, las membranas
se lavaron a 65ºC durante 2 \times 30 min en una solución de
lavado (2 x SSC, 1% de SDS o 0,2 x SSC, 0,1% de SDS). Se efectuó la
autorradiografía mediante la superposición de la membrana recubierta
con una película plástica y la película de autorradiografía. La
exposición duró de aproximadamente 1 a 3 días.
Se incubaron 40 \mug de ADN en tampón de
digestión (10 x A, Boehringer Mannheim) en presencia de 2,4
unidades de Sau3A (Boehringer Mannheim) durante 5 min a 37ºC,
y la reacción se detuvo añadiendo fenol. Después del tratamiento con
fenol, se purificó el ADN por precipitación con etanol. Los
fragmentos de ADN así obtenidos se procesaron con electroforesis
preparativa en gel de agarosa (0,3% de BTG, baja temperatura de
gelificación). El ADN, que era de 20 kb o mayor, se tomó del gel
cortando y purificando mediante fenolización de la agarosa. Se
trataron fragmentos BamHI de un vector de fago comercial,
\lambda EMBL 4, (Amersham International plc, Amersham, RU) con
fosfatasa alcalina (FAIT, fosfatasa alcalina intestinal de ternero,
Promega) según las instrucciones del fabricante. El inserto de ADN
(fracción Sau3A) y el vector así obtenido se ligaron mediante
incubación durante 2 h a temperatura ambiente y durante 2 h a 14ºC
en presencia de ADN ligasa T4 (Promega) según la recomendación del
fabricante. La mezcla de ligamiento se empaquetó en partículas
\lambda utilizando la serie de reactivos Packagene (Promega
Biotech) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó la cepa
GM2163 de Escherichia coli como hospedador. Las células se
prepararon para infección según las instrucciones de empaquetado y
las células infectadas con la mezcla de empaquetado se extendieron
sobre placas de cultivo según las instrucciones de Promega.
Se transfirió ADN de fago de placas de cultivo
con aproximadamente 4000 placas/placa de cultivo a una membrana
(Colony/Plaque Screen, New England Nuclear) según las instrucciones
del fabricante. Las membranas se hibridaron como se describe
anteriormente. Se recogieron las placas que proporcionaron una señal
en autorradiografía y los fagos se eluyeron de ellas mediante la
incubación de una placa con 0,5 ml de tampón SM durante 2 horas.
Debido a que las placas de cultivo de placa eran densas, las placas
se purificaron infectándolas en la cepa hospedadora LE392 (Promega)
e hibridando como anteriormente.
De los clones purificados se preparó ADN de fago
a escala de 20 ml infectando las células LE392 según las
instrucciones de empaquetado de Promega. El ADN así obtenido se
digirió con diversas endonucleasas de restricción para cartografiar
los clones (Sambrook et al., 1989) y mediante hibridación con
diferentes sondas. El mapa de restricción así obtenido se da en la
Fig. 2.
Se transfirió el fragmento mostrado en el mapa de
restricción (Fig. 2) a S. lividans en forma de fragmentos
EcoRI (pSY1 y pSY6) o de un fragmento BglII (pSY15).
Los clones \lambda se digirieron con enzima de restricción
EcoRI o BglII y se ligaron a un plásmido linealizado
con la misma enzima, y se transformaron mediante electroporación en
E. coli o mediante transformación de protoplasto en S.
lividans. La mayoría de los insertos se clonaron primero en el
plásmido pUC19 amplificando en E. coli, con lo que se
utilizó como hospedador E. coli cepa
XL1-Blue. Se clonó pSY15 directamente en S.
lividans cepa TK24. Se utilizó E. coli porque de esa
manera podían utilizarse cantidades menores de ADN de fago. La
eficacia de la transformación de E. coli fue de 2 \times
10^{8} transformantes/\mug de ADN cuando se utilizó el
dispositivo de electroporación Pulser Apparatus
(Bio-Rad) con E. coli con los siguientes
ajustes (200 ohmios, 25 \muF, 1,4 kV). Para la electroporación,
las células se trataron como se describe en Dower, W.J. et
al. (1988) y se utilizaron cubetas de 0,1 cm de
Bio-Rad en la transformación, el volumen de celda
fue de 20 \mul.
Se utilizó S. lividans cepa TK24 como
hospedador intermedio ya que se creyó que la expresión era sólo
exitosa en cepas de S. galilaeus. S. galilaeus no es
en absoluto transformable con ADN propagado en E. coli. Sólo
el plásmido pSY15 causó la modificación de la cepa TK24, que se
observó como un color marrón en la placa de cultivo ISP4, cuando
TK24 es normalmente bastante incoloro o azul. Sólo la cepa TK24
portadora del plásmido pSY15 causó la formación de productos
coloreados en el medio E1 bien adecuado para la producción de
antraciclinas. Basándose en cromatografía en capa fina, los
productos de la cepa recombinante TK24/pSY15 parecieron ser
similares pero no idénticos a los producidos por el mutante H036
(Ylihonko et al., 1994) que produce el éster metílico del
ácido aclanónico. Con el eluyente tolueno: acetato de etilo:
metanol: ácido fórmico (50:50:15:3) se obtuvieron los siguientes
valores de R_{f} para estos productos:
TK24/pSY15: 0,66; 0,60; 0,50
H036: 0,67; 0,62; 0,51
Se confirmó que estas características procedían
del plásmido pSY15 mediante la retransformación del plásmido a
S. lividans cepa TK24. Los transformantes así obtenidos
fueron capaces también de producir precursores de antraciclina.
