CN101340921B - 一种预防或治疗血栓性疾病的提取物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种预防或治疗血栓性疾病的提取物，具体地说，提供一种水蛭和/或地龙分子量不超过5800道尔顿的提取物，以及它的制备方法、药物组合物、用途。本发明的提取物和现有的同类产品相比，在药物活性或治疗作用不被减弱的前提下，药物安全性被显著地提高。

Description

一种预防或治疗血栓性疾病的提取物
技术领域
本发明涉及一种预防或治疗血栓性疾病的提取物，具体地说，涉及水蛭和/或地龙5800道尔顿以下分子量的提取物，以及其药物组合物、制备方法和用于制备预防或治疗血栓性疾病的药物的用途。
背景技术
水蛭作为经典的破血逐淤药物，为中国药典所收载。中国药典收载的水蛭药材品种有三种，即水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo mpponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania ac-ranulata Whitman，其中作为药用主要品种为水蛭科动物蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)。水蛭的主要成分为蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、酶、糖类以及微量元素等。对水蛭中蛋白质、氨基酸、糖类及微量元素等成分的定性、定量研究已多有报道，主要方法为薄层色谱法、高效液相色谱法、电泳法等。其中小分子成分主要为次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷等，嘧啶和嘌呤均为含有N原子的不饱和的杂环化合物。
地龙作为传统中药，具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效，为中国药典所收载。中国药典收载的地龙药材品种有四种，即钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretimapectinifera Michaelsen，其中作为药用主要品种为钜引科动物参环毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))，习称广地龙。地龙的主要成分为蛋白质、氨基酸、核酸、酶、糖类等。对地龙中蛋白质、氨基酸等成分的定性、定量研究已有报道。其中小分子成分主要为次黄嘌呤及含氮化合物。
临床上使用的药品疏血通注射液，是由水蛭、地龙两味药材的水提取物作为药物活性成分的中药注射剂是一种高效速效的治疗心脑血管疾病的注射剂。中国专利申请03148281.3、200410101538.8以及200510000266.7分别公开了疏血通注射液及其制备过程，前述申请的全部内容，引入本申请作为参考。
具有免疫原性的物质通常为大分子物质，相对分子量越大，免疫原性越强。而小分子多肽则免疫原性较弱或无免疫原性。抗原通常为大分子物质的可能原因是：(1)抗原相对分子量越大，表面特殊化学基因(抗原决定簇)就越多，因而就越能有效地刺激免疫细胞，产生免疫应答；(2)大分子抗原物质化学组成复杂、结构稳定，不易被破坏和清除，在体内停留时间较长，故可持续刺激免疫系统发生免疫应答。医药学上，通常将由51个氨基酸组成的人胰岛素(人胰岛素标准分子量为5800道尔顿)作为分界限，将分子量大于5800道尔顿的物质统称为高分子量物质，在注射剂中受到严格的限量控制。
发明内容
本发明目的是提供一种预防或治疗血栓性疾病的提取物，具体地说，提供一种水蛭和/或地龙分子量5800道尔顿以下的提取物及其制备方法和用于制备药物的用途。相对于现有技术，本发明的提取物在临床上应用更加安全和放心。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种预防或治疗血栓性疾病的提取物，其以水蛭和/或地龙作为原料经提取而制成的，其特征在于所述提取物的分子量5800道尔顿(dalton)以下。
上述所述的提取物，可以是水蛭的提取物、地龙的提取物或者水蛭和地龙混和在一起的提取物，其中，所述的水蛭和地龙混合在一起的提取物，可以是水蛭和地龙分别提取所得到的提取物混合后的提取物，也可以是水蛭和地龙混合在一起提取得到的提取物。
