CN103288889B - 蒽醌衍生物及其药物组合物与其在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

提供蒽醌衍生物及其药物组合物与其在制药中的应用。从酸模属中药和一株白三叶草内生真菌烟曲霉中分离纯化一系列蒽醌类化合物，它们具有显著的抑制高糖诱导的肾系膜细胞株分泌IL-6,纤粘连蛋白（Fibronectin）和IV型胶原蛋白的作用，显示该类化合物在制备抗糖尿病性肾病和慢性肾病药物或食品中的应用前景。<!--1-->

Description

蒽醌衍生物及其药物组合物与其在制药中的应用

技术领域：

本发明属于药物或食品技术领域，涉及一类蒽醌衍生物及其在制备治疗糖尿病性肾病或慢性肾病的药物或食品中的应用。

背景技术：

现代紧张的生活方式以及饮食方式的改变，致使高血糖成为世界范围内肥胖和糖尿病增多的主要原因。而作为糖尿病的主要并发症，糖尿病肾病是终末期肾脏疾病甚至致死的主要病因。肾科虽小，却有大病。肾衰患者由于需要肾脏供体或透析对经济社会造成了较重的经济负担。

糖尿病肾病是由于高血糖引起的机体病变：血流量和血管通透性增加，产生过剩沉积的细胞外基质(ECM)。而其进而持续抑制系膜细胞的生长以及随后诱导系膜细胞肥大，同时下调内皮细胞营养因子的产生。这些变化又导致肾肾小球系膜扩张，肾小球肥大，肾小球硬化和肾细胞的损失。在高血糖引起的肾病发生过程中，确切的发病机制还不很清楚,但致病原因主要涉及四个方面的分子生物学机制：通过多元醇通路增加通量，增加后期糖基化末端产物形成，PKC亚型的活化以及己糖胺通路的激活。针对上述机理，目前动物实验或临床上在研究的药物主要如肾素阻滞剂、糖基化终产物抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、抗氧化剂以及内皮素A受体拮抗剂等，但其疗效还在进一步观察中，其中部分药物因强烈副作用而终止了其临床研究。一些血管紧张素II受体抑制剂、血管紧张素转化酶拮抗剂、免疫抑制剂等在肾病干预中能发挥作用，但其疗效和副作用都有待于进一步改善。因此肾病的治疗，目前除了一些预防措施如血糖、血压控制外，并没有特效的治疗方法。

传统观点认为，糖尿病肾病主要由糖代谢紊乱、脂质代谢紊乱、血流动力学异常以及遗传等非免疫性因素造成的肾脏病变。然而，一项对448例欧洲糖尿病肾病患者的肾组织病理检查发现，糖尿病肾病患者肾组织中炎症细胞数量明显增加。动物试验也发现SD大鼠注射STZ(Ⅰ型糖尿病模型)第2天肾脏巨噬细胞数量已明显增加，并且在肾组织中检测到高表达的IL-6、MCP-1、IL-1β和ICAM-1、VCAM-1等促炎症细胞因子。巨噬细胞浸润及炎症介质表达上调与肾脏细胞外基质的合成增加相关，表明在糖尿病肾病早期肾组织的炎症反应已明显加强。该研究结果提示炎症反应可能参与糖尿病肾病的发生机制。侯凡凡等最近的研究也证实Ⅰ型糖尿病动物早期肾小球和肾小管中巨噬细胞的数量以及MCP-1、TGF-β1的表达均有增加。并发现糖尿病时体内蓄积的代谢毒素—晚期氧化蛋白产物(AOPPs)能够进一步促进糖尿病动物肾组织中巨噬细胞浸润和MCP-1和TGF-β1表达上调。通过阻断实验表明AOPPs主要通过活化NADPH氧化酶，促进肾组织超氧阴离子生成，从而激活redox敏感的炎症反应，造成糖尿病动物肾脏病变和肾功能进一步恶化。因此肾病发展过程中伴随炎症，以炎症过程为靶点去寻找抗炎药物可能有助于肾病的治疗。细胞外基质如Ⅳ型胶原(CollagenIV)、纤粘蛋白(Fibronectin,FN)、III型前胶原(PIII)、透明质酸(HA)等不仅是肾脏系膜的主要组分，同时也是肾基底膜的重要成分。然而在胶原成分中，最重要的是IV胶原蛋白。IV型胶原是典型的基质胶原，可由活化的肾小球系膜细胞、内皮细胞、上皮细胞、肾小管上皮细胞等合成和分泌。因此IV型胶原的合成和分泌增多及降解减少是许多肾脏疾病发展、ECM积聚、终至肾小球硬化和肾间质纤维化的主要原因或重要参与因素之一。抑制IV型胶原的合成或分泌将有助于肾病治疗。

