CN102309694A - 一种玉米须总黄酮的提取与纯化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种玉米须总黄酮的提取与纯化方法及其应用。本发明以玉米须为原料，包括原料剪碎、浸提、浓缩、纯化步骤，其特征在于：所述浸提是指在浓度为60％的乙醇溶液中温度为60℃条件下提取时间3小时，料液比1∶20；所述纯化是指用HPD-100大孔树脂纯化粗提取液，在家兔饲料中按照2％添加量饲喂家兔，取得了显著(P≤0.1)的降血脂效果。该方法操作简单，成本低，适于实际生产操作。可以开拓农副产品的综合利用，带动农村经济的繁荣，本发明对玉米须总黄酮进行研究为对玉米须更好地开发利用，为其临床疗效的依据奠定基础。

Description

一种玉米须总黄酮的提取与纯化方法及其应用

技术领域

本发明是关于一种从玉米须提取高含量药物成分的工艺，具体的说是涉及从禾本科玉蜀属植物玉米的花柱和柱头即玉米须中提取纯化降血脂物质黄酮的生产工艺。 

背景技术

玉米须(Stigma maydis)为禾本科玉蜀属植物玉米(Zea mays L.)的花柱和柱头。它含有多种化学成分，如挥发油、皂苷、生物碱、类总黄酮、多聚戊糖、尿囊素、有机酸等。其味淡、性平，有利尿、泻热、平肝、利胆之功效，可用于治疗肾炎、胆结石、糖尿病、黄疸、麻疹、乳糜血尿、血蹦等症。现代药理研究证明玉米须有显著的利尿^[、降血糖、降压、抑菌、增强免疫、抗癌等功效。而且玉米须总黄酮是一类高效低毒的天然抗氧化剂，因此其成为研究和开发利用的热点，任顺成等的研究证明，玉米须总黄酮对脂质体发生的过氧化有明显的抑制能力。玉米须是我国传统的中药材，全国各地均广泛栽培玉米，因此，作为玉米副产物的玉米须资源十分丰富，但对它的开发利用非常有限，仅少量入药外，大部分被白白丢弃。玉米须既有明显的药理价值，又具备一定的食疗特征，进行工业化开发利用前景相当广阔。当前对玉米须的临床及应用效果研究较多，但对其活性成分研究极少。 

黄酮类化合物(flavonoid)泛指2个具有酚羟基的苯环通过中央3碳原子相互连接而成的化合物，是在植物中分布非常广泛的一类天然产物，其在植物体内大部分与糖结合成苷类，有一部分是以游离态(苷元)形式存在的。根据中央三碳链的氧化程度、B-环连接位置(2-或3-位)以及三碳链是否构成环状等特点，可将主要天然黄酮类化合物分类为：黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、花色素、黄烷二醇、双苯吡酮、异黄酮、二氢异黄酮、查耳酮、二氢查耳酮、橙酮、高异黄酮等10余类化合物。根据任顺成等、张慧恩等的研究，玉米须中的黄酮主要有：刺芒柄花素(7-羟基-4′2-甲氧基异黄酮)(I)，2″-O-α-L-鼠李糖基-6-C-(3-脱氧葡萄糖基)-3′-甲氧基木犀草素(II)，2″-O-α-L-鼠李糖基-6-C-(6-脱氧-ax-5-甲基-木-己-4-羰基)-3′-甲氧基木犀草素(III)，7，4′-二羟基-3′-甲氧基黄酮-2″-O-α-L-0鼠李糖基-6-C-岩藻糖苷(IV)，7，4′-二羟基-3′-甲氧基黄酮-2″-O-α-L-鼠李糖基-6-C-岩藻糖苷(V)和6，4′-二羟基-3′，5′-二甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖苷(VI)等。 

对于玉米须，总黄酮含量相对较低，若直接采用超临界流体萃取技术，消耗流体会很多，从经济效益来看非常不合算，所以富集分离总黄酮的方法主要有有机溶剂萃取法和树脂吸附分离法。由于有机溶剂萃取法存在溶剂残留和生产成本高的缺点，而大孔吸附树脂由于它具有物理化学稳定性高，吸附选择性强，富集效果好，解吸条件温和，再生简便，使用周期长 等特点，因此，近些年来，树脂吸附法得到了长足的发展，广泛应用于天然产物的分离纯化。 

