CN110075152A - 蔓菁在制备保护肝脏的药物中的用途 - Google Patents

蔓菁在制备保护肝脏的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了蔓菁在制备保护肝脏的药物中的用途，通过作用机制研究发现，藏药蔓菁多糖能提高CCl4致急性肝损伤模型小鼠肝脏的抗氧化能力，显著降低肝脏的氧化损伤，能抑制CCl4致急性肝损伤小鼠肝脏caspase3蛋白表达，减少肝细胞的凋亡，对CCl4诱导小鼠急性肝损伤有保护作用。蔓菁多糖在保护肝脏方面，兼有预防和治疗双重作用，且疗效好，安全性高，应用广泛。

Description

蔓菁在制备保护肝脏的药物中的用途
技术领域
本发明涉及蔓菁在制备保护肝脏的药物中的用途。
背景技术
藏药蔓菁为十字花科植物芜菁(Brassica rapa Linn.)的干燥块根，秋季块根成熟时采收。在藏药中，蔓菁又名“妞玛”(《四部医典》)，西藏通称其为“蔓菁”、“圆根”或“芫根”。藏医传统理论认为，蔓菁块根“祛风、生赤巴’、滋补、解毒，治‘培根病’、‘龙病’、虚弱、中毒病”，主治“各种中毒症，‘龙’病，身体虚弱”，现代研究表明，蔓菁提取物具有抗缺氧、提高免疫力、抗辐射等活性。蔓菁富含多糖，多糖的抗氧化作用已被证实是植物多糖发挥作用的重要机制。
查阅文献，蔓菁的肝保护相关研究还未见报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了蔓菁或其提取物在制备保护肝脏的药物中的用途。
进一步地，所述蔓菁提取物为蔓菁多糖。
进一步地，所述药物是预防和/或治疗急性肝损伤的药物。
更进一步地，所述药物是预防和/或治疗化学药物导致的急性肝损伤的药物。
更进一步地，所述药物是抑制血清中ALT、AST和ALP升高的药物。
更进一步地，所述药物是降低肝组织中MDA的药物。
更进一步地，所述药物是升高肝组织中SOD、GSH-Px的药物。
更进一步地，所述药物是降低肝组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的药物。
更进一步地，所述药物是抑制肝组织caspase3蛋白表达的药物。
更进一步地，所述药物是减少肝细胞凋亡的药物。
进一步地，所述蔓菁多糖采用如下方法制备：
(1)取蔓菁药材粉末，加80％乙醇提取，滤过，取滤渣烘干，加水提取，提取液60℃减压浓缩至料液比为1:1，再加无水乙醇，4℃下静置24h，离心，得沉淀；
(2)取沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤至无色，加水溶解，溶液用大孔吸附树脂脱蛋白，浓缩，再用透析膜透析，干燥即得。
更进一步地，步骤(1)所述加80％乙醇提取是加10倍量(v/w；ml/g)的80％乙醇回流提取2次，每次3h；所述加水提取为加30倍量(v/w；ml/g)的水，90℃回流提取3次，每次2h；所述加无水乙醇使乙醇体积分数为80％；所述离心速度为4000r·min-1，时间10min；和/或，步骤(2)所述加水溶解配制成浓度为5mg/ml蔓菁多糖溶液；所述大孔吸附树脂脱蛋白是蔓菁多糖溶液以流速1BV/h过大孔吸附树脂D301R；所述透析膜规格为MW 3500Da；所述透析温度为20℃，时间48h；所述干燥为冷冻干燥。
本发明蔓菁在制备保护肝脏的药物中的用途，通过作用机制研究发现，藏药蔓菁多糖能提高CCl4致急性肝损伤模型小鼠肝脏的抗氧化能力，显著降低肝脏的氧化损伤，能抑制CCl4致急性肝损伤小鼠肝脏caspase3蛋白表达，减少肝细胞的凋亡，对CCl4诱导小鼠急性肝损伤有保护作用。蔓菁多糖在保护肝脏方面，兼有预防和治疗双重作用，且疗效好，安全性高，应用广泛。本发明蔓菁多糖降低ALT、ALP作用与联苯双酯组相当，在防治急性肝损伤的新药综合开发方面前景广阔。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1小鼠肝组织病理切片图
图2肝组织caspase3蛋白表达量柱形图
具体实施方式
实施例1
1材料
1.1实验动物
昆明种小鼠，SPF级，雄性，18±22g，由成都达硕生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(川)2013-24。
1.2药物及试剂
