CN103735599A - 臭灵丹提取物及组合物在抗甲型病毒性流感药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感药物中的应用。该臭灵丹提取物对呼吸道甲型病毒性流感病毒有较强的抑制作用。该臭灵丹提取物活性成分用乙醇、甲醇或脂溶性溶剂提取或再萃取、沉淀、层析获得。本发明所述的臭灵丹提取物通过细胞病变、血凝效价、RealTimeRT-PCR等一系列实验，对臭灵丹提取物的样品进行甲型流感病毒的体外中和作用和增殖抑制作用检测，臭灵丹提取物及其活性成份具有抗甲型流感病毒活性，具有开发成单方、复方抗甲型流感病毒药物的前景。

Description

臭灵丹提取物及组合物在抗甲型病毒性流感药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说是臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感药物中的应用。
背景技术
臭灵丹 (Laggera Pterodonta （DC.) Benth） 为菊科六棱菊属药用植物， 别名狮子草、臭叶子、六棱菊等，分布于云南、四川、西藏等地，主产于我国云南省，药源丰富。《云南中草药》、《昆明民间常用草药》及《滇南本草》等大量收载了云南民间使用臭灵丹的经验，该药具有良好的抗菌消炎、清热解毒的作用，被广泛用于治疗感冒、咽喉炎、支气管炎、疟疾等病症。目前已经从该属植物中鉴定的化合物主要为桉烷型倍半萜及黄酮醇类化合物。
从植物中发现天然抗病毒药物，是开发抗病毒药物的重要途径。臭灵丹药材资源十分丰富，现已开发成为抗细菌类的咽喉肿痛、肺热咳嗽类药物，但对病毒作用尚无系统基础研究和应用研究。目前未见臭灵丹提取物用于抗甲型病毒性流感的文献报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型流感病毒中的应用，以及所述臭灵丹提取物的提取方法。
本发明对臭灵丹进行药物活性成分的富集和提取分离，并且进行呼吸道合胞病毒及甲型流感病毒株的体外培养，研究臭灵丹活性成分的体内外抗病毒作用，发扬和利用我国中药的优势和特色，对有效成分的深入药理机理研究，进一步寻找具有生物活性的化合物，研制出疗效确切、副作用小、经济有效和能广泛应用于临床的抗甲型病毒性流感的臭灵丹提取物的应用。
本发明的臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型流感病毒中的应用是将臭灵丹提取物及其组合物制备成抗甲型病毒性流感的药物。
所述的臭灵丹提取物活性成分含以下化合物： 3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4’,5-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮、5,6-二羟基-3,4’,7-三甲氧基黄酮、4’,5-二羟基-3,6,7-三甲氧基黄酮、5-羟基-3,3’,4’,6,7-五甲氧基黄酮、4’,5-二羟基-3,3’,6,7-四甲氧基黄酮、3’,5-二羟基-3,4’,6,7-四甲氧基黄酮。
所述的臭灵丹提取物组合物为：臭灵丹提取物可配以贯众、金银花、药用赋形剂组合成药物组合物。各组份的重量份为：臭灵丹提取物70～80、贯众10～15、金银花10～15，必要的药用赋形剂（其用量可按现有技术）。
所述药物为：片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、散剂、丸剂、合剂、颗粒剂、冲剂、滴丸剂、膏剂、口服液，或控释、缓释、纳米制剂。
所述的臭灵丹提取物的提取方法：用臭灵丹药材，加入臭灵丹药材10倍重量乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种，用冷浸或渗滤、回流加热、超声提取回收溶剂得到初提物；该初提物按以下方法处理：加初提物2～3倍重量的水，放置2～3小时，滤去不溶物叶绿素、树脂状物，水液减压浓缩，加入浓缩物2～3倍量的无水乙醇，放置4～5小时，滤除醇不溶物；醇溶液再次重复去除水不溶物，或直接回收溶剂至干得臭灵丹提取物；或者初提物上大孔树脂柱或活性炭柱，水洗，除去水溶性杂质，再用20%-95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物；或者初提物溶液通过聚酰胺柱或葡聚糖凝胶柱，依次用水、95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物。
