CN1269526C - 黄精凝集素ⅱ蛋白在制备治疗或预防乙型肝炎的药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过实验证明，黄精凝集素II蛋白可以有效抑制HepG2.2.1.5细胞两种抗原HBeAg和HBsAg的分泌，在0.313mg/ml和0.156mg/ml时，对HepG2.2.1.5细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率达50%以上，而且细胞毒性很小。本发明还通过实验证明，黄精凝集素II蛋白对人类免疫缺陷病毒(HIV)有很强的抑制作用，抑制HIV对正常细胞感染活性高出其它甘露糖结合凝集素10-100倍。本发明为黄精凝集素II蛋白发掘了新的医疗用途，为严重威胁人类生命的乙型肝炎及艾滋病的预防和治疗提供了新的药品。

Description

黄精凝集素II蛋白在制备治疗或预防乙型肝炎的药中的应用

                             技术领域

本发明涉及以百合科植物囊丝黄精(Polygonatum cyrtonema Hua.)这种中草药为原料制备的黄精凝集素II蛋白的用途，特别涉及黄精凝集素II蛋白在制药中的用途。

                             背景技术

凝集素(Lectin)是自然界中广泛存在的一类非酶、非免疫来源的、具有糖结合专一性并能使糖复合物沉淀的蛋白或糖蛋白。从第一个植物凝集素在蓖麻籽中发现到目前为止，人们已发现并分离了几百种凝集素。

百合科植物囊丝黄精(Polygonatum cyrtonema Hua.)是我国传统中草药，鲍锦库等在《生物化学杂志》(第12卷第6期，1996年12月)上发表的论文“黄精凝集素II分子的稳定性与生物学活性研究”公开了一种以植物黄精块茎为原料所制备的黄精凝集素II对淋巴细胞的促有丝分裂活性，以广州产PHA为对照，黄精凝集素II对人外周淋巴细胞的转化率高达97.6％，细胞分裂比达18.3％，是一种极强的促有丝分裂源。

乙型肝炎是由HBV(hepatitis B virus)引起的世界范围的病毒性传染病，它可演变为肝硬化或肝癌。据估计，全世界有3亿人携带有HBV，而我国就有1.2亿乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性携带者。利用我国丰富的中草药资源开发新的抗HBV药物具有重要意义。

自从1981年在美国发现艾滋病(获得性免疫缺陷综合症，AIDS)以来，世界各地发现艾滋病或带病毒者与日俱增。1983年人们确定了AIDS是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起以后，为医治这种给人类造成巨大危害的病症，全世界都在研究开发有效的抗HIV药剂。目前已开发出多种抗艾滋病毒药物，如蛋白酶抑制剂、核苷类似物等。治疗方法也由传统的单一药物治疗转变为多种药物组合方式，但至今仍然很难设计出一种长效抵御这一逆转录酶病毒的药物。

                             发明内容

本发明的目的在于提供以植物黄精块茎为原料所制备的黄精凝集素II蛋白在制药中的新应用，以便开发出预防和治疗乙型肝炎的新药品。

本发明所述黄精凝集素II(PCL II)是从植物黄精中分离纯化出来的一种植物蛋白。从植物黄精中可分离纯化出的具有强凝集活性的蛋白有三种：黄精凝集素I(PCL I)、黄精凝集素II(PCL II)、黄精凝集素III(PCL III)，其中，黄精凝集素II(PCL II)含量最多。黄精凝集素II(PCL II)的制备方法有两种，一种方法的工艺步骤依次为“粗品制备、亲和柱分离纯化、CM-Sepharose离子交换快速柱纯化、分子筛纯化”，另一种方法的工艺步骤依次为“粗品制备、亲和柱分离纯化、分子筛纯化”。

本发明通过实验证明：黄精凝集素II(PCLII)蛋白具有较强的RPHI活性(HBsAg结合活性)，在7.8ug/ml时仍具有明显的RPHI活性；黄精凝集素II蛋白可以有效抑制HepG2.2.1.5细胞两种抗原HBeAg和HBsAg的分泌，在0.313mg/ml和0.156mg/ml时，对HepG2.2.1.5细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率达50％以上，而且细胞毒性很小，是一种有效抗乙型肝炎病毒(HBV)药物。