综上，近年的研究进展表明糖尿病肾病和肾病的发生发展是与慢性炎症如IL-6,细胞外基质如Ⅳ型胶原和纤粘连蛋白的过度分泌和沉积密切相关。观察药物对高糖诱导的肾系膜细胞的细胞因子和胶原蛋白的影响，已经成为目前研究糖尿病肾病和慢性肾病防治药物的常用方法。

酸模属(Rumex)植物广泛分布，具有凉血止血、清热、利便、利尿通淋等功效。推测其中含有治疗泌尿系统疾病的药效成分。本申请人曾从酸模属植物中发现一个抗焦虑候选药物，在目标化合物制备工艺研究中，蒽醌类化合物常作为杂质进行去除，本发明为蒽醌类化合物的综合利用也提供了空间。

现有技术中未见有本发明的化合物及其具有糖尿病肾病或慢性肾病价值治疗前景的活性的相关报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供具有抗糖尿病肾病或慢性肾病价值的化合物14和15及其结构衍生物1-4,6-8,9,11,14-20；该发明的系列化合物在制备抗糖尿病性肾病或/和慢性肾病的药物或食品中的应用。

本发明的上述目的是由下述的技术方案得以实现的：

具有下述结构式的蒽醌类化合物，

治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物组合物，含有治疗有效量的上述化合物和药学上可接受的载体。

上述化合物在制备治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物中的应用。

上述化合物在制备治疗糖尿病肾病或慢性肾病的食品中的应用。

治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物组合物，含有治疗有效量的下述结构式所示的蒽醌类化合物和药学上可接受的载体，

上述的任一化合物或其组合物在制备治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物中的应用。

上述的任一化合物或其组合物在制备治疗糖尿病肾病或慢性肾病的食品中的应用。

本发明化合物可以单独直接应用或组合应用，也可以与其它药物包括植物提取物组成复方的形式使用，可以使用不同的药用辅料，制成多种固体制剂和液体制剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射两种形式给药。使用量可根据给药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。

附图说明：

图1表示化合物抑制高糖诱导的肾系膜细胞促炎症因子及细胞外基质测定实验：采用USCK公司的ELISA试剂盒检测大鼠系膜细胞培养上清IL-6，CollagenIV和Fibronectin的表达；

图1A为化合物对白细胞介素-6(IL-6)的抑制作用，*P<0.05vs正常糖；^#P<0.05vs高糖，化合物的名称为：chrysophanol(1),emodin(2),physcion(3),aloe-emodin(4),chrysophanol-8-O-β-D-glucopyranoside(6),emodin-8-O-β-D-(6)-O-acetyl)glucopyranoside(7),emodin-8-O-β-D-glucopyranoside(8),nepalensideA(9),rumejaposideE(11),1-O-methylemodin(16),questin(17),1,2-seco-trypacidin(18),trypacidin(19),andasperfumin(20)；