并且，所述的水蛭，可以是水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo mpponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania ac-ranulataWhitman，所述的地龙，可以是钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectiniferaMichaelsen。其中，作为优选，水蛭为水蛭科动物蚂蟥(Whitmania pigraWhitman)的干品或鲜品，地龙为钜引科动物参环毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))的干品或鲜品。
本发明所述提取物可通过包含用截留分子量小于或等于6000道尔顿、优选截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤步骤的方法制备的。例如，本发明所述的原料通过用现有技术中常规方法制备得到的提取物(半成品或中间体)，用截留分子量小于或等于6000道尔顿、优选截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤，以得到分子量5800道尔顿以下的水蛭和/或地龙提取物。
其中，作为优选，本发明所述的提取物是通过包含如下步骤的方法制备的：
(1)原料用注射用水或生理盐水洗净，低温浸渍，过滤，得到滤液和药渣；
(2)药渣破碎后，与步骤(1)的滤液混合，形成匀浆，将匀浆反复冷冻和解融，离心分离，取上清液；
(3)将步骤(2)所得上清液用截留分子量10000～100000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行超滤，得到透过液或滤液；
(4)将步骤(3)所得透过液或滤液，用截留分子量小于或等于6000道尔顿、优选截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤。
其中，如果需要，可以反复用截留分子量小于或等于6000道尔顿、优选截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤。并且，如果需要，还可以在过滤前进行热压处理，例如滤液在温度105～136℃热压10～45分钟处理。
其中，作为优选，本发明所述的提取物是也可以通过包含如下步骤的方法制备的：
(1)原料用注射用水或生理盐水洗净，破碎形成匀浆，经反复冷冻和解融，离心分离，取上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液用截留分子量10000～100000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行超滤，得到透过液或滤液；
(3)将步骤(2)所得透过液或滤液用离子交换柱层析处理；
(4)将步骤(3)所得洗脱液经脱盐处理后，用截留分子量小于或等于6000道尔顿、优选截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤；或者将步骤(3)所得洗脱液用截留分子量小于或等于6000道尔顿、优选截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤后，进行脱盐处理。
其中，如果需要，可以反复用截留分子量小于或等于6000道尔顿、优选截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤。
超滤膜或超滤柱可以选用本技术领域种常见的超滤膜或超滤柱，例如材质为聚砜材料的中空纤维超滤柱，切割分子量小于或等于6000道尔顿，优选切割分子量为6000道尔顿；以及粗滤时使用切割分子量10000～100000道尔顿的中空纤维超滤柱，优选为10000道尔顿或50000道尔顿。
上述所述的离子交换柱，可以为阳离子交换柱，也可以为阴离子交换柱。其中，阳离子交换柱例如选用CM-交联葡聚糖、CM-琼脂糖、CM-纤维素、SP-交联葡聚糖、SP-琼脂糖、SP-纤维素等；阴离子交换柱例如可选用DEAE-交联葡聚糖、DEAE-琼脂糖、DEAE-纤维素、Q-交联葡聚糖、Q-琼脂糖、Q-纤维素等。
本发明所述的提取物，其中含有多肽、氨基酸和次黄嘌呤的成份。
