CN113717295B - 一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备治疗脂肪肝药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了医药技术领域的一种杜仲酸性多糖EUP‑A1的提取方法及其在开发治疗脂肪肝药物中的应用，杜仲酸性糖EUP‑A1主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖组成，摩尔比为：8.31：1.73：43.97：3.77：31.56：10.65。杜仲酸性多糖EUP‑A1具有较好的降低脂肪肝中TG含量的功效，且对肝细胞的细胞活力无显著影响。

Description

一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备治疗脂肪肝药物中 的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备治疗脂肪肝药物中的应用。

背景技术

随着国家的发展，人们的生活水平不断提高，非酒精性脂肪肝等富贵病在我国的发生比例急剧升高。目前对非酒精性脂肪肝患者的药物治疗多采用西医药疗法，可以使用维生素e、甘草酸制剂、多烯磷脂胆碱等，如有胰岛素抵抗，还可使用胰岛素增敏剂，合并有血脂增高的患者，可以在综合治疗的基础上应用降脂药物。

中医药文化在我国有数千年的发展与积淀，是我们重要的文化宝库，也是药物研发的宝库。杜仲是一味非常重要的中药，为杜仲科植物杜仲的树皮，其味甘，性温，有补益肝肾、强筋壮骨、调理冲任的功效。临床上被广泛用于降血压，利尿等疾病，而在治疗脂肪肝方面的研究尚未见报道。

发明内容

本发明意在提供一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备治疗脂肪肝药物中的应用。

本方案中的一种杜仲酸性多糖EUP-A1，主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖组成，各组分的摩尔比为8.31：1.73：43.97：3.77：31.56：10.65。

本发明所提供的杜仲酸性多糖EUP-A1的提取方法，包括以下步骤：

S1、将杜仲树皮放入蒸馏水浸泡至湿透；

S2、采用水提醇沉的方法得到杜仲树皮的提取物，将提取物冻干得到杜仲总多糖；

所述水提醇沉的步骤是：(1)将浸透后的杜仲树皮煎煮多次，每次1～3h，合并每次的煎煮液；(2)煎煮液离心后留取上清液，再向上清液中加入乙醇进行沉淀，上清液中乙醇的浓度为80％，沉淀组分即为杜仲树皮的提取物，将提取物冻干得到杜仲总多糖；

S3、所得杜仲总多糖经DEAE-cellulose层析，水洗3倍柱体积后，经0.2M NaCl洗脱3倍柱体积得到洗脱液；

S4、将所述洗脱液浓缩、透析、冻干得到所述杜仲酸性多糖EUP-A1。

通过本方法得到纯度较高的杜仲酸性多糖EUP-A1。经分析了解到杜仲酸性多糖EUP-A1的组成结构，进一步探索了EUP-A1在抑制脂肪肝中TG生成方面的作用，结果表面在5mg/mL浓度下EUP-A1对肝细胞无毒副作用，同时可较好的抑制脂肪肝中TG的生成，可以作为治疗脂肪肝疾病的潜在药物研发，在治疗脂肪肝药物中的杜仲酸性多糖EUP-A1的浓度为2mg/mL。

附图说明

图1为杜仲总多糖的梯度洗脱分析结果；

图2为杜仲酸性多糖EUP-A1降脂肪肝TG含量图；

图3为杜仲酸性多糖EUP-A1降低脂肪肝Srebp基因表达图；

图4为杜仲酸性多糖EUP-A1对L02肝细胞活力的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1，杜仲总多糖的提取

取干燥杜仲树皮(重量为985g)，剪成小段，加入10L超纯水浸泡过夜。第二天，杜仲树皮经水煮提取3h后用纱布过滤。往残渣中加入10L超纯水继续煮提2h，同法重复。提取过滤后，往过滤后的残渣中加入5L超纯水继续提取1h，过滤、合并3次煮提液。经4000rpm离心20min，上清合并，将沉淀弃用。将95％乙醇加入上清中(乙醇终浓度80％)，4℃静置隔夜。

小心倾倒弃去醇沉后的上清液，沉淀部分于4000rpm离心20min，加入适量超纯水溶解。加热挥尽多余的乙醇，静置，待其冷却后分装至塑料杯中，至-80℃冰箱中冷冻成固体，然后取出进行冷冻干燥，干燥后，合并称重，得到杜仲总多糖EUP。

