CN105560352A - 一种抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖磷酸化分子修饰法 - Google Patents

一种抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖磷酸化分子修饰法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗鸭病毒性肝炎(DVH)黄芪多糖磷酸化分子修饰法，属于中兽药制备技术领域。提取黄芪多糖不同醇沉部分，经反复临床试验筛选出抗DVH黄芪多糖有效部位，再用正交法确定三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰黄芪多糖有效部位的最佳条件为：反应温度70℃，反应时间4h，pH8.5；经红外光谱分析所得产物为黄芪多糖磷酸酯，其糖含量达36.87％，磷酸根含量达12.03％，产物得率达130.32％。黄芪多糖有效部位磷酸酯抗DHV-1感染鸭胚肝细胞作用和对DVH的疗效优于黄芪多糖有效部位。本发明所获得的抗DVH黄芪多糖有效部位磷酸酯具有较高的糖和磷酸根含量，及较高产物得率，对DVH有良好疗效。

Description

一种抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖磷酸化分子修饰法
一、技术领域
本发明涉及一种抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖磷酸化分子修饰法，属于中兽药制备技术领域。
二、背景技术
鸭病毒性肝炎是鸭肝炎病毒(DHV)感染引起的一种传播迅速、高发病率、高致死性疫病。1949年首次分离到该病毒，目前已呈全世界范围分布。DHV主要存在DHV-1及其变异株、DuckAstrovirus以及DHV-3三个血清型，其中DHV-1型毒性最强、分布最广，主要侵染3周龄以内的雏鸭，病死率高于80％，甚至可高达100％，是严重危害养鸭业主要病原之一。
目前，世界范围内临床上还没有有效的抗DHV-1药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现，即造成难以挽回的损失。1958年Gerber等首先发现海藻多糖具有抗病毒作用，此后多种多糖及硫酸化多糖的抗病毒作用陆续被报道。近年来，本实验室也发现了黄芪、香菇、当归等多种中药多糖能显著抵抗新城疫、传染性法氏囊病等病毒的感染。中药化合物结构修饰是提高其水溶性和生物活性的主要手段之一。许多学者发现，中药多糖成分、皂苷等成分硫酸化或磷酸化分子修饰后，使其成酯化物，其水溶性普遍增加，免疫药理作用明显增强。
黄芪是一种经典的补气用中药。大量的现代药理学研究和普遍的临床应用结果表明，黄芪多糖是其主要有效成分之一，具有良好的提高免疫的作用。虽然有学者发现，经过硫酸化修饰的硫酸化黄芪多糖对鸡传染性法氏囊病毒、猪繁殖呼吸综合征病毒和猪圆环病毒等表现出良好的抑制作用。我们课题组发现，按照不同的条件修饰中药多糖所获得的多糖成分分子修饰物的活性往往大相径庭。为研究有效的抗鸭病毒性肝炎药物，我们根据前期的预试验，将分离获得并经在体试验验证有一定效果的黄芪多糖最有效部位采用磷酸化分子修饰，并利用正交试验比较优化了其制备工艺，以进一步提高其生物活性和生物利用率。
本发明首次对黄芪多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位进行筛选和磷酸化分子修饰，并采用正交法优化了抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖活性部位磷酸化分子修饰条件，发现磷酸化分子修饰能显著增加黄芪多糖有效部位抗鸭病毒性肝炎效果，提高其生物利用度，并获得较高的产物得率。
三、发明内容
技术问题本发明针对世界范围内临床上还没有有效的抗鸭病毒性肝炎药物问题，提供一种黄芪多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位的磷酸化分子修饰方法，所获得的黄芪多糖磷酸酯pAPS75含量达36.87％，磷酸根含量为12.03％，产物得率达130.32％，且对鸭病毒性肝炎的治疗作用明显提高，可望最终应用于鸭病毒性肝炎的防治。
