CN112098569B

CN112098569B - 一种威灵仙提取物的制备方法及其质量测定方法

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Publication number: CN112098569B
Application number: CN201910521683.8A
Authority: CN
Inventors: 孙宜春; 朱鹤; 李慧馨; 胡晓; 娄涛涛; 谢隼; 安跃; 张建锋; 潘雄; 张锋; 张甘纯; 漆正方; 黄春跃; 欧阳丹薇
Original assignee: Guoyaojituan Tongjitang Guizhou Pharmaceutical Co ltd; Guangdong Yifang Pharmaceutical Co Ltd; Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guoyaojituan Tongjitang Guizhou Pharmaceutical Co ltd; Guangdong Yifang Pharmaceutical Co Ltd; Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-06-17
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2039-06-17
Also published as: CN112098569A

Abstract

本发明提供了一种威灵仙提取物的制备方法及其质量测定方法，制备方法为将威灵仙饮片加水煎煮1～3次，合并滤液，滤液水浴冷却后浓缩；滤液减压浓缩至适量，置于进行冷冻干燥，即得威灵仙提取物。其质量测定方法为特征峰图谱的测定。本发明提供的一种威灵仙提取物的制备方法，有效提取出威灵仙中有效成分，其制备工艺稳定，使得工艺标准化。通过威灵仙提取物进行对质量测定方法的研究，使得获得的威灵仙提取物的质量能稳定控制。

Description

一种威灵仙提取物的制备方法及其质量测定方法

技术领域

本发明属于中药制备技术领域，具体涉及一种威灵仙提取物的制备方法及其质量测定方法。

背景技术

威灵仙为毛莨科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck、棉团铁线莲Clematishexapetala Pall.或东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.的干燥根和根茎。性温、味辛、咸，具有祛风湿、通经络、止痛及消骨哽之功效，常用于治疗风寒湿痹、关节不利、四肢麻木、扁桃体炎及食道癌等疾病，临床上多用于抗炎镇痛，松弛平滑肌，抗肿瘤的治疗和对肢体麻木、免疫抑制及屈伸不利等症状的质量。但是目前制备的威灵仙饮品质量残差不齐，因没有国家统一的质量标准，也没有一致的行业标准，导致质量标准差异很大，有的有含量测定，有的无含量测定，含量测定的指标成分和含量测定的方法不尽相同，即使含量的指标成分和含量测定方法相同，但含量测定限度的表述不一致，有的按百分比计，有的以每克计，有的以每袋计，所测的指标绝对量更是不同的，这样难以界定含量测定的统一限度。

现有研究表明，东北铁线莲的化学成分主要为三萜皂苷类、甾醇类、木质素类和黄酮类等化合物，具有抗肿瘤、解痉与抗氧化、抗菌抑菌、抗炎镇痛、免疫抑制、抑制黑色素、利胆等药理作用。其中三萜皂苷类是最主要的化学成分，主要分为齐墩果酸型和常春藤型，即经水解后能够游离出齐墩果酸和常春藤皂苷元，毕丹等通过研究发现东北铁线莲药材中齐墩果酸大于0.30％，但常春藤皂苷元含量极微。钟方丽等采用高效液相色谱法测定了东北铁线莲中木犀草素的含量，结果显示含量均值为29.97μg/g，极低，不建议作为含量指标。张海丰等采用高效液相色谱法测定了东北铁线莲中白头翁素的含量，结果为0.123％。但经后期的LC-MS和对照品指认研究可知，并不含有白头翁素。史记等通过研究不同采收期的东北铁线莲中灵仙新苷的含量变化，结果显示灵仙新苷在东北铁线莲的生长周期中，含量较高，波动范围是1.28％-4.24％，但是灵仙新苷是该实验室自己提取的对照品，在市场上也没有成分确切的灵仙新苷对照品售卖，因此不适合作为含量测定指标。为严格控制威灵仙配方颗粒的质量，为威灵仙配方颗粒的生产工艺提供更全面的质量控制参数，对威灵仙提取物特征图谱的特征峰相对峰面积设定限量标准，是非常必要的。而目前尚未有对威灵仙提取物的特征图谱的测定。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种威灵仙提取物的制备方法及其质量测定方法。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种威灵仙提取物的制备方法，其包括将威灵仙饮片加水煎煮1～3次，合并滤液，滤液水浴冷却后浓缩；滤液减压浓缩至适量，置于进行冷冻干燥，即得威灵仙提取物。