实施例2：杜仲多糖分级分析

取250mg DEAE-纤维素(DEAE-Cellulose)，分多次加入，使其充分溶胀10L蒸馏水中(加入时边加边搅拌)，用纱布过滤，尽可能除去水分。浸泡至0.5M的HCl中1h，纱布过滤，用蒸馏水浸泡清洗，使其成中性，再浸泡至0.5M的NaOH中1h，纱布过滤，用蒸馏水浸泡清洗，使其成中性。其中的气泡经真空泵减压脱气除去，浸泡于蒸馏水中，置于4℃环境中备用。

填料装柱前处理：从4℃冰箱中取出适量填料，经减压脱气处理后即可装柱，采用2.6X50cm层析柱，用两倍柱体积的高纯水平衡后即可上样。

样品前处理：取75mg杜仲总多糖EUP样品加入3mL超纯水，配成25mg/mL的溶液，10000rpm离心10min，用移液枪小心吸出上清，使用微孔滤膜(0.45μm)过滤即可。(上样体积/上样量：2mL/50mg)

用连续梯度洗脱的方法，使用DEAE-纤维素柱对杜仲水提总糖进行分级。水洗240mL、梯度盐(氯化钠)洗456mL(盐浓度从0梯度增至1M)、1M盐洗240mL,(层析柱型号：2.6cm×50cm)。洗脱液按试管顺序被依次收集(流速：0.4mL/min，4mL/管，10min/管)。

采用硫酸-苯酚法测定收集部分的糖含量：从每管中取200μL洗脱液，加入400μL的5％的苯酚溶液，摇匀，迅速加入2mL浓硫酸混匀。静置使其冷却，在波长为492nm条件下测定吸光度值。以横坐标洗脱液体积、纵坐标吸光度值和盐浓度绘图。

结果如图1所示，杜仲多糖共计分为5个多糖级分，分别是杜仲中性多糖EUP-N，杜仲酸性糖EUP-A1，杜仲酸性糖EUP-A2，杜仲酸性糖EUP-A3，杜仲酸性糖EUP-A4。

实施例3：杜仲多糖分级制备

采用实施例2中方法，DEAE-Cellulose装柱，6X50cm层析柱，取杜仲总多糖EUP，1g，分别经水洗，0.0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、1mol/L NaCl洗脱，每个洗脱条件洗脱3倍柱体积，水洗级分浓缩后冻干，得到EUP-N级分，各NaCl洗脱部分，透析后浓缩，冻干，分别得到EUP-A1，EUP-A2，EUP-A3，EUP-A4。

表1杜仲多糖各级分收率

名称	缩写	收率
			杜仲总糖	EUP	3.56％
杜仲中性糖	EUP-N	28.1％
			杜仲酸性糖级分1	EUP-A1	10.8％
杜仲酸性糖级分2	EUP-A2	8.54％
			杜仲酸性糖级分3	EUP-A3	5.34％
杜仲酸性糖级分4	EUP-A4	6.32％

实施例4：杜仲酸性多糖EUP-A1的单糖组成分析

HPLC条件：流动相组成为乙腈：磷酸缓冲盐＝18.2:81.8。检测器型号：VarianProstar325，检测波长：245nm。色谱柱型号：Thermo ScientificODS-2(c18)Hypersil Dim.(mm)150×4.6；柱温：30℃。进样量：15μL，流速：1mL/min。

样品前处理：(1)酸水解：称取2mg杜仲酸性多糖EUP-A1样品置于棕色小瓶中，使其溶于2mL 4M的三氟乙酸(TFA)，加盖密封。在110℃的条件下加热水解4h，取出冷却至室温，使用甲醇减压浓缩，重复操作直至除尽TFA。蒸干后，残渣溶解200μL蒸馏水中。

(2)PMP衍生化：取100μL(1)中的完全酸水解溶液，加入浓度为0.6M的NaOH溶液100μL混匀，再加入200μL现配置的浓度为0.5M的PMP甲醇溶液，密封后涡漩混匀。水浴温度为70℃条件下反应100min后，冷却至室温，用浓度为0.3M的HCl 200μL进行中和，加蒸馏水补足至1mL。再加入1mL三氯甲烷萃取，取出上层水相，多次重复萃取，尽量除尽PMP。涡旋后取15μL上清液进样分析。

(3)取100μL 1mg/mL单糖标准品(Man，Rha，Gal，GalA，Glc，GlcA，Xyl，Ara，Fuc)混合液，按样品PMP衍生同法处理，然后进样分析。

结果显示杜仲酸性糖EUP-A1主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖组成，含量比为：8.31：1.73：43.97：3.77：31.56：10.65。