本发明所述的臭灵丹提取物通过细胞病变、血凝效价、Real Time RT-PCR等一系列实验，对臭灵丹提取物的样品进行甲型流感病毒的体外中和作用和增殖抑制作用检测，臭灵丹提取物其活性成份具有抗甲型流感病毒活性，具有开发成单方、复方抗甲型流感病毒药物的前景。 
附图说明
图1是3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸结构图。
图2是3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸结构图。
图3是4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸结构图。
图4是4’,5-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮结构图。
图5是5,6-二羟基-3,4’,7-三甲氧基黄酮结构图。
图6是4’,5-二羟基-3,6,7-三甲氧基黄酮结构图。
图7是5-羟基-3,3’,4’,6,7-五甲氧基黄酮结构图。
图8是4’,5-二羟基-3,3’,6,7-四甲氧基黄酮结构图。
图9是3’,5-二羟基-3,4’,6,7-四甲氧基黄酮结构图。
图10是臭灵丹提取物HPLC色谱图，所用色谱条件如下：色谱柱：岛津VP-ODS 150L x 4.6，流动相：甲醇-0.1%甲酸梯度洗脱（时间0→40→50min；甲醇30%→70%→100%；0.1%甲酸70%→30%→0%），波长：254nm，流速：1ml/min，柱温：30℃。
图11是流感病毒感染后病变的MDCK细胞图, a正常MDCK细胞,b病变MDCK细胞。
图12是实验样品血凝效价实验照片。
图13是实验样品RT-PCR实验照片）。
图14是72N组的扩增曲线。
图15是72N组的溶解曲线1 。
图16是72N组的溶解曲线2。
图17是72M组的扩增曲线。
图18是72M组的溶解曲线1。
图19是72M组的溶解曲线2。
图20是96N组的扩增曲线。
图21是96N组的溶解曲线1。
图22是96N组的溶解曲线2。
图23是96M组的扩增曲线。
图24是96M组的溶解曲线1。
图25是96M组的溶解曲线2。
图26是各组小鼠每日的体重变化（平均值）。
图27是臭灵丹药物体内抗病毒的鼠肺病理检查（200×），A：正常对照；B：病毒对照组；C：利巴韦林；D：臭灵丹药物高剂量组(1600mg/kg·d)；E：臭灵丹药物中剂量组(800mg/kg·d)；F：臭灵丹药物低剂量组(400mg/kg·d)。
图1-9中：1为3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸；2为3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸；3为4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸；4为4’,5-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮；5为5,6-二羟基-3,4’,7-三甲氧基黄酮；6为4’,5-二羟基-3,6,7-三甲氧基黄酮；7为5-羟基-3,3’,4’,6,7-五甲氧基黄酮；8为4’,5-二羟基-3,3’,6,7-四甲氧基黄酮；9为3’,5-二羟基-3,4’,6,7-四甲氧基黄酮。
具体实施方式
实施例1：
臭灵丹提取物的提取方法：用臭灵丹药材，加入臭灵丹药材10倍重量乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种，用冷浸或渗滤、回流加热、超声提取得到初提物；该初提物按以下方法处理：加初提物2倍重量的水，放置2小时，滤去不溶物叶绿素、树脂状物，水液减压浓缩，加入浓缩物2倍量的无水乙醇，放置4小时，滤除醇不溶物；醇溶液再次重复去除水不溶物，或直接回收溶剂至干得臭灵丹提取物；或者初提物上大孔树脂柱或活性炭柱，水洗，除去水溶性杂质，再用20%-95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物；或者初提物溶液通过聚酰胺柱或葡聚糖凝胶柱，依次用水、95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物。
