CN106832042B - β-1,3-葡聚糖、其制备方法以及制药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种β‑1,3‑葡聚糖GPW1、其制备方法以及其在制备用于治疗阿尔兹海默症的药物中的用途。具体而言,所述β‑1,3‑葡聚糖GPW1通过以下方法制备:首先从赤灵芝孢子粉中提取粗多糖,再醇沉、最后经多种柱层析纯化得均一的β‑1,3‑葡聚糖。所述β‑1,3‑葡聚糖GPW1明显改善阿尔兹海默症小鼠学习和记忆能力,并且可促进神经干细胞生长,可用做治疗阿尔兹海默症的糖类药物。

Description

β-1,3-葡聚糖、其制备方法以及制药用途
技术领域
本发明涉及从中草药中提取多糖的技术领域,更具体而言,涉及一种β-1,3-葡聚糖、其制备方法及在治疗阿尔兹海默症中的应用。
背景技术
赤灵芝(Ganoderma lucidum),别名红芝、木灵芝、万年蕈、灵芝草等,属于担子菌纲(Basidiomycetes),多孔菌科(Polyparaceae),灵芝属(Ganoderma),是一种药、食两用高等真菌。赤灵芝主要含有三萜、多糖与多糖缀合物、甾醇及脂肪酸等成分,尤其是前两类,一般被认为是赤灵芝的主要活性物质,可作为赤灵芝的特征性化学成分。现代药理学研究表明,赤灵芝具有多种重要的功能,如抗肿瘤、抗炎、降血压、降血糖和镇静作用等,同时它还有扶正固本、强身健体和延缓衰老等保健功效。对赤灵芝孢子粉的初步研究表明,其中的多糖类成分可能是孢子粉的免疫调节、提高机体耐缺氧能力、镇静和抗炎等药理作用的物质基础。
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)亦称为早老性痴呆,是一种慢性进行性的神经退行性疾病,主要表现为渐进性的记忆能力下降,认知功能障碍以及失去生活独立自理能力。随着人口老龄化的不断加剧,AD的发病率也逐年升高,已成为最重要的公众关注健康问题之一。
研究表明灵芝来源多糖对阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)模型大鼠脑组织有保护作用。晏涛等人(晏涛,陈世保,徐蕾,杨丽,陈龙菊,“灵芝多糖对阿尔茨海默病大鼠学习记忆和氧化应激的影响”,《陕西医学杂志》,第40卷第4期,第387-389页,2011年)通过向大鼠双侧海马注射Aβ1~40建立大鼠阿尔兹海默病模型,并研究灵芝多糖对AD大鼠的学习记忆能力和氧化应激的影响,结果显示,与模型组大鼠相比,经灵芝多糖治疗后,大鼠的认知能力有所提高,其机理可能是通过减少氧自由基的损伤从而提高AD大鼠学习记忆能力。裴钢等人之前也发现灵芝多糖粗糖给药能显著改善AD模型小鼠的学习记忆能力。然而由于灵芝多糖结构复杂且与分离手段相关,目前用于AD模型实验中的灵芝多糖其发挥功效的结构基础尚不明确,这在一定程度上影响了灵芝多糖进一步的开发利用。
因此,进一步阐明灵芝多糖治疗AD的物质基础,将会使灵芝多糖在营养保健、药物研发等方面得到更广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵芝多糖,其可用于治疗阿尔茨海默症,并公开了其制备方法和用途。
一方面,本发明提供一种β-1,3-葡聚糖GPW1,其结构式如下:
其中,n=5~100,所述β-1,3-葡聚糖GPW1的重均分子量范围为5-100kDa,优选为10-80kDa,更优选为10-40kDa。
另一方面,本发明提供所述β-1,3-葡聚糖GPW1的制备方法,其包括以下步骤:
a.多糖提取:干燥的赤灵芝孢子粉经乙醇脱脂、水提,过滤并将所得滤液浓缩,透析,浓缩,醇沉,离心,洗涤,真空干燥得水提赤灵芝孢子粉粗多糖;以及
b.多糖纯化:将步骤a中制备的所述赤灵芝孢子粉粗多糖先用DEAE纤维素阴离子柱进行初步分级,水洗脱得中性多糖组分,进而用S300凝胶色谱柱纯化,得到所述β-1,3-葡聚糖。
更具体地,本发明提供了一种从赤灵芝孢子粉中提取β-1,3-葡聚糖的方法,该方法包括以下步骤:
a.多糖提取:干燥的赤灵芝孢子粉经乙醇(例如,95%乙醇)脱脂,风干,加入蒸馏水,加热条件下提取,过滤,残渣再次用去离子水提取,如此反复提取2~6次,滤液合并,加热浓缩,加入3~4倍于浓缩液体积的乙醇,离心得沉淀,沉淀经洗涤(例如,经无水乙醇和丙酮洗涤)、真空干燥得水提赤灵芝孢子粉粗多糖;以及