本发明还通过实验证明：黄精凝集素II蛋白对人类免疫缺陷病毒(HIV)有很强的抑制作用。当受试细胞系为HT-4(小鼠神经细胞)时，黄精凝集素II蛋白对HIV-1的半数抑制浓度为EG₅₀＝0.08ug/ml，对HIV-2的半数抑制浓度为EC₅₀＝0.08ug/ml；当受试细胞系为CEM(T细胞淋巴瘤细胞)，黄精凝集素II蛋白对HIV-1和HIV-2的半数抑制浓度分别为EG₅₀＝0.05ug/ml和EC₅₀＝0.10ug/ml，比其它甘露糖结合凝集素的半数抑制浓度低10-100倍，即抑制HIV对正常细胞感染活性高出其它甘露糖结合凝集素10-100倍。而黄精凝集素II对HT-4和CEM的半数细胞毒性浓度分别为CC₅₀＝73ug/ml和CC₅₀＝74ug/ml，也比其它凝集素高出近10倍，显示出很高的抗HIV活性和很低的毒性。

因此，可将黄精凝集素II蛋白制备成治疗或预防乙型肝炎病毒(HBV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)所致疾病的药品，用药方法可以通过口服、静脉内的注射等。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明为黄精凝集素II蛋白发掘了新的医疗用途，为严重威胁人类生命的乙型肝炎及艾滋病的预防和治疗提供了新的药品。

2、黄精凝集素II蛋白药理作用强且毒性很低，预示着很好的药用前景。

3、制备黄精凝集素II蛋白的原料——植物黄精块茎来源广，制备黄精凝集素II蛋白的工艺简单，因而便于工业化生产，有利于降低制备成本。

                             附图说明

图1是本发明所述黄精凝集素II蛋白的SDS-PAGE电泳图。

                           具体实施方式

实施例1：黄精凝集素II蛋白的制备

本实施例中，黄精凝集素II蛋白的制备方法如下：

1、粗品制备

将切成片状的黄精块茎以生理盐水溶液浸取(G/V＝1∶5)过夜，经高速组织捣碎机捣成糊状，生理盐水溶液浸取过夜，纱布过滤，离心(4℃，4500r/min，30min)，向上清中加入固体硫酸铵达30％饱和度，置4℃过夜，离心(4℃，4500r/min，30min)去沉淀，上清继续加硫酸铵至90％，离心收集沉淀，并将沉淀溶于蒸馏水，透析除盐，冷冻干燥得黄精凝集素粗品。

2、亲和柱分离纯化

取粗品200mg溶于20ml生理盐水溶液，透析平衡，离心除去不溶物，取上清液进行亲和层析(柱：2.6×40cm)。以甘露糖-Sepharose 4B为亲和吸附剂，用生理盐溶液平衡层析柱后，将上述凝集素粗品上柱，相同的生理盐溶液洗脱至流出液在280nm处吸收值小于0.02，换用0.2mol/L甘露糖溶液解吸附，洗脱及解吸附过程中皆分部收集，流速18ml/hr，3-4ml/管，收集管经280nm处测定紫外吸收后，将样品用生理盐水透析，以兔红细胞检查样品的凝集活性，合并活性部分并透析去盐，冷冻干燥得亲和层析样品。

3、分子筛纯化

取经处理的Sephacryl S-100装柱(1.6×100cm)，用生理盐水平衡。将上述亲和层析样品用生理盐溶液溶解并透析平衡后上柱，用相同溶液洗脱，分部收集，流速为2ml/min，3ml/tube，经280nm处测定紫外吸收和检测活性后，收集活性部分，透析除盐，冷冻干燥得到纯化的黄精凝集素II，经SDS-PAGE检测为单一蛋白组分，见图1。