技术方案
采用水煎醇沉法，收集不同醇沉部位黄芪多糖，经数次临床试验发现黄芪多糖乙醇浓度75％醇沉部分(APS75)对鸭病毒性肝炎有较理想的治疗效果，再用正交试验法对APS75的磷酸化分子修饰方法进行优化。经优化后的黄芪多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位(APS75)的磷酸化分子修饰方法为：精确称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0000g三偏磷酸钠，溶于50ml蒸馏水中；精密称取250mg黄芪多糖有效部位APS75加入至100ml蒸馏水中，充分溶解后将配好的三聚磷酸钠-三偏磷酸钠混合液50ml加入，调节pH＝7.5～9，置恒温水浴锅内，反应温度70℃～90℃、反应时间4～8h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化黄芪多糖。经NicoletFT-IR200型傅立叶变换红外光谱仪分析为黄芪多糖磷酸酯pAPS75。按此方法制备的黄芪多糖磷酸酯含量达36.87％，磷酸根含量为12.03％，产物得率达130.32％。所获得的黄芪多糖磷酸酯对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养的鸭胚肝细胞具有良好的抑制作用，对鸭肝炎病毒DHV-1攻毒感染引起的鸭病毒性肝炎具有良好的治疗作用，且其作用均优于未修饰的黄芪多糖APS75。
有益效果
病毒性疾病已经成为目前人类和动物健康的最大威胁之一，并造成了巨大的社会经济损失。近年来肆虐人类的禽流感、甲流、艾滋病、非典、流感、肠道病毒EV71型等等，肆虐动物的禽流感、新城疫、蓝耳病、圆环病毒2型、伪狂犬病、细小病毒病、鸭病毒性肝炎等等，都使人类和动物生命健康遭受了严重的威胁。病毒性疾病肆虐人畜的一个重要原因是人类对于这些烈性病毒目前尚没有临床特效的药物。曾今的抗流感病毒特效药“达菲”现在对H5N1、H7N9却不再那么有效。虽然三氮唑核苷、盐酸金刚乙胺、无环鸟苷等抗病毒药对病毒病也有一定的临床疗效，但是其引起的恶心、精神紊乱、腹泻、肝肾功能损伤、眩晕等等不良反应利药物残留，这些医源性、药源性疾病的不断增加使得人们开始拒绝这些抗病毒西药，转而选择毒副作用小的中草药，目前已有40％以上的消费者选择了中药或中西结合治疗。而在养殖业中，病毒性疾病仍然是目前养禽业危害最大的疫病之一，随着金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒西药的全面被禁用，动物药品市场上治疗动物病毒病的西药出现了空档。由于世界范围内临床上尚还没有有效的抗DHV-1药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现3周龄以内的感染雏鸭，其病死率往往高于80％，甚至可高达100％，造成的损失难以估量。
黄芪多糖是黄芪的主要药效成分，具有良好的抗病毒、提高免疫等作用，目前已经开发成为兽医临床用抗病毒药物和提高免疫用药物。广泛的兽医临床试验发现，黄芪多糖对猪圆环病毒、繁殖呼吸综合征病毒、鸡传染性法氏囊病毒等有较好的疗效，但对鸭病毒性肝炎、鸡新城疫等瘟疫疗效却不稳定。已有的研究发现黄芪多糖硫酸化分子修饰物具有更良好的抗病毒作用，但硫酸化分子修饰操作相对复杂，刺激性大，修饰物水溶性欠佳，生物利用度也有限。为研制有效的抗鸭病毒性肝炎治疗用药，并提高黄芪多糖的水溶性和生物利用度，本发明采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰黄芪多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位APS75，所形成的黄芪多糖磷酸酯pAPS75不仅磷酸根和磷酸酯多糖含量高，产物得率亦很高，临床试验发现其对鸭病毒性肝炎的疗效明显增强，且水溶性良好，制剂使用更为方便。
与现有技术相比，本发明优点如下：