b.多糖纯化:取步骤a中制备的赤灵芝孢子粉粗多糖,水溶解,离心,上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离,以蒸馏水洗脱,硫酸-苯酚检测,收取合并洗脱液,浓缩冷冻干燥得水洗脱组分,进而采用S300凝胶色谱柱分离,纯化得GPW1组分。
对以上制备方法得到的GPW1组分进行结构鉴定,结果如下:
分子量
经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定,GPW1组分的相对分子质量为15kDa。
组成和结构
对上述GPW1组分进行糖组成分析,即将多糖完全水解、还原、乙酰化、萃取、浓缩后进行GC分析。糖组成分析结果显示,GPW1多糖只含葡萄糖。然后用碘甲烷进行反应至多糖完全甲基化,再完全酸水解、还原。乙酰化、萃取、浓缩后用GC-MS分析。结合红外和核磁共振分析和甲基化结果,推测其一级结构为β构型的葡聚糖,其主链由1,3-连接的葡聚糖组成,侧链内部由1,6-连接的葡萄糖残基组成,通过1→6糖苷键取代于分支点的O-6上。
再一方面,本发明公开了所述β-1,3-葡聚糖GPW1在制备用于促进神经干细胞生长的药物中的用途。
最后,本发明公开了所述β-1,3-葡聚糖GPW1在制备用于治疗阿尔兹海默症的药物中的用途。
附图说明
图1为本发明的β-1,3-葡聚糖GPW1的高效凝胶色谱图。
图2为本发明的β-1,3-葡聚糖GPW1的红外谱图。
图3为灌注本发明的β-1,3-葡聚糖GPW1的阿尔茨海默症模型小鼠的水迷宫实验结果(其中,WT+Veh为给安慰剂的野生型阴性对照组,AD+Veh为给安慰剂的AD小鼠,AD+GPW1为给β-1,3-葡聚糖GPW1的AD小鼠)。
图4显示β-1,3-葡聚糖GPW1对神经干细胞生长的影响。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明,但并不限制本发明的范围。
制备实施例:β-1,3-葡聚糖GPW1的制备
a.多糖提取:
取1.35kg破壁赤灵芝孢子粉,加20L 95%乙醇,浸泡一周。浸泡完毕,离心,固体物置于室温通风处晾干。然后用沸水提取,每次加蒸馏水约30L,提取时间为5h,用苯酚-硫酸法检测提取液的糖含量,直至糖显色反应不明显,共计提取6次。每次提取、离心得到的清液合并、浓缩至较小体积,加95%乙醇至溶液的乙醇终浓度为80%,静置过夜,离心收集沉淀,沉淀物经无水乙醇和丙酮洗涤,真空干燥得28.2g灵芝孢子粉水提粗多糖(GP)。
b.多糖纯化:
取赤灵芝孢子粉水提粗多糖(GP),加适量蒸馏水并加热溶解,离心,上清液用DEAE-纤维素阴离子交换柱(美国GE公司)(5.0cm×50cm,Cl-型)进行初步分离。以蒸馏水作洗脱液,自动部分收集器分部收集流分,4mL/管,硫酸-苯酚法检测,根据糖显色反应结果合并相同流分,得到1个洗脱峰位,洗脱液分别减压浓缩至适当体积,对蒸馏水透析,对透析袋内液减压浓缩并冷冻干燥,所得产物命名为GPW(12.9g)。GPW用EZ Purifier半制备型色谱系统和Hiprep Sephacryl S-300柱(美国GE公司)进一步纯化,获得一个均一的多糖GPW1。
实验实施例1:多糖结构解析
经高效凝胶色谱法析(HPGPC)分析表明GPW1的分子量为15kDa,其纯度测定参见图1。
糖组成分析表明GPW1为一葡聚糖。红外图谱(图2)显示,GPW1具有一般多糖在红外光谱中的特征性结构:3405.7cm-1处的强吸收峰是糖分子中O-H键的伸缩振动吸收,2923.6cm-1处的峰是C-H键的伸缩振动吸收,1650.8cm-1处的峰是糖分子中结合水的吸收,894.8cm-1的峰是β-葡聚糖的特征吸收峰。另外,红外光谱在1730cm-1附近无糖醛酸对应的吸收峰,表明该多糖不含糖醛酸。该多糖经硼氢化钠还原、乙酰化后转变为部分甲基化的糖醇乙酸酯(PMAA),进行GC-MS分析,结果如下表1所示。该多糖含有非还原末端、1,6-、1,3-及1,3,6-连接的葡萄糖的4种连接方式,其比例为1∶1∶3∶1。非还原末端及1,3,6-连接葡萄糖的存在说明该多糖具有分支,根据甲基化后各残基摩尔比分析的结果,可以确定GPW1的主链由1,3-连接的葡萄糖组成,每6个单糖残基组成的重复单元中含有一个分支,平均单位链长度约为6。侧链由1,6-连接的葡萄糖残基构成,连接在1,3-连接的葡萄糖残基的O-6上。