实施例2：黄精凝集素II蛋白的制备

本实施例中，黄精凝集素II蛋白的制备方法如下：

1、粗品制备

将切成片状并晾干的黄精块茎以生理盐水溶液浸取(G/V＝1∶5)过夜，经高速组织捣碎机捣成糊状，生理盐水溶液浸取过夜，纱布过滤，离心(4℃，4500r/min，30min)，向上清中加入固体硫酸铵达30％饱和度，置4℃过夜，同前法离心去沉淀，上清继续加硫酸铵至90％，离心收集沉淀，并将沉淀溶于蒸馏水，透析除盐，冷冻干燥得黄精凝集素粗品。

2、亲和柱分离纯化

取粗品(200mg)溶于20ml生理盐水溶液，透析平衡，离心除去不溶物，取上清液进行亲和层析(柱：2.6×40cm)。以猪甲状腺球蛋白-Sepharose 4B为亲和吸附剂，用生理盐溶液平衡层析柱后，将上述凝集素粗品上柱，相同的生理盐溶液洗脱至流出液在280nm处吸收值小于0.02，换用0.2mol/L HAC溶液解吸附，洗脱及解吸附过程中皆分部收集，流速18ml/hr，3-4ml/管，收集管经280nm处测定紫外吸收后，以兔红细胞检查收集管得凝集活性(先以5％的NaHCo₃中和解吸附部分收集管)，合并活性部分并透析去盐，冷冻干燥得亲和层析样品。

3、CM-Sepharose离子交换快速柱纯化

取经处理的CM-Sepharose离子交换快速柱装柱(2.6×28cm)，用pH4.0，0.02mol/L的NaAC-HAC缓冲液平衡，将亲和样品(100mg)溶于20ml相同缓冲液中，离心除去不溶物并上CM-Sepharose柱，用相同的缓冲液洗脱至流出液在280nm处吸收值小于0.02，改用0.6mol/L的NaCl进行连续离子梯度洗脱，分部收集(3ml/min，3-4ml/管)，收集管经280nm测定后，兔红细胞检查凝集活性(先以5％的NaHCo₃中和解吸附部分收集管)，合并活性部分，透析除盐并冷冻干燥得离子交换层析样品。

4分子筛纯化

取经处理的Sephadex G-100装柱(1.6×100cm)，用生理盐水平衡。将上述CM-Sepharose柱样品用生理盐溶液溶解并透析平衡后上柱，用相同溶液洗脱，分部收集，流速为12ml/hr，3ml/tube，经280nm处测定紫外吸收和检测活性后，收集活性部分，透析除盐，冷冻干燥得到纯化的黄精凝集素II，经SDS-PAGE检测为单一蛋白组分，见图1。

实施例3：黄精凝集素II蛋白(PCL II)对乙型肝炎(HBV)病毒的抑制作用

1、材料和方法

1.1材料

黄精凝集素II蛋白(PCL II)采用实施例1或实施例2所述的方法制备，经系列倍比稀释后用于细胞毒性和抗乙肝活性测定。

冻干HBsAg诊断血球：上海实业科华生物工程有限公司。

重组酵母乙型肝炎病毒疫苗(HBsAg)：卫生部北京生物制品研究所产品。

HepG2.2.1.5细胞：重庆医科大学肝炎研究所提供细胞株。HBsAg、HBeAg检测试剂盒：北京四环生物工程制品厂产品。

培养基：RPMI-1640(GIBCO产品)按照说明溶解，调节至pH7.2，过滤除菌，加入胎牛血清(GIBCO产品，进口分装)至浓度为10％，含100U/ml青霉素(重庆药友制药有限责任公司)、100μg/ml硫酸链霉素(上海四药股份有限公司)和0.2mg/ml G418(GIBCO产品)。

胰蛋白酶：GIBCO产品；磷酸缓冲液(PBS)：为Na₂HPO₄和NaH₂PO₄配制成的浓度0.02M的水溶液，pH＝7.0，121～126℃灭菌30分钟，4℃冰箱保存备用，所用化学药品均为国产分析纯试剂。