Cuando la cepa recombinante se cultivó en medio E1 sin la presión de
selección de la cepa de plásmido causada por tioestreptón, se redujo
la producción de nuevos compuestos.
De la digestión con EcoRI se obtuvo un
fragmento de hibridación con actI de 2 kb y se secuenció. Se
secuenciaron adicionalmente aproximadamente 2 kb de ADN de la
derecha según el mapa (Fig. 2). Se prepararon para secuenciar 31
clones de los sitios de digestión de enzimas de restricción en los
vectores pUC18 y pUC19, linealizándolos con las correspondientes
enzimas.
Para aislar los plásmidos para las reacciones de
secuenciación se utilizó el kit de sistema de purificación de ADN
Magic/Wizard™ Minipreps de Promega. Se cultivaron células
XL1-Blue de E. coli durante una noche en 3 ml
de medio LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina, y los plásmidos
se aislaron según las instrucciones del fabricante.
La secuenciación de ADN se realizó utilizando el
método de terminación de cadena didesoxi. Para las reacciones de
secuenciación, se utilizaron las series de reactivos de
secuenciación de mezclas Deaza G/A ^{T7}Sequencing™ (Pharmacia) y
los sistemas de secuenciación TaqTrack® Deaza (Promega). La
desnaturalización se realizó siempre según las instrucciones del kit
de Pharmacia (método C). Cuando se utilizó el kit de Pharmacia, los
cebadores se ligaron según el método C dado en las instrucciones
(asociación estándar del cebador al molde bicatenario). Cuando se
utilizó el kit de Promega, se siguió el punto "Protocolo de
secuenciación utilizando incorporación directa" de las
instrucciones del fabricante. Desviándose de la temperatura de
ligamiento del cebador recomendada por el fabricante (37ºC), se
utilizó una temperatura de 45ºC para evitar las estructuras
secundarias causadas por el alto contenido de G-C.
La temperatura se mantuvo después de ello a 45ºC hasta el final de
la reacción. Como marcaje radiactivo se utilizó
[\alpha^{35}S]dATP (NEN Products, Boston, MA). La mayoría
del dominio PKS se secuenció con un cebador universal
(5'-d(GTTTTCCCAGTCACGAC)-3')
y con un cebador inverso
(5'-d(CAGGAAACAGCTATGAC)-3'
(cebadores de 17 unidades de pUC/M13, Promega). Cuando se
secuencian los fragmentos más largos (500-600 pb)
del dominio, y para definir las secuencias de aquellos sitios de
restricción que no podrían "pasarse", se utilizaron seis
cebadores específicos. Los cebadores se prepararon en el
Departamento de Química Bioorgánica de la Universidad de
Turku.
Turku.
Los geles de secuenciación se procesaron por el
sistema Macrophor de Pharmacia, utilizando un gel en gradiente de 4%
de grosor. Condiciones de proceso: corriente 20 mA, voltaje 2500
V.
Se secuenció del dominio PKS un fragmento de ADN
con aproximadamente 4134 bases (como se da en el listado de
secuencias), cuyo análisis se realizó mediante software GCG
(Genetics Computer Group, GCG Package, Wisconsin, EE.UU.). Con el
subprograma CODONPREFERENCE, se buscaron los marcos de lectura
abiertos de la secuencia. Los marcos de lectura obtenidos se
tradujeron a la secuencia aminoacídica y se buscaron las homologías
con secuencias conocidas con el subprograma TFASTA.
Según el programa CODONPREFERENCE, el fragmento
de ADN de 4134 bases secuenciado tenía en total tres marcos de
lectura abiertos (ORF1, ORF2, ORF3) (ORF1 es el fragmento
359-1651 en la SEC ID Nº 1 del listado de
secuencias, ORF2 es el fragmento 1648-2877 en la SEC
ID Nº 4 y ORF3 es el fragmento 2937-3197 en la SEC
ID Nº 1). Al inicio de cada marco de lectura abierto se encontró un
posible sitio de unión a ribosoma (SUR). Las funciones de los genes
se dedujeron comparando las secuencias aminoacídicas traducidas de
sus secuencias de bases con secuencias conocidas. Así, se obtuvieron
las siguientes similitudes con los marcos de lectura abiertos de los
dominios PKS de actinorodina y tetracenomicina: ORF1 (80%, 81%),
ORF2 (74%, 77%), ORF3 (62%, 62%) y, basándose en esto, los
inventores presentan las siguientes funciones de dichos genes: ORF1
es cetoacilsintasa, ORF2 es el factor que afecta a la longitud de la
cadena; ORF3 es una proteína portadora de acilo. Estos tres marcos
de lectura abiertos son necesarios para una policeturo sintasa
funcional.
Cadena arriba del dominio PKS se secuenció un
fragmento de ADN de aproximadamente 6 kb (kb= 1000 bases). En este
dominio, se han reconocido las siguientes actividades génicas
basándose en la secuencia (Fig. 2): genes regulatorios,
monooxigenasa, metiltransferasa y cetoreductasa.