表1
以上结果表明GPW1的结构为:
实验实施例2:水迷宫实验
选用5-6月龄的APP/PS1转基因雄性小鼠20只(The Jackson Laboratory,美国),按随机数字表法分为模型组及多糖给药组,灵芝多糖采用灌胃给药方式,每天给药,同时用非转基因小鼠10只作为阴性对照组,连续给药90天后,利用Morris水迷宫行为学实验来检测灵芝多糖对APP/PS1小鼠的学习,认知功能的影响。本实验采用的是经典Morris水迷宫测试程序,包括两部分,即定位航行试验和空间探索试验实验,共进行7天,第4天和第7天加入空间探索试验。
从实验结果(图3)可知,此次定位航行实验,3组动物经过3天训练,其逃避潜伏期均缩短,说明各小鼠均能顺利完成水迷宫的空间学习任务。以逃避潜伏期作为检测指标。经过7天训练后,结果显示:对照组小鼠反应比较迅速,入水后能快速找到平台,随着训练次数增加,寻找平台的潜伏期时间缩短;而模型组小鼠反应迟钝,入水后沿桶壁有画圈行为,无逃避行为,人为将其引领平台后,又跳入水中,经多次训练后,最终找到平台,但寻找平台潜伏期明显延长;给药组小鼠随着训练次数的增加,寻找平台的能力不断提高。以上3组都具有一定的空间记忆能力,模型组小鼠的潜伏期成绩比对照组差,提示模型组小鼠学习记忆能力出现下降,模型鼠较好地模拟了AD的学习记忆障碍。给药组小鼠潜伏期与模型组相比有显著差异具有统计学意义,可见GPW1给药后AD小鼠学习和记忆能力有明显改善。
实验实施例3:对神经干细胞生长的影响
在含有20ng/ml表皮生长因子(EGF,美国Invitrogen公司)和20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,美国Invitrogen公司)的NeuroCult神经干细胞(STEMCELL)培养基中培养成年小鼠神经干细胞,采用不同浓度的GPW1处理细胞6天后,进行细胞计数。
实验结果如图4所示:GPW1在100ug/ml的浓度下,可显著促进神经干细胞的生长,且在10ug/ml-100ug/ml的浓度范围内,具有线性关系。
综上,本发明人从赤灵芝孢子粉中分离纯化得到均一的β-1,3-葡聚糖GPW1,其可显著改善AD小鼠的学习和记忆能力,并且具有促进神经干细胞生长作用,具有开发为治疗AD的糖类药物的应用价值。

Claims (7)

1.一种β-1,3-葡聚糖,其化学结构式如下:
其中,n=5~100,所述β-1,3-葡聚糖的重均分子量范围为5-100kDa。
2.根据权利要求1所述的β-1,3-葡聚糖,其重均分子量范围为10-80kDa。
3.根据权利要求2所述的β-1,3-葡聚糖,其重均分子量范围为10-40kDa。
4.一种从赤灵芝孢子粉中提取权利要求1所述的β-1,3-葡聚糖的方法,该方法包括以下步骤:
a.多糖提取:干燥的赤灵芝孢子粉经乙醇脱脂、水提,过滤并将所得滤液浓缩,透析,浓缩,醇沉,离心,洗涤,真空干燥得水提赤灵芝孢子粉粗多糖;以及
b.多糖纯化:将步骤a中制备的所述赤灵芝孢子粉粗多糖先用DEAE纤维素阴离子柱进行初步分级,水洗脱得中性多糖组分,进而用S300凝胶色谱柱纯化,得到所述β-1,3-葡聚糖。
5.根据权利要求4所述的方法,所述方法包括以下步骤:
a.多糖提取:干燥的赤灵芝孢子粉经乙醇脱脂,风干,加入蒸馏水,沸水提取,过滤,残渣再次用去离子水提取,如此反复提取2~6次,滤液合并,加热浓缩,加入3~4倍于浓缩液体积的乙醇,离心得沉淀,沉淀经洗涤、真空干燥得水提赤灵芝孢子粉粗多糖;以及
b.多糖纯化:取步骤a中制备的赤灵芝孢子粉粗多糖,水溶解,离心,上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离,以蒸馏水洗脱,硫酸-苯酚检测,收取合并洗脱液,浓缩冷冻干燥得水洗脱组分,进而采用S300凝胶色谱柱分离纯化得所述β-1,3-葡聚糖。
6.如权利要求1-3中任一项所述的β-1,3-葡聚糖在制备用于促进神经干细胞生长的药物中的用途。
7.如权利要求1-3中任一项所述的β-1,3-葡聚糖在制备用于治疗阿尔兹海默症的药物中的用途。
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