CN1250240C - 板蓝根提取物及制备方法和它的应用 - Google Patents
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Abstract
板蓝根提取物及制备方法和它的应用，涉及来源于植物原料的药物及制备方法和应用，属医药、食品、保健品领域。采用板蓝根或十字花科菘蓝属植物的水提醇沉得到的浸膏，再用10～50倍量的极性混合溶剂提取得到的提取液，回收溶剂后浓缩得活性提取物，经测定发现提取物含有大量抗病毒活性作用的核苷，其含量约5.2%～28.0%，腺苷含量为1.10～2.80%(以提取物为干品计)。该提取物可用于制备抗病毒药物、食品、保健品，除可制备成颗粒剂外，同样适合制成片剂、胶囊剂、溶液剂等。
Description
技术领域
本发明涉及来源于植物原料的药物及制备方法和应用，属医药、食品、保健品领域，具体涉及中药板蓝根的抗病毒活性成份及制备方法。
背景技术
板蓝根(Radix isatidis)为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的根，具有清热解毒、凉血利咽之功效。《中国药典》(1990～2000年版)记载的板蓝根制剂如板蓝根颗粒、板蓝根茶的提取工艺均是取板蓝根的水煎液加乙醇使其浓度为60％，去沉淀后、取上清液浓缩加辅料而制成。也有文献报道对板蓝根的提取工艺的研究，“板蓝根抗流感病毒有效部位筛选”中草药1999.30(19)：650公开了将板蓝根以70％乙醇提取然后依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取后的水层部分经阳离子树脂分离而得到抗病毒活性强的部位，但其提取工艺复杂，工艺步骤多，成本高，其阳离子树脂的分离耗时，生产上难于控制，不适合于工业化批量生产。在文献“板蓝根颗粒提取工艺的改进”华西药学杂志1999，14(5～6)：381-382和“板蓝根制剂提取工艺的探讨”中国中药杂志1990，15(7)：30-32作者建议板蓝根的提取工艺以60％或70％的乙醇提取为好，其提取物中的靛蓝、靛玉红的含量较高。而在文献“中药板蓝根抑菌作用评价”中成药研究1987，12：9中，又证明了靛蓝、靛玉红没有抗病毒活性。
上述板蓝根的提取工艺研究中，《中国药典》所说的水提醇沉工艺简单，所得浸膏中成分类别多，抗病毒的活性组份相对含量低，从而导致了板蓝根制剂服用剂量大，同时也限制了板蓝根的制剂种类。为此，我们有必要进一步研究板蓝根的抗病毒的有效成份的提取和制备方法。
发明内容
本发明的目的在于研制出适宜于工业化生产的具有抗病毒活性的板蓝根制剂和制备方法。
为实施本发明的目的所采取的技术方案是：采用板蓝根或十字花科菘蓝属植物，经水提醇沉获得浸膏，再用10～50倍量的甲醇和丙酮混合溶剂提取，提取液回收溶剂后浓缩，得活性提取物。
活性提取物中含有大量抗病毒活性作用的核苷，其含量约为11.0～28.0％，提取物中腺苷含量可达到1.10％～2.80％(以提取物为干品计)。用HPLC分析方法(以水∶乙腈为96∶4作流动相、260nm为检测波长)测定腺苷含量。
该活性部位的制备方法是将原料板蓝根或十字花科菘蓝属植物，用水煎煮1～3次，取煎煮液，将其浓缩至相对密度在50℃时测为1.1～1.2的流浸膏(1)，向流浸膏(1)中加入乙醇使其浓度为50～70％，析出沉淀，取上清液浓缩至无醇味，得浸膏(2)，浸膏(2)用10～50倍量的甲醇和丙酮混合溶剂提取1～3次，提取液回收溶剂，浓缩得浸膏(3)，即得活性提取物。
采用的原料优选为十字花科菘蓝属植物板蓝根，该植物在中国分布广，产量多，是最佳的原料。
为了方便保存活性提取物，以将浸膏(3)进一步干燥得含水量为＜5％的干品更佳。而且也方便添加各种辅料，制备成各种剂型作药品、食品或保健品用。
本发明所提供的制备方法所得到的活性提取物具有显著的抗病毒作用可添加各种辅料，制备成各种剂型作药品、食品或保健品用。添加药用辅料，按常规的制药工艺制备成各种剂型如颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液等。
