JPH10506533A

JPH10506533A - アントラサイクリン類およびその中間体の製造方法

Info

Publication number: JPH10506533A
Application number: JP8511427A
Authority: JP
Inventors: ユリホンコ，クリスティーナ; ハカラ，ユハ; メントセレ，ペッカ
Original assignee: ガリラエウス・オサケ・ユキテュア
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 1998-06-30
Also published as: AU3610395A; EP0792285A1; DE69533141D1; US5986077A; ES2220938T3; EP0792285B1; DE69533141T2; FI944556A0; WO1996010581A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、アントラサイクリン生合成経路に関連したＤＮＡフラグメントを異種ストレプトマイセス宿主中で発現させることによるアントラサイクリン類およびその中間体の製造方法に関し、所望ならば、得られた中間体は非生産ストレプトマイセス変異株を用いてアントラサイクリン類またはそのアグリコンに変換される。

Description

【発明の詳細な説明】アントラサイクリン類およびその中間体の製造方法本発明は、アントラサイクリン（anthracycline）類の生合成経路に関連したＤＮＡフラグメントを異種宿主中で発現させることによるアントラサイクリン類およびその中間体の製造方法に関し、そして所望ならば、得られた中間体は、非産生変異株を用いてアントラサイクリン類またはそのアグリコンに変換される。ポリケチド抗生物質は、ポリ−β−ケトメチレン鎖[ＣＨＲＯ]_4-20から構成される化合物の広範で多様な群である。ポリケチドの共通の特徴は脂肪酸の生合成に類似の生合成経路である。Katz,L.and Donadio,S.(1993)はポリケチドに関する論文を最近公表した。構造的にはアントラサイクリン群の抗生物質は芳香族ポリケチドであるので、共通の構造本体は式（Ａ）の７,８,９,１０−テトラヒドロ−５,１２−ナフタセンキノンである。この構造本体に対して１個またはそれ以上の糖が結合している。糖が結合している分子の構造本体はアグリコンとよばれる。アントラサイクリン類は、例えば A.Fujiwara and T.Hoshino(1986)の論文においてより詳細に議論されている。いくつかのアントラサイクリン類は細胞静止活性があり、それゆえ、それらは興味の対象であり続けている。新しいアントラサイクリン類を見つけるために土壌由来のストレプトマイセス（Streptomyces）細菌のスクリーニングが用いられている。既知のアントラサイクリン類を修飾するために合成的方法が用いられており、それによりアグリコンまたは糖部分に化学基が付加されあるいは除去される。同様に、生物変換（biot ransformation）が用いられており、他の産生株または合成方法により生産された分子が生細胞において修飾される。いくつかのアントラサイクリン類は合成法によっても生産される。ハイブリッド抗生物質テクノロジーが、新しい抗生物質の製造における新しいテクノロジーとして開示されている。該テクノロジーは、２種の株の本来の生産物の構造的特徴を有する分子を遺伝子工学により製造することを包含するものとして確立されている。H.G.Floss:"Hybrid antibiotics-the contribution of th e new gene combinations"(1987)という刊行物に該方法が記載されている。ハイブリッド抗生物質テクノロジーは、新しい化合物の制御された製造を行う機会を与える。ストレプトマイセス・ケリコロール（Streptomyces coelicolor）由来のアクチノロジン遺伝子のクローニング（Hopwood et al.,1985）はポリケチド抗生物質、さらに同時にストレプトマイセスの分子生物学的研究における先駆的研究と考えられる。１９８７年に、Malpartida et al.は、ａｃｔIおよびａｃｔIIIＤＮＡフラグメントへの異なるポリケチドプロデューサーのハイブリダイゼーションについて報告しており、その後、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）ドメインの遺伝子が多くのストレプトマイセス種において同定され、相同性が示されている。これらの遺伝子の配列決定により、遺伝子は強く保存されていて３つの読み枠ＯＲＦ１、２および３を含むことが示された。これら３つの遺伝子産物は、酵素複合体に結合した直鎖状ポリケチドの形成に必要とされる。テトラセノマイシンにおいては、ＰＫＳ遺伝子によりコードされている正確な生成物の最適な形成には５つのＯＲＦが必要である（Shen and Hutchinson,1993）。配列決定された芳香族ＰＫＳを表１に示す。ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）は、長鎖脂肪酸のシンターゼの機能的に関連している多酵素複合体である。アクチノロジンＰＫＳの個々の成分は、いわゆるａｃｔＯＲＦ１ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）；ＫＳに相同的でポリケチド鎖長に影響するａｃｔＯＲＦ２（McDaniel,R.,et al.,1993）；ａｃｔＯＲＦ３アシル担体蛋白（ＡＣＰ）；ａｃｔＯＲＦ５ケトレダクターゼ（ＫＲ）および第１環の芳香族化の原因となりうるａｃｔＯＲＦ４シクラーゼ／デヒドラーゼである。生合成されたアントラサイクリン類の大部分ものもは、アクラビノン中間体相を経由して生成され、その後、化合物はグリコシレーションされるか、あるいは例えばヒドロキシルまたはメチル基の付加により修飾される。グリコシレーション後でも修飾が起こりうる。アクラビノンおよびそれよりさらに生成されるアン bioconversion of anthracycline antibiotics"(1989)およびそこで引用された文献に記載されている。１０個のアセテートから構成されているノガラマイシンのアグリコンの生合成経路は、明らかにアクラビノンの生合成に類似している（図１Ａおよび１Ｂ）。発明の説明ストレプトマイセス・ノガラテル（Streptomyces nogalater）からクローンされたＤＮＡフラグメントを本発明に従って用いてアントラサイクリン類の生合成経路の異なる相を一緒にすることができ、それによりハイブリッドアントラサイクリン類およびアントラサイクリン類の前駆体を得ることができる。クローンされたＤＮＡフラグメントをアントラサイクリン類生産ストレプトマイセス株あるいはアントラサイクリン非生産株に移すことにより、これを行う。