优选地，加水量为使水浸过威灵仙饮片药面的2～5cm。

如上所述的制备方法，优选地，所述加水煎煮操作为：威灵仙饮片加入7～9倍水浸泡20～30min，每次加7～9倍量水煎煮20～30min，选择300目标准筛趁热过滤，合并每次滤液。

如上所述的制备方法，优选地，所述减压浓缩的温度为60～70℃，浓缩真空度-0.085～-0.09Mpa，至相对密度为1.035～1.054g/mL。

如上所述的制备方法，优选地，所述冷冻干燥包括：第一阶段-40℃，持续时间2h，第二阶段-60℃，持续时间2h；升华干燥温度为-40℃-25℃，时间为24h。

本发明的制备方法中采用低温浓缩和冷冻干燥，最大限度保留中药有效成分群，制成威灵仙提取物的冻干粉。

一种威灵仙提取物的质量测定方法，为特征峰图谱的测定，其包括以下步骤：

S1、制备威灵仙提取物的样品溶液；

S2、制备齐墩果酸对照品溶液；

S3、采用超高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图。

如上所述的特征峰图谱的测定中，优选地，所述威灵仙提取物样品溶液的制备为取威灵仙提取物样品约0.15g～0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理20～30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取过滤液即为威灵仙提取物样品液。

如上所述的特征峰图谱的测定中，优选地，所述特征峰图谱的测定的色谱柱为Waters ACQUITY HSS T3色谱柱，其柱长为150mm，内径2.1mm，粒径为1.8μm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B；进行梯度洗脱，柱温为30℃；流速为每分钟0.25mL；检测波长为205nm。

如上所述的特征峰图谱的测定中，优选地，所述梯度洗脱为：0～3min，0％流动相A；3～24min，0％→22％流动相A；24～28min，22％→28％流动相A；28～29min，28％→29％流动相A；29～31min，29％→33％流动相A；31～36min，33％→38％流动相A；36～37min，38％～40％流动相A；37～42min，40％→90％流动相A；42～48min，90％→90％流动相A；48～48.1min，90％→0％流动相A；48.1～52min，0％流动相A，其中，每个时间段中除流动相A外，剩余为流动相B，流动相A与流动相B之和为100％。

进一步地，获得的特征峰图谱中应有6个较为明显的共有峰，各峰的相对保留时间规定，规定范围，相对峰面积规定范围为：

本发明还提供齐墩果酸含量的测定方法，其包括样品溶液制备和齐墩果酸对照品，用液相色谱仪进行测定；所述液相色谱仪的条件为分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，以体积比为90:10的乙腈-水为流动相；检测波长为205nm。

如上所述的测定方法，优选地，所述样品溶液制备方法为取威灵仙提取物约0.5g，准确加入25mL按体积比为25:0.5的甲醇-浓盐酸混合溶液，称重，水浴回流30min-2h，待冷却至室温，称重，用所述甲醇-浓盐酸混合溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液；齐墩果酸对照品为含齐墩果酸1mg/mL的甲醇溶液。

如上所述的质量测定方法，优选地，所述液相色谱的流速为1.0mL/min,柱温为30℃。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种威灵仙提取物的制备方法，有效提取出威灵仙中有效成分，其制备工艺稳定，使得工艺标准化。通过威灵仙提取物进行对质量标准化测定方法的研究，使得获得的威灵仙提取物的质量能稳定控制。

附图说明

图1为实施例1中威灵仙提取物冻干曲线；

图2为实施例2中威灵仙提取物制备工艺流程图；

图3为不同提取溶剂的提取效率对比图；

图4为不同提取方式的提取效率对比图；

图5为不同提取时间的提取效率对比图；

图6为威灵仙标汤对照特征图谱。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

威灵仙饮片的制备：取威灵仙药材，除去杂质及非药用部位，快速淘洗至无泥沙，取出后，将带有水滴的威灵仙药材闷润至透，将变软的威灵仙整理成把状，置于铡刀下切成段状。将切好的段的威灵仙置于烘箱，65℃下烘至饮片变脆。关闭烘箱，打开箱门至温度到30℃，饮片过10目筛网后获得威灵仙饮片。