1.多糖磷酸化分子修饰的方法国内虽有3篇报道[1.李益，钱慈，郭明，梁东军.香菇多糖磷酸化修饰的工艺研究[J].黑龙江大学自然科学学报，2013，30(5)：664-670；2.孙雪，潘道东，曾小群，曹锦轩.浒苔多糖的磷酸化修饰工艺[J].食品科学，2011，32(24)：73-77；3.张难，吴远根，莫莉萍，邱树毅，王文平.香菇多糖磷酸化修饰工艺条件的研究[J].食品与发酵工业，2007，33(12)：63-67]，但此3文并不是对黄芪多糖进行修饰，更不是对有效作用部位进行修饰，所选的工艺方法为响应面法，本法采用的正交筛选，获得的最佳修饰条件也不同。且最根本的在于本发明所修饰的黄芪多糖为抗鸭病毒性肝炎有效部位APS75，目前国内外尚未见相似研究。
2.通过本发明实施所获得的黄芪多糖磷酸酯pAPS75含量达36.87％，磷酸根含量为12.03％，产物得率达130.32％，而且具有良好的水溶性，入水即溶，制剂使用方便。
3.通过本发明实施所获得的黄芪多糖磷酸酯pAPS75不仅对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养的鸭胚肝细胞作用显著优于未修饰黄芪多糖有效部位APS75，且对DHV-1攻毒感染鸭的治疗作用也优于未修饰的黄芪多糖有效部位APS75。
四、具体实施方式
1.黄芪多糖的提取及有效部位筛选
称取1000g黄芪，加10倍量水浸泡3h，加热煮沸1h，收集煎煮液，反复3次；合并收集的煎煮液，煮沸浓缩至1000mL，用高速离心机离心，取上清。缓慢向浓缩液中加入不同体积分数为95％的乙醇，使溶液中乙醇含量分别为50％、65％、75％、80％，静置过夜，分别离心收集沉淀。经流水透析后，真空浓缩，3000rpm/min，离心20min，上清再次加入不同体积分数95％乙醇沉淀，重复透析、浓缩、离心，反复3次后，60℃真空干燥，碾碎，分别得到黄芪多糖不同醇沉部位APS50、APS65、APS75、APS80和总多糖APSt。
3日龄非免樱桃谷鸭随机均分7组，每组31羽，分别为空白对照组、攻毒对照组和5个不同醇沉部位黄芪多糖组。除空白对照组外，其余6组鸭分别肌肉注射鸭肝炎病毒DHV-10.2mL/羽后，1h后各多糖组分别于饮水中添加多糖饮喂，5mg/羽.天，连续3天，每天观察记录各组鸭死亡情况，死亡鸭及时逐只剖检观察病变，剔除无病变雏鸭，待全群鸭停止死亡时，统计各组存活率。结果发现，黄芪多糖不同醇沉部位APS50、APS65、APS75、APS80和总多糖APSt及攻毒对照组各组存活率依次为12.90％、16.13％、22.58％、19.35％、19.35％和16.13％。其中75％醇沉部位APS75的存活率显著高于攻毒对照组，并高于其他醇沉部位，拟对此部位进一步修饰研究。
2.黄芪多糖有效部位APS75磷酸化分子修饰及条件优化
采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰黄芪多糖有效部位APS75。根据单因素预试验结果，反应pH值、反应温度，反应时间对磷酸化修饰的影响较大，采用正交试验设计方法，选取反应PH值(A)、反应温度(B)和反应时间(C)为因素，确定三个水平，按照正交表L9(34)(表1)设计正交试验。
表1正交试验因素和水平设计
精确称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0000g三偏磷酸钠，溶于50ml蒸馏水中；精密称取250mg黄芪多糖有效部位APS75加入至100ml蒸馏水中，充分溶解后将配好的三聚磷酸钠-三偏磷酸钠混合液50ml加入，调节pH＝7.5～9，置恒温水浴锅内，反应温度70℃～90℃、反应时间4～8h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化黄芪多糖。结果见表2。
表2L9(34)正交试验结果
以产物量为指标，最佳组合为A2B3C1，产物量为336.8mg，以产物量为指标的极差(R)值可以看出，影响因素A＞C＞B，即PH对产物量影响最大，其次是反应时间，最后是反应温度。以糖含量为指标，最佳组合为A2B3C1，多糖含量为29.27％，以多糖含量为指标的极差(R)值可以看出，影响因素C＞B＞A，即反应时间对多糖含量影响最大，其次是反应温度，最后是pH。以磷酸根含量为指标，最佳组合为A1B1C1，磷酸根含量为10.28％，以磷酸根含量为指标的极差(R)值可以看出，影响因素A＞C＞B，即pH对磷酸根含量的影响最大，其次是反应时间，最后是反应温度。综合分析，当pH为8.5时，产物量和磷酸根含量最高；当反应时间为4h时，多糖含量最高；反应温度对产物量、多糖含量和磷酸根含量的影响均较小，但是在70℃时产物量和磷酸根含量均较高。所以，pH为8.5，反应时间为4h，反应温度为70℃为磷酸化黄芪多糖APS75的最佳工艺。