アントラサイクリンの生合成を含み、本発明に従ってクローンされたストレプトマイセス・ノガラテルのＤＮＡフラグメントは、驚くべきことに、アントラサイクリン類を生産しない宿主であるエス・リビダンス（S.lividans）においてアントラサイクリン前駆体の生産を引き起こした。得られた化合物の構造に基づいて、該ＤＮＡフラグメントはアントラサイクリンのアグリコンの生合成に必要な遺伝子の大部分を含むと考えられた。変異株の相補、ハイブリッド生成物の分析およびＤＮＡフラクションの配列決定により、我々は、ＤＮＡフラグメントが以下のものを含むことを示すことができた： − ９−位の側鎖を決定する出発ユニットの選択の原因となる活性（エス・ガリラエウス（S.galilaeus）のハイブリッド生産物）、 − ポリケチドシンターゼ遺伝子、 − ２−位のヒドロキシルの除去に必要な酵素（ケトレダクターゼ）の遺伝子 − カルボン酸のエステル化に必要なメチルトランスフェラーゼ遺伝子 − モノ−オキシゲナーゼ遺伝子。このＤＮＡフラグメントおよびそれにより生成されるアントラサイクリン前駆体をさらに用いてハイブリッドアントラサイクリン類を得た。本発明は、いくつかの既知の細胞静止活性を有するアントラサイクリン類（アウラマイシン類）ならびに以前未知であった化合物の製造を可能にする。ハイブリッドアントラサイクリン類の製造におけるアントラサイクリン類のポリケチドシンターゼの使用はこれまでに記載されておらず、また、異種宿主に遺伝子を移すことによるポリケチド合成の出発ユニットの変更もこれまで記載されていない。さらに、エス・ノガラテル（S.nogalater）により生産されるノガラマイシンの生合成経路の遺伝子のクローニング、あるいはその使用についてもこれまで開示されていない。 Malpartida et al.(1987)により開示されたポリケチド抗生物質の生合成遺伝子の類似性は、ノガラマイシンの生合成遺伝子の発見の出発点であった。適当な制限酵素で開裂されたエス・ノガラテルの全ＤＮＡをサザン−法によりａｃｔI プローブにハイブリダイゼーションさせ、かくして２個のハイブリダイゼーションするＤＮＡフラグメントを得た。最適な場合、適切なプローブは１つのＤＮＡフラグメントを示す。しかしながら、クロスハイブリダイゼーションの使用は、シグナルが強力なため、生合成遺伝子の同定における方法として可能であると考えられた。本発明ＤＮＡフラグメントが見いだされた方法は下記のごとし：Malpartida e t al.(1987)により記載されたａｃｔIフラグメントに相同的なフラグメントをエス・ノガラテルから単離した。該相同的フラグメントおよび隣接ＤＮＡフラグメントをエス・リビダンスＴＫ２４株中に移した。全部で約２０ｋｂ（＝キロベース、１０００塩基）を５つのフラグメントにして異種宿主中に移した。これらのうち、約１２ｋｂのＤＮＡフラグメントであるｐＳＹ１５はエス・リビダンスにおいてノガラマイシン中間体の産生を引き起こした。得られた組み換え株をアントラサイクリン生産株用栄養培地で培養し、適当な有機溶媒で生成物を抽出した。本発明ＤＮＡフラグメントを、下記ストレプトマイセス株ならびに表２に示すエス・ガリラエウス変異株Ｈ０２８、ＪＨ００３、Ｈ０６１、Ｈ０３６およびＨ０３９中に移し、それらにおいて発現させた。所望生産物に応じて、該ＤＮＡフラグメントを同様に表中の他の変異株に移すことができる。ストレプトマイセス・リビダンス６６ＴＫ２４株（制限的修飾のない株）ストレプトマイセス・ガリラエウスＡＴＣＣ３１６１５（アクラシノマイシン生産株）ストレプトマイセス・ガリラエウスＡＴＣＣ３１６１５の変異株（表２参照）（Ylihonko et al.,1994）生物変換を行うための出発生成物を得る場合には、好ましくは、使用宿主はエス・リビダンスである。なぜなら、その株はそれ自体、使用増殖条件において着色化合物または抽出可能化合物を生産しないからである。生物変換を行うためのアグリコンを得る場合には、好ましくは、アントラサイクリン類生産細菌株またはその非生産変異株を用いるが、最も好ましくは上記１２ｋｂのＤＮＡフラグメントを担持しているプラスミドｐＳＹ１５（図３）で形質転換されたエス・ガリラエウスの変異株を用いる。プラスミドｐＳＹ１５を用いて得られたアントラサイクリン前駆体をアントラサイクリン類またはそれらのアグリコンに変換する場合には、好ましくは、アクラルビシンを生産しないエス・ガリラエウス変異株、例えば、ＪＨ００３またはＨ０２８を用いる。記載されたドメイン由来の適当なＤＮＡフラグメントを適当なベクターに連結することにより本発明ＤＮＡ構築物を構築することができる。好ましくは、かかるベクターは、ストレプトマイセス属のいくつかの株において増幅しうる高コピー数プラスミドｐＩＪ４８６である（Ward et al.,1986）。アントラサイクリン類およびそれらの前駆体を得るために、ｐＳＹ１５プラスミドを担持株を、好ましくはストレプトマイセス細菌用培地、好ましくはチオストレプトンを添加したＥ１−培地で増殖させて、プラスミド担持株を維持する。生産株に有利な条件で、例えば、ビンに入れて振盪器で、あるいは撹拌および通気を行うファーメンターで株を増殖させる。適当な培養時間後、好ましくは２ないし７日後、細菌の代謝に関して記載されている方法により、好ましくは、適当な溶媒（例、トルエンまたはクロロホルム）での抽出により生成物を単離する。抽出された化合物を適当な方法により、例えば、カラムクロマトグラフィーにより精製する。本来的にアントラサイクリン類を生産する株またはその変異株においてアントラサイクリン前駆体はアントラサイクリン類に変換される。このようにして、９ −位にメチルを有し２−位に水素を有する、該株により本来的に生産される化合物に類似の化合物を該株により得る。生物変換において、最も適当には、プラスミドｐＳＹ１５を担持するエス・ガリラエウス株により生産されたアウラマイシノン、あるいは同じプラスミドを担持し本来的にはアントラサイクリン類を生産しない株により生産されたノガロニン酸のメチルエステルを出発物質として用いる。生物変換において、最も好ましくは、アントラサイクリン生産株の非生産株、例えば、変異株Ｈ０２８またはＪＨ００３を用いる。最も好ましくは、株を適当な培地、例えば、Ｅ１−培地で培養し、適量のアントラサイクリン前駆体を添加することにより生物変換を行う。適当時間後、例えば６ないし４８時間後、最も好ましくは１６ないし３２時間後、そのようにして生産されたアントラサイクリン類を抽出する。生物変換に使用した株（表２も参照）を以下に説明する。ＴＫ２４はエス・リビダンス株であり、使用した条件では着色２次代謝物を生じない。他の増殖条件では、アントラサイクリン類とは非常に異なる抗生物質であるアクチノロジンを生産する。ＴＫ２４はアントラサイクリン類を生産せず、また、それらの前駆体も生産しない。ＴＫ２４／ｐＳＹ１５の生産物をＮＭＲ− スペクトルにより特徴づけたところ、化合物Ｉが主要生成物として得られ、それはおそらくアントラサイクリン生合成の中間体である（スキームＩ参照）。