CN104042958B

CN104042958B - 玉米须活性组分的半仿生提取方法及其抗氧化作用

Info

Publication number: CN104042958B
Application number: CN201410291613.5A
Authority: CN
Inventors: 周鸿立; 潘宏伟; 郭志红; 张扬; 刘丽; 穆红领; 李兴国
Original assignee: Jilin Institute of Chemical Technology
Current assignee: Jilin Yili Ula Grass Products Co ltd
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2014-06-26
Publication date: 2017-04-12
Anticipated expiration: 2034-06-26
Also published as: CN104042958A

Abstract

本发明涉及玉米须活性组分的半仿生提取方法及其抗氧化作用，属于生物制品加工技术领域。通过正交试验设计，采用水和醇两种溶剂，分别采用半仿生与传统方法比较，以多糖和黄酮的总提取量和抗氧化活性为考察指标，优化最佳提取工艺。半仿生提取方法模拟人体胃肠道酸碱环境，一方面提高提取量，另一方面探究提取物在进入人体胃肠道时能够直接被吸收，有利于玉米须的活性组分在人体内最大程度的发挥其功能，同时减轻人体肠胃负担。结果表明，半仿生水提总提取量与传统方法接近，其中多糖提取量比传统水提法提高了，但黄酮传统方法相对高些，两种水提取物均有抗氧化活性；半仿生醇提多糖和黄酮提取量均比传统醇提提高，两种醇提取物均有抗氧化活性且半仿生法较强。研究证明，半仿生醇提玉米须黄酮多糖均提高，且有较高的生物活性，可为玉米须的药用价值提供理论依据。

Description

玉米须活性组分的半仿生提取方法及其抗氧化作用

技术领域

本发明涉及玉米须活性组分的半仿生提取方法及其抗氧化作用，属于生物制品加工技术领域。

背景技术

玉米须(Zea mays L.)为禾本科玉蜀黍属植物玉米的花柱和柱头,含有黄酮类、多糖类、皂甙、生物碱、单宁酸、绿原酸、蛋白质、挥发性油和类固醇等多种生物活性成分。现代药理研究证明, 玉米须的利尿、降血糖、抑菌、降压、增强免疫、抗癌等功效尤其显著。因此，有必要研究玉米须多糖和黄酮类化合物的提取方法及其生物活性；

目前多糖和黄酮的提取方法主要有溶剂法，如浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法等，新兴的提取方法有超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酶解法、超临界流体萃取法，还有半仿生提取法、破碎提取法、空气爆破法、亚临界流体萃取等，其中半仿生提取法是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，为经人类消化道给药的中药及其复方药剂创立的一种提取新技术，该法模仿口服药物在人体胃肠道中的转运过程，采用选定pH值的酸性和碱性溶剂依次提取得到活性混合物，体现中医治病综合成分作用的特点。目前，半仿生法提取法已应用于提取柚皮总黄酮（水提）、了哥王总黄酮（醇提）、半边莲黄酮苷（醇提）、叶下珠总黄酮（水提），但玉米须多糖和黄酮的半仿生浸提工艺研究尚未见报道。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于运用半仿生法原理，以特定pH的水和乙醇为溶剂，玉米须多糖和黄酮为主要活性成分，因此，以多糖和黄酮的提取量为指标，比较同样条件下传统方法黄酮、多糖的提取率和粗提取物的抗氧化性能，为玉米须的药用价值开发提供基础依据。为达到上述目的，本发明提供一种玉米须活性组分的半仿生提取方法及其抗氧化作用，所述方法包括以下步骤：

1材料与方法

1.1实验材料与仪器

玉米须（购于安徽亳州），芦丁对照品（0080-9705,纯度>98%)，中国药品生物制品检定所；实验用水为蒸馏水，无水乙醇，浓盐酸，氢氧化钠，浓硫酸，苯酚，无水三氯化铝，均为分析纯；

752紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；TG328A分析天平（上海上平仪器公司）；GZX-GW·2-BS高温干燥箱（上海博泰实验设备有限公司）；PHS-3C数字式酸度计（上海理达仪器厂）；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；

1.2 实验方法

1.2.1 多糖的含量测定

以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸方法测定玉米须多糖的含量，得回归方程: y=6.6671x+0.0202,r²=0.9994,多糖质量浓度在20.84~125.04μg/mL呈良好的线性关系；

多糖提取率(%)=样品中多糖质量/药材质量×100%；

1.2.2 黄酮的含量测定

以芦丁为对照品，采用三氯化铝显色法测定玉米须黄酮。得回归方程为：y=24.834x+0.0071,r²=0.9995,黄酮质量浓度在10~30μg/mL呈良好的线性关系；

黄酮提取率(%)=黄酮总含量/药材质量×100%；

1.2.3 半仿生提取

1.2.3.1 提取溶剂的制备

根据仿生学原理，人体消化道（胃、小肠、大肠）体液的pH分别为2.0、7.5、8.3，水作溶剂提取时，由于磷酸缓冲溶液和三氯化铝溶液混合后会有白色的絮状沉淀，经多次尝试改用5%盐酸溶液和稀氢氧化钠溶液(2%）调pH；乙醇作溶剂时用磷酸缓冲溶液调pH,备用；

