CN108371666B - 炮天雄精制多糖在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种炮天雄精制多糖在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用。本发明公开了一种炮天雄精制多糖的制备方法，通过对炮天雄多糖进行提取纯化，经提取和纯化后其收得率为0.5％～5％，进而采用GC‑MS分析其单糖组成以及测定单糖含量，并结合药理实验对炮天雄精制多糖在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用，特别是在制备治疗腺嘌呤致慢性肾衰竭药物中的应用进行研究，研究结果显示本发明所制备的炮天雄精制多糖对慢性肾功能衰竭具有明显的改善作用，可用于制备治疗慢性肾功能衰竭药物。

Description

炮天雄精制多糖在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用

技术领域

本发明属于药物学和制剂学领域，具体涉及炮天雄精制多糖在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用。

背景技术

慢性肾功能衰竭(ChronicRenalFailure，CRF)，又称慢性肾功能不全，是由多种慢性肾脏疾病或累及肾脏的全身性疾病引起的慢性进行性肾实质损害，致慢性肾功能减退，肾脏不能维持其排泄代谢废物、调节水盐和酸碱平衡、分泌和调节各种激素代谢等基本功能，从而出现氮质血症、代谢紊乱和各系统受累等一系列临床症状的综合征。根据病情分为以下四个阶段：肾功能代偿期、肾功能失代偿期、肾衰竭期(尿毒症前期)、尿毒症期。慢性肾衰的发病率与患病率呈逐年上升的趋势。

炮天雄为中药附子的一种炮制品，附子为毛茛科植物乌头(AconitumCarmichaeli Dexb)子根的加工品，主要用于亡阳虚脱、肢冷脉微、阳萎、宫冷、心腹冷痛、虚寒吐泻、阴寒水肿等。附子中主要化学成分有生物碱、多糖、苷类等，国内外对附子的研究主要集中在生物碱类成分，对附子中的多糖的研究则较少。多糖是一类天然具有多种生理活性的高分子化合物，现有研究表明，附子多糖具有较强的生理活性，且无明显毒性，有调节免疫、抗肿瘤、保护心肌细胞、降血脂等作用。

本发明的目的是提供一种炮天雄精制多糖的制备方法，通过对炮天雄多糖进行提取纯化，进而采用GC-MS分析其单糖组成以及测定单糖含量，并结合药理实验对炮天雄精制多糖在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用，特别是在制备治疗腺嘌呤致慢性肾衰竭药物中的应用进行研究。

发明内容

一种炮天雄精制多糖在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用。

一种炮天雄精制多糖，所述的多糖在制备治疗腺嘌呤致慢性肾衰竭药物中的应用。

进一步，所述的炮天雄精制多糖包含单糖有甘露糖、D-葡萄糖醛酸、鼠李糖、D-(+)-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖、木糖、L-阿拉伯糖。

进一步，所述的炮天雄精制多糖，其特征在于，所述的多糖所含的单糖组成GC-MS分析条件为：

HP-5MS毛细管色谱柱(30m×250μm×0.25μm)，进样口温度280℃，载气为氦气，流速1ml/min，离子源温度230℃；升温程序：起始温度为60℃，以10℃/min升至120℃，以20℃/min升至220℃，以10℃/min升至280℃；分流进样；分流比5:1，进样量为1.0μl，溶剂延迟2.90min，扫描范围35～550amu。

进一步，所述的炮天雄精制多糖中单糖的组成分析：

样品柱前衍生化：样品溶液置于离心管中，一次加入PMP甲醇溶液和氢氧化钠溶液，混匀，70℃水浴加热反应30min，取出，冷却至室温，加入盐酸溶液中和，混匀后再加三氯甲烷涡旋混合，静置10min，弃去下沉有机相，如此重复3次，离心，备用；

单糖含量测定条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)-磷酸缓冲盐(pH为6.8)为流动相，按照0～30min，16％-18％(A)为梯度洗脱；检测波长250nm，柱温30℃，流速1ml/min。