本发明所述的水蛭和/或地龙的提取物，原料水蛭和/或地龙可以是干品，也可以是鲜品。水蛭、地龙可以分别提取，分别得到水蛭提取物、地龙提取物，也可以水蛭和地龙混合在一起进行提取，得到水蛭和地龙混和在一起的提取物。
本发明所述的提取物，可以为提取液，也可以经脱水干燥后形成固体形式。
本发明还提供一种所述提取物的制备方法，所述方法包括用截留分子量小于或等于6000道尔顿、优选截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤的步骤。例如，所述原料水蛭和/或地龙可通过用现有技术中常规方法提取、分离，将所得到的提取物(也称半成品或中间体)最后用截留分子量小于或等于6000道尔顿、优选截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤，以得到分子量5800道尔顿以下的水蛭和/或地龙提取物。
作为优选，制备本发明的提取物的方法，包括：
(1)原料用注射用水或生理盐水洗净，低温浸渍，过滤，得到滤液和药渣；
(2)药渣破碎后，与步骤(1)的滤液混合，形成匀浆，将匀浆反复冷冻和解融，离心分离，取上清液；
(3)将步骤(2)所得上清液用截留分子量10000～100000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行超滤，得到透过液或滤液；
(4)将步骤(3)所得透过液或滤液，用截留分子量小于或等于6000道尔顿、优选截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤。
其中，如果需要，可以反复用截留分子量小于或等于6000道尔顿、优选截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤。并且，如果需要，还可以在过滤前进行热压处理，例如滤液在温度105～136℃热压10～45分钟处理。
本发明提取物中物质分子量的测定，通过用人胰岛素(分子量为5800)作为参照物，测定分子量大于人胰岛素的物质的含量作为高分子量物质含量。
例如，本发明采用高效液相色谱法进行测定，具体方法如下：
一、试验材料与仪器
1、标准蛋白分子量物质：人胰岛素(Insulin)，分子量5800，规格1mg/支，购自中国药品生物制品检定所。
2、仪器
可见紫外分光光度计(日本日立U-3210)
高效液相色谱仪Waters 600系统
高效液相色谱仪Agilent Hp1100
3、试剂
三氟醋酸化学纯(理工大学化工与材料学院)
乙腈色谱纯(迪马公司)
二、色谱条件
色谱柱：凝胶色谱柱(TSK GEL 2000SWxl 7.8mm×300mm)；
流动相：三氟醋酸-乙腈-水，按体积比为0.025∶30∶70；
紫外检测器，检测波长为214±1nm；
流速为0.7ml/min。
三、测定
精密量取供试品适量，用流动相制成供试品溶液；精密称取人胰岛素适量，用流动相制成对照品溶液；分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录色谱图，测定分子量大于人胰岛素的物质的含量，即计算保留时间小于人胰岛素峰保留时间的色谱峰所对应的物质的含量，作为供试品中高分子量(分子量大于5800道尔顿)的物质含量。
本发明提取物中物质分子量的分布，也可以通过质谱法进行测定。例如通过如下方法测定提取物中组分的分子量分布情况。
取本发明提取物样品适量(或据需要作脱盐处理)，用0.5％TFA(三氟乙酸)水溶液溶解。将样品和基质按1∶1混合后，点靶，室温干燥。所述的基质为：DHB(2，5-二羟基苯甲酸)、CCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸)。
用Autoflex(Bruker公司)仪器测定。质谱条件：(MALDI-TOF-MS)；N2激光源，波长337nm；线性扫描(飞行管长1.6m，加速电压20kv)；离子类型：正离子(或负离子)。
测定结果表明本发明提取物中所含组份分子量均小于5800道尔顿。
本发明所述的提取物，经过上述方法测定，未发现分子量大于5800道尔顿的物质，因此本发明所述的具有预防或治疗血栓性疾病的提取物分子量不超过5800道尔顿。