威灵仙提取物的制备方法：S1、取威灵仙饮片100g，称定，置砂锅中，一煎药液是加水量为浸过药面2～5cm，加入煎药壶煎煮，选择100目、200目、300目标准筛趁热过滤，滤液水浴冷却；药渣进行二煎，即药渣再加水，武火煮沸后，再文火煎煮，标准筛趁热过滤，合并两次滤液，滤液水浴冷却至65℃后浓缩；滤液减压浓缩至适量，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得威灵仙提取物。

经多次试验发现，第一次煎煮加9倍水量液面高度为3.5cm，浸泡30分钟后，已经完全浸透。第二次煎煮加7倍水后的液面高度为2.5cm。所以最终加水量确定为第一次煎煮9倍量水，浸泡30分钟，第二次煎煮7倍量水。威灵仙的化学成分有白头翁素等小环类化合物、内脂等易开环化合物以及酚类等易氧化化合物，这些化学成分不易高温久煮，优选一煎为30min，二煎为20min。过滤选择100目、200目、300目标准筛的滤布上均无残留物，滤速和澄清度无差异，所以认为所选的三个不同目数的滤布对固液分离没有影响。

优选地，浓缩采用旋转蒸发仪减压65℃浓缩(真空度：-0.085～-0.090MPa)至约140mL。浸膏粘稠度适中，流动性好，方便转移，含固量为11.19％。因此确定浓缩比例为1:1.4。

优选地，取上述威灵仙浓缩液，加水稀释至含固量约为4.0-6.0％，均匀分装至10mL西林瓶中，装量为1.5mL(高度约0.9cm)，放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，威灵仙浓缩液预冻温度及时间第二阶段预冻温度及时间，升华干燥温度为-40℃-0℃，解析干燥温度为0℃-25℃，各阶段冻干工艺参数如表1；获得的冻干曲线如图2所示。

表1冻干工艺参数

优选地，威灵仙浓缩液预冻第一阶段温度为-40℃，预冻时间为120分钟，第二阶段温度为-60℃，预冻时间为120分钟，升华干燥温度为-40℃～0℃，升华干燥时间为1077分钟，真空度为0.2mbar；解析干燥温度为0℃～25℃，解析干燥时间为390分钟，真空度为0.2mbar。最后，获得质地疏松的淡黄的絮状固体。

实施例2

威灵仙提取物制备工艺，按图2的工艺流程图进行：

(1)取威灵仙饮片100g，称定，置砂锅中，加入9倍水浸泡30min后，煎煮30min，选择300目标准筛趁热过滤，滤液水浴冷却；

(2)药渣再加7倍水，煎煮20min，300目标准筛趁热过滤，滤液水浴冷却；

(3)合并滤液65℃减压浓缩至密度1.03-1.05g/mL，取浓缩液测定收膏率。

浓缩液出膏率的计算公式：出膏率％＝浓缩液重量×浓缩液含固率/饮片量×100％。标汤浓缩液出膏率值即为提取物出膏率。结果如表2所示。其中，威灵仙浓缩液含固率测定方法：精密称取浓缩液10g，置已恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量，计算得到浓缩液含固率。

(4)冻干前，加水调节浓缩液的固含量至4.0-6.0％左右，后进行冷冻干燥，即得威灵仙提取物，提取物的收率见表3。其中，上述所用的威灵仙饮片的平行3份样选自201803(辽宁省抚顺市)，201804(辽宁省鞍山市)，201807(吉林省通化市)。标汤样品指标成分转移率计算方法:标汤样品中指标成分转移率(％)＝标汤冻干粉含量/饮片含量×标汤出膏率(％)。

表2

表3

上述结果表明威灵仙提取物的制备工艺稳定。

实施例3齐墩果酸含量测定分析方法的建立

(1)供试品溶液制备方法的优化

由于药典中威灵仙药材的前处理方法较为繁杂，而威灵仙提取物是经水煎煮后得到的冻干粉，成分较药材少，因此可以考虑简化前处理步骤。以下实验比对了药典前处理方法(前处理方法1)与本发明研制的前处理方法(前处理方法2)。