实施例5：杜仲酸性多糖降脂肪肝TG活性实验

LO2人正常肝细胞，细胞密度为4*104个细胞/mL铺板至12孔板，37℃，5％CO₂中培养继续培养过夜。加诱导试剂油酸，终浓度为80μg/mL，培养12小时后，换培养基，加入不同浓度杜仲酸性多糖EUP-A1，多糖药物处理48小时。吸弃细胞培养基，加入PBS洗涤细胞1次(1mL/孔)；加入胰酶细胞消化液消化细胞，1000rpm/min，离心10min；吸弃上清，加入PBS洗涤2次，每次12000rpm/min，离心10min，吸弃上清，留细胞沉淀；加入匀浆介质/抽提液无水乙醇，重悬细胞；后续步骤按照甘油三酯(TG)测定试剂盒说明书进行(A110-2-1，南京建成)。结果如图2所示，结果显示杜仲酸性多糖EUP-A1具有较好的抑制脂肪肝中TG的生成的作用。

实施例6：杜仲酸性多糖升高肝脏ChREBP基因表达实验

LO2人正常肝细胞，细胞密度为2*10⁴个细胞/mL铺板至24孔板，放入37℃，5％CO₂中培养继续培养过夜，lipo2000转染0.5ug的pGL3-Srebp-luciferase和0.5ug的pCMV-gal质粒，培养10小时后，加诱导试剂油酸，终浓度为80μg/mL，培养12小时后，换培养基，加入不同浓度杜仲酸性多糖EUP-A1，多糖药物处理48小时。吸弃培养基上清，加入细胞裂解液(碧云天)，100μl/孔，冰上放置10min。将液体转移至1.5ml离心管，12000rpm/min离心10min,取上清液加入到96孔板中每孔25μl，加入化学发光底物100μl，多功能酶标仪检测发光数值(RLU)。另取离心上清30μl，加入ONPG显色，作为内参质粒数值(beta-gal)。将RLU/beta-gal作为样品的化学发光检测值。结果如附图3所示，杜仲酸性糖EUP-A1级分可以显著降低SREBP-1c的基因表达，且呈浓度梯度依赖性。SREBP-1c是脂肪肝中脂肪代谢的关键酶，SREBP-1c表达降低，表示EUP-A1以SREBP-1c为靶点降低脂肪肝中TG的生成。

实施例7：杜仲酸性多糖EUP-A1对L02肝细胞活力的影响

LO2人正常肝细胞，细胞密度为3*10³个细胞/mL铺板至96孔板，放入37℃，5％CO₂中培养继续培养过夜，换培养基，加入不同浓度杜仲酸性多糖EUP-A1，多糖药物处理48小时。然后每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)继续培养4h，弃去上清液。最后，每孔加入150μL的DMSO，在490nm波长处检测吸光值。结果如图4显示，杜仲酸性多糖EUP-A1对L02肝细胞的细胞活力在5mg/mL浓度下无影响。

Claims (6)

1.一种杜仲酸性多糖EUP-A1，其特征在于：主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，各组分的摩尔比为8.31：1.73：43.97：3.77：31.56：10.65。

2.根据权利要求1所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A1的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、将杜仲树皮放入蒸馏水浸泡至湿透；

S2、采用水提醇沉的方法得到杜仲树皮的提取物，将提取物冻干得到杜仲总多糖；

S3、所得杜仲总多糖经DEAE-cellulose层析，水洗后再经0.2M NaCl洗脱得到洗脱液；

S4、将所述洗脱液浓缩、透析、冻干得到所述杜仲酸性多糖EUP-A1。

3.根据权利要求2所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A1的提取方法，其特征在于：所述水提醇沉的步骤为：（1）将浸透后的杜仲树皮煎煮多次，每次1~3h，合并每次的煎煮液；（2）煎煮液中加入一定浓度的乙醇进行沉淀，沉淀组分即为杜仲树皮的提取物。

4.根据权利要求3所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A1的提取方法，其特征在于：进行乙醇沉淀前将所述煎煮液离心，留取上清液，再向上清液中加入乙醇，上清液中乙醇的浓度为80%。

5.根据权利要求3所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A1的提取方法，其特征在于：所述S3中，将所得杜仲总多糖经DEAE-cellulose层析，用3倍柱体积的水洗后，经3倍柱体积的0.2MNaCl洗脱得到洗脱液。

6.根据权利要求1所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A1在制备治疗脂肪肝药物中的应用，其特征在于：所述治疗脂肪肝药物中的杜仲酸性多糖EUP-A1的浓度为5mg/mL。

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