进一步，所述的炮天雄精制多糖的提取和纯化方法为：

a.取炮天雄，打成小碎块，煎煮两次，过滤，合并两次滤液，浓缩；将上述水煎液放冷，缓缓加入95％乙醇，边加边快速搅拌，使溶液充分混匀，放置24小时，过滤，收集多糖沉淀，冷冻干燥，研末，备用；

b.将粉末用适量的水溶解，加1％α-淀粉酶，水浴处理，保温水解淀粉，直至淀粉水解完全，随后沸水浴加热，灭活淀粉酶；向上述提取液中加入0.1％的木瓜蛋白酶，在温度为40℃，PH为6.0的条件下酶解，接着将溶液PH调至弱碱性(7.0-8.5)，100℃沸水浴处理，使木瓜蛋白酶变性失活；

c.将上述提取液与sevage试剂(三氯甲烷-正丁醇＝4:1)体积比为4:1充分振摇30min后，经离心机离心，将水相和三氯甲烷相分开，将水相加入相当于其体积1/4的sevage溶液中，重复上述步骤，直至水层和三氯甲烷层之间不出现白色沉淀为止；

d.在待脱色多糖溶液中加入适量活性炭，煮沸，过滤除去活性炭，将上述溶液装入透析袋(分子截留量为3500KD)，以纯水透析一天，换水，再透析一天；将上述透析后的溶液冷冻干燥至全干，取出，研末，备用。

优选的，所述的炮天雄精制多糖的提取和纯化方法为：

a.取炮天雄500g，打成小碎块，第一次加10倍量水，煎煮1h，200目纱布过滤，第二次加8倍量水，煎煮1h，过滤，合并两次滤液，浓缩至生药含量为0.5g/ml；将上述水煎液放冷，将5.4倍体积的95％乙醇缓缓加入到提取液，使溶液含醇量达到80％，同时边加边快速搅拌，使溶液充分混匀，在4℃下放置24小时，过滤，收集多糖沉淀，冷冻干燥，研末，备用；

b.将粉末用适量的水溶解，加1％α-淀粉酶，在60℃水浴条件下处理3小时，保温水解淀粉，直至提取液遇碘水不变蓝，即淀粉水解完全，随后沸水浴加热5min，灭活淀粉酶；向上述提取液中加入0.1％木瓜蛋白酶，在温度为40℃，PH为6.0的条件下酶解2h，接着将溶液PH调至弱碱性(7.0-8.5)，100℃沸水浴处理1h，使木瓜蛋白酶变性失活；

c.将上述提取液与sevage试剂(三氯甲烷-正丁醇＝4:1)体积比为4:1充分振摇30min后，经离心机离心，将水相和三氯甲烷相分开，将水相加入相当于其体积1/4的sevage溶液中，重复上述步骤，直至水层和三氯甲烷层之间不出现白色沉淀为止；

d.在待脱色多糖溶液中加入适量活性炭，煮沸20min，过滤除去活性炭。将上述溶液装入透析袋(分子截留量为3500KD)，以纯水透析一天，换水，再透析一天；将上述透析后的溶液冷冻干燥至全干，取出，研末，备用。

进一步，所述的炮天雄精制多糖经提取和纯化后其收得率为0.5％～5％。

与现有技术相比，本发明有益效果：本发明所提供的炮天雄精制多糖的制备分析方法，通过对炮天雄中多糖的提取和纯化能够得到精制多糖并通过GC-MS对其单糖组成进行分析以及测定单糖含量，进一步对精制多糖的慢性肾功能衰竭的药理作用进行研究，研究结果表明本发明所制备的炮天雄精制多糖对慢性肾功能衰竭具有明显的改善作用，特别是对腺嘌呤所致慢性肾功能衰竭作用明显，可用于制备治疗慢性肾功能衰竭药物。

附图说明

图1是肾脏HE染色病理切片结果(A.空白组、B.模型组、C.金匮肾气丸组、D.炮天雄多糖低剂量组、E.炮天雄多糖中剂量组、F.炮天雄多糖高剂量组)

图2是脾脏HE染色病理切片结果(A.空白组、B.模型组、C.金匮肾气丸组、D.炮天雄多糖低剂量组、E.炮天雄多糖中剂量组、F.炮天雄多糖高剂量组)