本发明所述的提取物中，含有多肽、氨基酸和次黄嘌呤成分。其中多肽、氨基酸可以用适宜的氨基酸分析仪或高效液相色谱仪适宜系统进行分析。例如可以按照中国药典2005年版一部附录VI D高效液相色谱法进行氨基酸测定：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A、B液为流动相，梯度洗脱，检测波长338nm和262nm，柱温30℃～40℃。其中：
A液：醋酸钠适量加注射用水溶解后，加入三乙胺适量，混匀，调节pH至中性，再加入四氢呋喃适量混匀。
B液：醋酸钠适量加注射用水溶解，加醋酸适量调节pH至中性，加乙腈-甲醇(1∶1)的混合液适量混匀。
氨基酸对照品适量加pH10.4的硼酸缓冲液适量混匀，加邻苯二甲醛和9-芴基甲基氯甲酸酯衍生试剂，搅拌均匀，使充分反应生成邻苯二甲酸-9-芴基甲基氯甲酸酯氨基酸，作为对照品溶液。本发明提取物作为供试品，依法操作，采用高效液相色谱仪测定氨基酸。
所述提取物中次黄嘌呤测定，也可以按照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法进行测定，采用十八烷基硅烷键合硅胶作为固定相，0.1％磷酸氢二钠水溶液为流动相，检测波长254nm。理论板数按次黄嘌呤计算应不低于3000。
本发明所述的预防或治疗血栓性疾病的提取物，通过家兔的局部刺激性试验，将所述提取物配制成含生药0.5g/ml的药液，家兔左右两腿股四头肌内各注射1ml，注射后48小时处死动物，解剖取出两侧股四头肌，纵向切开，观察注射局部刺激反应，并放入10％甲醛溶液固定，按常规进行病理组织学检查。结果：肉眼检查发现家兔股四头肌均无充血、坏死现象，根据刺激反应中反应级的分值计为O分，即为无明显变化，病理检查证实无明显炎症反应。结果为本发明提取物局部刺激性反应无明显变化。
本发明所述的预防或治疗血栓性疾病的提取物，通过家兔的血管刺激性试验，将所述提取物配制成含生药0.5g/ml的药液，按1g/kg剂量(相当于临床用药量25倍)，每日作耳静脉注射一次，连续三次。取注射部位耳片固定，按常规进行病理组织学检查，观察局部注射的静脉是否有炎症反应。结果：病理检查表明家兔耳静脉均无组织变性或坏死的刺激反应，说明多次静脉注射本发明的提取物对局部血管无明显炎症反应。
本发明所述的预防或治疗血栓性疾病的提取物，通过豚鼠的过敏性试验，将所述提取物配制成含生药0.5g/ml的药液，取健康豚鼠6只，分第l组和第2组，每组3只。本实验第1组第2组豚鼠于实验第l天、第3天和第5天腹腔注射本发明的提取物注射液，每只0.5ml。第1组于第1次注射后第14天每只豚鼠静脉注射本发明的提取物注射液lml。第2组于第1次注射后第21天每只豚鼠静脉注射本发明的提取物注射液lml。在静脉注射后15分钟内，立即观察每只豚鼠是否有竖毛、呼吸困难、打喷嚏、干呕或咳嗽，或有锣音、抽搐、虚脱或死亡等现象。结果：第l组豚鼠于第14天和第2组豚鼠于第2l天静脉注射本发明提取物注射液后15分钟内均未出现竖毛、呼吸困难、打喷嚏、咳嗽、抽搐、死亡等现象。实验观察到末次给药的第2天，豚鼠均未出现明显过敏反应现象，说明本发明的提取物对豚鼠过敏试验结果呈阴性。
此外，本发明所述的预防或治疗血栓性疾病的提取物，通过家兔的溶血性试验。试验结果表明未发现有溶血现象，也未见有红细胞凝集作用。说明本发明的提取物溶血试验为阴性结果。
因此，本发明所述的预防或治疗血栓性疾病的提取物，可以作为制备各种制剂的原料。本发明也涉及一种包含上述所述的提取物作为活性成分的药物组合物。其中所述的药物组合物，可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、膜剂、贴剂、贴片、栓剂、丸剂、散剂、软膏剂、合剂(如口服液)、糖浆剂、酊剂、眼用制剂、鼻用制剂、注射液、注射用无菌粉末、注射用浓溶液或者它们的缓释、控释制剂。所述的制剂为常规药物制剂，因此，通过本领域的常规制药技术可以制得上述所述的制剂。
上述所述的提取物或药物组合物，具有预防、治疗血栓性疾病的作用，可用于制备预防、治疗血栓性疾病的药物。例如，可以用于预防、治疗高脂血症、动脉粥样硬化、心肌梗死、心绞痛、动脉硬化性脑梗死、脑栓塞、静脉血栓形成、肺栓塞、肺梗死、血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症、弥散性血管内凝血(DIC)、外科手术并发血栓形成和血栓栓塞、肝梗死、肾脏梗死、胆囊梗死、肠系膜梗死、肢体坏疽、糖尿病外周神经病变、视网膜血管阻塞或突发性聋等疾病。