MTT：3-(4，5)-双甲基-乙-噻唑-(2，5)-二甲基澡化四氮唑蓝，Sigma产品。

96孔板：Nunclon产品；酶标仪：Model 550，Bio-Red产品。

无环鸟苷注射剂(ACV)：丽珠集团湖北科益药业有限公司产品。

贺普丁(Heptin)：拉米夫定，(2R-顺式)-4-氨基-1-(2-羟甲基-1，3-氧硫杂环戊-5-基)-1-H-嘧啶-2-酮，英国GlaxoWelcome公司产品。

1.2方法

1.2.1反相被动凝血抑制实验(RPHI，郑民实，李桦，韩漪萍等，100种中草药对乙型肝炎病毒表面抗原抑制作用的观察。中草药，1987年第18卷第10期：27～29；郑民实，章晋根，刘志勇等，ELISA技术筛选200种中草药抗HBsAg的实验研究。微生物学杂志，1996年01期：1～4；郑民实，李文，李蓉，章晋根等，使用ELISA技术筛选270种中草药抗HBsAg作用。中医研究，1996，9(1)：51～54.)测定黄精凝集素II的HBsAg结合活性

在96孔板各孔中加入25微升血球稀释液，在第一孔中加入25微升待测黄精凝集素II样品(1mg/ml)，进行系列倍比稀释，振荡混匀。每孔中加入25微升乙型肝炎病毒疫苗(HBsAg)溶液，振荡混匀，放入37.0℃恒温、恒湿培养箱中温育4小时。同时用5ml血球稀释液稀释冻干HBsAg诊断血球，放入培养箱中活化1小时。然后96孔板的每孔加入50微升诊断血球悬液，放入培养箱中温育1小时，取出观察凝血结果。样品反复三次检测，确定其活性。阴性对照(完全凝血)：25微升血球稀释液，25微升HBsAg溶液，50微升诊断血球悬液；阳性对照(没有凝血)：50微升血球稀释液，50微升诊断血球悬液；药物阳性对照：25微升血球稀释液，25微升黄芪浸提液倍比稀释，25微升HBsAg溶液，50微升诊断血球悬液。

1.2.2黄精凝集素II在HepG2.2.1.5细胞上的抗HBV活性研究

1.2.2.1HepG2.2.1.5细胞培养

取一管液氮保存的HepG2.2.1.5细胞，置于37℃温水浴中快速解冻(1分钟内完全溶解)，转移到5ml新鲜培养基中，混匀，1000rpm离心10分钟，弃去上清(去掉冻存细胞悬液中的DMSO)，加入培养基5ml，混匀后转入培养瓶中，37℃，5％CO₂培养箱中进行培养至单层，传代分瓶培养。

1.2.2.2黄精凝集素II对HepG2.2.1.5细胞的细胞毒性和抗HBV活性研究

用培养基将黄精凝集素II样品溶解，配成1mg/ml，倍比稀释成若干浓度，-20℃保存备用。HepG2.2.1.5细胞长成单层后，用磷酸缓冲液PBS洗三次，每次4～5ml，加入0.25％胰蛋白酶溶液约2ml，消化成单细胞，加入培养基6ml，1000rpm离心10分钟，弃去上清，加入培养基振荡成细胞悬液，进行细胞计数，用培养基调节细胞浓度为1×10⁵cells/ml。然后接种HepG2.2.1.5细胞于96孔板，每孔0.2ml，37℃，5％CO₂培养箱中培养至单层后，吸去培养基，加入含不同浓度样品的的培养基，每个浓度设四个复孔，细胞空白组加入新鲜培养基。培养四天后，取细胞培养上清，-20℃保存，加入新鲜的含样品的培养基，连续培养12天，每四天取样一次。最后一次取样后，每孔加入0.5mg/ml新鲜培养基溶解的MTT溶液0.2ml，置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养4小时，然后轻轻吸去上清溶液，每孔加入二甲亚砜(DMSO)200μl，在振荡器上振荡5min，然后用双波长(570nm为测量波长，参考波长为630nm)法测定吸光度O.D值，计算细胞存活率。