发明内容

本发明是为了避免现有技术存在的不足之处，旨在提供一种从玉米须中提取及纯化总黄酮的方法。 

本发明玉米须总黄酮的提取与纯化方法，以玉米须为原料，包括原料粉碎、浸提、浓缩、纯化步骤，其特征在于：所述浸提步骤中，浸提液是体积浓度为55-65％的乙醇溶液，浸提是在温度为60-80℃、密闭条件下浸提2-4小时，浸提料液质量百分比为1∶20。 

本发明所述纯化步骤中使用HPD-100大孔树脂对黄酮粗提取液进行初步纯化粗提液。 

本发明的另一目的是提供玉米须总黄酮在降血脂药物中的应用。 

与已有技术相比，本发明有益效果具体体现在： 

本发明首先从玉米须中提取了总黄酮，浓缩配制成不同浓度的总黄酮初提液，然后选择了HPD-100吸附树脂，进行梯度洗脱等吸附与解吸实验来确定HPD-100的最佳吸附分离条件。最佳提取条件为：提取60℃，提取时间3小时，乙醇浓度60％，料液比1∶20。其中温度是首要因素。大孔吸附树脂HPD-100对玉米须总黄酮的最佳吸附条件是提取液总黄酮含量为0.43～0.54mg/mL，pH为提取原液3.7，上样流速为1.5mg/min。 

本发明利用HPD-100型大孔树脂提取纯化黄酮，使黄酮的纯度由约5.6％提高到了60％以上，提取和纯化效率较高。本发明采用了大孔树脂吸附分离技术和乙醇洗脱技术，大大提高了黄酮的提取量，该工艺操作更加简单易于控制条件，成本低，树脂可反复利用，更适合工业生产。 

本发明可以开拓农副产品的综合利用，带动农村经济的繁荣，本发明对玉米须总黄酮进行研究为对玉米须更好地开发利用，为其临床疗效的依据奠定基础。 

附图说明

图1是本发明具体实施方式中家兔生长曲线图。 

以下通过具体实施方式对本发明做进一步说明。 

具体实施方式

1)玉米须的获取 

从安徽毫州华佗镇一玉米种植农田采摘(玉米植株生长至成熟期，玉米须为棕褐色，含水量约为20％)，将采摘回的玉米须于70℃烘箱中烘6小时，使其失去游离水，一周内使用；或102℃烘10小时，除结合水，待长期使用。 

2)树脂的预处理 

用浓度为50-60％的乙醇充分浸泡，乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊，去离子水洗尽醇，最后用5％HCl溶液浸泡3h，去离子水洗至pH值为中性，接着用5％NaOH溶液浸泡3h，去离子水洗至pH值为中性。 

3)黄酮的提取过程 

用天平称取20g玉米须，倒入1L的烧杯内，加体积浓度60％乙醇溶液400mL，即料液比为1g∶20mL，充分浸泡数小时后放入水浴锅60℃下浸提2-4h(加入乙醇后要注意密封，防止乙醇挥发，影响提取效率)，将浸提液倒入1L烧杯，在可调式电炉上浓缩，浓缩至200mL加去离子水400mL继续浓缩，至200mL再加去离子水400mL，直到浓缩至100mL且无醇味。冷却后将浓缩液装入离心管离心，5000r/min，离心1h后取出，将上清液倒入广口瓶加适量去离子水稀释盖上玻璃塞放入冰箱。依此方法数次提取足够量提取物以备用。 

4)标准曲线的绘制 

精密称取5.6mg芦丁标准品(含量91.7％)，定容至50ml容量品中。配制成0.102704mg/ml芦丁对照品溶液。分别取芦丁对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0ml于25ml容量瓶中，用0.1mol/L三氯化铝乙醇溶液定容至25ml，混匀，10min后于400nm波长处测定吸光度，三氯化铝乙醇溶液为空白参比，制标准曲线，得回归方程：Y＝0.03040X+0.00097，r＝0.99986。 

5)含量的测定 

取玉米须黄酮供试液于50ml容量瓶中，用0.1mol/L三氯化铝乙醇溶液定容至50ml，混匀，10min后于400nm波长处测定吸光度(仪器名称：722S分光光度计，生产厂家：上海精密科学仪器有限公司制造)，三氯化铝乙醇溶液为空白参比。 

6)玉米须总黄酮的纯化 

①装柱：使用缓冲液将树脂调至指定pH(中性)后，利用漏斗将预处理好的树脂装入(1×20)cm玻璃层析柱中，柱床体积为15.5mL。装柱要让树脂随着缓冲液慢慢沉下，柱床应该紧实不能有气泡。 