Se aisló el plásmido pSY15 de S. lividans
cepa TK24 y se transformó en el mutante H039 de S. galilaeus,
y el ADN aislado del mismo adicionalmente en otros mutantes de S.
galilaeus. Se ha descrito anteriormente el método utilizado en
la transformación de la cepa de S. galilaeus que se está
modificando en el método de transformación utilizado en la
transformación de S. lividans (Ylihonko, K., tesis de
graduación, Universidad de Turku, 1986). Para preparar protoplastos,
las células se hicieron crecer en SGYEME al que se había añadido
sacarosa al 0,8%. Los plásmidos se transformaron exitosamente
primero en el mutante H039, mediante el que se obtuvieron con 2
\mug de ADN de plásmido aproximadamente 10 transformantes. Debido
a una fuerte barrera de restricción, S. galilaeus es
débilmente transformable con ADN extraño, pero la eficacia de
transformación aumenta muchas veces si el plásmido se ha aislado de
una cepa de S. galilaeus.
Se cultivaron primero transformantes H039 durante
aproximadamente 5 días en una placa de cultivo ISP4, a la que se
había añadido tioestreptón. Se inoculó el micelio en 50 ml de caldo
nutriente TSB (tioestreptón 5 \mug/ml añadida) y se hizo crecer en
un agitador durante 5 días. Se aisló el plásmido como se describe
anteriormente y se transformó en otros mutantes. Habitualmente se
utilizaron 200 a 500 ng de plásmido para cada transformación, de los
que se obtuvieron 10 a 100 transformantes.
Después de la regeneración, las cepas mutantes
transformadas se extendieron en placas de cultivo ISP4, de las que
se transfirió adicionalmente el micelio a medio nutriente E1. Para
retener el plásmido, se añadió tioestreptón a todos los medios
nutrientes. Se incubó el micelio E1 en un agitador (330 rpm, 30ºC) y
se siguió la producción tomando después de 3 días una muestra de 0,5
ml del micelio diariamente durante 3 a 5 días. La muestra se tamponó
a pH 7 con tampón fosfato y se extrajo con una mezcla
metanol-tolueno (1:1). Además, se acidificaron parte
de las muestras con HCl 1 M y se extrajeron con
tolueno-metanol. En los cultivos EI, tanto los
mutantes como la cepa silvestre de S. galilaeus se utilizaron
como controles. Al comparar los productos por TLC, se observaron los
efectos del plásmido sobre la producción.
Los mutantes de S. galilaeus utilizados en
las transformaciones se enumeran anteriormente. El plásmido pSY15
complementó, concretamente restauró la capacidad de producción de
antraciclinas o precursores de las mismas en los siguientes
mutantes: H028, H061 y JH003. No afectó al perfil de producción de
los mutantes H036 y H039 en ninguna extensión apreciable. JH003, que
no produce compuestos coloreados en las condiciones utilizadas, se
ha mutado de la cepa H054 y el transformante JH003/pSY15 se comparó
con la cepa H054. H028 es también un mutante no productor, que se
obtuvo mutando la cepa silvestre S. galilaeus ATCC 31615.
Así, la cepa silvestre se utilizó como control del transformante
H028/pSY15. Utilizando el eluyente tolueno:acetato de
etilo:metanol:ácido fórmico (50:50:15:3), se obtuvieron los
siguientes valores de R_{f} para los transformantes y las cepas
hospedadoras utilizadas como controles.
H028/pSY15: (0,69); 0,61; 0,58;
0,01
JH003/pSY15: 0,59; 0,50; 0,46; 0,35
H061/pSY15: (0,69); 0,61; 0,58; 0,06;
0,01
S. galilaeus ATCC 31615: 0,23; 0,14;
0,11
H054: 0,65; 0,60; 0,53; 0,48
H061: 0,50 (ácido).
El producto aislado a pequeña escala se hidrolizó
calentando en ácido clorhídrico 1 M a 80ºC durante 0,5 h. Después de
la hidrólisis, se obtuvieron los siguientes valores de R_{f} para
la agliconas o precursores de las mismas:
H028/pSY15: 0,61
JH003/pSY15: 0,61
H061/pSY15: 0,61
Debido a que todos estos mutantes utilizados se
han producido originalmente a partir de una cepa silvestre de S.
galilaeus, se utilizó la aclavinona como comparación, al ser la
aglicona de las aclacinomicinas producidas por S. galilaeus.
En el eluyente utilizado, se obtuvo para la aclavinona un valor de
R_{f} de 0,69. En los productos de los transformantes, se
detectaron también pequeñas cantidades de aclavinona.
Se inocularon diez matraces erlenmeyer de 250 ml
que contenían cada uno 60 ml de medio E1 con alícuotas de 1 ml de la
cepa TK24/pSY15. Los matraces se incubaron en un agitador a 330 rpm
a una temperatura de 30ºC durante aproximadamente 3 días. Se
confirmó la producción de los micelios terminados extrayendo
muestras de 0,5 ml con una mezcla de etanol y tolueno (1:1). Los
productos se compararon con el patrón mediante cromatografía en
capa
fina.
fina.
Se vaciaron los matraces en dos tubos de
centrífuga de 400 ml y se centrifugaron durante 10 min a 3000 rpm.
Se recuperó el sobrenadante. Se suspendió el precipitado añadiendo a
cada tubo 50 ml de metanol. Los tubos se volvieron a centrifugar
durante 10 min a 3000 rpm. La solución de metanol se añadió al
sobrenadante. Se desechó el precipitado. La solución se extrajo con
2 \times 100 ml de cloroformo, con lo que se obtuvo una solución
de cloroformo fuertemente amarilla anaranjada. Se desechó la fase
acuosa. Se evaporó el cloroformo en baño de agua en un rotavapor. Se
disolvió el producto seco amarillo anaranjado en 2 ml de
cloroformo.