用一步法ELISA检测HBeAg试剂盒和一步法ELISA检测HBsAg试剂盒测定细胞培养上清中抗原的效价，结果按照试剂盒上使用说明进行评价，抗原效价S/N大于或者等于2.1为阳性，抗原效价S/N小于2.1为阴性，根据试剂盒说明书计算样品对HBeAg和HBsAg的抑制率，评价样品的抗HBV活性。

2结果与讨论

2.1反相被动凝血抑制实验(RPHI)

表1黄精凝集素II(PCLII)的RPHI活性

Cell	Lectin Concentration(μg/mL)
												500	250	125	62.5	31.25	15.6	7.8	3.9	1.95	0.95	0.49
	RPHI	++++	++++	+++	+++	++	++	+-	-	-	-												-

注：“+++”表示RPHI活性很强，“++”表示RPHI活性较强，“+”表示RPHI活性明显，“±”表示RPHI活性不明显。

从表1可以发现黄精凝集素II(PCLII)具有较强的RPHI活性(HBsAg结合活性)，在7.8ug/ml时仍具有明显的RPHI活性。表明黄精凝集素II具有抗乙型肝炎病毒活性。其活性高低可以通过对HepG2.2.1.5细胞的细胞毒性实验和抑制HepG2.2.1.5细胞两种抗原HBeAg和HBsAg的分泌进行测定。

2.2黄精凝集素II样品对HepG2.2.1.5细胞的细胞毒性和抗HBV活性

取贺普丁一片，粉碎，用培养基配2.5mg/ml的溶液，ACV和黄精凝集素II也用培养基配成2.5mg/ml的溶液，过滤除菌，倍比稀释后-20℃保存。待96孔板上HepG2.2.1.5细胞长成单层后，吸去培养基，加入含不同浓度样品的新鲜培养基，每个浓度四个复孔，每4天更换含相同浓度样品的新鲜培养基，培养12天，吸去培养基后，MTT法(见CamplingBG，Pym J，Baker HM，Cole SP，Lam YM.Chemosensitivity testing of small cell lung cancerusing the MTT assay.Br J Cancer，1991，63(1)：75-83.)测定细胞存活率，结果见表2：由表2可以看出，在贺普丁各浓度下，第12天时细胞存活率多超过了100％，明显高于空白细胞对照组，故贺普丁对HepG2.2.1.5细胞的毒性很小；从第十二天的细胞存活率来看，可以发现ACV在浓度大于或等于0.625mg/ml时具有明显的细胞毒性，ACV在浓度为2.5mg/ml和1.25mg/ml时，细胞的存活率分别为12.83％和14.83％，细胞数量大大低于空白细胞对照，在显微镜下可以看到有大片的细胞死亡脱落，细胞存活率低于50％，ACV的细胞毒性较大。而黄精凝集素II的细胞毒性很低，在2.5mg/ml的浓度下对细胞基本无毒，细胞存活率均保持在96％以上。

为了进一步研究贺普丁、ACV和黄精凝集素II对HepG2.2.1.5细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用，用相应的试剂盒检测HBsAg和HBeAg的效价，并计算抑制率，结果见表3。贺普丁(拉米夫定)作为一种临床上治疗乙型肝炎的有效药物，尽管细胞毒性低，但不能有效抑制HepG2.2.1.5细胞分泌HBeAg和HBsAg。在2.5mg/ml的浓度下，对HBsAg和HBeAg抑制率分别为35.8％和47.24％。

表2 第12天细胞的存活率

浓度(mg/ml)	2.5	1.25	0.625	0.313	0.156	0.078	0.039
								贺普丁％ACV％PCLII％	153.3212.8396.55	156.3514.8398.33	171.9238.8198.26	141.8779.3698.56	131.9481.5397.37	132.1081.5598.72	95.5781.9799.58