图1B为化合物对IV型胶原的抑制作用.*P<0.05vs正常糖；^#P<0.05vs高糖；

图1C为化合物对纤粘连蛋白的抑制作用.*P<0.05vs正常糖；^#P<0.05vs高糖。

图2为化合物14和15的CD图谱。

具体实施方式：

下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明的范围。

实施例1：

化合物14和15的分离纯化：

巴天酸模干燥根19kg，粉碎成粗粉，用95％乙醇室温浸渍4次，每次溶媒40L，每次28h，浸渍过程不断搅拌。合并浸渍液，减压回收溶剂得浸膏2.4kg，浸膏用水混悬后依次用等体积石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，每种溶媒萃取3次。乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂得245g提取物，该提取物经硅胶柱层析(硅胶3000g)，氯仿－甲醇系统梯度洗脱(99:1，98:2，97:3，96:4，95:5，94:6，93:7，92:8，90:10，85:15，80:20)，每种溶剂梯度为2倍柱体积，按照每份500mL收集，根据薄层色谱10％硫酸乙醇溶液显色行为进行合并，共得7个流份。流份4(90:10洗脱部分，7g)经MCIgelCHP20P柱层析，30％-100％甲醇洗脱，收集45％洗脱部分(700mg)，回收溶剂后经凝胶SephadexLH-20柱色谱，甲醇洗脱得3个流份，其中1个流份(260mg)经硅胶柱层析，氯仿－甲醇(9:1-10:1)洗脱，根据TLC特征合并，得化合物11(9mg),14(7mg)和15(10mg)。

化合物14和15的结构确证：

化合物14和15的结构式如下所示：

化合物14和15的结构鉴定数据：

¹Hand¹³CNMRdataofcompound14^aand15^ainCD₃OCD₃

^a1HNMRrecordedin500MHz,¹³CNMRrecordedin125MHz

BatiansuanmosideA(14):yellowamorphoussolid；[α]²² _. ⁵ _D-56.6(c0.3,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)367(3.46),276(3.17),252(3.11),211(3.75)nm；CD(c0.1,MeOH)Δε₂₀₆–7.91,Δε₂₇₄+7.47,Δε₃₀₅–5.16,Δε₃₄₁–7.48；IR(KBr)ν_max3441,3425,2921,2852,1639,1619,1482,1378,1290,1267,1216,1160,1085,1019cm^-1；¹Hand¹³CNMRdata,seeTable1；EI-MS:m/z448[M]⁺；HR-EI-MS:m/z448.1362[M]⁺(calcdforC₂₂H₂₄O₁₀,448.1369).

BatiansuanmosideB(15):yellowamorphoussolid；[α]²⁵ _D+1.0(c0.15,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)367(3.43),276(3.16),253(3.11),211(3.72)nm；CD(c0.1,MeOH)Δε₂₀₇+6.32,Δε₂₇₅–8.40,Δε₃₀₄+1.93,Δε₃₄₀+4.69；IR(KBr)ν_max3441,2924,2855,1620,1482,1378,1306,1258,1160,1093,985cm^-1；¹Hand¹³CNMRdata,seeTable1；EI-MS:m/z448[M]⁺；HR-EI-MS:m/z448.1363[M]⁺(calcdforC₂₂H₂₄O₁₀,448.1369).

化合物11(rumejaposideE)的结构通过与文献Jiang,L.L.；Zhang,S.W.；Xuan,L.J.Phytochemistry2008,68,2444.的波谱学数据对照而鉴定。

实施例2：

白三叶草健康新鲜叶片于自来水冲洗洗净，甩干水，于75％乙醇液中浸泡5min，取出，再于2％次氯酸钠溶液中浸泡20min，取出，无菌水冲洗3-4次，无菌刀将其切成约0.5×0.5cm的小片，贴附于PDA培养基上，37℃培养至切片边缘长出菌丝，划线分离至PDA培养基上的菌落为单一菌落，插片法观察菌落形态，18SrRNA基因测序鉴定本菌种为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)。采用大米(5kg)固体发酵培养基发酵，种子培养基为不加琼脂的PDA培养基，按10-20％的接种量接种于大米培养基，待菌丝长满，乙酸乙酯提取三次，提取液减压回收溶剂，得浸膏15g。浸膏经硅胶柱(1.7kg)，层析，氯仿－甲醇13:1洗脱，展开后掏柱，根据薄层色谱显色行为合并，分为Ⅰ-Ⅳ个部位，取部位Ⅱ(11.7g)上凝胶SephadexLH-20柱，氯仿:甲醇(3:2)洗脱，共分七个部位A-G，部位G再经RP-18柱层析，60％甲醇洗脱得四个部分，其中G-3(30mg)含一个主成份，其再次经RP-18柱层析(40％甲醇洗脱)、凝胶SephadexLH-20(氯仿－甲醇3:2)和制备薄层色谱(石油醚－丙酮2:1)跟踪得化合物16(9.6mg)。部位F(385mg)经RP-18柱层析，50％甲醇洗脱得化合物17(11.5mg)。部位E(3.75g)经RP-18柱层析，40％甲醇洗脱，收集含主点组份，其再经凝胶SephadexLH-20(氯仿－甲醇3:2)和HPLC(RP-18，5μM)半制备(70％甲醇洗脱)得化合物20(4.2mg)。部位G-4(70mg)含一个主成分，其经RP-18柱层析(40％甲醇洗脱)、凝胶SephadexLH-20(氯仿－甲醇3:2)跟踪得化合物18(44.8mg)。部位C(453mg)经硅胶柱层析，氯仿－甲醇150:1洗脱，得到二个组份，其中C-2(30mg)经凝胶SephadexLH-20(氯仿－甲醇3:2)，硅胶柱层析(石油醚－乙酸乙酯2:1)和HPLC(RP-18，5μM)半制备(80％甲醇洗脱)得化合物19(1.7mg)。