Ｈ０２８はストレプトマイセス・ガリラエウス変異株であり、アントラサイクリン類またはそれらの前駆体を生産しない。しかしながら、この株をアントラサイクリン前駆体の生物変換に用いてアクラルビシン類似生成物を得ることができる。Ｈ０２８／ｐＳＹ１５生産物を特徴づけたところ、この株は、アクラビノン類似のアントラサイクリンのアグリコンであるアウラマイシノン（化合物II）ならびにアウラマイシノンのグリコシドであるアウラマイシン類、例えば化合物II Iを生産することがわかった。アウラマイシンを加水分解した場合、アウラマイシノンが得られ、そのことはさらに、生成した化合物がアウラマイシノンのグリコシドであることを示す。新しいアントラサイクリン類を生物変換により製造する場合、アウラマイシノンはアントラサイクリン類の有用な前駆体である。アウラマイシン類は、癌の化学療法に使用できる細胞静止性アントラサイクリン類であると説明されている。これらの物質の製造へのＨ０２８／ｐＳＹ１５の使用は新しい。Ｈ０６１はストレプトマイセス・ガリラエウス変異株であり、２−ＯＨ−アクラノン酸を生産する。このことは、明らかに、２−位のヒドロキシルの除去を妨げる変異によるものである。Ｈ０６１／ｐＳＹ１５はアクラビノン、アウラマイシノンおよびアクラルビシン類似のそれらのグリコシドを生産する。結果によれば、ｐＳＹ１５はＨ０６１の変異を相補し、したがって２−位のデヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を含む。このプラスミドは、生成物が本来的に２−位にヒドロキシルまたはメトキシ基を有する株に形質転換された場合、新しいハイブリッド化合物の製造に有用である。結果によれば、ｐＳＹ１５は、本来的にアントラサイクリン類を生産しない株におけるアントラサイクリン類前駆体の生産に有用であり、あるいはアントラサイクリン類生産株においてハイブリッドアントラサイクリン類を生産する場合に有用であり、さらにそれらの株の変異株においても有用である。該プラスミドを用いて９−位の側鎖の形成を行うことができ、２個の炭素からなる側鎖を９−位に形成する株が、１個の炭素からなる側鎖を当該位置に有する化合物を生産するようにすることができる。このように修飾されていてもよいアントラサイクリン類の生産に使用できる株は、例えば、エス・ガリラエウス、エス・ペウセティウス（S.peucetius）およびエス・パープラセンス（S.Purpurascens）である。このようにして生産されたアントラサイクリン前駆体は、生物変換による新しいアントラサイクリン類の製造に有用である。２−位にヒドロキシルまたはメトキシ基を有する化合物を本来的に生産する株にｐＳＹ１５を形質転換することもできる。そのことにより、この位置に水素を有する化合物が得られる。さらに、本発明の新規方法によりｐＳＹ１５は上記アウラマイシノンおよびそのグリコシドの生産を可能にする。本発明の詳細な具体例を、エス・ノガラテル（S.nogalater）ＡＴＣＣ２７４５１株からのＤＮＡフラグメント単離、エス・リビダンスＴＫ２４株におけるノガラマイシン前駆体の生産、変異株Ｈ０２８におけるアウラマイシンの生産、および変異株ＪＨ００３におけるアントラサイクリン類へのそれらの修飾に関する実施例として説明する。さらに、エス・ガリラエウス変異株における本発明ＤＮＡフラグメントの発現ならびにこれらの株により生産された化合物についても説明する。ＴＫ２４／ｐＳＹ１５株、ＪＨ００３／ｐＳＹ１５株、Ｈ０２８／ｐＳＹ１５株およびＨ０６１／ｐＳＹ１５株の主生成物を特徴づけた。図面の簡単な説明図１Ａストレプトマイセス株により生産されたアントラサイクリン類、および同定されたその前駆体（出発分子：プロピオネート）。中間体を生産するエス・ガリラエウス変異株数をカッコ内に示す。図１Ｂアセテートを出発分子としてストレプトマイセスにより生産されたアントラサイクリン図２エス・ノガラテルのゲノム由来の１２ｋｂの連続したＤＮＡフラグメントの制限地図。この図は、得られたｐＳＹプラスミド中に含まれるインサートも開示する。ｐＳＹベクターの調製にプラスミドｐＩＪ４８６を用いた。配列決定に基づいて、図示した読み枠に関して下記機能を得た。１＝ケトアシルシンターゼ−アシルトランスフェラーゼ、２＝鎖長制御因子（ＣＬＦ）、３＝アシル転移蛋白；ＡおよびＢ＝調節遺伝子、Ｃ＝モノ−オキシゲナーゼ、Ｄ＝メチルトランスフェラーゼ、Ｅ＝ケトレダクターゼ。図３プラスミドｐＳＹ１５の構造。図４化合物ＩのＮＭＲ−スペクトル図５アウラマイシノンのＮＭＲ−スペクトル図６アウラマイシン−ロドサミン−デオキシフコースのＮＭＲ−スペクトル図７アウラマイシノン−ロジノース−デオキシフコースのＮＭＲ−スペクトル使用材料細菌株およびプラスミドストレプトマイセス・ノガラテルＡＴＣＣ２７４５１株を遺伝子ドナーとして用いた。宿主として本研究に用いたストレプトマイセス細菌株は上に示してある。イー・コリ（E.coli）XL1-Blue株（recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44 ,relA1,lac,[F¹proAB,lacIZΔM15,TnIO(tet^r)]）（Stratagene Cloning Systems ,California）においてエス・ノガラテルのＤＮＡの処理を行った。イー・コリＧＭ２１６３株（E.coli Genetic Stock Center,Department of Biology 255 OM L,Yale University,New Haven,USA）およびＬＥ３９２株（Promega）を遺伝子バンクの調製およびファージＤＮＡの増幅に使用した。イー・コリ中では、プラスミドｐＵＣ１８／ｐＵＣ１９（Pharmacia Biotech ）を用い、ストレプトマイセス株中ではプラスミドｐＩＪ４８６（Ward et al., 1987;John Innes Centre,UKのHopwood教授から得た）を用いた。使用栄養培地および溶液トリプトン−ソーヤブロス（ＴＳＢ）１リットルあたり：Oxoidトリプトンソーヤブロス粉末３０ｇ。ＹＥＭＥ（Hopwood et al.,1985.,p.239）１リットルあたり：酵母エキス（Difco）３ｇ、バクト−ペプトン（Difco）５ｇ、麦芽エキス（Oxoid）３ｇ、グルコース１０ｇおよびサッカロース３４０ｇ。オートクレーブ後、２ｍｌの２.５ＭＭｇＣｌ₂滅菌溶液および２５ｍｌの２０％グリシンを添加した。ＳＧＹＥＭＥサッカロース量が１リットルあたり１１０ｇであることを除いてＹＥＭＥと同様であった。プロトプラストを調製するために、使用菌株に応じて２０％グリシン量を１リットル中１２ｍｌから５０ｍｌまで変化させた。ＹＭ−寒天 Bacto酵母麦芽エキス寒天,ISP−培地2（Difco）；３８ｇ／リットル。