1.2.3.2 样品的处理与制备

玉米须清洗去尘，晾干，粉碎，过筛（60目）后，称取2.0g于250mL圆底烧瓶中，先在pH2.0溶剂（水或不同浓度乙醇）中提取，冷却过滤，收集滤液，所得滤渣再在pH7.5，pH8.3溶剂各重复提取一次，合并滤液，减压浓缩得提取液，定容到100mL容量瓶中备用。传统提取即半仿生中优选条件排除pH因素；

1.3 抗氧化能力实验

分别取半仿生法水提取液（SBWEP和SBWEF），传统水提取液（TWEP和TWEF），半仿生醇提液（SBEEP和SBEEF），传统醇提液（TEEP和TEEF）1、2、3、4、5mL，用蒸馏水（或60%乙醇）定容到10mL容量瓶中，备用；

1.3.1 还原力的测定

取不同质量浓度的玉米须多糖1mL，在10mL离心管中分别加入0.2mol/L ph 6.6的磷酸缓冲液2.5mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。取出后加入2.5mL10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL三氯化铁，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。Vc作为阳性对照，在波长700nm条件下测定吸光度，以吸光度值A的大小判断还原能力；

1.3.2 清除DPPH自由基能力的测定

取不同质量浓度的玉米须多糖，在517nm处检测吸光度。以维生素c作为阳性对照。2mL蒸馏水加2mL0.1mmol/L的DPPH溶液（用无水乙醇配制）所测的吸光度为Ao； 2mL样品液加上2mL无水乙醇所测的吸光度为Aj；2mL样品液加上2mL0.1mmol/L的DPPH溶液（用无水乙醇配制）所测的吸光度为Ai。

清除率（%）=[1-（Ai－Aj）/Ao] ×100

1.4 正交实验设计

半仿生水提取选取提取时间，提取温度，料液比三个因素，选用L₉(4³)正交表进行三因素三水平实验，优选提取工艺条件。每个实验分别在pH2.0、7.5、8.3的水溶剂中提取一次，合并滤液后测定多糖（SBWEP）和黄酮（SBWEF）的含量。实验因素、水平安排结果见表1；

半仿生法醇提玉米须多糖（SBEEP）和黄酮（SBEEF）工艺，提取时间，温度，料液比、乙醇浓度，进行四因素三水平实验，其它同水提，实验因素、水平安排结果见表2；

表1 半仿生水提正交实验因素水平表

表2 半仿生醇提正交实验因素水平表

1.5 传统提取玉米须黄酮和多糖

传统水提取玉米须多糖和黄酮的工艺为半仿生提取中水提取最佳工艺，蒸馏水提取三次，合并滤液，蒸发浓缩，用蒸馏水定容到100mL容量瓶，分别测量多糖和黄酮的提取量；

传统醇提玉米须多糖和黄酮的工艺为半仿生中乙醇提取最佳工艺，乙醇提取三次，合并滤液，蒸发浓缩，用60%乙醇定容到100mL容量瓶中，测定多糖和黄酮的提取量；

2 结果与分析

2.1 水提玉米须多糖和黄酮的正交实验；

根据表1实验安排，半仿生水提玉米须多糖和黄酮含量结果,见表3、4、5；

表3 半仿生水提取正交实验直观分析表

注：R₁是多糖极差；R₁ˊ是黄酮极差

表4半仿生水提玉米须多糖实验结果方差分析表

注:查F表，F_0.05(2,4)=6.94, F_0.1(2,4)=4.32

表5 半仿生水提玉米须黄酮实验结果方差分析表

注：查F表，F_0.05(2,4)=6.94, F_0.1(2,6)=3.46

从表3、4中极差R1的大小可知，影响多糖提取量主次关系为C(料液比)>B(温度)>A(时间),料液比C为主要因素，半仿生水提取玉米须多糖的最佳工艺条件为A₃B₂C₃即提取时间为2h，提取温度为80℃，料液比为1：35。考察影响因素中, 提取料液比对多糖的提取量的影响显著, 温度有一定的影响, 提取时间影响不显著，与极差分析一致；

从表3、5极差R1ˊ大小可知，在实验考察的三个因素中，黄酮提取量影响主次关系为B>C>A,实验因素B（温度）为主要因素，影响显著。半仿生水提取玉米须黄酮的最佳工艺条件为A₃B₃C₁即提取时间为2h，提取温度为90℃，料液比为1：15；

2.2 半仿生醇提实验结果

半仿生醇提玉米须黄酮正交实验结果,如表6，7；

表6 L₉(4³)半仿生醇提正交实验直观分析表

注：R₁是多糖极差；R₁ˊ是黄酮极差

表7 半仿生醇提玉米须多糖实验结果方差分析表

注：查F表，F_0.01(2,4)=18,F_0.05(2,4)=6.94

表8 半仿生醇提玉米须黄酮实验结果方差分析表

注：查F表，F_0.01(2,4)=18,F_0.05(2,4)=6.94

从表6、7极差R的大小可以看出，对多糖提取量的影响因素主次关系为C（料液比）>B(温度）>D（浓度）>A（时间），最佳的提取工艺为A₃B₃C₃D₃,即提取时间为2h,温度为90℃，料液比为1:35,乙醇浓度为70%。料液比对多糖提取量影响显著；