Se pipetearon las soluciones de cloroformo a una
columna de vidrio de cromatografía equipada con sinterizado de
vidrio que tenía un diámetro de 2 cm y contenía aproximadamente 5 cm
de sílice suspendida en cloroformo (gel de sílice 60, Merck). La
columna se eluyó con alícuotas de 2,5 ml de cloroformo. Se recogió
cada fracción en un tubo de ensayo separado. Se añadieron gota a
gota muestras de cada fracción en una capa fina y se compararon con
los patrones. Las fracciones que contenían compuestos individuales
se combinaron y evaporaron hasta sequedad.
Se determinaron los espectros de RMN de los
compuestos puros y se identificaron los compuestos comparando los
espectros con compuestos análogos. En la Fig. 4, se da el espectro
de H-RMN del compuesto I.
Se inocularon diez matraces erlenmeyer de 250 ml
que contenían cada uno 60 ml de medio E1 con alícuotas de 1 ml de la
cepa H028/pSY15. Los matraces se incubaron en un agitador a 330 rpm
a una temperatura de 30ºC durante aproximadamente 4 días. Se
confirmó la producción de los micelios terminados extrayendo
muestras de 0,5 ml con una mezcla de metanol y tolueno (1:1). Los
productos se compararon con los patrones mediante cromatografía en
capa fina.
Se vaciaron los matraces en dos tubos de
centrífuga de 400 ml y se centrifugaron durante 10 min a 3000 rpm.
Se recuperó el sobrenadante. Se suspendió el precipitado añadiendo a
cada tubo 50 ml de metanol. Se volvieron a centrifugar los tubos
durante 10 min a 3000 rpm. Se añadió la solución de metanol al
sobrenadante. Se desechó el precipitado. Se extrajo la solución con
2 \times 100 ml de cloroformo, con lo que se obtuvo una solución
de cloroformo fuertemente amarilla. Se desechó la fase acuosa.
Se evaporó el cloroformo en baño de agua en un
rotavapor. Se disolvió el producto seco amarillo en 2 ml de
cloroformo.
Se pipetearon las soluciones de cloroformo en una
columna de vidrio de cromatografía equipada con sinterizado de
vidrio que tenía un diámetro de 2 cm y contenía aproximadamente 5 cm
de sílice suspendida en cloroformo (gel de sílice 60, Merck). Se
eluyó la columna con alícuotas de 2,5 ml de cloroformo. Se recogió
cada fracción en un tubo de ensayo separado. Se añadieron gota a
gota muestras de cada fracción en una capa fina y se compararon con
los patrones. Las fracciones que contenían compuestos individuales
se combinaron y evaporaron hasta sequedad.
Se determinaron los espectros de RMN de los
compuestos puros y se identificaron los compuestos comparando los
espectros con compuestos análogos. En la Fig. 5, se da el espectro
de H-RMN de la auramicinona (compuesto II).
Se inoculó un matraz erlenmeyer de 250 ml que
contenía 60 ml de medio E1 con 1 ml de cepa JH003. Se incubó el
matraz en un agitador a 330 rpm a una temperatura de 30ºC durante
aproximadamente 3 días. Después de un cultivo de dos días, se
añadieron aproximadamente 2 mg de auramicinona al matraz. A las 24
horas de esto, se confirmó la producción extrayendo una muestra de
0,5 ml con una mezcla de metanol y tolueno (1:1). Los productos se
compararon con el patrón por cromatografía en capa fina.
Se vació el matraz en dos tubos de centrífuga de
60 ml y se centrifugaron durante 10 min a 3000 rpm. Se recuperó el
sobrenadante. Se suspendió el precipitado añadiendo a cada tubo 10
ml de metanol. Se volvieron a centrifugar los tubos durante 10 min a
3000 rpm. Se añadió la solución de metanol al sobrenadante. Se
desechó el precipitado. La solución combinada se extrajo con 2
\times 20 ml de cloroformo, con lo que se obtuvo una solución de
cloroformo fuertemente amarilla. Se desechó la fase acuosa.
Se evaporó el cloroformo en baño de agua en un
rotavapor. Se disolvió el producto seco amarillo en cloroformo.
Basándose en la TLC, se encontró que el producto correspondía a los
productos de la cepa JH003/pSY15 (véase el ejemplo 5.2).
Se inocularon diez matraces erlenmeyer de 250 ml
que contenían cada uno 60 ml de medio E1 con alícuotas de 1 ml de la
cepa H028/pSY15. Se incubaron los matraces en un agitador a 330 rpm
a una temperatura de 30ºC durante aproximadamente 4 días. Se
confirmó la producción de los micelios terminados extrayendo
muestras de 0,5 ml con una mezcla de metanol y tolueno (1:1). Los
productos se compararon con el patrón por cromatografía en capa
fina.
Se vaciaron los matraces en dos tubos de
centrífuga de 400 ml y se centrifugaron durante 10 min a 3000 rpm.
Se recuperó el sobrenadante. Se suspendió el precipitado añadiendo a
cada tubo 50 ml de metanol. Los tubos se volvieron a centrifugar
durante 10 min a 3000 rpm. La solución de metanol se añadió al
sobrenadante. Se desechó el precipitado. La solución se extrajo con
2 \times 100 ml de cloroformo, con lo que se obtuvo una solución
de cloroformo fuertemente amarilla anaranjada. Se desechó la fase
acuosa.
Se evaporó el cloroformo en baño de agua en un
rotavapor. Se disolvió el producto seco amarillo anaranjado en 2 ml
de cloroformo.