ＩＳＰ４ Bacto ISP−培地4（Difco）；３７ｇ／リットルＲ２ＹＥ Hopwood et al.,(1985 p.236) ＬＢ Sambrook et al.,(1989,3:A.1) ＥＩ１リットルあたり：グルコース２０ｇ、澱粉２０ｇ、Farmamedia ５ｇ、酵母エキス２.５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄・３Ｈ₂Ｏ１.３ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１ｇ、ＮａＣｌ３ｇ、ＣａＣＯ₃３ｇ。水道水を添加して１リットルとし、ｐＨを７.４に合わせた。ＴＥＴｒｉｓ−ＨＣｌ−緩衝液,ｐＨ８：１０ｍＭ、ＥＤＴＡ,ｐＨ８：１ｍＭ２０＊ＳＳＣ１リットル中：ＮａＣｌ１７５.３ｇ、クエン酸Ｎａ８８.２ｇ。ＮａＯＨでｐＨを７に合わせた。デンハート溶液（Sambrook et al.,1989,3:B.1）５０＊基本溶液を調製する。基本溶液はFicoll ５ｇ、ポリビニルピロリドン５ｇ、ＢＳＡ（ウシ・血清アルブミン）５ｇ。蒸留水を添加して５００ｍｌとし、濾過により滅菌する。実施例１. ストレプトマイセス・ノガラテルのアントラサイクリン生合成に含まれる遺伝子のクローニングおよび特徴づけ１.１エス・ノガラテル由来の遺伝子バンクの調製およびアントラサイクリン遺伝子のクローニングストレプトマイセス・ノガラテルからの全ＤＮＡの単離エス・ノガラテル（ＡＴＣＣ２７４５１）菌糸を、０.５％グリシンを添加したＴＳＢ培地５０ｍｌ中で激しく撹拌しながら２８℃で約３日間培養した。菌糸をペレット化し、上清を捨てた。ペレットを１０ｍｌの溶解バッファー（１５％サッカロース、２５ｍＭＴｒｉｓ,ｐＨ８.０、２５ｍＭＥＤＴＡおよびリゾチーム５ｍｇ／ｍｌ）中に懸濁し、３７℃で１５分インキュベーションした。プロテイナーゼＫ１ｍｇおよび１ｍｌの１０％ＳＤＳを撹拌しながら添加した。即座に混合物を７０℃で１５分間インキュベーションした。次いで、溶解したペレットを氷冷し、１ｍｌの３Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ６.０）を添加し、アイスバス中に数分間保った。０.１ＭＴｒｉｓで平衡化したフェノール５ｍｌを添加し、チューブを転倒回転させることにより撹拌した。相を遠心分離し、水相を５ｍｌのクロロホルムでさらに抽出した。次いで、１０ｍｌのイソプロパノールを添加することによりＤＮＡを沈殿させた。炎で口を閉じたパスツールピペットで注意深くＤＮＡを巻き取り、７０％エタノール中に浸し、チューブの壁にゆるく押し付けてＤＮＡをはずした。ＤＮＡを５ｍｌのＴＥ−バッファーに溶解し、ＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌＤＮａｓｅ不含ＲＮａｓｅを２５μｌ）で３０分間、３７ ℃において処理した。フェノールクロロホルム抽出を繰り返した。次いで、ＤＮＡをイソプロパノールで再沈殿させ、上記のように洗浄した。最後に、ＤＮＡを１ｍｌのＴＥ−バッファーに溶解し、その後の工程に使用した。サザンハイブリダイゼーションａｃｔIプローブはプラスミドｐＩＪ２３４５から得られた０.８ｋｂのＢｇｌ II−フラグメントであり、ａｃｍプローブはプラスミドｐＡＣＭ５（Niemi et a l.,1994）から得られた３ｋｂのＢａｍＨI−フラグメントであった。プラスミドをミニ−スケール（Promegaのマジックミニプレプス試薬シリーズ）で単離し、まずＢｇｌll、そしてＢａｍＨIでそれぞれ消化した後、調製用アガロースゲル電気泳動によりプローブフラグメントを単離した。次いで、ニックトランスレーションにより５０μＣｉの［α³²−Ｐ］ＣＴＰでプローブを標識した（Boehring er Mannheimのニックトランスレーション標識試薬シリーズ）。上記のごとく単離された全ＤＮＡ標品をＥｃｏＲI酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で分画した。使用説明書に従ってVacugene装置（LKB 2016,Pharmac ia LKB Biotechnology）を用いて、分画ＤＮＡをゲルからHybond N膜（Amersham ）に移した。ＵＶ光中で３分間インキュベーションすることによりＤＮＡを膜中に固定した。ハイブリダイゼーションオーブン内で、１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（１％ＳＤＳ、１ＭＮａＣｌ、５＊デンハート溶液、１００μｇ／ｍｌ変性担体ＤＮＡ（子ウシ・胸腺由来ＤＮＡ,Boehringer Mannheim）中、６５℃にて６時間膜をハイブリダイゼーションさせ、その後、少なくとも１００ｎｇの標識− ＤＮＡをハイブリダイゼーションチューブ中に添加し、さらに約１２時間インキュベーションを継続した。この操作後、洗浄溶液（２＊ＳＳＣ,１％ＳＤＳまたは０.２＊ＳＳＣ,０.１％ＳＤＳ）中、６５℃で３０分間２回膜を洗浄した。オートラジオグラフィーを行った。プラスチックフィルムで被覆した膜をオートラジオグラフィーフィルムに焼き付けることによりオートラジオグラフィーを行った。露出を約１ないし３日間継続した。エス・ノガラテルＤＮＡ由来の遺伝子バンクの調製４０μｇのＤＮＡを、２.４ユニットのＳａｕ３Ａ（Borhringer Mannheim）存在下で消化バッファー（10*A,Boehringer Mannheim）中にて５分間３７℃でインキュベーションし、フェノールを添加することにより反応を停止した。フェノール処理後、ＤＮＡをエタノール沈殿にて精製した。そのようにして得られたＤＮＡ−フラグメントを調製用アガロースゲル電気泳動（０.３％ＬＧＴ、低融点）に供した。カッティングにより２０ｋｂまたはそれより大型のＤＮＡをゲルから取り、アガロースからのフェノール化（phenolization）により精製した。製造者の説明書に従って、市販ファージベクターλ ＥＭＢＬ４のＢａｍＨIフラグメント（Amersham International olc,Amersham UK）をアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ,子ウシ・アルカリ性ホスファターゼ,Promega）で処理した。製造者の推奨に従って、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（Promega）存在下にて室温で２時間インキュベーションし、次いで、１４℃で２時間インキュベーションすることにより、インサートＤＮＡ（Ｓａｕ３Ａフラクション）およびそのようにして得られたベクターを連結した。製造者の指示に従って、パッケージ試薬シリーズ（Pr omega Biotech）を用いて連結混合物をλ−粒子にパッキングした。エシェリシア・コリ（Escherichia coli）ＧＭ２１６３株を宿主として用いた。