②上样：利用恒流泵将玉米须总黄酮提取液(上样液浓度0.43～0.54mg/mL)上柱，控制一定流速(1.5mL/min) 

③收集定容：分步收集(5mL/管)，用微型移液器取出1mL流出液，用0.1mol/L三氯化铝乙醇溶液定容到50mL。 

④测吸光度：反应10分钟后400nm处测出吸光度。 

⑤吸附量的计算：当流出液吸光度达上样液的1/10时，停止上样，将接到的流出液倒入量筒，量得流出液体积，计算吸附量。(吸附量＝上样液浓度(mg/mL)×流出液体积(mL)) 

 ⑥解吸：使用3倍柱床体积(40mL)的75％的乙醇溶液进行解吸，同样控制一定流速，分步收集洗脱液主段(5mL/管)。 

⑦黄酮含量的测定：用氯化铝显色法测定每个收集管内洗脱液的总黄酮含量，得到洗脱曲线。(解吸率＝洗脱液体积(mL)×洗脱液浓度(mg/mL)/吸附量) 

⑧黄酮纯度测定：分别蒸干上样浓缩物与主段，称取重量。(黄酮纯度＝黄酮总量(mg)/干燥物重量(mg)×100％) 

所有不同条件下的吸附和解吸实验都做两个平行，这样可以减少实验误差。 

树脂除了吸附目标物外，还会吸附杂质，而这些杂质会污染树脂，所以每次使用后，树脂必须再生。每次层析后，将树脂倒出，用95％乙醇冲洗数次，待颜色较浅后加95％乙醇浸泡数小时，再用去离子水将醇洗净，最后用缓冲液调至一定pH后即可再次使用。(树脂可以反复使用3到4次) 

本发明中所述料液比为1g∶20mL，最佳浸提温度为60℃，为实验节省了原材料和能源。采用HPD-100大孔树脂对粗黄酮进行精制，使黄酮的纯度有约5.6％提高到了60％以上，提取和纯化效率较高。 

下面通过药学实验进一步验证：玉米须黄酮对幼年家兔生长性能及血脂的影响。 

1.材料与方法 

1.1生长兔颗粒饲料配方及营养比 

原料配比(％)：玉米20.0，小麦麸15.0，大豆粕5.0，花生仁饼11.2，花生秧36.0，苜蓿草粉10.4，食盐0.5，兔乐0.7，球净1.0，蛋氨酸0.1，赖氨酸0.1。 

配方营养(％)：消化能9.54兆焦/千克，粗蛋白17.46，粗纤维12.0，钙1.2，总磷0.34，赖氨酸0.71，蛋+胱氨酸0.52。 

1.2仪器与试剂 

1.2.1仪器 

兔笼2个、食盆4个、烧杯(1000mL)、可调温电炉(1000W)、物理天平(感量：0.01g)、玻棒、量筒(1000mL)、一次性注射器(2mL)6只、试管6个、AUP-1-35G-1型实验室级专用超纯化水机(颐洋企业发展有限公司)、DHG-9425A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)、DK-8AX型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)。 

1.2.2试剂 

玉米须提取物(由上述方法提取获得，玉米须黄酮含量为0.24％)，纯水，消毒酒精。 

1.3实验步骤 

1.3.1动物及分组： 

家兔9只，体重300g～400g，普通颗粒饲料适应性饲养全部家兔一周后，选取体重值接近的6只随机分为2组，各组分别再饲养3周。分组前，家兔在毛色、眼神、进食、活动、粪便颜色及性状等一般情况均无明显差异。(1)对照组(3只)：每日饲喂普通颗粒饲料；(2)黄酮组(3只)：每日饲喂含玉米须黄酮0.2％的普通颗粒饲料(饲料混匀采用逐渐扩大，充分混匀，反复过筛，烘干的方法)。调整幼兔饲喂颗粒饲料为每组100g。兔子均在同一生长条件下自由采食与饮水。 

1.3.2兔子体重及生长观察 

每日观察两组家兔精神与进食情况，每周定时称重一次(清晨8点，空腹)。根据公式：生长速度(平均日增重)＝统计期内肉兔增重(克)/统计期内饲养日期(天) 

料肉比＝肥育期中消耗的饲料量/肥育期中的总增重 

转化率(％)＝总增重/总消耗饲料量×100％ 

肝肾称量，得数据。 

1.3.3血脂测定 

分别在实验第一周末和第四周末耳中动脉采血。采血前家兔禁食12h，禁水6h。取血2mL。标本送至武警安徽省总队医院检验科检测(血脂检测仪，型号：NF42M2675，生产厂家：南京丰达医疗仪器有限责任公司)。 