图3是睾丸HE染色病理切片结果(A.空白组、B.模型组、C.金匮肾气丸组、D.炮天雄多糖低剂量组、E.炮天雄多糖中剂量组、F.炮天雄多糖高剂量组)

图4是附睾HE染色病理切片结果(A.空白组、B.模型组、C.金匮肾气丸组、D.炮天雄多糖低剂量组、E.炮天雄多糖中剂量组、F.炮天雄多糖高剂量组)

图5是混合对照品色谱图(1.PMP试剂峰、2.甘露糖、3.D-葡萄糖醛酸、4.鼠李糖、5.D-(+)-半乳糖醛酸、6.葡萄糖、7.D-半乳糖、8.木糖、9.L-阿拉伯糖)

图6是炮天雄精制多糖色谱图(1.PMP试剂峰、2.甘露糖、3.D-葡萄糖醛酸、4.鼠李糖、5.D-(+)-半乳糖醛酸、6.葡萄糖、7.D-半乳糖、8.木糖、9.L-阿拉伯糖)

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明所述的发明内容作进一步详细说明，但不应理解为本发明所要求保护的范围仅限定于以下所述的实施例中，本发明所要求保护的范围以权利要求所述的内容为准。

实施例1炮天雄精制多糖的提取和纯化

a.取炮天雄500g，打成小碎块，第一次加10倍量水，煎煮1h，200目纱布过滤，第二次加8倍量水，煎煮1h，过滤，合并两次滤液，浓缩至生药含量为0.5g/ml；将上述水煎液放冷，将5.4倍体积的95％乙醇缓缓加入到提取液，使溶液含醇量达到80％，同时边加边快速搅拌，使溶液充分混匀，在4℃下放置24小时，过滤，收集多糖沉淀，冷冻干燥，研末，备用；

b.将粉末用适量的水溶解，加1％α-淀粉酶，在60℃水浴条件下处理3小时，保温水解淀粉，直至提取液遇碘水不变蓝，即淀粉水解完全，随后沸水浴加热5min，灭活淀粉酶；向上述提取液中加入0.1％木瓜蛋白酶，在温度为40℃，PH为6.0的条件下酶解2h，接着将溶液PH调至弱碱性(7.0-8.5)，100℃沸水浴处理1h，使木瓜蛋白酶变性失活；

c.将上述提取液与sevage试剂(三氯甲烷-正丁醇＝4:1)体积比为4:1充分振摇30min后，经离心机离心，将水相和三氯甲烷相分开，将水相加入相当于其体积1/4的sevage溶液中，重复上述步骤，直至水层和三氯甲烷层之间不出现白色沉淀为止；

d.在待脱色多糖溶液中加入适量活性炭，煮沸20min，过滤除去活性炭。将上述溶液装入透析袋(分子截留量为3500KD)，以纯水透析一天，换水，再透析一天；将上述透析后的溶液冷冻干燥至全干，取出，研末，备用。

炮天雄精制多糖经提取和纯化后其收得率为2.00％。

实施例2炮天雄精制多糖的含量测定

样品溶液制备：取精制多糖20mg，精密称定，置10ml具塞试管中，加入2mol/L的硫酸溶液2ml，混匀，在110℃烘箱中水解6h，用8mol/L氢氧化钠中和至pH约为7，用水稀释至5ml，离心，收集上清液，即得。

对照品溶液配制：分别称取鼠李糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、D-(+)-半乳糖醛酸对照品适量，精密称定，用水溶解，配制成浓度分别为1.04mg/ml、1.10mg/ml、1.54mg/ml、1.14mg/ml、1.59mg/ml、0.98mg/ml、1.01mg/ml、1.50mg/ml的对照品溶液，将上述单个对照品溶液各取100μl定容至1ml，即为对照品溶液。