本发明的有益效果是：1、该发明所述的提取技术操作简单、生成成本低，仅需3步溶剂提取即可提取精制得到抗病毒活性部位，适于工业批量生产。2、该发明所得提取物是在原药典的工艺基础上经过精制而得，抗病毒活性组份的含量明显提高，表现在该提取物的活性明显强于其它任何组份。3、该发明所得提取物，可用于制备抗病毒药物、食品、保健品等，在剂型上除可以作成颗粒剂外，同样适合作成片剂、胶囊剂、溶液剂等。
下面通过具体实施例的药效试验来证实其抗病毒作用。
具体实施方案
实施例1
取板蓝根药材100Kg，以10倍量的水进行煎煮2次，第1次2小时，第2次1小时，合并煎煮液。滤过，滤液浓缩至相对密度在50℃时测为1.10的流浸膏(1)，向流浸膏(1)中加入乙醇30L，测其乙醇浓度为70％，析出沉淀，取上清液浓缩至无醇味，得浸膏(2)(编号IsiL)，浸膏(2)每次加20L的甲醇和丙酮混合溶剂提取3次，提取液回收溶剂，浓缩得浸膏(3)(相对密度为1.10)，得到8.6Kg活性提取物(编号HG)，用HPLC分析方法测定其含腺苷含量为2.56％(以提取物为干品计)。将甲醇—丙酮提取后的残渣浓缩，除去甲醇和丙酮，加水稀释成一定浓度，即得样品(编号WHG)。另制备板蓝根浸膏中蛋白质样品：取按药典法定工艺生产的板蓝根稠膏，加入等量(V/V)的1mol/LNaCl溶液，于4000rpm的转速下离心15min，去除上清液，取沉淀，透析去除NaCl后，以水稀释成一定浓度，即得板蓝根中的蛋白质样品(编号IsiA.)。
四种编号(IsiL、HG、WHG、IsiA)样品均进行抗病毒实验(阳性药物为利巴韦林)，结果表明，甲醇和丙酮提取物HG抗病毒活性明显强于其它部位，其有效剂量显著低于其它部位。
试验如下：
一、MDCK细胞法
细胞毒性实验：将两组已长成细胞片的MDCK倒掉细胞培养液，一组加入0.8ml维持液(2％的小牛血清1640培养液)及0.2ml待测药物(已稀释的上述板蓝根的4部分样品，以下简称药物，样品浓度均按同样药材量折算)，另一组加入0.9ml维持液及0.1ml待测药物。加样24小时观察结果，4种药物的上述2种浓度对MDCK细胞均无毒性。进一步通过提高药物浓度，发现该4部分药物对狗肾细胞MDCK株，除IsiL样品在实验浓度大于100mg/ml时有轻微的毒性反应，表现为细胞形态少量变圆，其他部分在最大实验浓度均无毒性反应。
二、抗甲型流感病毒实验：
将已生长48h的MDCK倒掉细胞培养液，备用。4种药物均按以下方式加样：取一支试管，加入0.4ml药物(已消毒灭菌)+3.6ml维持液，混匀混合液，分别吸取0.9ml，0.5ml，0.25ml混合液至试管，每组2支共6支试管，后四支试管各补加0.4ml及0.65ml维持液，最后总量为0.9ml；另准备2支试管单纯加入0.9ml维持液，作为病毒对照。以上实验管分别接种HA为1∶64的流感163株病毒培养液(-40℃保存)0.1ml。接种后于33℃温箱培养72h，测定HA，结果见表1。根据血细胞凝集程度的不同来进行判断，以“++”为终点，即观察到红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集块，以此为标准测定血凝滴度。判断结果时若药物实验组血凝滴度为病毒对照组的1/4以下，即说明药物对病毒增殖有抑制作用。
表1不同部位对甲型流感病毒的抑制作用
| 药名 | 管号 | 1 | 2 |
| HA | 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 | 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 | |
| 含生药量mg/ml | |||
| IsiL | 200 | - - - - - - | - - - - - - |
| 100 | - - - - - - | ++ - - - - - | |
| 50 | +++ +++ - - - - | +++ +++ - - - - | |
| HG | 50 | - - - - - - | - - - - - - |
| 25 | - - - - - - | - - - - - - | |