从表6、8极差Rˊ的大小可以看出，对黄酮提取量的影响因素主次关系为B(温度）>C（料液比）>A（时间）>D（浓度），比较各因素的K值可知，最佳的提取工艺为A₃B₃C₁D₂,即提取时间为2h,温度为90℃，料液比为1:15,乙醇浓度为60%。温度对黄酮提取量影响显著

2.3 验证实验结果

分别按表3、4,最佳实验条件以及传统水提和醇提的条件下做验证性实验,相同条件下平行三次，结果见图1；

从图1可以看出，半仿生水提多糖的提取量比传统方式水提提取量提高了9.9%左右，而提取黄酮的量比传统水提要降低了大约36.6%;半仿生醇提多糖的量比传统醇提的提取量提高了25.7%,黄酮的量比传统醇提的提取量提高了32.3%,可以得出，半仿生水溶剂提取法适合玉米须多糖的提取而不利于提取黄酮，半仿生醇提多糖和黄酮均优于传统醇提。虽然半仿生多糖和黄酮的提取量比常规的高，但不是提取率越高，活性越好，为此选抗氧化实验考察其活性；

2.4 两种方法提取液的抗氧化活性结果分析

以不同玉米须提取液的抗氧化活性为考察指标，考察了不同方法的提取液总还原能力和清除DPPH自由基能力，结果如图2，3。

从图2、3、4、5可以看出，两种水提取液均有总还原能力和清除DPPH自由基能力，随着体积浓度浓度的增加，总还原能力和清除DPPH的能力也随之增强，呈现良好的量效关系。传统水提取液的总还原能力和清除自由基的能力均比半仿生水提取法强，原因可能是由于pH的环境使得玉米须中黄酮和多糖等抗氧化活性物质被破坏，使得抗氧化能力减弱；

半仿生醇提和传统醇提法对玉米须醇提取物的抗氧化活性的影响，如图6、7；

从图5、6、7可以看出，半仿生醇提和传统醇提均有总还原能力和清除DPPH自由基的能力，且随着溶液浓度的增加吸光度也随着增加，能力为VC>半仿生醇提>传统醇提；

本发明有以下有益效果：

1.半仿生法水提多糖的提取量可达38.29mg/g，比传统水提高出9.9%；黄酮的量比传统水提降低了大约36.6%，因此半仿生水提法是提取玉米须多糖的有效途径；

2. 半仿生法醇提玉米须黄酮提取量达到了15.59mg/g，比传统醇提提高了32.3%；多糖为59.53mg/g,比传统醇提提高了25.7%；

3. 半仿生醇提取液中，杂质的浸出率低，多糖、黄酮含量高，不同pH值的醇溶液提高了玉米须中的含有羟基的类物质的溶解度具有较高的还原能力和自由基清除能力，结果半仿生醇提玉米须有较好的抗氧化活性。

附图说明

图1验证性实验结果

图2 水提取液的总还原能力

图3 VC总还原能力

图4 水提取液清除DPPH自由基能力

图5 VC清除DPPH自由基能力

图6 醇提取液总还原能力

图7 醇提取液清除DPPH自由基能力

实施例1

将玉米须剪碎，称取2g玉米须四份，分别放入100 ml圆底烧瓶中，进行水提、60%乙醇醇提、半仿生水提、半仿生醇提（60%乙醇），料液比为1:35，提取温度为90℃，水浴加热，提取次数为3次，提取时间为2h，半仿生提取的pH值分别为2、7.5和8.3；

提取率为：水提多糖3.96%，半仿生水提多糖8.58%；醇提多糖7.4%，半仿生醇提多糖23.41；水提黄酮0.51%，半仿生水提黄酮1.05%；醇提黄酮0.81%，半仿生醇提黄酮2.64%；

传统水提总还原能力和清除DPPH自由基能力高于半仿生水提；半仿生醇提总还原能力和清除DPPH自由基能力高于传统醇提。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，在不脱离本发明的核心技术的前提下，考虑药材目数、料液比、提取温度、提取时间、提取次数等，使半仿生技术接近真正仿生提取效果，减少成本，这些提高也应属本专利的保护范围。

Claims

1.一种玉米须活性组分的半仿生提取方法，其特征在于：玉米须清洗去尘，晾干，粉碎，过60目筛后，以乙醇为溶剂，乙醇浓度50-70%，两者料液质量比1:15-1:35，加入圆底烧瓶中，温度70-90℃，提取时间1-2h，先在pH2.0溶剂中提取，冷却过滤，收集滤液，所得滤渣在pH7.5，pH8.3溶剂各重复提取一次，合并滤液，减压浓缩得提取液，冷冻干燥得玉米须醇提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用磷酸缓冲液调pH。