样品溶液衍生化产物制备：取单个对照品溶液、混合对照品溶液和供试品溶液各200μl，分别置于5ml离心管中，一次加入0.5mol/l的PMP甲醇溶液200μl和0.3mol/l的氢氧化钠溶液200μl，混匀，70℃水浴加热反应30min，取出，冷却至室温，加入0.3mol/l的盐酸溶液200μl中和。混匀后再加1ml三氯甲烷涡旋混合，静置10min，弃去下沉有机相，如此重复3次，16000r/min，离心10min，备用。空白对照除不加样品外其余步骤按照上述方式进行。将样品溶液浓度稀释10倍。

液相条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)-磷酸缓冲盐(pH为6.8)为流动相，按照0～30min，16％-18％(A)为梯度洗脱；检测波长250nm，柱温30℃，流速1ml/min。

结果：样品采用外标一点法进行计算，计算结果见表1。

表1炮天雄精制多糖各单糖含量测定(单位：％)

由上述结果可知，炮天雄精制多糖中含有甘露糖、D-葡萄糖醛酸、鼠李糖、D-(+)-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖、木糖、L-阿拉伯糖等单糖，其中葡萄糖所占的比例最大，其含量所占比例大小顺序为：葡萄糖>鼠李糖>L-阿拉伯糖>甘露糖≈D-半乳糖>D-(+)-半乳糖醛酸>D-葡萄糖醛酸>木糖。

实施例3炮天雄精制多糖GC-MS分析

1.炮天雄精制多糖和单糖标准品乙酰化

取炮天雄精制多糖10mg，溶于2ml 2mol/L三氟乙酸(TFA)溶液中，封口，置于110℃烘箱中水解4h，将多糖酸水解为单糖。55℃减压除去TFA，加入甲醇1ml，减压蒸干，反复三次，除去三氟乙酸。标准品单糖各取5mg，在精制多糖水解产物和标准品单糖中加入10mg盐酸羟胺和0.5ml吡啶，封口，90℃水浴30min，随时振荡，冷却后加入1ml乙酸酐，封口，90℃水浴30min，冷却后，70℃水浴减压蒸干，残渣加入2ml三氯甲烷溶解，过0.22μm微孔滤膜，备用。

2.GC-MS分析条件

HP-5MS毛细管色谱柱(30m×250μm×0.25μm)，进样口温度280℃，载气为氦气，流速1ml/min，离子源温度230℃；升温程序：起始温度为60℃，以10℃/min升至120℃，以20℃/min升至220℃，以10℃/min升至280℃；分流进样；分流比5:1；进样量为1.0μl；溶剂延迟2.90分钟；扫描范围35～550amu。

3.炮天雄精制多糖单糖组成分析方法

对比标准单糖的TFA衍生化产物的GC-MS总离子流图、炮天雄多糖酸解产物TFA衍生化产物的总离子流图，根据总离子流峰的保留时间和质谱，确定炮天雄多糖的单糖组成。

表2各标准品GC-MS分析结果

表3炮天雄精制多糖GC-MS分析可能含有单糖

注：匹配度大于75

由上述实验结果可知，炮天雄精制多糖中除了含有HPLC测定的甘露糖、D-葡萄糖醛酸、鼠李糖、D-(+)-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖、木糖、L-阿拉伯糖的单糖外，可能还含有太洛糖、乳糖、纤维二糖、蜜二糖和海藻糖等单糖。

实施例4炮天雄精制多糖治疗慢性肾衰竭作用研究

1实验材料

实验药物：炮天雄，由四川好医生攀西药业有限责任公司提供；

炮天雄精制多糖：按照实施例1所述的方法制备所得，以下实验中所述的炮天雄多糖即为炮天雄精制多糖；

实验动物：SPF级KM小鼠，雄性，体重30-35g，购买于成都达硕实验动物有限公司，合格证号SCXK(川)2015-030。

2动物给药剂量的设计及制备

(1)炮天雄：《四川省中药饮片炮制规范(2015年版)》规定炮天雄的用量是3～15g。按照成人日服最大用量15g、成人体重50kg计算，成人一日最大剂量是0.3g生药/kg。