所述的臭灵丹提取物活性成分含以下化合物： 3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4’,5-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮、5,6-二羟基-3,4’,7-三甲氧基黄酮、4’,5-二羟基-3,6,7-三甲氧基黄酮、5-羟基-3,3’,4’,6,7-五甲氧基黄酮、4’,5-二羟基-3,3’,6,7-四甲氧基黄酮、3’,5-二羟基-3,4’,6,7-四甲氧基黄酮。
以上化合物可以采用以下方法分离得到：
取上述方法得到的臭灵丹提取物用硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（10~0：1），得到1~20的组份；第20组份用C18柱色谱分离，以甲醇-0.1%甲酸梯度洗脱，得到化合物1、2和3；第16组份用C18柱色谱分离，以甲醇-水梯度洗脱，得到化合物4、5、8、9；7组份用硅胶柱分离，以氯仿-甲醇（95：5）洗脱，得到化合物6；5组份用硅胶柱分离，以氯仿洗脱，得到化合物7。化合物4、5、9系首次从臭灵丹得到。
将上述臭灵丹提取物按现有技术的方法加药用赋形剂，制成片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、散剂、丸剂、合剂、颗粒剂、冲剂、滴丸剂、膏剂、口服液，或控释、缓释、纳米制剂。
实施例2：
臭灵丹提取物可配以贯众、金银花、药用赋形剂组合成药物组合物。各组份的重量份为（千克）：臭灵丹提取物80、贯众10、金银花10，必要的药用赋形剂（其用量可按现有技术配制）。
实施例3：
臭灵丹提取物药物组合物各组份的重量份为（千克）：臭灵丹提取物70、贯众15、金银花15，必要的药用赋形剂（其用量可按现有技术配制）。
实施例4：
臭灵丹提取物药物组合物各组份的重量份为（千克）：臭灵丹提取物75、贯众15、金银花10，必要的药用赋形剂（其用量可按现有技术配制）。
将上述臭灵丹提取物药物组合物加加入必要的药用赋形剂，制成片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、散剂、丸剂、合剂、颗粒剂、冲剂、滴丸剂、膏剂、口服液，或控释、缓释、纳米制剂。
以下是臭灵丹提取物对于抗甲型病毒性流感的试验研究。
取臭灵丹及其组合物的组方药物各400克、200克，乙醇提取后回收溶剂，残留液分别用一定量的石油醚（PE）、乙酸乙酯（EA）、正丁醇（BU）萃取二次，回收溶剂得到臭灵丹提取物和残留水部分共8个部分。8部分药品标号如下：A，臭灵丹提取物正丁醇部分、B，臭灵丹提取物乙酸乙酯部分、C，臭灵丹提取物水部分、D，臭灵丹提取物石油醚部分、E,臭灵丹正丁醇部分、F，臭灵丹乙酸乙酯部分、G，臭灵丹水部分、H，臭灵丹石油醚部分。
刮取适量臭灵丹提取物样品加乙醇或水溶解成浓度为100ug/ul的母液。对照药品达菲溶解：取1粒达菲（75mg），弃胶囊外壳，药品溶解于750ulMEM中（100ug/ul）。作如下实验研究。
一、病毒分离培养和滴度测定
1、MDCK细胞培养方法：DMEM培养基，37℃，5%CO2培养箱内培养。胰酶消化传代。
2、病毒扩增条件：
A：配制病毒吸附液：空DMEM+TPCK胰酶（1%），以此比例配所需用量。
B:将长至单层的MDCK细胞弃去培养液，PBS洗细胞面3次，加入病毒吸附液，置34+1℃吸附1-1.5h，每20分钟摇晃1次，使病毒液均匀作用于细胞面（以T25细胞培养瓶为例每瓶加1ml病毒吸附液）。
C：配制维持液：在剩余病毒吸附液中补加1%BSA，加适当NaHCO3调节PH，成为维持液。
D：向吸附好的培养瓶中补加9ml维持液，34+1℃培养，3-4天会出现病变。反复冻融3次后，收取悬液于15ml离心管中，4000rpm离心10min，收集上清分装于1.5ml离心管中，-80℃保存。
病变程度判断标准如图11所示。
3、病毒滴度测定：
1):病毒梯度稀释：