上述已知化合物的结构通过与文献对照而鉴定，分别是化合物16(贾振宝,陈文伟,蒋家新,etal.决明子中蒽醌类化学成分的研究.林产化学与工业.2009,29(3):100-103)；化合物17(华燕,周建于,倪伟,etal.虎杖的化学成分研究.天然产物研究与开发.2001,13(6):16-18.)；化合物18,19(张志杰,屈凌波,周雨朦,etal.植物内生真菌SIPI3.0550的分类鉴定及代谢产物研究.ChineseJournalofNewDrugs.2010,19(16):1402-1406.)，化合物19具有一个手性中心，其对应的比旋光值为-142(c0.3,MeOH)；化合物20(JYLiu,YCSong,ZZhang,etal.AspergillusfumigatusCY018,anendophyticfungusinCynodondactylonasaversatileproducerofnewandbioactivemetabolites.JBiotechnol,2004,114:279-87)

实施例3：

化合物9的制备和鉴定见文献RenqiangMei,HenxingLiang,JunfengWang,LinhongZeng,QingLu,YongxianCheng*.NewSeco-anthraquinoneGlucosidesfromRumexnepalensis,PlantaMedica,2009,75,1162-1164。

化合物1－8曾从尼泊尔酸模和戟叶酸模中分离得到，后经市场购买供药理学研究，购自江西本草天工科技有限公司和阿拉丁试剂有限公司。

化合物14和15是从巴天酸模中分离得到的，化合物16-20是从白三叶草内生真菌烟曲霉(Aspergillusfumigatus)中发现的，其它化合物分别来自尼泊尔酸模和戟叶酸模。它们是一类具有显著抑制肾系膜细胞促炎症因子(如IL-6)、纤粘连蛋白和IV型胶原的蒽醌、裂环蒽醌、氢化蒽醌或蒽醌中间体，目前化合物14和15尚未见其结构式报道，因此是新物质，其抑制肾系细胞多种促炎症因子和胶原的药理作用也未见过报道。在糖尿病肾病或慢性肾病中具有重要的药用价值。

化合物1-20的结构式为：

实施例4：

实施例1-3中化合物中的任一种，按常规法加注射用水，精滤，灌封灭菌后可制成注射液。

实施例5：

实施例1-3中化合物中的任一种，将其溶于无菌注射用水中，用无菌漏斗过滤，分装，低温冷冻干燥后无菌熔封即得粉针剂。

实施例6：

实施例1-3中化合物中的任一种，按常规法配以各种药用辅料可制成片剂。

使用实施例1-3中化合物中的任一种作为药物活性成分，使用几种赋形剂作为制备组合药物片剂的辅料成分，按照一定比例配比制成每片含有药物成分1-100mg的片剂样品，表1给出普通片剂的配方比例。

将一定数量实施例1-3中化合物中的任一种原料与赋形剂辅料制备成不同剂量片剂制剂(如表1)：将几种赋形剂辅料与原料药均匀混合，加入1％羟甲基纤维素钠溶液适量制成软料，过筛制粒，湿粒烘干并过筛整粒，加入硬脂酸镁和滑石粉混合均匀后压片即得。

表1实施例1-3中化合物中的任一种组合药物片剂的原料药和辅料配方

实施例7：

实施例1-3中化合物中的任一种按常规法配以各种药用辅料可制成胶囊剂：

含有实施例1-3中化合物中的任一种作为有效成分的药物组合胶囊制剂的制备，使用实施例1-3中化合物中的任一种作为药物活性成分、使用几种赋形剂作为制备组合药物胶囊剂的辅料成分，按照一定比例配比制成每粒胶囊中含有化合物成分1-100mg的胶囊制剂，表2给出普通胶囊制剂的配方比例。