小鼠与人的等效剂量换算为约10倍，则用量为3g生药/kg，将其作为低剂量，将其2倍(即6g生药/kg)作为中剂量，将其4倍(即12g生药/kg)作为高剂量。

(2)炮天雄精制多糖给药剂量：按照高剂量12g生药/kg进行计算，小鼠给药量为0.4ml/20g，精制多糖提取率为2％，精制多糖给药量为0.24g/kg，适当增加灌胃量，给药量增加至0.5g/kg，精制多糖给药浓度为0.025g/ml。

(3)阳性药物(金匮肾气丸)剂量：人用剂量1次4～5g(20～25粒)，一日2次，按一日最大10g、成人体重50kg计算，则一日最大剂量为0.2g/kg。将其剂量的10倍作为小鼠给药剂量，即2g/kg。取丸剂10g，加生理盐水适量研磨成混悬液，加水定容至100ml，即为0.1g/ml的药液，备用。

(4)小鼠腺嘌呤灌胃剂量：根据前期预实验，确定小鼠腺嘌呤致慢性肾衰竭的剂量为0.2115mg/g，即211.5mg/kg/d。小鼠灌胃0.4ml/20g，配制浓度为10.575mg/ml的腺嘌呤。

3动物造模、分组

取体重为30～35g的SPF级KM小鼠88只，适应性喂养3天后，随机分为正常组13只和造模组75只，正常组每天灌胃等体积生理盐水，其余小鼠每天灌胃腺嘌呤0.2115mg/g，每天1次，连续灌胃7天。各造模小鼠已经表现出体形消瘦、蜷缩拱背、畏寒肢冷、体毛疏松发黄、无光泽、精神萎靡、反应迟钝、多饮食少、多尿等慢性肾衰竭症状。将造模成功的小鼠随机分组从第8天起，除正常组、模型组灌胃等体积生理盐水外，炮天雄多糖低剂量组(给药剂量为0.125g/kg)、炮天雄多糖中剂量组(0.25g/kg)、炮天雄多糖高剂量组(0.5g/kg)和金匮肾气丸组(2g/kg)灌胃相应体积药液，连续灌胃给药7天。在造模过程中小鼠死亡5只，在给药过程中炮天雄多糖组死亡1只。

4结果

4.1一般状态观察

实验前小鼠活动正常，皮毛滑顺，有光泽，反应灵敏，正常饮水饮食。造模一周后小鼠出现了皮毛疏松无光泽，活动减少，体形消瘦，蜷缩拱背，畏寒肢冷，喜欢扎堆，嗜睡，外阴部潮湿，精神萎靡，反应迟钝，饮水量增加，饮食量减少，尿量增多的情况。治疗期间，各炮天雄多糖组和金匮肾气丸组小鼠畏寒蜷缩现象稍好转，自主活动稍有增加，体重稍有增加，小鼠的慢性肾功能衰竭症状逐渐减轻，有一定的改善作用。空白对照组小鼠状态一直良好，其自主活动次数和体重变化情况见表4、表5。

表4炮天雄精制多糖治疗慢性肾衰竭小鼠自主活动次数

注：模型对照组与空白对照组比较，*P<0.05。

表5炮天雄精制多糖治疗慢性肾衰竭小鼠体重变化

注：模型对照组与空白对照组比较，**P<0.01。

4.2对脏器指数的影响

脏器指数是脏器与体重的百分比，能反映造模对动物脏器的影响，结果见表6。

表6炮天雄精制多糖治疗慢性肾衰竭小鼠脏器指数

注：(1)模型对照组与空白对照组比较，**P<0.01；

(2)各给药组与模型对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。

由上述表格可知，脏器指数是脏器与体重的百分比，能反映造模对动物脏器的影响。与空白对照组比较，模型对照组肾、睾丸、精囊腺脏器指数有极显著差异(P<0.01)，证明造模后导致小鼠肾肿胀和精囊腺萎缩，而脾和附睾没有显著性差异，但有萎缩的趋势。与模型对照组比较，炮天雄精制多糖高剂量组的肾、附睾脏器指数有显著性差异(P<0.05)，精囊腺脏器指数有极显著性差异(P<0.01)，说明炮天雄精制多糖对肾肿胀和精囊腺萎缩有一定的改善作用，脾和睾丸虽无显著性差异，但有改善的趋势。与模型对照组比较，金匮肾气丸组脾和附睾的脏器指数有显著性差异(P<0.05)，说明对其有改善作用，肾、睾丸、精囊腺等脏器指数虽无显著性差异，但是均有改善的趋势。由此说明，炮天雄精制多糖和金匮肾气丸对腺嘌呤致肾阳虚模型小鼠有改善作用。