取10ul病毒液入ep.管中，加培养基至1ml，混匀后取100ul入新ep.管中，加培养基900ul，即为10-3稀释度，混匀后从中再取100ul至新ep.管中，加培养基900ul，即为10-4稀释度，如此依次稀释至10-8。
2):将梯度稀释的病毒液加入96孔板，100ul/孔。同时设空白细胞对照（NC）
3):病毒滴度计算：72小时后取出96孔板，数病变孔数。
在10-1~10-2梯度下8孔完全病变，10-3梯度下6孔病变，10-5梯度下无病变。
病毒的50%组织细胞感染量（TCID50）计算：TCID50=10-4.25/ml
4、病毒血凝效价（HA）测定（微量法）：
以现有A型流感病毒毒种测血凝效价。
抗凝剂配制： （酸性）柠檬酸葡萄糖溶液B（ACD）
柠檬酸钠：1.32%（M/V）
柠檬酸：0.48%（M/V）
葡萄糖：1.47%（M/V）
鸡血球细胞制备：抗凝剂20ml+新鲜公鸡血20ml，混匀后1000rpm*10min离心，弃上清，加入20ml生理盐水，混匀后1000rpm*10min离心，弃上清，如此洗3遍，获得鸡血球细胞。
实验流程：1):在U形板中加生理盐水50ul/孔，加24孔。其中12孔为阴性对照。
          2):加样品于第一孔50ul，换新枪头吹打混匀，取50ul于下一孔，依次对倍稀释至第12孔，弃去50ul。
          3):鸡血按1%稀释，即1ml鸡血+99ml生理盐水，混匀。
          4):取鸡血50ul/孔，加入上述样品及阴性对照孔中。
          5):置室温45分钟~1小时，观察结果。
结果：病毒的血凝效价为1：1028
5、最适种毒条件探索：
以现有A型流感病毒毒种稀释各个梯度以摸索最适种毒条件。
种1块48孔板，上半部24孔保留病毒液直至产生病变，以模拟中和实验，下半部24孔种毒后24小时去掉病毒液，加培养基，以模拟抗增殖实验。以 48孔板筛选流感病毒最适种毒浓度。
观察种毒后48小时观察病变结果、种毒后72小时观察病变结果、种毒后96小时观察病变结果。
实验结果表明：最适合用于中和实验和抗增殖实验的种毒稀释度为10-1~10-3，拟定以10-2为种毒稀释度，最适结果观测时间为72小时。
二、对病毒具有中和杀伤作用和增殖抑制作用的臭灵丹提取物药物粗筛
1、药物对流感病毒中和杀伤作用：
病毒终稀释度为10-2，中药终浓度为5 ug/ml 、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml，同时作用于细胞。
实验流程：1）将复苏后传1-2代的MDCK细胞种3块96孔板，长至单层。
2）病毒稀释：取A型流感病毒500ul溶于25ml维持液中，稀释度为2*10-2。
 3）药物稀释：用维持液将药物稀释成10 ug/ml 、40ug/ml、100ug/ml、200ug/ml四个浓度梯度。
4）MDCK细胞用PBS洗2遍，将80ul各浓度稀释的药液与80ul病毒液混合，接种长满单层细胞的96孔板，另设病毒对照C+V、细胞对照C和达菲对照DF。以上每孔设三个复孔。将板子于37℃，5%CO2培养箱内培养，每天观察记录病变情况。
在中和实验中，病毒阳性对照在种毒后第48小时出现轻微病变，而加药孔均无，明显病变；在种毒后72小时，病毒阳性对照18孔有14孔完全病变，乙酸乙酯、石油醚部分、臭灵丹乙酸乙酯、石油醚部分有中和病毒作用。在种毒后96小时，乙酸乙酯部分、石油醚部分病毒阳性对照孔完全病变，药物有中和病毒作用。
2、药物对流感病毒增殖抑制作用：
病毒终稀释度为10-2，先加入细胞作用24小时后弃掉病毒液，加入中药。中药终浓度为5 ug/ml 、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml。
实验流程：1）将复苏后传1-2代的MDCK细胞种3块96孔板，长至单层。
2）病毒稀释：取A型流感病毒400ul溶于39.6ml维持液中，稀释度为10-2。
3）MDCK细胞用PBS洗2遍，将病毒液接种长满单层细胞的96孔板，100ul/孔，细胞对照孔和药品对照孔加培养基100ul/孔，于37℃，5%CO2培养箱内培养24小时。
4）药品稀释：用维持液将8个药品和达菲稀释成5 ug/ml 、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml四个浓度梯度：