Se pipetearon las soluciones de cloroformo a una
columna de vidrio de cromatografía equipada con sinterizado de
vidrio que tenía un diámetro de 2 cm y contenía aproximadamente 5 cm
de sílice suspendida en cloroformo (gel de sílice 60, Merck). La
columna se eluyó con alícuotas de 2,5 ml de cloroformo. Se recogió
cada fracción en un tubo de ensayo separado. Se añadieron gota a
gota muestras de cada fracción a una capa fina y se compararon con
los patrones. Las fracciones que contenían compuestos individuales
se combinaron.
Se determinaron los espectros de RMN de los
compuestos puros y se identificaron los compuestos comparando los
espectros con compuestos análogos. En la Fig. 6, se da el espectro
de H-RMN de
auramicinona-rodosamina-desoxifucosa
(compuesto III).
Se inocularon diez matraces erlenmeyer de 250 ml
que contenían cada uno 60 ml de medio E1 con 1 ml de cepa
JH003/pSY15. Se incubaron los matraces en un agitador a 330 rpm a
una temperatura de 30ºC durante aproximadamente 4 días. Se confirmó
la producción de los micelios terminados extrayendo muestras de 0,5
ml con una mezcla de metanol y tolueno (1:1). Los productos se
compararon con el patrón por cromatografía en capa fina.
Se vaciaron los matraces en dos tubos de
centrífuga de 400 ml y se centrifugaron durante 10 min a 3000 rpm.
Se recuperó el sobrenadante. Se suspendió el precipitado añadiendo a
cada tubo 50 ml de metanol. Se volvieron a centrifugar los tubos
durante 10 min a 3000 rpm. Se añadió la solución de metanol al
sobrenadante. Se desechó el precipitado. La solución combinada se
extrajo con 2 \times 100 ml de cloroformo, con lo que se obtuvo
una solución de cloroformo fuertemente amarilla. Se desechó la fase
acuosa.
Se evaporó el cloroformo en baño de agua en un
rotavapor. Se disolvió el producto seco amarillo en 2 ml de
cloroformo.
Se pipetearon las soluciones de cloroformo a una
columna de vidrio de cromatografía equipada con sinterizado de
vidrio que tenía un diámetro de 2 cm y contenía aproximadamente 5 cm
de sílice suspendida en cloroformo (gel de sílice 60, Merck). La
columna se eluyó con alícuotas de 2,5 ml de cloroformo: metanol
100:10. Se recogió cada fracción en un tubo de ensayo separado. Se
añadieron gota a gota muestras de cada fracción a una capa fina y se
compararon con los patrones. Las fracciones que contenían compuestos
individuales se combinaron y evaporaron hasta sequedad.
Se determinaron los espectros de RMN de los
compuestos puros y se identificaron los compuestos comparando los
espectros con compuestos análogos. En la Fig. 7, se da el espectro
de H-RMN de
auramicinona-rodinosa-desoxifucosa.
Se determinaron los tiempos de retención de los
compuestos en una columna RP-18 con un eluyente
acetonitrilo:metanol:tampón dihidrogenofosfato de potasio (8,00 g/l,
pH 3,0) 5:2:3. Los tiempos de retención de los compuestos son: I:
4,63; II: 3,52; III: 4,09 y IV: 7,26. Las estructuras de los
compuestos I-IV se dan en el esquema I.
Se determinaron los espectros de
H-RMN de algunos de los productos de TK24/pSY15,
H028/pSY15 y JH003/
pSY15 mediante un espectrómetro de RMN Brücker de 400 MHz en deuteriocloroformo. Los espectros dados por los compuestos se compararon con los espectros de compuestos conocidos, por ejemplo aclarubicina. Los espectros obtenidos se dan en las Fig. 4 a 7.
pSY15 mediante un espectrómetro de RMN Brücker de 400 MHz en deuteriocloroformo. Los espectros dados por los compuestos se compararon con los espectros de compuestos conocidos, por ejemplo aclarubicina. Los espectros obtenidos se dan en las Fig. 4 a 7.
En todos los compuestos, se encuentran los
hidrógenos en posiciones 1, 2 y 3 unidos entre sí y con las mismas
transiciones. El singlete correspondiente al hidrógeno en posición
11 se encontró en todos los compuestos con la misma transición.
Adicionalmente, pueden observarse los picos dados por los dos
hidroxilos aromáticos. Basándose en los picos de estos seis
hidrógenos, los restos cromofóricos aromáticos son similares, y
corresponden por ejemplo al cromóforo de aclavinona.
En todos los compuestos se encuentra un singlete
del tamaño de tres hidrógenos aproximadamente a 3,7 ppm,
correspondiente al metilo del éster metílico. Se encuentra otro
singlete en todos los compuestos aproximadamente a 3,8 ppm, que
corresponde al hidrógeno en posición 10. El conjunto de esto es del
tamaño de un hidrógeno en auromicinona y sus glicósidos y del tamaño
de dos hidrógenos en el compuesto I. Según esto, el compuesto I se
ajusta a un compuesto en el que el cuarto anillo no se ha
cerrado.
La región de 4,7 a 6 ppm tiene en antraciclinas y
en compuestos relacionados con las mismas hidrógenos en posición 7 y
posición 1 de los azúcares. La auramicinona tiene en esta región un
pico, los compuestos III y IV tienen tres picos, pero en el
compuesto I no hay picos en esta región. Según esto, la auramicinona
no tiene azúcares y los compuestos III y IV tienen dos azúcares,
mientras que el compuesto I no tiene hidrógeno en esta región, lo
que se ajusta a la forma ceto en posición 7.