4.3小鼠血清中BUN和Cr含量水平

慢性肾衰竭(CRF)是指各种原因造成慢性进行性肾实质损害，致使肾脏明显萎缩，不能维持基本功能，临床出现以代谢产物潴留，水、电解质、酸碱平衡失调，全身各系统受累为主要表现的临床综合征。慢性肾衰竭患者血清中尿素氮和肌酐会迅速上升，逐渐导致肾功能衰竭。灌胃腺嘌呤致慢性肾衰竭小鼠的血清中BUN和Cr升高，其结果见表7。

表7炮天雄精制多糖治疗慢性肾衰竭小鼠血清BUN和Cr含量水平

注：(1)模型对照组与空白对照组比较，**P<0.01；

(2)各给药组与模型对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。

结果表明，与空白组比较，模型组小鼠血清中BUN和Cr含量明显上升，其具有极显著性差异(P<0.01)；与模型组比较，炮天雄多糖高剂量组小鼠血清中BUN和Cr含量明显降低，其分别具有显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)，而炮天雄多糖中剂量组BUN和Cr均有降低趋势，但无显著性差异，炮天雄多糖低剂量组趋势不明显；与模型组比较，金匮肾气丸组小鼠小鼠血清中BUN有降低的趋势，Cr降低很明显，其具有极显著性差异(P<0.01)。由此可知，炮天雄多糖和金匮肾气丸具有改善慢性肾衰竭模型小鼠血清BUN和Cr的作用，对慢性肾衰竭具有明显治疗作用。

4.4对肾脏外观形态的影响

灌胃腺嘌呤导致小鼠肾脏形态发生改变，对肾造成实质性损伤，形成“大白肾”，导致形成慢性肾功能衰竭，给药炮天雄精制多糖，特别是高剂量组后，肾脏颜色有所改善。

4.5 HE染色病理切片结果

通过对各脏器进行HE染色病理切片，在光镜下观察，其结果见图1～图4。通过HE染色病例切片观察可知，与空白组比较，模型组小鼠肾组织，发现肾小球坏死、间质内大量纤维组织增生及炎细胞浸润、肾小管坏死、脓细胞渗出，脾红髓内中性粒细胞浸润，睾丸中生精细胞变性或坏死脱落，附睾内精子数量明显减少；而金匮肾气丸治疗后，小鼠的中肾脏、脾脏、睾丸、附睾均恢复正常水平；经过炮天雄多糖给药后，肾脏由低剂量组的肾小球坏死至中剂量组的病变减轻至高剂量组的病变逐渐恢复，脾脏由低剂量组至高剂量组其脾红髓内中性粒细胞浸润现象减轻至恢复正常水平，睾丸由低剂量组至高剂量组其神经细胞脱落或坏死现象减轻至物脱落坏死现象，附睾由低剂量组至高剂量组其精细胞数量由减少到逐步增减。因此，说明炮天雄多糖对小鼠肾衰竭病变所导致的各脏器的病理变化有所改善和恢复作用。

实验例1

为了验证本发明的方法的可行性和准确性，作了如下的方法学验证试验：

1仪器与材料

1.1仪器

RJ-TGL-16C型高速离心机(无锡瑞江分析仪器有限公司)；UPH-I-10T优普超纯水器(成都超纯科技有限公司)；DZF-6051真空干燥箱(上海将任实验设备有限公司)；PS-80超声波清洗机(深圳市洁康洗净电器有限公司)；FA1204C电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；HHS-8S电子恒温不锈钢水浴锅(上海宜昌仪器纱筛长)；SHZ-D(III)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；RE2000B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；BS200S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；YP30002电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱(上海将任实验设备有限公司)；ZDHW调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)；SCIENTZ-10N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Agilent1260高效液相色谱仪：包括G1311C(四元泵)、G1329B(自动控温自动进样器)、G1316A(柱温箱)、G4212B(DAD检测器)、Agilent OpenLAB Chemstation工作站；Agilent ZORBAX SB-Aq-C18(4.6mm*250mm，5μm)。