| 12.5 | - - - - - - | - - - - - - | |
| 阳性对照 | - - - - - - | - - - - - - | |
| WHG | 200 | - - - - - - | ++ - - - - - |
| 100 | +++ +++ +++ - - - | +++ +++ +++ - - - | |
| 50 | # # # +++ +++ - | # +++ +++ +++ +++ - | |
| IsiA | 200 | # # # +++ +++ - | +++ +++ +++ +++ +++ - |
| 100 | # # # # +++ +++ | +++ +++ +++ +++ +++ +- | |
| 50 | +++ +++ +++ +++ +++ +++ | +++ +++ +++ +++ +++ - | |
| 病毒对照 | # +++ +++ +++ +++ +++ | +++ +++ +++ +++ - - | |
“#”为细胞完全病变(++++)；病毒株为粤防-9220，病毒效价为1∶64
“-”表示抑制病毒生长；“+”表示病毒生长，细胞病变。
表1结果表明，对甲型流感病毒在作用72h后，样品HG能显著的抑制病毒生长，其低浓度(相当于12.5mg/ml生药)的抑制作用和阳性药的抗病毒效果相当；IsiL在较高浓度时能基本抑制病毒的生长；WHG在很高浓度时对病毒生长有抑制作用；IsiA在高浓度时对病毒无抑制作用。从上表的药物浓度和HA滴度可以反映出，活性部位HG的抗病毒活性为其它部位的数倍以上，和阳性药物的作用浓度相当。
三、抗副流感病毒实验
细胞：人羊膜细胞Wish株；病毒：副流感病毒PIV-III株。
方法：取已长成的24h的羊膜细胞，药物按以下方法稀释：0.2ml药物(已消毒灭菌)+1.8ml维持液，混匀后分别吸取0.45ml，0.25ml，0.125ml三种剂量溶液至试管，每种2支共计6支，后4支管分别补加0.2ml及0.325ml维持液，使最后总量为0.45ml；另准备2支试管各加0.45ml维持液作为病毒对照。以上实验管分别接种副流感病毒PIV-III，10-2稀释度；每管0.05ml。接种后置37C温箱培养，48h或72h测血球吸附实验。结果见表2。
表2培养48h后，血球吸附实验结果
| 药名 | IsiA | IsiL | 病毒对照 | 细胞对照 |
| 含药量 | 200 100 50 | 200 100 50 | ||
| 血球吸附 | ** ** - | - - - | ## | - |
培养72h后，血球吸附实验结果
| 药名 | HG | WHG | 阳性药物对照 | 病毒对照 | 细胞对照 |
| 含药量 | 50 25 12.5 | 200 100 50 | |||
| 血球吸附 | -- -- -- | -- --+ ++++ | -- | ## | -- |
备注：**细胞脱落；#全部病变
表2结果表明，对副流感病毒的作用，HG、IsiL在作用48h后，在试验浓度范围内均可完全抑制病毒生长。WHG在浓度大于100mg生药/ml时可完全抑制病毒生长。以上比较结果表明，从板蓝根中分离得到的活性部位HG对副流感病毒的抑制作用同样非常显著，其作用强度明显高于其它部位、作用浓度明显小于其它部位。
实施例2
取板蓝根药材100Kg，按实施例1同样的制备方法制备活性提取物，得到提取物浸膏(密度1.10)10.3Kg，干燥后得干粉8Kg(编号：GFx)用HPLC分析方法测定其含腺苷含量为1.89％(以提取物为干品计)。与按原药典工艺提去得到的流浸膏的干粉(编号：GFy)，用HPLC分析方法测定其含腺苷含量为0.128％(以提取物为干品计)。进行抗甲型流膏病毒的对比，其结果如表3所示。
| 药名 | 管号 | 1 | 2 |
| HA | 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 | 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 | |