本发明所述的预防或治疗血栓性疾病的提取物，其突出的优点表现在：其组分的分子量分布均在5800道尔顿以下，相对分子质量(分子量)较小，因此免疫原性较弱或无免疫原性。而且，在不溶性微粒的数量、粒径方面，与已有的水蛭和/或地龙提取物相比较，本发明的水蛭和/或地龙提取物中不溶性微粒的数量少得多、粒径小得多，因而安全性显著提高。相对于已有的水蛭和/或地龙提取物，在药物活性或治疗作用丝毫不减弱甚至是有所提高的情况下，药物的安全性被显著地提高，本发明的提取物制成的注射液使用前可以不经过皮试试验，从而节省了抢救病人时间以及减轻患者的痛苦等。
附图说明
图1：人胰岛素(分子量5800道尔顿)高效液相色谱检测图。
图2：本发明提取物(水蛭地龙提取物)高效液相色谱检测图。
图3：本发明提取物(水蛭提取物)质谱检测图。
其中：基质为CCA，检测为正离子。
图4：本发明提取物(地龙提取物)质谱检测图。
其中：基质为DHB，检测为负离子。
具体实施方式
实施例1
取等量的水蛭(干品)、地龙(干品)，用生理盐水或注射用水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水或注射用水洗净，置于2-4倍的生理盐水或注射用水中于低温0-4℃浸渍24小时，过滤，滤液和药渣分别存放备用。
将药渣用组织捣碎机捣碎，再用胶体磨与上述滤液混合匀浆，磨成直径小于0.5微米的匀浆液，将匀浆液在零下15℃以下冷冻15-30小时后取出，于低温0-4℃条件下解融，再按上述条件反复冷冻解融至少2次。
将上述冻融液置于离心机离心分离，得到上清液，通过分子量5万道尔顿的超滤柱进行粗滤，滤液再通过分子量1万道尔顿的超滤柱过滤纯化
取通过分子量1万道尔顿超滤柱的滤液，再通过分子量6000道尔顿的超滤柱进一步纯化，滤液经105-136℃热压10-45分钟处理，再通过分子量6000的超滤柱过滤，得到提取液。
如果需要，可以将上述得到的提取液脱水干燥成固体。
采用上述所述方法测定，提取液中含有多肽、氨基酸和次黄嘌呤成分。通过前述的高效液相色谱检测，上述提取物中未发现分子量大于5800道尔顿的物质，因而所得到的提取物的分子量均分布在5800道尔顿以下。色谱检测结果见图1和2。
图1和2各峰数据分别见表1和2。
表1  图1人胰岛素检测结果
Figure G95979781150141000D000111
表2  图2本发明的提取物检测结果
实施例2
取等量的水蛭(干品或鲜品)、地龙(干品或鲜品)，分别用生理盐水或注射用水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水或注射用水洗净，置于2-4倍的生理盐水或注射用水中于低温0-4℃浸渍24小时，过滤，滤液和药渣分别存放备用。
将药渣用组织捣碎机捣碎，再用胶体磨与上述滤液混合匀浆，磨成直径小于0.5微米的匀浆液，将匀浆液在零下15℃以下冷冻15-30小时后取出，于低温0-4℃条件下解融，再按上述条件反复冷冻解融至少2次。
将上述冻融液置于离心机离心分离，得到上清液，通过分子量50000道尔顿的超滤柱进行粗滤，滤液再通过分子量10000道尔顿的超滤柱过滤纯化，得到过滤液。
将过滤液用磷酸盐缓冲液调PH6.0-7.0，通过CM-交联葡聚糖阳离子交换柱，用5倍柱体积的缓冲液洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH6.0-7.0，通过DEAE-交联葡聚糖阴离子交换柱，用缓冲液冲洗，弃去洗脱液，最后用PH6.0-7.0的缓冲液加入0.2-0.5mol/L的氯化钠进行洗脱，收集洗脱液，再通过分子量6000道尔顿的超滤柱过滤，进行脱盐处理，得到提取液。分别制得水蛭提取液和地龙提取液，将所制得的两种提取液混合均匀后，得到水蛭地龙提取物。
如果需要，可以将上述得到的提取液脱水干燥成固体。
采用上述所述方法测定，上述提取液中含有多肽、氨基酸和次黄嘌呤成分。通过前述的高效液相液相色谱检测，上述提取物中未发现分子量大于5800道尔顿的物质，因而所得到的水蛭地龙提取物的分子量分布均在5800道尔顿以下。
实施例3
取等量的水蛭(干品或鲜品)、地龙(干品或鲜品)，分别用生理盐水或注射用水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水或注射用水洗净，置于2-4倍的生理盐水或注射用水中于低温0-4℃浸渍24小时，过滤，滤液和药渣分别存放备用。
将药渣用组织捣碎机捣碎，再用胶体磨与上述滤液混合匀浆，磨成直径小于0.5微米的匀浆液，将匀浆液在零下15℃以下冷冻15-30小时后取出，于低温0-4℃条件下解融，再按上述条件反复冷冻解融至少2次。