1.2材料与试剂

样品：炮天雄由四川好医生攀西药业有限责任公司提供；

对照品：鼠李糖(批号：160811)、木糖(批号：161121)、L-阿拉伯糖(批号：160218)、甘露糖(批号：17042605)、葡萄糖(批号：17042604)、D-半乳糖(批号：17042706)，均购买于成都普菲德生物技术有限公司；

2方法学实验

2.1系统适应性考察

选择了不同洗脱条件，调整不同流动相比例，同时考察了不同流速对样品出峰的影响，最后确定最佳条件为“液相条件”所示。

2.2精密度考察

取实施例2中混合对照品溶液，连续进样6次，结果甘露糖、D-葡萄糖醛酸、鼠李糖、D-(+)-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖、木糖、L-阿拉伯糖色谱峰保留时间相对标准偏差值分别为1.52％、1.74％、0.11％、0.24％、0.20％、0.19％、0.18％、0.20％，其峰面积的相对标准偏差值分别为2.88％、0.50％、1.47％、0.28％、1.92％、1.01％、0.61％、0.20％，其值均小于3％，即RSD％＜3％，表明仪器精密度较高，实验设备较好。

2.3线性关系考察

分别精密量取混合对照品溶液2、6、8、10、15μl，注入高效液相色谱仪，按照实施例2所述的液相条件进行检测，以峰面积(y)对进样量(x,μg)进行回归，其回归方程和线性范围如下表所示：

表8单糖及醛酸的线性范围

2.4稳定性考察

取同一供试品溶液，分别在0h、2h、6h、8h、12h、24h不同时间点进行检测，结果各时间点检测甘露糖、D-葡萄糖醛酸、鼠李糖、D-(+)-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖、木糖、L-阿拉伯糖保留时间相对标准偏差分为0.16％、1.47％、1.75％、1.42％、1.23％、1.24％、1.20％、1.22％，其峰面积的相对标准偏差值分别为1.22％、2.13％、0.98％、1.37％、1.11％、1.76％、2.26％、1.55％，其值均小于3％，即RSD％＜3％，说明供试品溶液在24h内稳定。

2.5重复性实验

按照供试品溶液的制备方法，平行制得6份供试品，同时按照实施例2所述的液相条件进行检测，记录峰面积，计算甘露糖、D-葡萄糖醛酸、鼠李糖、D-(+)-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖、木糖、L-阿拉伯糖的含量。

结果各单糖含量相对标准偏差值分别为3.45％、4.65％、3.08％、4.94％、2.28％、2.68％、3.43％、4.17％，其值均小于5％，即RSD％＜5％，表明此方法重复性良好。

2.6专属性考察

分别取供试品溶液、混合对照品溶液、空白对照溶液各20μl，按照实施例2所述的液相条件进行检测，色谱图见图5、图6。由图谱可知，供试品溶液色谱中对照品溶液色谱在相同保留时间有对应峰，证明专属性较强。

Claims (4)

1.一种炮天雄精制多糖在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用，所述的多糖经过提取和纯化后其收得率为0.5%~5%；

所述的多糖包含单糖有甘露糖、D-葡萄糖醛酸、鼠李糖、D-(+)-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-半乳糖、木糖、L-阿拉伯糖、太洛糖、乳糖、纤维二糖、蜜二糖和海藻糖；