表3 第12天贺普丁、ACV和黄精凝集素II对HBsAg和HBeAg的抑制作用

浓度(mg/ml)			2.5	1.25	0.625	0.313	0.156	0.078
									贺普丁	HBsAg	S/N	1.313	1.537	1.493	1.418	1.433	2.581
抑制率％	35.8	24.8	23.17	-21.8	-23.1	-11.6
							HBeAg	S/N			7.233	2.524	4.152	5.405	8.076	7.295
抑制率％	47.24	85.19	72.07	61.97	40.45	46.74

ACV	HBsAg	S/N	2.829	3.738	1.875	2.080	2.370	1.641
									抑制率％	80.25	72.34	21.57	-13.25	-38.92	-56.39
		HBeAg	S/N	2.523	5.326	1.693	1.373	1.875								2.356
	抑制率％								86.24	65.83	26.36	-18.3	-45.90	-76.32
			PCLII	HBsAg	S/N	2.432	2.812	5.522							5.824	1.837	1.549
抑制率	85.78	80.86							64.37	50.32	32.16	26.87
					HBeAg	S/N	3.045	2.436					3.633	5.532	5.823	3.236
抑制率	89.89	84.35		76.35					67.68	50.12	35.67

表3的实验结果表明，贺普丁可以抑制HBV-DNA的复制，而且对HBeAg和HBsAg分泌的抑制作用并不一致。ACV在浓度为2.5mg/ml和1.25mg/ml时，第12天的HBeAg抑制率达到了86.24％和65.83％，这与ACV的毒性有关，因为在这两个浓度下，细胞的存活率分别为12.83％和14.83％，细胞数量大大低于空白细胞对照(见表2)，所以细胞分泌的抗原必定大大减小，所以ACV对HBeAg和HBsAg也没有明显的抑制作用。黄精凝集素II可以有效抑制HepG2.2.1.5细胞两种抗原HBeAg和HBsAg的分泌，在0.313mg/ml和0.156mg/ml时，对HepG2.2.1.5细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率达50％以上，而且细胞毒性很小(见表2、表3)，是一种有效抗乙型肝炎病毒(HBV)药物。

虽然HepG2.2.1.5细胞只是一个体外实验系统，脱离了机体中免疫系统对HBV产生影响的环境，但是该细胞模型为全面、准确评价药物抗HBV效果提供了科学依据。

实施例4：黄精凝集素II蛋白(PCL II)对人类免疫缺陷病毒(HIV)的抑制作用

1 实验材料和方法

1.1 材料

雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin，GNA)、铃兰凝集素(Scilla campanulataagglutinin，SCA)、兰科植物凝集素(Listera Ovta lectin，LOL)样品由鲁文大学植物保护研究所的Van Damme教授实验室提供；石蒜凝集素(Lycoris radiataAgglutinin，LRA)由四川大学生物材料中心提供；黄精凝集素II(PCL II)蛋白由实施例1或实施例2所述方法制备。

艾滋病病毒株：HIV-1和HIV-2由日加医学研究所保存。

正常细胞株：CEM(T细胞淋巴瘤细胞系)和TH-4(小鼠神经细胞系)为日加医学研究所传代培养。

1.2方法

黄精凝集素II抗艾滋病毒活性的测定采用Balzarini的实验方法(见Balzrini J，Naesens L，Herdewijn P，Rosenberg I，Holy A，Pauwels R，Baba M，Johns DG，De Clercq I，Marked in vivo anti-retrovirus activity of PMEA[9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenine]，anew selective anti-HIV agent，Proc Natl Acad Sci USA，1989，86：332-336；Balzarini J，Aaesens L，Slachmuylders J，Niphuis H，Rosenberg I，Holy A，Schellekens H，De Clercq E，[9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenine](PMEA)effectively inhibits retrovirus replication invitro and simian immunodeficiency virus infection in Rhesus monkeys，AIDS，1991，5：21-28)：分别测定PCL II的EC₅₀(半抑制浓度)和CC₅₀(对受试细胞的半数细胞毒性浓度)。所用细胞株为CEM(T细胞淋巴瘤细胞系)和TH-4(小鼠神经细胞系)；艾滋病病毒为HIV-1和HIV-2病毒株，对照样品为雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin，GNA)，石蒜凝集素(Lycoris radiata Agglutinin，LRA)，铃兰凝集素(Scilla campanulata agglutinin，SCA)，兰科植物凝集素(Listera Ovta lectin，LOL)。