前处理方法1：取提取物(批号：BT201803-1)约4g，精密称定，置索氏提取器中，加乙酸乙酯适量，加热回流3小时，弃去乙酸乙酯液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒转移至锥形瓶中，精密加入稀乙醇50mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取过滤液25mL，置水浴上蒸干，残渣加2mol/L盐酸溶液30mL使溶解，加热回流2小时。立即冷却，移入分液漏斗中，用水10mL分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中。加乙酸乙酯振摇提取3次，每次15mL，合并乙酸乙酯液，70℃以下浓缩至近干，加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

前处理方法2：称取提取物(批号：BT201803-1)约0.5g于100mL圆底烧瓶，准确加入25mL甲醇-浓盐酸(体积比为25:0.5)混合溶液，称重，水浴回流2h，待冷却至室温，称重，用甲醇-浓盐酸(体积比为25:0.5)混合溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。

高效液相色谱法：以乙腈-水(体积比为90:10)为流动相；检测波长为205nm。理论板数按齐墩果酸峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品(齐墩果酸可购自中国食品药品鉴定研究院或上海诗丹德标准技术服务有限公司)适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，即得。

表4不同前处理方式的比较

由上述结果知，本发明的处理方法更简便，且含量较药典略高。

(2)不同提取溶剂的考察

取实施例2制备的(批号：BT201803-1)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇-浓盐酸(25:0.5)、无水乙醇-浓盐酸(25:0.5)25mL，密塞，称定重量，水浴回流2h，放冷，再称定重量，用不同的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取过滤液，即得。不同溶剂均平行配制两份。分别精密吸取各供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，得齐墩果酸含量，结果如表5所示。

表5

结论表明：由以上表可以看出：甲醇-浓盐酸(25:0.5)较无水乙醇-浓盐酸(25:0.5)的含量略高。故选择甲醇-浓盐酸(25:0.5)混合溶液作为最佳提取溶剂。

(3)不同提取时间的考察

取实施例2中制备的标汤(批号：BT201803-1)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-浓盐酸(25:0.5)混合溶液25mL，密塞，称定重量，分别水浴回流30分钟、60分钟、120分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇-浓盐酸(25:0.5)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取过滤液作为供试品溶液。不同回流时间均平行配制两份。分别精密吸取各供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，得齐墩果酸含量，结果如表6.1所示。

表6.1不同提取时间的比较

结论表明：回流处理时间越长，齐墩果酸含量越高，为保证提取完全和合理的实验时间，因此确定提取时间为120分钟。

(4)含量测定分析方法的方法学验证

1).重复性试验：取威灵仙提取物(批号：BT201803-1)约0.5g，平行6份，精密称定，分别按上述前处理方法2制成样品供试液，分别进样10μL，测定样品中齐墩果酸峰面积值，计算其总量及RSD，结果如下表6.2，表明重复性(RSD％＝0.36％)良好。

表6.2重复性结果

2).耐用性试验

取样品1份(批号：BT201803-1)，按上述前处理方法2制备供试品溶液供试液，考察0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min三个流速。结果表明：三种流速下色谱峰分离效果均较好。流速为1.0mL/min时分析所需时间适中，优选流速为1.0mL/min。

取样品1份(批号：BT201803-1)，按上述前处理方法2制备供试品溶液供试液，考察27℃、30℃、35℃三个温度。结果表明三种柱温下色谱峰分离效果和理论踏板数均较好，且30℃和35℃条件下保留时间并未有太大差别。考虑到色谱柱的耐受性及分析所需时间，因此选择柱温为30℃。

取样品1份(批号：BT201803-1)，按上述前处理方法2制备供试品溶液供试液，分别采用1-ZORBAX SB-C18(Agilent，250×4.6mm，5μm)、2-Diamonsil C18(2)(Dikma Welch，250×4.6mm，5μm)、3-Ultimate XB-C18(Welch，250×4.6mm，5μm)三种色谱柱，对威灵仙提取物样品进行分析。结果显示，三种色谱柱的分离均较好，保留时间适中，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小。