将上述冻融液置于离心机离心分离，得到上清液，通过分子量50000道尔顿的超滤柱进行粗滤，滤液再通过分子量10000道尔顿的超滤柱过滤纯化。
取通过分子量10000道尔顿超滤柱的滤液，再通过分子量6000道尔顿的超滤柱进一步纯化，滤液经105-136℃热压10-45分钟处理，再通过分子量6000道尔顿的超滤柱过滤，得到提取液。分别制得水蛭提取液和地龙提取液。
采用上述所述的质谱方法进行检测，结果水蛭提取物、地龙提取物中组分的分子量分布均在5800道尔顿以下。结果见图3和4。
将所制得的两种提取液混合均匀后，得到水蛭地龙提取物。加入4％的药用辅料甘露醇和0.5-1％的活性炭除热原，微孔滤膜过滤，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，制得冻干粉针。
实施例4
取水蛭药材原料(干品或鲜品)，用生理盐水或注射用水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水或注射用水洗净，置于2-4倍的生理盐水或注射用水中于低温0-4℃浸渍24小时，过滤，滤液和药渣分别存放备用。
将药渣用组织捣碎机捣碎，再用胶体磨与上述滤液混合匀浆，磨成直径小于0.5微米的匀浆液，将匀浆液在零下15℃以下冷冻15-30小时后取出，于低温0-4℃条件下解融，再按上述条件反复冷冻解融至少2次。
将上述冻融液置于离心机离心分离，得到上清液，通过分子量50000道尔顿的超滤柱进行粗滤，滤液再通过分子量10000道尔顿超滤柱过滤纯化。
取通过分子量10000道尔顿超滤柱的滤液，经105-136℃热压10-45分钟处理，再反复通过分子量6000道尔顿的超滤柱过滤2-3次，得到提取液。
将提取液中加入5.4％的β-环糊精，搅拌均匀，在45℃条件下浸泡30分钟，使包合充分，喷雾干燥，得干粉；
按干粉计算，加入二氧化硅1.5％、PVP 0.3％、羧甲基淀粉1％充分混匀，制粒，灌硬胶囊，每粒含生药1g。
实施例5
按实施例1的方法操作得到提取液。
将提取液中加入6.4％的淀粉，充分混匀，干燥，过筛得药用粉末。
在干燥粉末中加入0.1％的微粉硅胶、0.1％的硬脂酸镁，混合均匀，灌入胶囊，即得。
实施例6：对小鼠凝血时间的影响
取雄性20±2g的昆明种小鼠，按体重随机分为3组，每组16只，每组分别尾静脉注射生理盐水10ml/kg，ZL 03148281.3提取物2.5g/kg，本发明的提取物(实施例1)2.5g/kg，15分钟后眼眶取血，用毛细血管法测凝血时间，结果见表3。
表3  对小鼠凝血时间的影响(X±s)
Figure G95979781150141000D000141
Figure G95979781150141000D000151
注：*与生理盐水组比较P＜0.01；#与ZL03148281.3提取物比较P＞0.05。
结果如表3所示：ZL 03148281.3提取物可明显延长小鼠凝血时间(与生理盐水组比较，Q值为5.9637，P＜0.01)，本发明的提取物亦可明显延长小鼠凝血时间(与生理盐水组比较，Q值为6.4456，P＜0.01)，说明两种提取物均可使凝血时间显著延长。两种提取物之间差异不显著(Q值为0.4819，P＞0.05)。
实施例7：对大鼠血小板和血小板粘附率的影响
1.对血小板的影响
取220-270g雄性大鼠30只，随机分成3组，尾静脉注射生理盐水5.0ml/kg，本发明的提取物1.0g/kg，ZL03148281.3提取物1.0g/kg，15分钟后眼眶取血，在八项血球计数仪上测血小板，结果见表4。
2.对血小板粘附率的影响
取220-270g雄性大鼠30只，随机分成3组，尾静脉注射生理盐水5.0ml/kg，本发明的提取物1.0g/kg，ZL03148281.3提取物1.0g/kg，15分钟后眼眶取血，在八项血球计数仪上测血小板，作为粘附前血小板数。取血1.5ml，放入装有0.3ml 3.8％的枸椽酸钠溶液中的试管中，混匀，从该试管中取血1ml放入一硅管环中，装到体外血栓形成-血小板粘附仪中，在37℃下以17转/分的速度转5min，取血测血小板作为粘附后血小板数，计算血小板粘附率，结果见表4。血小板的计算方法如下：
粘附率(％)＝粘附前血小板数-粘附后血小板数/粘附前血中血小板数×100％
表4  对大鼠血小板数、血小板粘附率的影响(X±s)
Figure G95979781150141000D000152