CEM和TH-4细胞悬浮于新鲜培养基(4×10⁵ cells/ml)，用100倍CCID₅₀/ml(cellculture infective dose 50)的HIV-I和HIV-II进行感染(1个CCID₅₀为50％培养细胞被感染时所需的病毒剂量)。然后，100ul感染的细胞悬液移入微量血清稀释板与100ul经系列倍比稀释的黄精凝集素II及其它样品混合后于37℃培养。4天后检测被感染细胞培养液中合胞囊的形成。抗病毒活性用EC₅₀(effective concentration 50)表示，即半抑制由HIV介导的合胞囊形成时所需的黄精凝集素II浓度；细胞毒性用CC₅₀(cytotoxicconcentration 50)表示，即50％培养细胞发生病变所需的黄精凝集素II浓度。

2结果与讨论

表4黄精凝集素II蛋白细胞毒性和抗HIV活性

	EC50(μg/ml)				CC50(μg/ml)
							HT-4		CEM
	HIV-1	HIV-2	HIV-1	HIV-2							HT-4	CEM
					PCL IIGNALRASCALOL	0.080.76.0.435.00.5	0.080.680.609.00.5	0.050.920.794.600.46	0.100.780.598.00.55	736.571808.6			746.97l837.9

黄精凝集素II对HIV-1和HIV-2抗性结果见表4，由表4可知，黄精凝集素II蛋白对HIV有很强的抑制作用。当受试细胞系为HT-4(小鼠神经细胞)时，黄精凝集素II对HIV-1的半数抑制浓度为EC₅₀＝0.08ug/ml，对HIV-2的半数抑制浓度为EC₅₀＝0.08ug/ml；当受试细胞系为CEM(T细胞淋巴瘤细胞)，黄精凝集素II对HIV-1和HIV-2的半数抑制浓度分别为EC₅₀＝0.05ug/ml和EC₅₀＝0.10ug/ml，比其它甘露糖结合凝集素的半数抑制浓度低10-100倍，即抑制HIV对正常细胞感染活性高出其它甘露糖结合凝集素10-100倍。而黄精凝集素II对HT-4和CEM的半数细胞毒性浓度分别为CC₅₀＝73ug/ml和CC₅₀＝74ug/ml。也比其它凝集素高出近10倍，显示出很高的抗HIV活性和很低的毒性。SCA是近年来研究得较为清楚的单子叶甘露糖结合凝集素，其空间结构也已阐明，特别是其抗艾滋病毒活性已引起许多学者的关注[Pierre Rizkallah，“Bluebells&Daffodils may be used in AIDS drugs”，BritishResearchers Report New Findings，2002]。本实验结果显示黄精凝集素II的抗HIV-1和HIV-2活性分别比SCA高出60倍和100倍。黄精凝集素II的活性明显高出其它单子叶甘露糖结合凝集素的原因可能是黄精凝集素II除可以结合甘露糖外，还可以结合唾液酸，是一种唾液酸和甘露糖结合凝集素。研究表明，HIV的gp120糖链除含甘露糖外，还含有唾液酸化的糖基，推测黄精凝集素II除和gp120的甘露糖基结合外，还结合gp120的唾液酸基团，从而更有效的封闭和阻断gp120与宿主细胞表面CD₄的识别和结合，显示出更强的抑制HIV感染的作用，也表明黄精凝集素II是一种高效的HIV感染抑制糖结合蛋白。

Claims (2)

1、黄精凝集素II蛋白在制备治疗或预防乙型肝炎的药中的应用。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所治疗或预防的乙型肝炎为病毒HBeAg、HBsAg所引起。