将一定数量的实施例1-3中化合物中的任一种与赋形剂辅料制备成胶囊制剂的方法是：将几种赋形剂辅料与实施例1-3中化合物中的任一种原料药混合均匀，加入1％羟甲基纤维素钠溶液适量，制成湿粒烘干过筛整粒，加入硬脂酸镁混合均匀，插入胶囊制得；或不使用制粒步骤，而直接将实施例1-3中化合物中的任一种原料药与几种赋形剂辅料混合均匀，过筛后，直接装入胶囊。

表2实施例1-3中化合物中的任一种组合药物胶囊制剂的原料药和辅料配方

实施例8：

本发明化合物及其与药用辅料组成的药物组合物的抗糖尿病肾病或慢性肾病的药理作用。

化合物抑制肾系膜细胞株炎症因子和细胞外基质测定实验(见图1所示)：

采用USCN公司的ELISA试剂盒检测大鼠系膜细胞培养上清IL-6，CollagenIV和Fibronectin表达。图1A为IL-6表达；图1B为Fibronectin表达；图1C为CollagenIV表达。

实验原理：

采用双抗体夹心法测定标本中大鼠系膜细胞培养上清IL-6、Fibronectin及CollagenIV表达水平。用纯化的抗IL-6、Fibronectin及CollagenIV抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被单抗的微孔中依次加入含表达IL-6、Fibronectin及CollagenIV的待测样品，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-6、Fibronectin及CollagenIV的表达呈正相关。用酶标仪450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中大鼠IL-6、Fibronectin及CollagenIV浓度。

样本处理：

1)细胞培养上清：无菌管收集，2,000rpm/min，离心20min。仔细收集上清。分装冻存于-80℃。

2)刮取底壁细胞，总蛋白裂解液裂解，12,000rpm/min，4℃离心10min，收集上清，Bradford法测量总蛋白含量。

ELISA检测：

操作按试剂盒说明进行：

1)标准品的稀释与加样：酶标包被板设标准品孔，倍比稀释(稀释后各孔加样量都为50μL)加入IL-6、Fibronectin及CollagenIV的标准品。

2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品和酶标试剂，其余各骤操作相同)、待测样品孔(样品稀释度为5倍)。轻轻晃动混匀。

3)温育：37℃，30min。

4)洗涤：弃去板中液体，甩干，洗液洗5次，30秒/次。吸水纸拍干。

5)加酶：每孔加入50μL酶标记液，空白孔除外。

6)温育：37℃，30min。

7)洗涤：弃去板中液体，甩干，洗液洗5次，30秒/次。吸水纸拍干。

8)显色：每孔加入底物A、B液各50μL/孔。37℃，15min。避光。

9)终止：每孔加入终止液各50μL/孔。

10)测定：以空白孔调零，酶标仪450nm读吸光度(OD值)。

11)实验重复3次。

结果计算：利用标准品定量曲线分析计算样品浓度并以细胞总蛋白含量校正(IL-6：pg/mgcellprotein；Fibronectin&CollagenIV：ng/mgcellprotein)。结果如图所示。

以上结果说明化合物1-4,6-9,11,14-20在10μM时对高糖诱导的肾系膜细胞株炎症因子IL-6,纤粘连蛋白(Fibronectin),以及胶原蛋白(CollagenIV)均有明显的抑制作用。由于糖尿病肾病和慢性肾病发展过程中伴随有明显的慢性炎症、细胞外基质沉积等，因此抑制促炎症细胞因子及细胞外基质的过度表达对糖尿病肾病或慢性肾病的防治是具有积极意义的。

Claims (5)

1.具有下述结构式的蒽醌类化合物，

2.治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物组合物，含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。

3.权利要求1所述的化合物在制备治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物中的应用。

4.权利要求1所述的化合物在制备治疗糖尿病肾病或慢性肾病的食品中的应用。

5.一种含有权利要求1中化合物的药物组合物，其中还可以包含下述化合物中的一种或多种，