La auramicinona y sus glicósidos tienen un
singlete de tres hidrógenos entre 1,39 y 1,47 ppm. Esto se ajusta al
grupo metilo en posición 13, que no está unido a los demás
hidrógenos. Este punto distingue a estos compuestos de la aclavinona
y sus glicósidos, en los que la cadena lateral es etilo.
Los hidrógenos CH_{2} en posición 8 de la
auramicinona y sus glicósidos proporcionan un doblete a 2,2 ppm y un
doble doblete a 2,6 ppm. Además, en los espectros de los compuestos
III y IV se encuentran picos correspondientes a sus azúcares.
Los resultados de H-RMN coinciden
bien con las estructuras dadas en las Figuras.
Se depositó el siguiente microorganismo en la
"Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Kulturen" (DSM),
Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig,
Alemania.
| Microorganismo | Número de depósito | Fecha de depósito |
| Streptomyces lividans TK24/pSY15 | DSM 9436 | 15 de septiembre de 1994 |
Esquema
I
Fórmulas estructurales de los
compuestos
obtenidos
Arrowsmith, T.J., Malpartida, F.,
Sherman, D.H., Birch, A., Hopwood, D.A. and
Robinson, J.A. 1992. Characterization of
actI-homologous DNA encoding polyketide synthase
genes from monensin producer Streptomyces cinnamonensis. Mol.
Gen. Genet. 234: 254-264.
Bhuyan, B.K. and Dietz, A.
1995. Fermentation, taxonomic, and biological studies of
nogalamycin. Antimicrob. Agents Chemother.
1965:836-844.
Bibb, M.J., Sherman, D.H.,
Omura, S. and Hopwood, D.A. 1994. Cloning
sequencing and deduced functions of a cluster of Streptomyces genes
probably encoding biosynthesis of the polyketide antibiotic
frenolicin. Gene.
Bibb, M.J., Biro, S.,
Motamedi, H., , Collins, J.F., and Hutchinson,
C.R. 1989. Analysis of the nucleotide sequence of the
Streptomyces glaucescens tcmI genes provides key information
about the enzymology of polyketide antibiotic biosynthesis. EMBO
J. 8:2727-2736.
Dower W.J., Miller, J.F. and
Ragsdale, C.W. 1988. High efficiency transformation
of E.coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids
Research. 16:6127-6145.
Fernandez-Moreno, M.A.,
Martinez, E., Boto, L., Hopwood, D.A. and
Malpartida, F. 1992. Nucleotide sequence and deduced
functions of a set of cotranscribed genes of Strptomyces
coelicolor A3(2) including the polyketide synthase for
the antibiotic actinorhodin. J. Biol. Chem. 267:
19278-19290.
Floss, H.G. (1987) Hybrid
antibiotics – the contribution of the new gene combinations.
Trends in Biotech. 5:111-115.
Fujivara, A. and Hoshino, T.
1986. Anthracycline antibiotics. CRC critical reviews in
biotechnology. 3:2:133-157.
Gräfe, U., Dornberger, K.,
Wagner, C and Eckardt, K. 1989. Advances in
bioconversion of anthracycline antibiotics. Biotech. Adv. 7:
215-239.
Hallman, S.E., Malpartida, F. and
Hopwood, D.A. 1988. Nucleotide sequence, transcription and
deduced function of a gene involved in polyketide antibiotic
synthesis in Streptomyces coelicolor. Gene 74:
305-320.
Hopwood, D.A., M.J. Bibb, K.F.
Chater, T. Kieser, C.J. Bruton, H.M.
Kieser, D.J. Lydiate, C.P. Smith, J.M.
Ward, and H. Schrempf. 1985. Genetic
manipulations of Streptomyces: a laboratory manual. The
John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom.
Katz, L., and Donadio, S.
1993. Polyketide synthesis: prospects for hybrid
antibiotics. Annu. Rev. Microbiol. 47:
875-912.
Kim, E.S., Bibb, MJ.,
Butler, M.J., Hopwood, D.A. and Sherman, D.H.
1994. Nucleotide sequence of the oxytetracycline (otc)
polyketide synthase genes from Streptomyces rimosus. Gene
141: 141-142.
Malpartida, F. and Hopwood, D.A.
1984. Molecular cloning of the whole biosynthetic pathway of
a Streptomyces antibiotic and its expresion in a
heterologous host. Nature. 309: 462-464.
Malpartida, F., S.E. Hallam, H.M.
Kieser, H. Motamedi, C.R. Hutchinson, M.J.
Butler, D.A., Sugden, M. Warren,
C.McKillop, C.R. Bailey, G.O. Humphresis, and
D.A. Hopwood. 1987. Homology between
Streptomyces genes coding for synthesis of different
polyketides used to clone antibiotic synthesis genes. Nature
(London) 325: 818-821.
McDaniel, R., S.
Elbert-Khosla, D.A. Hopwood, and
C.Khosla. 1993. Engineered biosynthesis of novel
polyketides. Science. 262: 1546-1550.
Niemi, J.K. Ylihonko, J.
Hakala, R. Pärssinen, A. Kopio, and P.
Mäntsälä. 1994. Hybrid anthracycline antibiotics:
production of new anthracyclines by cloned genes from Streptomyces
purpurascens in Streptomyces galilaeus. Microbiol. 140:
1351-1358.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T.
Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory
manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y.
Shen, B. and Hutchinson, R.