藏药蔓菁购于四川省阿坝州马尔康县，经成都中医药大学张艺研究员鉴定为十字花科芸薹属植物蔓菁(Brassica rapa Linn.)的块根。联苯双酯滴丸，北京协和药厂；蔓菁多糖，实验室自制；四氯化碳购于成都市科龙化工试剂厂，批号：2010061。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、考马斯亮蓝试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。IL-1β、IL-6、TNF-α均购于SRB生产。BCA蛋白浓度测定试剂盒购于南京凯基生物公司；预染蛋白Marker购于美国NEB公司；ECL发光试剂盒购于美国Thermo公司；兔多克隆抗体Caspase3、鼠单克隆抗体β-actin抗体购于艾博抗(上海)贸易有限公司。4％多聚甲醛固定液购于国药集团化学试剂有限公司生产。PBS磷酸盐缓冲液(0.01M PH7.2-7.4)购于北京中杉金桥生物技术有限公司生产。
1.3实验仪器
UV9100可见紫外分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)，MY－10匀浆器(上海净信实业发展有限公司)，转轮式切片机(徕卡-2016，德国)；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)等；图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)。L-500低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，YP5002FA2204B电子天平(上海越平科学仪器有限公司)。酶标仪，型号，Multlskan Mk3，赛默飞世尔仪器有限公司生产；优普超纯水制造系统，型号，UPH-Ⅱ-10T，成都超纯科技有限公司生产。
2实验方法
2.1蔓菁多糖的制备
取蔓菁药材粉末200g，加入10倍量的80％乙醇回流提取2次，每次3h，滤过，滤渣烘干，加30倍量的水，90℃回流提取3次，每次2h，合并滤液，60℃减压浓缩至料液比为1:1，加入无水乙醇使乙醇体积分数为80％，于4℃下静置24h，离心(4000r·min-1，10min)，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤至无色，沉淀用大孔吸附树脂法(D301R)脱蛋白(即：用水将沉淀配成5mg/ml蔓菁多糖溶液，以流速1BV/h过大孔吸附树脂D301R，脱蛋白)，浓缩，再用透析膜(MW 3500Da)低温(20℃)透析48h，冷冻干燥，即得。
2.2分组
将小鼠随机分为6组，分为正常对照组(Control)、模型组(Model)、阳性对照组(联苯双酯，LBSZ，15mg/ml)、蔓菁多糖低剂量组(BRPL，3.8mg/ml)、蔓菁多糖中剂量组(BRPM，7.5mg/ml)和蔓菁多糖高剂量组(BRPH，15mg/ml)，共6组，每组8只。
2.3 CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型的建立
除正常对照组和模型组给予等量的生理盐水，其余给药组按剂量表给药，给药体积均为10mL/kg/d，连续给药7d，1次·d-1。末次给药1h后，除正常组外其余各组小鼠均腹腔注射0.2％CCl4花生油溶液10ml/kg。末次给药后禁食不禁水，16h后，摘眼球取血，对小鼠予以脱臼处死，解剖分离肝脏。
2.4指标检测
2.3.1小鼠一般状况观察观察小鼠造模前后的体质量、进食以及饮水、活动、皮毛等一般状况变化。
2.3.2肝脏病理学检查取小鼠肝左叶大致相同部位的一小块肝脏，用4％多聚甲醛溶液固定后，石蜡包埋，切片(片厚5μm)，苏木素-伊红(HE)染色，然后在光镜下观察肝脏病理学改变。
2.3.3血清ALT、AST、ALP活性检测采集到的血样，在室温放置1h后，以3000r/min离心10min分离出血清，生化分析仪测定血清中ALT、AST和ALP的活性。
2.3.4肝组织中SOD、MDA、GSH-Px和IL-1β、IL-6、TNF-α测定取右叶肝脏加生理盐水1：9制作组织匀浆，2500r·min-1离心10min，取上清液测定SOD、GSH-Px活性和MDA的含量；采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠肝组织中IL-1β、IL-6、TNF-α含量。