パッキングについての説明書に従って細胞を感染用に調製し、Promegaの説明書に従ってパッキング混合物に感染させた細胞をプレートに広げた。ハイブリダイゼーションクローンの単離およびマッピング製造者の説明書に従って、４０００個のプラーク（プレート１枚あたり）を有するプレートからのファージＤＮＡを膜（Colony/pLaque Screen,New England N uclear）に移した。膜を上記のようにハイブリダイゼーションさせた。オートラジオグラフィーでシグナルを発したプラークをピックアップし、プラークを０. ５ｍｌのＳＭ−バッファー中で２時間インキュベーションすることにより、それらからファージを溶出させた。プラークプレートが密集していたため、それらを宿主ＬＥ３９２株（Promega）中に感染させ、上記のごとくハイブリダイゼーションさせることによりプラークを精製した。 Promegaのパッキング説明書に従って、ＬＥ３９２細胞を感染させることにより精製クローンからファージＤＮＡを２０ｍｌスケールで調製した。そのようにして得られたＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼで消化してクローンをマッピングし（Sambrook et al.,1989）、異なるプローブとハイブリダイゼーションさせた。そのようにして得られた制限地図を図２に示す。ＤＮＡフラグメントのエス・リビダンスへの移行および新化合物の検出制限地図（図２）に示したフラグメントを、ＥｃｏＲI−フラグメント（ｐＳＹ１およびｐＳＹ６）またはＢｇｌII−フラグメント（ｐＳＹ１５）としてエス・リビダンス中に移した。λ−クローンをＥｃｏＲIまたはＢｇｌII−制限酵素で消化し、同じ酵素で直鎖状にしたプラスミドに連結し、イー・コリ中へのエレクトロポレーション、またはエス・リビダンス中へのプロトプラスト形質転換により形質転換した。大部分のインサートをまずプラスミドｐＵＣ１９中にクローンし、イー・コリ中で増幅し、そのことによりイー・コリXL1-Blue株を宿主として用いた。ｐＳＹ１５をエス・リビダンスＴＫ２４株中に直接クローンした。イー・コリを使用した。なぜなら、そうすることによって少量のファージーＤＮＡを用いることができるからである。下記セッティング（２００オーム、２５μＦ、１.４ｋＶ）でE.coli Pulser Apparatus-エレクトロポレーション装置（Bio-R ad）を用いた場合、イー・コリの形質転換効率は２ｘ１０⁸個／μｇＤＮＡであった。エレクトロポレーション用に、Dower,W.J.et al.,(1988)に記載のごとく細胞を処理し、Bio-Radの０.１ｃｍキュベットを形質転換に使用し、細胞体積を２０μｌとした。エス・ガリラエウスにおいてのみ発現が成功すると考えられたので、エス・リビダンスＴＫ２４株を中間宿主として用いた。エス・ガリラエウスは、イー・コリで増殖したＤＮＡを用いると全く形質転換不可能であった。プラスミドｐＳＹ１５のみがＴＫ２４株における修飾を引き起こし、そのことは、通常はＴＫ２４は無色または青色であるＩＳＰ４プレート上の褐色として認知された。ただし通常はＴＫ２４は無色または青色である。アントラサイクリン生産に十分適したＥ１−培地においてプラスミドｐＳＹ１５を担持するＴＫ２４株のみが着色生成物の生成を引き起こした。薄層クロマトグラフィーに基づくと、組み換え株ＴＫ２４／ｐＳＹ１５の生成物はアルカリであるが、アクラノン酸メチルエステル生産変異株Ｈ０３６による生成物（Ylihonko et al.,1994）とは同じでないと思われた。溶離液トルエン：酢酸エチル：メタノール：ギ酸（５０：５０：１５：３）を用いるとこれらの化合物に関して以下のＲｆ−値が得られた：ＴＫ２４／ｐＳＹ１５：０.６６；０.６０；０.５０Ｈ０３６：０.６７；０.６２；０.５１エス・リビダンスＴＫ２４株へのｐＳＹ１５の形質転換によるこれらの特徴はｐＳＹ１５から生じることが確認された。チオストレプトンにより生じるプラスミド株に対する選択圧のないＥ１培地で組み換え株を培養した場合、新しい化合物の生成が減少した。１.２ＰＫＳ−遺伝子の局在化ハイブリダイゼーションフラグメントの配列決定ＥｃｏＲI−消化により、２ｋｂのａｃｔIハイブリダイゼーションフラグメントを得て、それを配列決定した。地図に従ってさらに約２ｋｂのＤＮＡを右の方へ配列決定した。配列決定のために、制限酵素消化部位から対応酵素で直鎖状にしたベクターｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９までの３１個のクローンを調製した。配列決定反応用のプラスミドを単離するために、PromegaのMagic/Wizard^TMMin ipreps DNA Purifucation Systemキットを用いた。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３ｍｌのＬＢ−培地中でイー・コリXL1-Blue細胞を培養し、製造者の説明書に従ってプラスミドを単離した。ジデオキシ鎖ターミネーション法を用いてＤＮＡ−配列決定を行った。配列決 Sequencing Systems,Deaza(Promega)配列決定試薬シリーズを用いた。常にPharm aciaキット中の説明書に従って変性を行った（方法Ｃ）。Pharmaciaキットを用いる場合、説明書に記載の方法Ｃ（２本鎖鋳型へのプライマーの標準的アニーリング）に従ってプライマーを連結した。プロメガのキットを用いる場合、製造者の説明書のアイテム「直接取り込みを用いる配列決定プロトコール」に従った。製造者により推奨されたプライマー連結温度（３７℃）からの逸脱、すなわち４５℃を用いて高ＧＣ含量により生じる２次構造を回避した。その後、反応終了まで温度を４５℃に維持した。放射性標識［α³⁵Ｓ］ｄＡＴＰ（NEN Products Boston,MA）を用いた。汎用プライマー（５'−ｄ（ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ）−３'）および逆プライマー（５'−ｄ（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）−３'）（pUC/M13 17mer Primers,Promega）を用いてＰＫＳ−ドメインの大部分を配列した。ドメインの最長フラグメント（５００〜６００ｂｐ）を配列決定する場合、そして「通過」できないかかる制限部位の配列を決定するために、６種の特異的プライマーを用いた。該プライマーはUniversity of Turk uのDepartment of Bioorganic Chemistryにおいて製造された。 PharmaciaのMacrophor-systemにより、濃度４％のグラジエントゲルを用いて、配列決定用ゲルにて泳動を行った。泳動条件：電流２０ｍＡ、電圧２５００Ｖ。