按照最佳条件，再次用250mg黄芪多糖有效部位APS75进行磷酸化分子修饰，结果发现，其多糖含量为36.87％，磷酸根含量为12.03％，产物得率达130.32％。所获得的磷酸化黄芪多糖分子修饰物分别用蒸馏水、PBS和细胞培养液溶解，加入后轻微振摇，均立刻溶解，溶液呈均质淡棕色，对光观察，无明显可视沉淀物。表明黄芪多糖有效部位APS75经过磷酸化分子修饰形成后，水溶性显著增加，制剂使用更为方便。
3.黄芪多糖有效部位APS75磷酸化分子修饰产物红外光谱分析
采用KBr压片法以NicoletFT-IR200型傅立叶变换红外光谱仪分析上述最佳条件修饰的黄芪多糖有效部位磷酸化分子修饰产物(见图1，图2)，黄芪多糖有效部位APS75和黄芪多糖磷酸化修饰物pAPS75红外吸收光谱基本一致，均表现出了多糖的特异性吸收峰：两者在3500-3200cm-1处出现的宽峰是由O-H伸缩振动引起的，在3020-2820cm-1处的吸收峰是C-H伸缩振动引起的。修饰后的黄芪多糖有效部位APS75保留了多糖特征吸收峰，并有三个磷酸化后新增加的吸收峰，分别是1241.80cm-1处为磷化物的吸收峰，1017.87cm-1处为亚磷酸酯的吸收峰，以及896.96cm-1处为焦磷酸酯的吸收峰。
附图说明图1黄芪多糖有效部位APS75红外分析光谱图
在3364.73cm-1处的吸收峰是-OH的伸缩振动吸收峰，2936.18cm-1处的吸收峰为分子内氢键伸缩振动吸收峰，1622.51cm-1吸收峰为-OH弯曲振动吸收峰、1413.45cm-1处吸收峰为＝CH2振动吸收峰，在1049.51处吸收峰可能为黄芪多糖特有的S＝O键。
附图说明图2黄芪多糖磷酸化修饰物pAPS75红外分析光谱图
修饰后的黄芪多糖保留了多糖特征吸收峰3401.99cm-1、2935.14cm-1和1654.93cm-1，并有三个磷酸化后新增加的吸收峰，分别是1241.80cm-1处为磷化物的吸收峰，1017.87cm-1处为亚磷酸酯的吸收峰，以及896.96cm-1处为焦磷酸酯的吸收峰。
4.黄芪多糖磷酸酯pAPS75对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养鸭胚肝细胞的抑制作用研究
取14-16日龄鸭胚，无菌条件下取出肝脏。将取出的鸭胚肝脏去胆囊，用D-Hank′s清洗2次，剪碎后用D-Hank′s清洗3次。加入0.25％胰蛋白酶，37℃消化8～15min，吸掉胰蛋白酶，用D-Hank′s清洗3次，加入含1％青霉素钾、1％硫酸链霉素、1％L-谷氨酰胺、10％小牛血清的DMEM培养基。计数使细胞浓度在0.8×106-1.2×106个/mL范围内，置37℃、5％CO2培养箱内培养，待细胞形成完整单层后，弃去细胞培养液，用D-Hank`s液洗2次待用。
将APS75、pAPS75用细胞维持液分别从最大安全浓度(APS75和pAPS75的最大安全浓度分别为625μg/mL和31.25μg/mL)连续倍比稀释5个浓度。在鸭胚肝细胞单层中每孔各加入病毒70μL，培养2h后弃去病毒液，用D-Hank’s反复清洗3遍，弃去清洗液，分别加入70μL稀释后受试药物，每药各浓度重复5孔。同时设细胞对照(CC)和病毒对照(VC)，置38℃5％CO2培养箱内培养，当VC组出现明显病变时，用MTT法检测，读取A570值。同时计算病毒抑制率＝(A570.药+病毒-A570.VC)/(A570.CC-A570.VC)×100％。以A570值和病毒抑制率综合分析药物的抗病毒作用。结果见表3。APS75在625～39.06μg/mL时，其A570值均高于病毒对照组，在78.125μg/mL时APS75表现出了显著的抗DHV-1感染作用，最大病毒抑制率为71.66％。pAPS75在安全浓度范围的最后3个浓度A570值均显著高于病毒对照组，均表现出抗DHV-1感染作用。pAPS75的病毒抑制率为29.19％～85.06％，普遍高于APS75。
表3APS75和pAPS75体外抗DHV-1作用的A570值和病毒抑制率
注：同列数据标不同字母者差异显著(P＜0.05)。