3).稳定性试验

取样品1份(批号：BT201803-1)，按上述前处理方法2制备供试品溶液供试液，每隔1个小时进样10μL，测定峰面积值，计算其RSD，共测定12小时。结果表明：样品供试液在12小时内稳定性良好(齐墩果酸的RSD％＝0.62％。)

4).回收率

分别取已知高含量的样品(批号：BT201806，含量：9.64mg/g)和已知低含量的样品(批号：BT201811，含量：3.42mg/g)约0.5g，精密称定，分别加入齐墩果酸对照品溶液(0.8978mg/mL)3mL，按上述前处理方法2供试品溶液制备方法制成加样回收供试品溶液，分别进样10μL，以下列公式计算回收率，RSD，其中高含量的样品的齐墩果酸准确度试验结果见表7，低含量的样品的齐墩果酸准确度试验结果见表8。

表7高含量的样品的齐墩果酸准确度试验结果

表8低含量的样品的齐墩果酸准确度试验结果

结果表明：齐墩果酸回收率在95％～105％之间，RSD％小于2.0％，准确度试验良好。

实施例5特征图谱分析方法的建立

1.高效液相色谱条件的确定

检测波长的确定：取威灵仙提取物(批号：BT201703)适量，研细。精密称取0.17g，加水25mL，超声处理30分钟，滤过，取过滤液作为供试液，记录190～400nm范围内的吸收光谱。结果表明，在205nm左右，威灵仙提取物样品溶液可以检测到的色谱峰最多，且各色谱峰的峰面积较大，因此选择205nm为检测波长。

流动相的优化：由于波长为205nm的末端吸收，因此不考虑甲醇作为有机相。大梯度考察A为乙腈，B为水、及对加酸和不加酸的情况(0.1％的磷酸水，0.1％的甲酸水，0.1％的醋酸水)进行考察，结果表明乙腈-0.1％的磷酸水峰型最好且基线平稳，故选择此系统进行梯度洗脱。

对不同流动相磷酸浓度(0.1％的磷酸水、0.05％的磷酸水和0.01％的磷酸水)的考察，结果表明乙腈-0.1％磷酸水峰型最好，故采用乙腈-0.1％磷酸水进行洗脱。

色谱条件的确定：最终确定了如下色谱条件：Waters ACQUITY HSS T3色谱柱(柱长为150mm，内径2.1mm，粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表9中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.25mL；检测波长为205nm。

表9

2.供试品溶液的制备

提取溶剂优化：取威灵仙提取物(批号：BT201803)适量，研细。取约0.17g，精密称定，精密加入水、乙醇、75％乙醇、稀乙醇、甲醇、75％甲醇和50％甲醇各25mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用不同的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取过滤液，进行液相色谱即得。结果如图3所示，结果表明：以水提取的色谱较多，峰型较好，因此选择水作为提取溶剂。

提取方式优化：取威灵仙提取物(批号：BT201803)适量，研细。取约0.17g，精密称定，加入水溶液25mL，称定重量，分别超声处理、振摇提取、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取过滤液，进行液相色谱。结果如图4所示，表明采用三种不同的处理方式所得的色谱峰数目一致，振荡提取的色谱峰响应值较低，超声提取及加热回流提取色谱峰响应值相近，考虑到超声处理的操作简捷，最终选择超声处理作为供试液提取方式。

提取时间优化：取威灵仙提取物(批号：BT201803)适量，研细。取约0.17g，精密称定，加入水溶液25mL，称定重量，分别超声处理15分钟、30分钟、45分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取过滤液，进行液相色谱。结果如图5所示，结果表明：超声提取30分钟即可提取完全，最终选择超声处理30分钟。

最后确定供试品溶液的制备：取标汤样品约0.17g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取过滤液，进行液相色谱仪，测定。

测定法：精密吸取供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，具体以WatersACQUITY HSS T3色谱柱(柱长为150mm，内径2.1mm，粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表10中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.25mL；检测波长为205nm。

表10

通过对辽宁省抚顺市、辽宁省鞍山市、吉林省通化市、辽宁省海城市、黑龙江牡丹江市实地取样的10个批次的威灵仙按实施例2中所述方法制备的提取物进行特征图谱的测定，结果表明，威灵仙提取物的特征图谱中由6个较为明显的共有峰。积分参数：峰宽为30；阈值450；最小峰高为2000。