统计学处理：采用SAS统计学软件，进行方差分析。 

2结果与分析 

2.1黄酮对家兔生长性能的影响 

2.1.1肉眼观察： 

黄酮组兔子表现活跃，静伏时间较短；食欲旺盛。越是到实验后期，和对照组差异愈发明显，对照组静伏时间长，活动不积极，食欲正常，有明显的满足感。其它未见任何不良反应。 

2.1.2家兔体重比较 

表1各组每周体重比较(g) 

做方差分析知： 

表2各组每周体重比较(g) 

由以上数据可知，第一周末和第二周末两组家兔体重差异不显著，对照组增重不明显；第三周末和第四周末两组家兔体重差异非常显著，对照组明显比黄酮组家兔体重增长快。 

2.1.3生长速度比较 

生长曲线如图1。 

对照组生长速度＝848(克)/21(天)＝40.4(克/天) 

黄酮组生长速度＝504(克)/21(天)＝24(克/天) 

2.1.4料肉比 

黄酮组料肉比＝2100g/504g＝4.17 

对照组料肉比＝2100g/848g＝2.48 

2.1.5转化率 

黄酮组转化率＝504/2100×100％＝24％ 

对照组转化率＝848/2100×100％＝40.4％ 

2.1.6肝肾重量 

肝肾重量比较，如表3-4。 

表3各组肝肾重量比较(g) 

做方差分析知： 

表4各组肝肾重量比较(g) 

可知：黄酮组的肝重和肾重与对照组相比差异不显著，说明添加黄酮不会影响家兔的肝肾代谢器官。 

由以上数据知：(1)黄酮组体重增长比对照组幅度小，生长速度明显比对照组慢；(2)两组家兔的料肉比属正常范围内(目前国内家兔的料肉比：国内核心群为2.5～3.0，最低水平为4.5)黄酮组的家兔料肉比较大，说明其饲料利用率比对照组低。(3)由转化率可以看出，食用相同的饲料量，对照组能更好的将其转化为自身生长所需，也说明，玉米须黄酮是通过降低家兔对饲料的利用及转化来减缓体重增长从而达到减肥的功效。(4)对肝肾重量作用不大可知，黄酮主要是对家兔的育肥有影响，而不是通过控制自身主要的消化、代谢器官的重量来减缓体重的增长。 

2.2黄酮对家兔血脂的影响 

表5玉米须黄酮对兔子血清中血脂水平的影响(mmol/L) 

血清中血脂的正常范围：CHO为3.35～5.70mmol/L；TG为0.2～2.3mmol/L。(血脂检测仪，型号：NF42M2675，生产厂家：南京丰达医疗仪器有限责任公司) 

做方差分析知： 

表6玉米须黄酮对兔子血清中血脂水平的影响(mmol/L) 

由以上数据知：黄酮组的CHO与对照组的CHO差异不显著，表明黄酮对家兔CHO的降低作用不明显，但由CHO的正常范围值观察，黄酮有降低家兔CHO的趋势。黄酮组的TG与对照组相比差异显著，说明黄酮能很好的降低血清中的TG。而血液TG与CHO含量是判断是否高血脂的重要指标，因此，从以上试验结果看，玉米须黄酮对降低血脂有很好的作用。 

3结论 

①玉米须黄酮能改善家兔的精，气，神。长期服用黄酮的兔子表现活跃，静伏时间较短；食欲旺盛，食量大。 

②玉米须黄酮对体重有明显的降低作用，有利于减肥治疗。 

③玉米须黄酮对降低血脂(甘油三脂)有很好的作用。 

Claims (3)

1.一种玉米须总黄酮的提取与纯化方法，以玉米须为原料，包括原料粉碎、浸提、浓缩、纯化步骤，其特征在于：所述浸提步骤中，浸提液是体积浓度为55-65％的乙醇溶液，浸提是在温度为60-80℃、密闭条件下浸提2-4小时，浸提料液质量百分比为1∶20。

2.根据权利要求1所述的一种降血脂玉米须总黄酮的提取与纯化方法，其特征在于：所述纯化步骤中使用HPD-100大孔树脂对总黄酮粗提取液进行初步纯化。

3.如权利要求1所述的玉米须总黄酮在降血脂药物中的的应用。

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