配列分析ＰＫＳドメインから、約４１３４塩基のＤＮＡフラグメント（配列表に示す）を配列決定し、ＧＣＧ−ソフトウェア（Genetics Computer Group,GCG Package, Wisconsin USA）によりその分析を行った。サブプログラムCODONPREFERENCEを用いて、該配列から読み枠を検索した。得られた読み枠をアミノ酸配列に翻訳し、 TFASTA-サブプログラムを用いて既知配列との相同性を検索した。 CODONPREFERENCEプログラムによれば、配列決定された４１３４塩基のＤＮＡフラグメントは全部で３つの読み枠（ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３）を有していた（ＯＲＦ１は配列番号：１中のフラグメント３５９−１６５１、ＯＲＦ２は配列番号：４中のフラグメント１６４８−２８７７、ＯＲＦ３は配列番号：１中のフラグメント２９３７−３１９７）。各読み枠の開始部分にリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）が見いだされた。それらの塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列を既知配列と比較することにより、それらの遺伝子の機能を決定した。そのようにして、アクチノロジンおよびテトラセノマイシンのＰＫＳドメインとの以下の類似性：ＯＲＦ１（８０％、８１％）、ＯＲＦ２（７４％、７７％）、ＯＲＦ３（６２％、６２％）が得られ、このことに基づいて我々は該遺伝子に関して以下の機能があると考える。ＯＲＦ１はケトアシルシンターゼ；ＯＲＦ２は鎖長に影響する因子；ＯＲＦ３はアシル担体蛋白。これら３つの読み枠は機能的ポリケチドシンターゼに必要である。ＰＫＳドメインの上流約６ｋｂのＤＮＡフラグメントを配列決定した（ｋｂ＝１０００塩基）。このドメインにおいて、配列（図２）に基づいて以下の遺伝子活性が認められた：調節遺伝子、モノ−オキシゲナーゼ、メチルトランスフェラーゼおよびケトレダクターゼ。実施例２. エス・ガリラエウスＡＴＣＣ３１６１５およびその変異株中への遺伝子の移行プラスミドｐＳＹ１５をエス・リビダンスＴＫ２４株から単離し、エス・ガリラエウス変異株Ｈ０３９中に形質転換し、そこから単離されたＤＮＡを他のエス・ガリラエウス変異株に形質転換した。エス・ガリラエウス株の形質転換に用いた方法は以前に記載されている（Ylihonko,K.,Pro gradu-thesis,University of Turku,1986）。プロトプラスト調製のために、０.８％サッカロースを添加したＳＧＹＥＭＥ中で細胞を増殖させた。まず、プラスミドを変異株Ｈ０３９にうまく形質転換し、そのことにより２μｇのプラスミド−ＤＮＡで約１０個の形質転換体を得た。強力な制限的障壁のため、エス・ガリラエウスは外来ＤＮＡを用いて形質転換しにくかったが、プラスミドをエス・ガリラエウス株から単離した場合には形質転換効率は格段に上昇した。Ｈ０３９−形質転換体を、まず、チオストレプトンを添加したＩＳＰ４プレート上で約５日間培養した。菌糸を５０ｍｌのＴＳＢ栄養ブロス（５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを添加）に接種し、シェーカーで５日間増殖させた。プラスミドを上記のごとく単離し、他の変異株中に形質転換した。通常には、２００ないし５００ｎｇのプラスミドを１回の形質転換に使用し、そのことにより１０ないし１００個の形質転換体を得た。再生後、形質転換変異株をＩＳＰ４プレート上に撒き、そこから菌糸をさらにＥ１栄養培地に移した。プラスミドを維持するために、チオストレプトンをすべての栄養培地に添加した。Ｅ１菌糸をシェーカー（３３０ｒｐｍ、３０℃）でインキュベーションし、生産を続行し、３日後から５日後まで０.５ｍｌの菌糸試料を毎日取った。試料をリン酸バッファーでｐＨ７に緩衝化し、メタノール−トルエン混合物（１：１）で抽出した。さらに、試料の一部を１ＭＨＣｌ溶液で酸性にし、トルエン−メタノール中に抽出した。Ｅ１−培養において、変異株およびエス・ガリラエウス野生株の両方を対照として用いた。ＴＬＣで生成物を比較することにより、生産に及ぼすプラスミドの影響を調べた。形質転換に用いたエス・ガリラエウス変異株は上に掲載したものである。プラスミドｐＳＹ１５は、以下の変異株：Ｈ０２８、Ｈ０６１およびＪＨ００３においてアントラサイクリン類またはその前駆体の生産能を相補、すなわち、回復させた。該プラスミドは、変異株Ｈ０３６およびＨ０３９の生産プロフィールに対して認め得るほどには影響しなかった。使用条件下では着色物質を生産しないＪＨ００３はＨ０５４株から変異したものであり、形質転換体ＪＨ０３／ｐＳＹ１５をＨ０５４株と比較した。Ｈ０２８も非生産変異株であり、エス・ガリラエウスＡＴＣＣ３１６１５野生株を変異させて得たものであった。そこで、野生株を形質転換体Ｈ０２８／ｐＳＹ１５の対照として用いた。溶離液トルエン：酢酸エチル：メタノール：ギ酸（５０：５０：１５：３）を用いて、形質転換体および対照として用いた宿主株について以下のＲｆ−値が得られた。Ｈ０２８／ｐＳＹ１５：（０.６９）；０.６１；０.５８；０.０１ＪＨ００３／ｐＳＹ１５：０.５９；０.５０；０.４６；０.３５Ｈ０６１／ｐＳＹ１５：（０.６９）；０.６１；０.５８；０.０６；０.０１エス・ガリラエウスＡＴＣＣ３１６１５：０.２３；０.１４；０.１１Ｈ０５４：０.６５；０.６０；０.５３；０.４８Ｈ０６１：０.５０（酸）小スケールで単離された生成物を、１Ｍ塩酸中にて８０℃で０.５時間加熱することにより加水分解した。加水分解後、アグリコンまたはその前駆体について以下のＲｆ−値が得られた。Ｈ０２８／ｐＳＹ１５：０.６１ＪＨ００３／ｐＳＹ１５：０.６１Ｈ０６１／ｐＳＹ１５：０.６１使用したこれらすべての変異株は、もともと、エス・ガリラエウス野生株から作られたものであるので、エス・ガリラエウスにより生産されるアクラシノマイシンのアグリコンであるアクラビノンを比較物質として用いた。使用溶離液において、アクラビノンについてＲｆ−値０.６９が得られた。形質転換体の生成物において、少量のアクラビノンも検出された。実施例３. アントラサイクリン前駆体の生産３.１ＴＫ２４／ｐＳＹ１５生成物の生産それぞれ６０ｍｌのＥ１−培地を入れた１０個の２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコにＴＫ２４／ｐＳＹ１５株の１ｍｌの部分試料を接種した。３３０ｒｐｍのシェーカーにて３０℃で約３日間フラスコをインキュベーションした。０. ５ｍｌの試料をメタノールおよびトルエンの混合物（１：１）で抽出することにより、最終菌糸からの生産を確認した。薄層クロマトグラフィーにより生成物を標準物質と比較した。フラスコ内容物を２本の４００ｍｌ遠心チューブに入れ、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収した。