1993. Enzymatic synthesis of a bacterial polyketide from
acetyl and malonyl Coenzyme A. Sciencie. 262:
1535-1540.
Sherman, D.H., Malpartida, F.,
Bibb, M.J., Kieser, H.M. and Hopwood, D.A.
1989. Structure and deduced function of the
granaticin-producing polyketide synthase gene
cluster of Streotomyces violaceoruber Tü22. EMBO J.
8: 2717-2725.
Ward, J.M, G.r. Janssen, T.
Kieser, M.J. Bibb, M.J. Butnner and M.J.
Bibb. 1986. Construction and charaterization of a
series of multi-copy promoter-probe
plasmid vectors for Streptomyces using the aminoglycoside
phosphotransferase from Tn5 as indicator. Mol. Gen. Genet.
203: 468-478.
Ylihonko, K., J. Hakala, J.
Niemi, J. Lundell and P. Mäntsälä.
1994. Isolation and characterization of aclacinomycin
A-nonproducing Strptomyces galilaeus (ATCC
31615) mutants. Microbiol. 140:
1359-1365.
Yu, T.-W., Bibb, M.J.,
Revill, W.P. and Hopwood, D.A. 1994. Cloning,
sequencing and analysis of the gricusin polyketide synthase gene
cluster from Streptomyces griseus. J. Bacteriol. 176:
2627-2634.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Galilaeus Oy
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Elinantie 2 A 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Turku
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Finlandia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): FIN-20510
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proceso para producir antraciclinas e intermedios de las mismas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25 (OEP)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3252 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Streptomyces nogalater ATCC 27451
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 359...1651
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "ORF1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2937...3197
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "ORF2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1648...1651
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "secuencia superpuesta a ORF1 y ORF2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 430 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 86 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3252 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Streptomyces nogalater ATCC 27451
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1648...2877
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "ORF2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 409 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Fragmento de ADN aislado y purificado, que es
el fragmento BglII-BglII de 12 kb de hibridación con
actI de la ruta biosintética de la antraciclina de la
bacteria Streptomyces nogalater.
2. Fragmento de ADN según la reivindicación 1,
que comprende la secuencia nucleotídica dada en la SEC ID Nº 1, o un
fragmento de la misma, que tiene al menos una de las funciones
enzimáticas mostradas para los marcos de lectura abiertos en la Fig.
2.
3. Construcción de ADN recombinante que comprende
el fragmento de ADN según la reivindicación 1 ó 2, incluida en un
plásmido que puede transferirse a una bacteria Streptomyces y
se copia en la misma.
4. Construcción de ADN recombinante según la
reivindicación 3 que es el plásmido pSY15, cuya estructura se da en
la Fig. 3, y que se depositó en S. lividans cepa TK24/pSY15
con el número de depósito DSM 9436.
5. Proceso para la producción de antraciclinas,
que comprende transferir el fragmento de ADN según la reivindicación
1 ó 2 a un hospedador Streptomyces galilaeus o un mutante del
mismo, que no produce antraciclinas, cultivar la cepa recombinante
obtenida y aislar los productos formados.
6. Proceso para la producción de precursores de
antraciclinas, que comprende transferir el fragmento de ADN según la
reivindicación 1 ó 2 a un hospedador Streptomyces lividans,
cultivar la cepa recombinante obtenida y aislar los productos
formados.
7. Proceso según la reivindicación 5 para
producir auramicinona o glicósidos de la misma, que comprende
transferir el fragmento de ADN según la reivindicación 2 a una cepa
mutante de Streptomyces galilaeus no productora, cultivar la
cepa recombinante así obtenida y aislar la auramicinona o un
glicósido de la misma según se forme.
8. Un precursor de antraciclina que es obtenible
según la reivindicación 6 y tiene la siguiente fórmula I:
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI944556A FI944556A0 (fi) | 1994-09-30 | 1994-09-30 | Foerfarande foer producering av antracykliner och deras mellanprodukter |
| FI944556 | 1994-09-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2220938T3 true ES2220938T3 (es) | 2004-12-16 |
Family
ID=8541475
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES95933446T Expired - Lifetime ES2220938T3 (es) | 1994-09-30 | 1995-09-29 | Proceso para producir antraciclinas y sus intermedios. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5986077A (es) |
| EP (1) | EP0792285B1 (es) |
| JP (1) | JPH10506533A (es) |
| AU (1) | AU3610395A (es) |
| DE (1) | DE69533141T2 (es) |
| ES (1) | ES2220938T3 (es) |
| FI (1) | FI944556A0 (es) |
| WO (1) | WO1996010581A1 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI107053B (fi) * | 1998-10-23 | 2001-05-31 | Galilaeus Oy | Nogalamysiinin biosynteesiin liittyvä geeniryhmittymä ja sen käyttö hybridiantibioottien tuotossa |