所述的多糖的提取和纯化方法为：

a.取炮天雄，打成小碎块，煎煮两次，过滤，合并两次滤液，浓缩；将上述水煎液放冷，缓缓加入95％乙醇，边加边快速搅拌，使溶液充分混匀，放置24小时，过滤，收集多糖沉淀，冷冻干燥，研末，备用；

b.将粉末用适量的水溶解，加1％α-淀粉酶，水浴处理，保温水解淀粉，直至淀粉水解完全，随后沸水浴加热，灭活淀粉酶；向上述提取液中加入0.1％的木瓜蛋白酶，在温度为40℃，PH为6.0的条件下酶解，接着将溶液PH调至7.0-8.5弱碱性，100℃沸水浴处理，使木瓜蛋白酶变性失活；

c.将上述提取液与三氯甲烷：正丁醇＝4:1形成的sevage试剂体积比为4:1充分振摇30min后，经离心机离心，将水相和三氯甲烷相分开，将水相加入相当于其体积1/4的sevage溶液中，重复上述步骤，直至水层和三氯甲烷层之间不出现白色沉淀为止；

d.在待脱色多糖溶液中加入适量活性炭，煮沸，过滤除去活性炭，将上述溶液装入透析袋，其分子截留量为3500KD，以纯水透析一天，换水，再透析一天；将上述透析后的溶液冷冻干燥至全干，取出，研末，备用。

2.根据权利要求1所述的一种炮天雄精制多糖在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用，其特征在于，所述的多糖所含的单糖组成GC-MS分析条件为：

HP-5MS毛细管色谱柱：30m×250μm×0.25μm，进样口温度为280℃，载气为氦气，流速1ml/min，离子源温度为230℃；升温程序：起始温度为60℃，以10℃/min升至120℃，以20℃/min升至220℃，以10℃/min升至280℃；分流进样；分流比5:1，进样量为1.0μl，溶剂延迟2.90min，扫描范围35～550amu。

3.根据权利要求1所述的一种炮天雄精制多糖在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用，其特征在于，所述的多糖中单糖的组成分析：

样品柱前衍生化：样品溶液置于离心管中，一次加入PMP甲醇溶液和氢氧化钠溶液，混匀，70℃水浴加热反应30min，取出，冷却至室温，加入盐酸溶液中和，混匀后再加氯仿涡旋混合，静置10min，弃去下沉有机相，如此重复3次，离心，备用；

单糖含量测定条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)-磷酸缓冲盐为流动相，其中磷酸缓冲盐的pH为6.8，按照0～30min，16％-18％(A)为梯度洗脱；检测波长250nm，柱温30℃，流速1ml/min。

4.根据权利要求1所述的一种炮天雄精制多糖在制备治疗慢性肾功能衰竭药物中的应用，其特征在于，所述的多糖的提取和纯化方法为：

a.取炮天雄，打成小碎块，第一次加10倍量水，煎煮1h，200目纱布过滤，第二次加8倍量水，煎煮1h，过滤，合并两次滤液，浓缩至生药含量为0.5g/ml；将上述水煎液放冷，将5.4倍体积的95％乙醇缓缓加入到提取液，使溶液含醇量达到80％，同时边加边快速搅拌，使溶液充分混匀，在4℃下放置24小时，过滤，收集多糖沉淀，冷冻干燥，研末，备用；

b.将粉末用适量的水溶解，加1％α-淀粉酶，在60℃水浴条件下处理3小时，保温水解淀粉，直至提取液遇碘水不变蓝，即淀粉水解完全，随后沸水浴加热5min，灭活淀粉酶；向上述提取液中加入0.1％木瓜蛋白酶，在温度为40℃，PH为6.0的条件下酶解2h，接着将溶液PH调至7.0-8.5，100℃沸水浴处理1h，使木瓜蛋白酶变性失活；

c.将上述提取液与三氯甲烷：正丁醇＝4:1形成的sevage试剂体积比为4:1充分振摇30min后，经离心机离心，将水相和三氯甲烷相分开，将水相加入相当于其体积1/4的sevage溶液中，重复上述步骤，直至水层和三氯甲烷层之间不出现白色沉淀为止；

d.在待脱色多糖溶液中加入适量活性炭，煮沸20min，过滤除去活性炭，将上述溶液装入透析袋，其分子截留量为3500KD，以纯水透析一天，换水，再透析一天；将上述透析后的溶液冷冻干燥至全干，取出，研末，备用。