各チューブに５０ｍｌのメタノールを添加することにより沈殿を懸濁した。３０００ｒｐｍで１０分間チューブを再遠心分離した。メタノール溶液を上清中に添加した。沈殿を捨てた。溶液を１００ｍｌのクロロホルムで２回抽出し、そのことにより濃オレンジ−黄色クロロホルム溶液を得た。水相を捨てた。水浴上でロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを蒸発させた。オレンジ−黄色乾燥生成物を２ｍｌのクロロホルムに溶解した。焼結ガラスを有し、クロロホルムに懸濁された約５ｃｍのシリカゲル（Kiesel gel 60,Merck）を入れた直径２ｃｍのガラス製クロマトグラフィーカラム中にクロロホルム溶液をピペットで入れた。２.５ｍｌずつのクロロホルムでカラムを溶出した。各フラクションを別々の試験管中に集めた。各フラクションの試料を薄層に供して標準物質と比較した。個々の化合物を含むフラクションを貯留し、次いで、蒸発乾固させた。スペクトルを類似化合物と比較することにより、純粋な化合物のＮＭＲ−スペクトルを調べ、化合物を同定した。図４に化合物IのＨ−ＮＭＲ−スペクトルを示す。３.２Ｈ０２８／ｐＳＹ１５株におけるアグリコンの生産それぞれ６０ｍｌのＥ１−培地を入れた１０個の２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコにＨ０２８／ｐＹＳ１５株の１ｍｌの部分試料を接種した。フラスコを３３０ｒｐｍのシェーカーにて３０℃で約４日間インキュベーションした。０ .５ｍｌの試料をメタノールおよびトルエンの混合物（１：１）で抽出することにより、最終菌糸からの生産を確認した。薄層クロマトグラフィーにより生成物を標準物質と比較した。フラスコ内容物を２本の４００ｍｌ遠心チューブに入れ、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収した。各チューブに５０ｍｌのメタノールを添加することにより沈殿を懸濁した。３０００ｒｐｍで１０分間チューブを再遠心分離した。メタノール溶液を上清中に添加した。沈殿を捨てた。溶液を１００ｍｌのクロロホルムで２回抽出し、そのことにより濃黄色クロロホルム溶液を得た。水相を捨てた。水浴上でロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを蒸発させた。黄色乾燥生成物を２ｍｌのクロロホルムに溶解した。焼結ガラスを有し、クロロホルムに懸濁された約５ｃｍのシリカゲル（Kiesel gel 60,Merck）を入れた直径２ｃｍのガラス製クロマトグラフィーカラム中にクロロホルム溶液をピペットで入れた。２.５ｍｌずつのクロロホルムでカラムを溶出した。各フラクションを別々の試験管中に集めた。各フラクションの試料を薄層に供して標準物質と比較した。個々の化合物を含むフラクションを貯留し、次いで、蒸発乾固させた。スペクトルを類似化合物と比較することにより、純粋な化合物のＮＭＲ−スペクトルを調べ、化合物を同定した。図５にアウラマイシノン（化合物II）のＨ− ＮＭＲ−スペクトルを示す。実施例４. ハイブリッド生成物の生物変換４.１ＪＨ００３株におけるアウラマイシノンの生物変換６０ｍｌのＥ１−培地を入れた１個の２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに１ｍｌのＪＨ００３株を接種した。フラスコを３３０ｒｐｍのシェーカーにて３０℃で約３日間インキュベーションした。２日培養後、約２ｍｇのアウラマイシノンをフラスコ中に添加した。この後２４時間目に、０.５ｍｌの試料をメタノールおよびトルエンの混合物（１：１）で抽出することにより、生産を確認した。薄層クロマトグラフィーにより生成物を標準物質と比較した。フラスコ内容物を２本の６０ｍｌ遠心チューブに入れ、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収した。各チューブに１０ｍｌのメタノールを添加することにより沈殿を懸濁した。３０００ｒｐｍで１０分間チューブを再遠心分離した。メタノール溶液を上清中に添加した。沈殿を捨てた。貯留した溶液を２０ｍｌのクロロホルムで２回抽出し、そのことにより濃黄色クロロホルム溶液を得た。水相を捨てた。水浴上でロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを蒸発させた。黄色乾燥生成物をクロロホルムに溶解した。ＴＬＣにより、生成物がＪＨ００３／ｐＳＹ１５株の生成物に対応することがわかった（実施例５.２参照）。実施例５. ハイブリッドアントラサイクリン類の生産５.１Ｈ０２８／ｐＳＹ１５株におけるアウラマイシノン−ロドサミン−デオキシフコースの生産それぞれ６０ｍｌのＥ１−培地を入れた１０個の２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコにＨ０２８／ｐＹＳ１５株の１ｍｌの部分試料を接種した。フラスコを３３０ｒｐｍのシェーカーにて３０℃で約４日間インキュベーションした。０.５ｍｌの試料をメタノールおよびトルエンの混合物（１：１）で抽出することにより、最終菌糸からの生産を確認した。薄層クロマトグラフィーにより生成物を標準物質と比較した。フラスコ内容物を２本の４００ｍｌ遠心チューブに入れ、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収した。各チューブに５０ｍｌのメタノールを添加することにより沈殿を懸濁した。３０００ｒｐｍで１０分間チューブを再遠心分離した。メタノール溶液を上清中に添加した。沈殿を捨てた。貯留した溶液を１００ｍｌのクロロホルムで２回抽出し、そのことにより濃黄色クロロホルム溶液を得た。水相を捨てた。水浴上でロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを蒸発させた。黄色乾燥生成物を２ｍｌのクロロホルムに溶解した。焼結ガラスを有し、クロロホルムに懸濁された約５ｃｍのシリカゲル（Kiesel gel 60,Merck）を入れた直径２ｃｍのガラス製クロマトグラフィーカラム中にクロロホルム溶液をピペットで入れた。２.５ｍｌずつのクロロホルムでカラムを溶出した。各フラクションを別々の試験管中に集めた。各フラクションの試料を薄層に供して標準物質と比較した。個々の化合物を含むフラクションを貯留した。スペクトルを類似化合物と比較することにより、純粋な化合物のＮＭＲ−スペクトルを調べ、化合物を同定した。図６にアウラマイシノン−ロドサミン−デオキシフコース（化合物III）のＨ−ＮＭＲ−スペクトルを示す。５.２ＪＨ００３／ｐＳＹ１５株におけるアウラマイシノン−ロジノース−デオキシフコースの生産それぞれ６０ｍｌのＥ１−培地を入れた１０個の２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコにＪＨ００３／ｐＹＳ１５株の１ｍｌの部分試料を接種した。