2.3.5肝组织中Caspase-3蛋白的检测取肝组织，提取蛋白，通过(SDS/PAGE)电泳分离并转移到PVDF膜上；将PVDF膜放入用TBST Buffer稀释的5％BSA液，TBST洗涤后，加入稀释的二抗，室温孵育2-3h；TBST洗涤后，加入ECL发光液显影和定影，使用凝胶图像分析成像系统进行扫描分析，以β-actin为内参。
2.4统计方法实验数据采用SPSS20.0软件处理，以表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异。
3实验结果
3.1各组小鼠状态
各组小鼠造模前均状态良好，饮水及进食正常，毛色润泽，活动正常；造模后，除空白组外，其余各组小鼠均表现为不同程度的体质量减轻，饮水及进食减少，少动，聚堆，弓背，呼吸紊乱，其中以模型组改变最为明显。
3.2各组小鼠肝组织病理学结果
正常组肝组织被膜完整、肝小叶分叶清楚、肝细胞排列较整齐，未见明显变化；模型组肝组织多灶状凝固性坏死、周边肝细胞变性，肝细胞可见嗜碱性深染的圆形单核样细胞浸润；蔓菁多糖高、中剂量组、低剂量组小叶结构尙存在，少量肝细胞可见点状坏死、炎细胞浸润；见图1。
3.2蔓菁多糖对CCl4诱导急性肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP水平的影响
从表2可见：与正常对照组比较，模型组小鼠血清中ALT、ALP的活性较正常组明显升高(P<0.01)，AST的活性升高(P<0.05)，说明本次实验模型造模成功。蔓菁多糖中、高剂量均能降低小鼠血清中ALT、ALP的活性，其中高剂量能降低血清中AST的活性，且高剂量组的降酶作用与联苯双酯组相当。
表2蔓菁多糖对CCl4诱导小鼠急性肝损伤ALT、AST、ALP活性的影响(n＝10,)
注：与正常对照组比较：##P＜0.01；与模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
3.3蔓菁多糖对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的保护机制
从表3和表4可见：结果表明与正常对照组比较，模型对照组大鼠肝组织SOD、GSH-Px显著下降(P＜0.01)，而MDA含量明显提高(P＜0.01)，提示急性肝损伤模型小鼠的抗氧化水平显著降低，氧化损伤明显，此外，可通过多种机制参与肝损伤调控的重要细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α也显著升高(P＜0.01)，而蔓菁多糖中、高剂量组小鼠肝组织SOD、GSH-Px、MDA及IL-1β、IL-6和TNF-α与模型对照比较，差异具有统计学意义(P＜0.01或0.05)。
表3蔓菁多糖对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA和GSH-Px水平的影响(n＝10,)
注：与正常对照组比较：##P＜0.01；与模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
表4蔓菁多糖对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影响(n＝10,)
注：与正常对照组比较：##P＜0.01；与模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
从图2可见：蔓菁多糖对肝组织caspase3蛋白表达的影响，与正常对照组比较，模型对照组小鼠肝组织caspase3蛋白表达明显增加，而肝组织无明显变化，提示CCl4致急性肝损伤模型肝组织caspase3蛋白表达增加，肝细胞凋亡增加。而蔓菁多糖高剂量大鼠肝组织caspase3蛋白表达与模型对照比较，差异均具有统计学意义。
4、讨论
急性肝损伤是由于肝炎病毒、乙醇、药物、毒物等多种损伤因素在短时间内刺激肝脏造成的一种急性肝脏疾病，是肝癌或肝硬化发生的重要始动因素[3]。研究表明，CCL4致肝损伤的机制与自由基密切相关，CCL4经肝微粒体细胞色素P450激活后产生三氯化碳(CCL3)等自由基，继而引发脂质过氧化反应，抑制GSH-Px活性。GSH-Px可以清除脂质过氧化物，保护细胞膜结构和功能的完整性，当GSH-Px活性被抑制后，会大量产生脂质过氧化产物如MDA，从而破坏细胞膜结构，导致胞质内可溶性酶如转氨酶(ALT，AST)、乳酸脱氢酶渗入血液而活性升高[3]。因此，血清ALT，AST活性升高，在一定程度上反映了肝细胞的损伤程度。