5.黄芪多糖磷酸酯对鸭肝炎病毒DHV-1攻毒感染雏鸭的治疗作用研究
将240只4日龄樱桃谷鸭随机均分成4组：第1组为APS75治疗组，60只；第2组为pAPS75治疗组，60只；第3组为病毒对照(VC)组，60只；第4组为空白对照(BC)组(隔离饲养)，30只。将1-3组的雏鸭肌肉注射DHV-1病毒0.2mL攻毒。攻毒后立即按如下方案于饮水中混饮给药：APS75治疗组4mg/只.天；pAPS75治疗组2mg/只.天；每天1次，连续5d。于攻毒后的急性期(4h和8h)和稳定期(54h)各组随机采取5只鸭采血，并用肝素抗凝，用real-timePCR测定血液病毒含量。每天观察各组鸭的临床症状及死亡情况，记录各组死亡数，死亡鸭及时逐只剖检观察病变，剔除无病变雏鸭，待全群鸭停止死亡时，统计各组死亡率(剔除采血雏鸭)，存活的鸭全面扑杀。
结果见表4。VC组的死亡率为85.0％；APS75治疗组的死亡率为78.3％，低于VC组；pAPS75治疗组的死亡率为66.7％，显著低于VC组；pAPS75组较APS75组死亡率低11.6个百分点，二者间没有显著性差异。说明黄芪多糖有效部位APS75磷酸化分子修饰后所获得的黄芪多糖磷酸酯pAPS75的治疗效果优于未修饰的黄芪多糖有效部位APS75。
表4APS75和pAPS75对感染DHAV雏鸭死亡率的影响
注：同列数据标不同字母者差异显著(p＜0.05)。/：BC组没有死亡，停止死亡时间无法计算。

Claims (4)

1.一种抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖磷酸化分子修饰法，采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰黄芪多糖，其特征在于：
(1)采用水煎醇沉法，收集了5个不同醇沉部位的黄芪多糖添加于饮水中治疗鸭肝炎病毒DHV-1攻毒鸭，数次临床试验发现5个醇沉部位的黄芪多糖对鸭病毒性肝炎具有不同的治疗作用，以黄芪多糖75％醇沉部分APS75对鸭病毒性肝炎的治疗效果较好；
(2)抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖磷酸化分子修饰的方法：精确称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0000g三偏磷酸钠，溶于50ml蒸馏水中；精密称取250mg黄芪多糖有效部位APS75加入至100ml蒸馏水中，充分溶解后将配好的三聚磷酸钠-三偏磷酸钠混合液50ml加入，调节pH＝7.5～9，置恒温水浴锅内，反应温度70℃～90℃、反应时间4～8h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化黄芪多糖。
2.根据权利要求1所述的一种抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖磷酸化分子修饰的方法，其特征在于，磷酸化分子修饰黄芪多糖的最佳条件为：反应温度70℃、反应时间4h、pH8.5；在最佳条件下磷酸化分子修饰黄芪多糖75％醇沉部分APS75，其产物中磷酸化黄芪多糖糖含量为36.87％，磷酸根含量为12.03％，产物得率为130.32％。
3.根据权利要求2所述的一种抗鸭病毒性肝炎黄芪多糖磷酸化分子修饰的方法，其特征在于：在最佳条件下磷酸化分子修饰黄芪多糖75％醇沉部分APS75，其产物磷酸化黄芪多糖的红外光谱图基本形状与修饰前一致，未发生根本性改变，均具有多糖特征吸收峰，除多糖母体特征峰得到保留之外，在1241.80cm-1处为磷化物的吸收峰，1017.87cm-1处为亚磷酸酯的吸收峰，在896.96cm-1处为焦磷酸酯的吸收峰，表明磷酸化分子修饰黄芪多糖75％醇沉部分APS75的产物为黄芪多糖磷酸酯；
且上述最佳条件下制备的黄芪多糖磷酸酯对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养的鸭胚肝细胞具有良好的抑制作用，对鸭肝炎病毒DHV-1攻毒感染引起的鸭病毒性肝炎具有良好的治疗作用，且其作用均优于未修饰的黄芪多糖。
4.权利要求1-3任一项所述的方法在制备抗鸭病毒性肝炎药物中的应用。
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