5）培养24小时后将板子中溶液弃尽，加入各浓度稀释的药液，细胞对照C和病毒对照C+V加维持液。浓度同4，以上每孔设三个复孔。将板子于37℃，5%CO2培养箱内培养，每天观察记录病变情况。
在增殖抑制实验中，病毒阳性对照在种毒后第48小时完全出现病变，而加药孔部分出现病变，组方药乙酸乙酯部分、臭灵丹乙酸乙酯、石油醚部分有抑制病毒增殖作用；在种毒后72小时，臭灵丹乙酸乙酯、石油醚部分有抑制病毒增殖作用，在种毒后96小时，所有药品均无抑制病毒增殖作用。
结果：乙酸乙酯部分、石油醚部分提取物具有抗流感、保护细胞的作用。在本实验中达菲无抗流感、保护细胞的作用，阳性对照不成立。
三、粗筛的臭灵丹提取物对流感病毒中和杀伤作用和增殖抑制作用研究
1、中和实验和抗增殖实验
实验流程：1）将复苏后传1-2代的MDCK细胞种6块6孔板，长至单层。
2）病毒稀释：取A型流感病毒600ul溶于30ml维持液中，稀释度为2*10-2。从中取10ml病毒液加入10ml维持液对倍稀释，稀释度即为10-2 。
 3）药品稀释：用维持液将3个样品稀释成其最佳浓度（100ug/ml）。
          4）中和试验：3板长满单层的MDCK细胞6孔板用PBS洗2遍，每孔加入1.5ml病毒液（稀释度为2*10-2），每孔再加入各药品1.5ml；病毒对照孔（V）加病毒1.5ml和维持液1.5ml；药品对照孔（O）加药品1.5ml和维持液1.5ml；细胞对照孔（C）加维持液3ml。
5）增殖抑制试验： 3板长满单层的MDCK细胞6孔板用PBS洗2遍，每孔加入2ml病毒液（稀释度为10-2），药品对照孔和细胞对照孔加入2ml维持液。将板子于37℃，5%CO2培养箱内培养24h，弃掉病毒液，加入各药品2ml；药品对照孔（O）加药品2ml；病毒对照孔（V）和细胞对照孔（C）加维持液2ml。
2、实验样品血凝效价（HA）测定（微量法）
血球吸附试验步骤见前述，测得的样品血凝效价结果见下表：
样品编号 72N 72M 96N 96M
B 1:16 1:8 1:32 1:32
F 1:4 1:8 1:16 1:256
H 1:4 1:4 1:32 1:32
（实验样品血凝效价表）
（注：N为Neutralization缩写，代表中和实验样品，M为Multiplication缩写，代表抗增殖实验样品；72代表72小时收毒，96代表96小时收毒。）
3、RT-PCR鉴定流感病毒RNA
    实验流程：将6块做中和实验和抗增殖实验的6孔板冻融2次，收集各编号的培养液，4000rpm*10min离心，收集上清，以试剂盒提取总RNA，用TAKARA公司PrimeScript One Step RT-PCR Kit进行RT-PCR。Primer：F: TTCTAACCGAGGTCGAAACG，R: ACAAAGCGTCTACGCTGCAG，目的片段235bp。
4、Real Time-PCR对初始模板量进行相对定量
以提取的样本RNA为模板，用TAKARA公司One Step SYBR PrimeScript RT-PCR KitⅡ(Perfect Real Time)进行Real Time RT-PCR。
    下表为放入Real Time-PCR仪的样品与仪器输出数据的对应表，其中N为Neutralization缩写，代表中和实验样品，M为Multiplication缩写，代表抗增殖实验样品；72代表72小时收毒，96代表96小时收毒。
         1 2 3 4 5 6 7 8 9
A 72NB 72NB 72NB 72MH 72MH 72MH 96NP 96NP 96NP
B 72NF 72NF 72NF 72MN 72MN 72MN 96NV 96NV 96NV
C 72NH 72NH 72NH 72MP 72MP 72MP 96MB 96MB 96MB
D 72NN 72NN 72NN 72MV 72MV 72MV 96MF 96MF 96MF
E 72NP 72NP 72NP 96NB 96NB 96NB 96MH 96MH 96MH
F 72NV 72NV 72NV 96NF 96NF 96NF 96MN 96MN 96MN
G 72MB 72MB 72MB 96NH 96NH 96NH 96MP 96MP 96MP
H 72MF 72MF 72MF 96NN 96NN 96NN 96MV 96MV 96MV
（ Real Time RT-PCR样品编号表）
2）System: H2O:              5.7ul