フラスコを３３０ｒｐｍのシェーカーにて３０℃で約４日間インキュベーションした。０.５ｍｌの試料をメタノールおよびトルエンの混合物（１：１）で抽出することにより、最終菌糸からの生産を確認した。薄層クロマトグラフィーにより生成物を標準物質と比較した。フラスコ内容物を２本の４００ｍｌ遠心チューブに入れ、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収した。各チューブに５０ｍｌのメタノールを添加することにより沈殿を懸濁した。３０００ｒｐｍで１０分間チューブを再遠心分離した。メタノール溶液を上清中に添加した。沈殿を捨てた。貯留した溶液を１００ｍｌのクロロホルムで２回抽出し、そのことにより濃黄色クロロホルム溶液を得た。水相を捨てた。水浴上でロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを蒸発させた。黄色乾燥生成物を２ｍｌのクロロホルムに溶解した。焼結ガラスを有し、クロロホルムに懸濁された約５ｃｍのシリカゲル（Kiesel gel 60,Merck）を入れた直径２ｃｍのガラス製クロマトグラフィーカラム中にクロロホルム溶液をピペットで入れた。２.５ｍｌずつのクロロホルム：メタノール１００：１０でカラムを溶出した。各フラクションを別々の試験管中に集めた。各フラクションの試料を薄層に供して標準物質と比較した。個々の化合物を含むフラクションを貯留し、蒸発乾固させた。スペクトルを類似化合物と比較することにより、純粋な化合物のＮＭＲ−スペクトルを調べ、化合物を同定した。図７にアウラマイシノン−ロジノース−デオキシフコースのＨ−ＮＭＲ−スペクトルを示す。実施例６. 生成物の特徴づけ６.１ＨＰＬＣ−ラン溶離液アセトニトリル：メタノール：リン酸二水素カリウムバッファー（８. ００ｇ／１,ｐＨ３.０）（５：２：３）を用いてＲＰ−１８−カラムにおける化合物の保持時間を調べた。化合物の保持時間は、I：４.６３、II：３.５２、III ：４.０９およびIV：７.２６であった。化合物I〜IVの構造をスキームＩに示す。６.２化合物のＮＭＲ−スペクトルＴＫ２４／ｐＳＹ１５、Ｈ０２８／ｐＳＹ１５およびＪＨ００３／ｐＳＹ１５生産物のいくつかのＨ−ＮＭＲ−スペクトルを、重水素−クロロホルム中においスペクトルを既知化合物、例えば、アクラルビシンのスペクトルと比較した。得られたスペクトルを図４から７に示す。すべての化合物において、同じ遷移を有する互いに結合した１、２および３− 位の水素が見られた。１１−位の水素に対応する同じ遷移を有するシングレットがすべての化合物において見られた。さらに、２個の芳香族ヒドロキシルにより生じたピークが見られた。これらの６個の水素のピークに基づけば、芳香族クロモフォア部分は類似であり、例えば、アクラビノンのクロモフォアに対応している。すべての化合物において、３個の水素のサイズのシングレットが約３.７ｐｐｍに見られ、メチルエステルのメチルに対応している。すべての化合物において別のシングレットが約３.８ｐｐｍにおいて見られ、それは１０−位の水素に対応する。この積分値は、アウラマイシノンおよびそのグリコシドにおける１個の水素のサイズならびに化合物Iにおける２個の水素のサイズである。このことにより、化合物Iは４番目の環が閉環していない化合物に適合する。４.７から６ｐｐｍの領域は、アントラサイクリン類およびその関連化合物における糖の７−位および１−位の水素を含む。この領域において、アウラマイシノンは１本のピークを有し、化合物IIIおよびIVは３本のピークを有するが、化合物Iはこの領域にピークがない。このことにより、アウラマイシノンは糖を有しておらず、化合物IIIおよびIVは２個の糖を有しているが、化合物Iはこの領域に水素を有しておらず、そのことは７−位のケト−型に適合する。アウラマイシノンおよびそのグリコシド類は３個の水素シングレットを１.３９から１.４７ｐｐｍに間に有している。このシングレットは１３−位のメチル基に適合し、それは他の水素に結合していない。このアイテムは、側鎖がエチルであるアクラビノンおよびそのグリコシド類からこれらの化合物を識別する。アウラマイシノンおよびそのグリコシド類の８−位のＣＨ₂−水素は、２.２ｐｐｍにおける１個のダブレットおよび２.６ｐｐｍにおける２個のダブレットを与える。さらに、化合物IIIおよびIVのスペクトルにおいて、それらの糖に対応するピークが見られる。Ｈ−ＮＭＲの結果は、図示された構造とよく一致する。寄託微生物下記微生物を、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(D SM),Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig,Germanyに寄託した。寄託微生物に関する指示Ｃ．さらなる指示の続きＤＳＭ９４３６オーストラリアを指定する場合、特許規則３.２５（オーストラリア法令規則１９９１Ｎｏ.７１）により、この特許出願に関してブダペスト条約により寄託された材料の試料は、本願に特許されるまでは；あるいは本願が失効、取り下げまたは拒絶されるまでは、当該試料の提供を求める者により推薦された本発明について利害関係のない専門家に提供されるだけである。

Claims

【特許請求の範囲】１．ａｃｔIにハイブリダイゼーションする細菌ストレプトマイセス・ノガラテルのゲノムの１２ｋｂのＢｇｌII−フラグメント中に含まれるストレプトマイセス・ノガラテルのアントラサイクリン生合成経路の遺伝子フラグメントである単離され精製されたＤＮＡ−フラグメント。２．配列番号：１に示されたヌクレオチド配列またはその機能的部分を含む請求項１記載のＤＮＡ−フラグメント。３．ストレプトマイセス細菌中に形質転換可能でその中でコピーされるプラスミド中に含有される請求項１または２記載のＤＮＡ−フラグメントを含む組み換え−ＤＮＡ−構築物。４．構造が図３に示されている寄託番号ＤＳＭ９４３６を有するエス・リビダンスＴＫ２４／ｐＳＹ１５株中にあるプラスミドｐＳＹ１５である請求項３記載の組み換え−ＤＮＡ−構築物。５．請求項１または２記載のＤＮＡ−フラグメントを異種ストレプトマイセス宿主中に移し、得られた組み換え株を培養し、次いで、生成物を単離することを含むアントラサイクリン類およびその前駆体の製造方法。６．ストレプトマイセス宿主がエス・リビダンスまたはエス・ガリラエウスである請求項５記載の方法。７．請求項２記載のＤＮＡ−フラグメントをストレプトマイセス・ガリラエウス宿主またはその変異株中に移し、そのようにして得られた組み換え株を培養し、次いで、生成したアウラマイシノンまたはそのグリコシドを単離することを含むアウラマイシノンまたはそのグリコシドの製造方法。８．ストレプトマイセス・ガリラエウス宿主がエス・ガリラエウスＡＴＣＣ３１６１５の変異株Ｈ０２８である請求項７記載の方法。９．請求項５に従って得られる下式Ｉを有するアントラサイクリン前駆体。