Figure G95979781150141000D000161
注：*与生理盐水组比较P＜0.05，**P＜0.01；#与ZL03148281.3提取物比较P＞0.05。
结果如表4所示：ZL 03148281.3提取物可明显降低正常大鼠血小板数(与生理盐水组比较，Q值为2.9260，P＜0.05)，本发明的提取物亦可明显降低正常大鼠血小板数(与生理盐水组比较，Q值为5.1399，P＜0.01)，说明两种提取物均可使正常大鼠血小板数降低。但两种提取物比较，在血小板数和血小板粘附率上，无显著性差异(Q值为2.2139，P＞0.05；t＝1.6066，P＝0.1186，P＞0.05)。说明本发明的提取物和ZL 03148281.3提取物给药后均有降低血小板数，降低血小板的粘附的作用，有利于降低血栓的形成。
实施例8：可见异物和不溶性微粒检测
另取水蛭(干品)、地龙(干品)等量，按照文献ZL 03148281.3所述方法，制成水蛭地龙提取物(下称ZL 03148281.3提取物)。
1、可见异物检测：按照中国药典(2005版)制剂通则注射剂项下规定，对本发明的提取物(实施例1)与ZL 03148281.3提取物中的可见异物进行检测，结果见表5。
表5  可见异物检测结果
  项目检品   灯检合格率   短小纤维
  本发明提取物   92.7％   3.9％
  ZL03148281.3提取物   63.7％   28.5％
试验结果表明，本发明的提取物与ZL 03148281.3提取物在可见异物方面，存在显著区别。本发明的提取物的灯检合格率和短小纤维显著优异于ZL 03148281.3提取物，因此本发明的提取物应用时更加安全。
2、不溶性微粒检测：按照中国药典(2005版)制剂通则注射剂项下规定，对本发明的提取物(实施例1)与ZL 03148281.3提取物中的不溶性微粒进行检测，结果见表6。
表6  不溶性微粒检测结果
  项目检品  10um以上微粒(平均值/支)  25um以上微粒(平均值/支)
  本发明提取物   196个/支   65个/支
  ZL03148281.3提取物   250个/支   110个/支
试验结果表明，本发明的提取物与ZL 03148281.3提取物在不溶性微粒方面，也存在显著区别。本发明的提取物不溶性微粒显著少于ZL 03148281.3提取物，因此本发明的提取物应用时更加安全。
上述的试验结果表明，本发明的提取物和ZL03148281.3提取物，药效试验比较结果表明，本发明的提取物与ZL 03148281.3提取物药效上无明显差异，甚至在有些指标上本发明提取物显示优于ZL 03148281.3提取物的结果。也就是说，本发明的提取物相对于现有的水蛭地龙提取物，在药物活性不被减弱的情况下，药物的安全性被显著地提高。
已经结合具体实施例对本发明作了描述。应当理解的是前面的描述和实施例仅仅为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。

Claims (23)

1.一种预防或治疗血栓性疾病的提取物，其以水蛭和地龙为原料经提取而制成的，其特征在于所述提取物的分子量5800道尔顿以下，并且是通过包含如下步骤的方法制备的：
(1)原料用注射用水或生理盐水洗净，低温浸渍，过滤，得到滤液和药渣；
(2)药渣破碎后，与步骤(1)的滤液混合，形成匀浆，将匀浆反复冷冻和解融，离心分离，取上清液；
(3)将步骤(2)所得上清液用截留分子量10000～100000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行超滤，得到透过液或滤液；
(4)将步骤(3)所得透过液或滤液，用截留分子量小于或等于6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤。
2.根据权利要求1所述的提取物，其中所述步骤(4)中，用截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤。
3.根据权利要求1所述的提取物，其中所述的步骤(4)中，反复用所述的超滤膜或超滤柱进行过滤。
4.根据权利要求1所述的提取物，其中所述的步骤(4)中，在过滤前进行热压处理。
5.根据权利要求4所述的提取物，其中所述的热压处理为滤液在温度105～136℃热压10～45分钟处理。