结果表明，供试品特征图谱中应有6个特征峰，如图6所示为例6其中，因6号峰在威灵仙标汤和药材中稳定存在，故以6号峰(灵仙新苷)为参照峰(即S峰)，选择其中相对保留时间和相对峰面积较为稳定的共有峰作为特征。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；计算各特征峰与S峰的相对峰面积，结果如表11所示。

表11 10批威灵仙提取物特征图谱相对峰面积

结果表明，以6号峰(灵仙新苷)为参照峰，10批威灵仙提取物特征图谱的其余5个特征峰相对保留时间RSD值在0.036％～1.834％，均小于3.0％，符合威灵仙提取物特征图谱的标准要求；10批威灵仙提取物特征图谱的其余5个特征峰相对峰面积的RSD值在53.517％～107.361％，结果表明不同批次威灵仙提取物的特征峰对应成分存在一定差异，峰1相对峰面积范围在6.047～92.564，峰2相对峰面积范围在1.251～2.459，峰3相对峰面积范围在0.614～15.691，峰4相对峰面积范围在0.520～5.031，峰5相对峰面积范围在1.648～7.116，具体如表12所示。

表12

3.特征峰的指认

采用LC/MS技术，主要针对下图中的6个特征峰进行指认，从各峰的紫外吸收和质谱分子量来看，峰2疑似苯甲酸酯类成分，峰6为皂苷，峰4和峰5为同一类成分。峰2(9.012min)：[M－H]:329.0611；[2M－H]:659.1270；[M－132]:197.0533；峰4(16.826min)：[M－H]-:359.1604；[M+HCOO]-:405.1693；[M－OCH3]-:329.1503；峰6：[M+HCOO]-:1851.9058；[M－470]-:1335.6797；为灵仙新苷(clematichinenoside AR)。上述特征图谱及特征峰的相对面积的设定，能更好控制威灵仙配方颗粒的质量并为其生产工艺提供较全面的质量控制参数。

Claims

1.一种威灵仙提取物的质量测定方法，其特征在于，为特征峰图谱的测定，包括以下步骤：

S1、制备威灵仙提取物的样品溶液；

所述威灵仙提取物样品溶液的制备为取威灵仙提取物样品0.15g～0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理20～30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取过滤液即为威灵仙提取物样品液；

S2、制备齐墩果酸对照品溶液：

S3、采用超高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图，与齐墩果酸对照品相应的峰为1峰；

所述特征峰图谱的测定的色谱柱为Waters ACQUITY HSS T3色谱柱，其柱长为150mm，内径2.1mm，粒径为1.8μm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B；进行梯度洗脱，柱温为30℃；流速为每分钟0.25mL；检测波长为205nm;

所述梯度洗脱为：0～3min，0％流动相A；3～24min，0％→22％流动相A；24～28min，22％→28％流动相A；28～29min，28％→29％流动相A；29～31min，29％→33％流动相A；31～36min，33％→38％流动相A；36～37min，38％～40％流动相A；37～42min，40％→90％流动相A；42～48min，90％→90％流动相A；48～48.1min，90％→0％流动相A；48.1～52min，0％流动相A，其中，每个时间段中除流动相A外，剩余为流动相B，流动相A与流动相B之和为100％；

其中，威灵仙提取物的制备方法，其包括将威灵仙饮片加水煎煮1～3次，合并滤液，滤液水浴冷却后浓缩；滤液减压浓缩至适量，置于进行冷冻干燥，即得威灵仙提取物；

所述减压浓缩的温度为60～70℃，浓缩真空度-0.085～-0.09Mpa，至相对密度为1.035～1.054g/mL；

所述冷冻干燥包括：第一阶段-40℃，持续时间2h，第二阶段-60℃，持续时间2h；升华干燥温度为-40℃-25℃，时间为24h。

2.根据权利要求1所述的质量测定方法，其特征在于，所述加水煎煮操作为：威灵仙饮片加入7～9倍水浸泡20～30min，每次加7～9倍量水煎煮20～30min，趁热过滤，合并每次滤液。