| 含生药量mg/ml | |||
| GFy | 200 | ++ +++ ++ -- -- -- | -++ +++ ++ -- -- -- |
| 100 | ++ +++ ++ ++ ++ -- | ++ +++ ++ ++ -- | |
| 50 | +++ +++ ++ ++ ++ ++ | +++ +++ +++ - - - | |
| GFx | 200 | - - - - - - | - - - - - - |
| 100 | - - - - - - | - - - - - - | |
| 50 | - - - - - - | - - - - - - |
“+”为病变
结果表明，该发明所得的板蓝根提取物的干粉的抗病毒活性明显强于原工艺提取的干膏粉。
实施例3
取板蓝根药材5kg，按实施例1的方法制备活性提取物，得到提取物浸膏，干燥后得到干粉430g用HPLC分析方法测定其含腺苷含量为2.08％(以提取物为干品计)。，加入蔗糖、淀粉和糊精等辅料，加入辅料的比例和原板蓝根颗粒的辅料加入比例相同，制得新板蓝根颗粒，编号Kx；或按常规的制药工艺制成片剂，编号：Px。和原板蓝根颗粒(药典法)(编号：Ky)用HPLC分析方法测定其含腺苷含量为0.168％(以提取物为干品计)。同时进行抗病毒实验的比较，抗病毒实验方法同实施例1，其结果如下表4所示。
| 药名 | 管号 | 1 | 2 |
| HA | 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 | 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 | |
| 含生药量mg/ml | |||
| Ky | 200 | +- -- -- -- -- -- | ++ --- -- -- -- -- |
| 100 | ++ +++ -- -- -- | ++ +++ -- -- -- | |
| 50 | +++ +++ ++ ++ ++ ++ | +++ +++ +++ - - - | |
| Px | 200 | - - - - - - | - - - - - - |
| 100 | - - - - - - | - - - - - - | |
| 50 | - - - - - - | - - - - - - | |
| Kx | 200 | - - - - - - | - - - - - - |
| 100 | - - - - - - | - - - - - - | |
| 50 | - - - - - - | - - - - - - |
结果表明，新制得的板蓝根颗粒、板蓝根片剂比原板蓝根颗粒抗病毒活性强。的板蓝根颗粒和板蓝根片在较低的实验浓度及高的病毒滴度的条件下，均有显著的抗病毒活性；而原板蓝根颗粒只有在高浓度及低的病毒滴度时，抗病毒效果才明显。
Claims (6)
1、一种板蓝根提取物，其特征在于：采用板蓝根或十字花科植物菘蓝，经水提醇沉法获得浸膏，再用10～50倍量的甲醇和丙酮混合溶剂提取，提取液回收溶剂后浓缩，得活性提取物。
2、根据权利要求1所说的板蓝根提取物，其特征在于：活性提取物中腺苷含量以提取物为干品计为1.10％～2.80％。
3、一种制备如权利要求1所说的板蓝根提取物的方法，其特征在于：将原料板蓝根或十字花科菘蓝属植物，用水煎煮1～3次，取煎煮液，将其浓缩至相对密度在50℃测为1～1.2的流浸膏(1)，向流浸膏(1)中加入乙醇，使其浓度为50～70％，析出沉淀，取上清液浓缩至无醇味，得浸膏(2)，浸膏(2)用10～50倍量的甲醇和丙酮混合溶剂提取1～3次，提取液回收溶剂后浓缩得浸膏(3)，即得活性提取物。
4、根据权利要求3所说的板蓝根提取物的制备方法，其特征在于：采用的原料为十字花科植物菘蓝的根。
5、根据权利要求3所说的板蓝根提取物的制备方法，其特征在于：活性提取物进一步干燥制得含水量＜5％的干品。
6、一种如权利要求1所说的板蓝根提取物的用途，在于制备抗病毒的药物、食品、保健品。
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