| FI107739B (fi) * | 1999-09-29 | 2001-09-28 | Galilaeus Oy | Aklasinomysiinin biosynteesiin liittyvä geeniryhmittymä ja sen käyttö geenitekniikassa |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI93860C (fi) * | 1991-03-25 | 1995-06-12 | Leiras Oy | Menetelmä antibioottien tuottamiseksi, siinä käyttökelpoisia DNA-jaksoja, yhdistelmä-DNA-konstruktioita ja näitä sisältäviä mikrobikantoja |
| US5364781A (en) * | 1991-11-18 | 1994-11-15 | Farmitalia Carlo Erba S.R.L | Process for preparing daunorubicin |
| NZ245124A (en) * | 1991-11-18 | 1994-06-27 | Erba Carlo Spa | Carminomycin 4-0-methyltransferase, dna encoding it, vectors and host cells; and also a process for producing daunorubicin |
| US5672491A (en) * | 1993-09-20 | 1997-09-30 | The Leland Stanford Junior University | Recombinant production of novel polyketides |
-
1994
- 1994-09-30 FI FI944556A patent/FI944556A0/fi not_active Application Discontinuation
-
1995
- 1995-09-29 EP EP95933446A patent/EP0792285B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-29 US US08/809,740 patent/US5986077A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-29 DE DE69533141T patent/DE69533141T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-29 ES ES95933446T patent/ES2220938T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-29 AU AU36103/95A patent/AU3610395A/en not_active Abandoned
- 1995-09-29 JP JP8511427A patent/JPH10506533A/ja not_active Ceased
- 1995-09-29 WO PCT/FI1995/000537 patent/WO1996010581A1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69533141T2 (de) | 2005-06-16 |
| DE69533141D1 (de) | 2004-07-15 |
| EP0792285B1 (en) | 2004-06-09 |
| WO1996010581A1 (en) | 1996-04-11 |
| AU3610395A (en) | 1996-04-26 |
| FI944556A0 (fi) | 1994-09-30 |
| EP0792285A1 (en) | 1997-09-03 |
| US5986077A (en) | 1999-11-16 |
| JPH10506533A (ja) | 1998-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Blanco et al. | Identification of a sugar flexible glycosyltransferase from Streptomyces olivaceus, the producer of the antitumor polyketide elloramycin | |
| Decker et al. | Cloning and characterization of a polyketide synthase gene from Streptomyces fradiae Tü2717, which carries the genes for biosynthesis of the angucycline antibiotic urdamycin A and a gene probably involved in its oxygenation | |
| Doumith et al. | Analysis of genes involved in 6-deoxyhexose biosynthesis and transfer in Saccharopolyspora erythraea | |
| Summers et al. | Nucleotide sequence of the tcmII-tcmIV region of the tetracenomycin C biosynthetic gene cluster of Streptomyces glaucescens and evidence that the tcmN gene encodes a multifunctional cyclase-dehydratase-O-methyl transferase | |
| Rajgarhia et al. | Minimal Streptomyces sp. strain C5 daunorubicin polyketide biosynthesis genes required for aklanonic acid biosynthesis | |
| Otten et al. | Cloning and expression of daunorubicin biosynthesis genes from Streptomyces peucetius and S. peucetius subsp. caesius | |
| Madduri et al. | Cloning and sequencing of a gene encoding carminomycin 4-O-methyltransferase from Streptomyces peucetius and its expression in Escherichia coli | |
| Olano et al. | A two-plasmid system for the glycosylation of polyketide antibiotics: bioconversion of ε-rhodomycinone to rhodomycin D | |
| Decker et al. | Nucleotide sequences and heterologous expression of tcmG and tcmP, biosynthetic genes for tetracenomycin C in Streptomyces glaucescens | |
| Madduri et al. | Functional characterization and transcriptional analysis of a gene cluster governing early and late steps in daunorubicin biosynthesis in Streptomyces peucetius | |
| Stutzman-Engwall et al. | Multigene families for anthracycline antibiotic production in Streptomyces peucetius. | |
| Niemi et al. | Nucleotide sequences and expression of genes from Streptomyces purpurascens that cause the production of new anthracyclines in Streptomyces galilaeus | |
| Dickens et al. | Analysis of clustered genes encoding both early and late steps in daunomycin biosynthesis by Streptomyces sp. strain C5 | |
| Summers et al. | The tcmVI region of the tetracenomycin C biosynthetic gene cluster of Streptomyces glaucescens encodes the tetracenomycin F1 monooxygenase, tetracenomycin F2 cyclase, and, most likely, a second cyclase | |
| Suwa et al. | Identification of two polyketide synthase gene clusters on the linear plasmid pSLA2-L in Streptomyces rochei | |
| JP2001511349A (ja) | Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓにおける６−デオキシヘキソースの生合成及び移送のための遺伝子 | |
| Schell et al. | Engineered biosynthesis of hybrid macrolide polyketides containing D-angolosamine and D-mycaminose moieties | |
| PT98428B (pt) | Clonagem da via de biossintese para formacao de clortetraciclina e tetraciclina a partir de streptomyces aureofaciens e sua expressao em streptomyces lividans | |
| ES2220938T3 (es) | Proceso para producir antraciclinas y sus intermedios. | |
| FI93860C (fi) | Menetelmä antibioottien tuottamiseksi, siinä käyttökelpoisia DNA-jaksoja, yhdistelmä-DNA-konstruktioita ja näitä sisältäviä mikrobikantoja | |
| Wang et al. | Modifications of aclacinomycin T by aclacinomycin methyl esterase (RdmC) and aclacinomycin-10-hydroxylase (RdmB) from Streptomyces purpurascens | |
| CN110305881B (zh) | 一种聚酮类化合物neoenterocins的生物合成基因簇及其应用 | |
| JP2005511054A (ja) | ハイブリッドグリコシル化産物及びそれらの産生及び使用 | |
| EP1443113B1 (en) | Method of obtaining indolocarbazoles using biosynthetic rebeccamycin genes | |
| FI111270B (fi) | Angusykliinien biosynteesin geeniryhmittymä ja sen käyttö yhdisteiden tuottamiseksi lääkeaineseulontaa varten |