本发明研究了藏药蔓菁多糖对CCL4致小鼠急性肝损伤的保护作用和氧化机制。实验采用CCL4造模法，采用腹腔注射CCl4诱导小鼠急性肝损伤，从ALT、ALP的活性，AST的活性，模型组比正常组升高，观察肝脏组织病理学变化，说明本次实验模型造模成功，检测小鼠血清中肝脏酶水平，从而评价蔓菁多糖对小鼠急性肝损伤有保护作用。通过检测肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)以及丙二醛(MDA)的水平，以及炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α，肝组织中蛋白的表达，揭示蔓菁多糖对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的保护机制。从结果可以说明，蔓菁多糖能提高CCl4致急性肝损伤模型小鼠肝脏的抗氧化能力，显著降低肝脏的氧化损伤，也能抑制IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子的分泌，说明蔓菁多糖能抑制CCl4致急性肝损伤小鼠肝脏caspase3蛋白表达，减少肝细胞的凋亡。
综上，藏药蔓菁多糖能提高急性肝损伤的抗氧化能力，显著降低肝脏的氧化损伤，能抑制急性肝损伤caspase3蛋白表达，减少肝细胞的凋亡，对肝脏有保护作用。

Claims (10)

1.蔓菁或其提取物在制备保护肝脏的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述蔓菁提取物为蔓菁多糖。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是预防和/或治疗急性肝损伤的药物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述药物是预防和/或治疗化学药物导致的急性肝损伤的药物。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述药物是抑制血清中ALT、AST和ALP升高的药物。
6.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述药物是降低肝组织中MDA的药物；和/或，所述药物是升高肝组织中SOD、GSH-Px的药物；和/或，所述药物是降低肝组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的药物。
7.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述药物是抑制肝组织caspase3蛋白表达的药物。
8.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述药物是减少肝细胞凋亡的药物。
9.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述蔓菁多糖采用如下方法制备：
(1)取蔓菁药材粉末，加80％乙醇提取，滤过，取滤渣烘干，加水提取，提取液60℃减压浓缩至料液比为1:1，再加无水乙醇，4℃下静置24h，离心，得沉淀；
(2)取沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤至无色，加水溶解，再用大孔吸附树脂脱蛋白，浓缩，再用透析膜透析，干燥即得。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：步骤(1)所述加80％乙醇提取是加10倍量(v/w；ml/g)的80％乙醇回流提取2次，每次3h；所述加水提取为加30倍量(v/w；ml/g)的水，90℃回流提取3次，每次2h；所述加无水乙醇使乙醇体积分数为80％；所述离心速度为4000r·min-1，时间10min；和/或，步骤(2)所述加水溶解配制成浓度为5mg/ml蔓菁多糖溶液；所述大孔吸附树脂脱蛋白是蔓菁多糖溶液以流速1BV/h过大孔吸附树脂D301R；所述透析膜规格为MW 3500Da；所述透析温度为20℃，时间48h；所述干燥为冷冻干燥。
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