          Buffer:            12.5ul
          Enzyme Mix:       1ul
          Primer            0.4/each
          Templete RNA:     5ul
          Total :             25ul
3）Protocol:
1: 95.0°C for 3:00
2: 95.0°C for 0:15
3: 55.0°C for 0:15
4: 72.0°C for 0:30
Plate Read
5: GOTO 2, 39 more times
6: 95.0°C for 0:30
7: 60.0°C for 0:30
8: Melt Curve 65°C to 95°C : Increment 0.5°C for 0:05
Plate Read
4）实验结果见图14-25。
5）数值计算：
样品的Ct值由仪器自动输出，详细信息见附件1PDF文档。各样品Ct值见下表：
  1 2 3 4 5 6 7 8 9
A 19.33 19.64 19.65 24.44 24.23 24.37 22.02 14.96 21.22
B 20.69 20.69 20.39 24.24 24.14 24.16 18.75 17.44 17.54
C 19.99 19.98 20.20 24.05 23.76 23.56 20.60 14.77 20.43
D 19.89 19.91 20.02 22.02 21.74 22.01 14.72 20.59 14.72
E 20.16 20.14 20.32 20.21 20.06 20.02 19．90 14.76 20.29
F 18.42 18.82 18.96 21.19 20.84 20.10 14.63 20.83 14.54
G 22.41 22.23 22.25 19.42 19.52 19.47 18.14 18.64 19.56
H 22.46 22.35 22.21 19.15 19.30 19.51 14.06 21.33 14.48
样品的平均Ct值为：
样品编号\ 72N 72M 96N 96M
B 19.54 22.30 20.10 20.52
F 20.59 22.34 20.71 14.72
H 20.06 24.35 19.47 20.10
样品的△Ct值计算：
△    Ct值=中药处理组样品平均Ct值—病毒阳性对照组样品平均Ct值
样品△Ct值 72N 72M 96N 96M
B 0.81 0.38 2.19 6.25
F 1.86 0.42 2.8 0.45
H 1.33 2.43 1.56 5.83
（Real Time RT-PCR样品△Ct值表）
药物处理组较之病毒阳性对照组在MDCK细胞中流感病毒的增殖比例：
样品组/对照组=2-△ct
2-△ct值 72N 72M 96N 96M
B 0.570 0.768 0.219 0.013
F 0.275 0.747 0.144 0.732
H 0.398 0.186 0.339 0.018
（药物处理组较之病毒阳性对照组在MDCK细胞中流感病毒增殖比例表）
则药物对流感病毒扩增抑制率=（1—2-△ct）*100%
扩增抑制率 72N 72M 96N 96M
B 43% 23.2% 78.1% 98.7%
F 72.5% 25.3% 85.6% 26.8%
H 60.2% 81.4% 66.1% 98.2%
         
         
（药物对流感病毒扩增抑制率表）
四、实验结果报告：
通过细胞病变、血凝效价、Real Time RT-PCR等一系列实验，对8个中药样品对甲型H1N1流感病毒的体外中和作用和增殖抑制作用进行检测，结果显示，在中和实验中，病毒阳性对照在种毒后第48小时出现轻微病变，而加药孔均无，明显病变；在种毒后72小时，病毒阳性对照18孔有14孔完全病变，在乙酸乙酯部分、石油醚部分有中和病毒作用，在种毒后96小时，病毒阳性对照孔完全病变，组方药乙酸乙酯部分、石油醚部分有中和病毒作用。在增殖抑制实验中，病毒阳性对照在种毒后第48小时完全出现病变，而加药孔部分出现病变，组方药乙酸乙酯部分、臭灵丹乙酸乙酯、石油醚部分有抑制病毒增殖作用；在种毒后72小时，组方药臭灵丹乙酸乙酯、石油醚部分有抑制病毒增殖作用，在种毒后96小时，所有药品均无抑制病毒增殖作用。初步筛选出组方药乙酸乙酯部分、臭灵丹乙酸乙酯、石油醚部分这3部分中药样品对流感病毒有明显的体外中和作用和增殖抑制作用，其最佳作用浓度为100ug/ml。