6.一种预防或治疗血栓性疾病的提取物，其以水蛭和地龙为原料经提取而制成的，其特征在于所述提取物的分子量5800道尔顿以下，并且是通过包含如下步骤的方法制备的：
(1)原料用注射用水或生理盐水洗净，破碎形成匀浆，经反复冷冻和解融，离心分离，取上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液用截留分子量10000～100000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行超滤，得到透过液或滤液；
(3)将步骤(2)所得透过液或滤液用离子交换柱层析处理；
(4)将步骤(3)所得洗脱液经脱盐处理后，用截留分子量小于或等于6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤；或者将步骤(3)所得洗脱液用截留分子量小于或等于6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤后，进行脱盐处理。
7.根据权利要求6所述的提取物，其中所述的步骤(4)中，用截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤。
8.根据权利要求6所述的提取物，其中所述的步骤(4)中，反复用所述的超滤膜或超滤柱进行过滤。
9.根据权利要求1-8任一项所述的提取物，其中含有多肽、氨基酸和次黄嘌呤成份。
10.根据权利要求1-8任一项所述的提取物，其中所述原料为水蛭和地龙的干品或鲜品。
11.根据权利要求1-8任一项所述的提取物，其中水蛭、地龙是分别提取或者混合在一起进行提取。
12.根据权利要求1-8任一项所述的提取物，其中所述提取物为提取液或脱水干燥后的固体。
13.一种制备权利要求1所述提取物的方法，其中包括：
(1)原料用注射用水或生理盐水洗净，低温浸渍，过滤，得到滤液和药渣；
(2)药渣破碎后，与步骤(1)的滤液混合，形成匀浆，将匀浆反复冷冻和解融，离心分离，取上清液；
(3)将步骤(2)所得上清液用截留分子量10000～100000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行超滤，得到透过液或滤液；
(4)将步骤(3)所得透过液或滤液，用截留分子量小于或等于6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的步骤(4)中，用截留分子量6000道尔顿的超滤膜或超滤柱进行过滤。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述的步骤(4)中，反复用所述的超滤膜或超滤柱进行过滤。
16.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述的步骤(4)中，在过滤前进行热压处理。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的热压处理为滤液在温度105～136℃热压10～45分钟处理。
18.包含权利要求1-12任一项所述的提取物作为活性成分的药物组合物。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其为片剂、胶囊剂、颗粒剂、膜剂、贴剂、贴片、栓剂、丸剂、散剂、软膏剂、合剂、糖浆剂、酊剂、眼用制剂、鼻用制剂、注射液、注射用无菌粉末或注射用浓溶液。
20.根据权利要求18所述的药物组合物，其为口服液。
21.根据权利要求18所述的药物组合物，其为缓释制剂或控释制剂。
22.权利要求1-12任一项所述的提取物或权利要求18-21任一项所述的药物组合物在制备预防或治疗血栓性疾病的药物中的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述的血栓性疾病选自由血栓引起或者导致血栓形成的高脂血症、动脉粥样硬化、心肌梗死、心绞痛、动脉硬化性脑梗死、脑栓塞、静脉血栓形成、肺栓塞、肺梗死、血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症、弥散性血管内凝血、外科手术并发症血栓形成和血栓栓塞、肝梗死、肾脏梗死、胆囊梗死、肠系膜梗死、肢体坏疽、糖尿病外周神经病变、视网膜血管阻塞、突发性聋。
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