进一步药物对甲型流感病毒的中和作用和增殖抑制作用进行探索，通过血凝效价实验显示，在实验中，中和组和增殖抑制组72小时和96小时病毒阳性对照样本的血凝效价分别为1:32、1:16、1:1024和1:2048；而药品处理组各数据均低于同组的病毒对照样本血凝效价。
将各组实验样品提RNA后，以甲型流感病毒特异性引物进行Real Time RT-PCR，以对各样本的初始模板量进行比较，结果证明，加入药物的细胞比阳性对照细胞病毒扩增量均有明显下降。在中和实验中，72小时乙酸乙酯部分中和作用最显著，病毒扩增率较阳性对照减少72.5%；96小时时药品臭灵丹乙酸乙酯部分中和作用最显著，病毒扩增率减少81.4%； 96小时时组方药乙酸乙酯部分抗增殖作用最显著，病毒扩增率减少98.7%。
同时实验结果表明：臭灵丹及其组方药物水提取得率高、但抗甲型流感病毒活性部位主要是在脂溶性部位。臭灵丹及其组方药物抗甲型流感病毒药物活性成分或部位宜用不同浓度乙醇、甲醇或其它脂溶性溶剂提取或萃取获得，可采用热回流提取、渗滤、冷浸、超声或超临界提取方法。
 
臭灵丹及其组合药物抗病毒作用---细胞水平活性评价：
一、            材料
1、  药材及其样品制备
臭灵丹组合物（药材I，粉末状）、臭灵丹（药材Ⅱ）。
阳性对照药物利巴韦林购自广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，批号：L071051。
醇提组分均由本实验室制备。制备方法如下：取臭灵丹组合物、臭灵丹各50克、100克，分别用10倍量95%乙醇回流提取3次，每次1小时。回收溶剂后冻干成粉状，分别得到干品提取物13.00克（得率26.00%）、15.07克（得率15.07%）。
2、  细胞  
狗肾上皮细胞（MDCK）引自美国经典培养物收藏中心（ATCC）。
3、  病毒株 
普通甲型H1N1流感病毒PR8株（A/PR/8/34，H1N1）购自美国经典培养物收藏中心（ATCC）。病毒均以9～11日龄鸡胚扩增，收获尿囊液，）测定其相应血凝效价。以Reed-Muench法测定其半数感染量（TCID50）作为病毒滴度，用于细胞病变抑制法。
二、            实验方法
1 药材醇提流程：
称取药材Ⅱ100g，用10倍量95%乙醇加热回流提取3次，每次1小时，合并乙醇提取液，过滤，浓缩至无乙醇馏出后冻干成粉末。Ⅰ号药材为粉末药物，不需提取。
2 药材醇提组分抑制甲型H1N1流感病毒PR8株（A/PR/8/34，H1N1）作用
2.1 药物溶解 药材醇提物用培养液溶解后，配制贮存液浓度为8mg/mL，0.22μm滤膜过滤，药物置4℃保存；阳性药物利巴韦林用培养液溶解，过滤后置4℃保存。
2.2 药物毒性试验(MTT法)[1]  按每孔约2.5×104细胞接种到96孔板，24~48h后待细胞长成单层后，弃去培养液，加入不同稀释度的药物100μL/孔，正常细胞对照孔加入100μL/孔MEM，37℃5％CO2继续培养2天，每孔加MTT溶液（5mg/mL）20μL，置37℃，5％CO2温箱中继续孵育4小时。吸弃培养上清液，每孔加100μL二甲基亚砜( DMSO)，低速振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。按照下列公式计算抑制率，并用Reed-Muench法[2]计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(TC50)。计算抑制率＝[（正常－空白）－（给药－空白）]/（正常－空白）×100％
2.3 药物体外抗流感病毒活性试验[3-4]  以细胞病变抑制法(Cytopathic Effect Reduction Method)在治疗作用试验策略下研究药材醇提物对普通甲型H1N1流感病毒PR8株的抑制作用。
长满单层的96孔细胞培养板内的MDCK细胞吸附病毒2小时，同时设定阳性药物和细胞对照，然后加入含不同浓度药物的培养液，置34℃、5%CO2环境下培养2天。
细胞出现病变程度按以下6级标准记录：- 为细胞生长正常，无病变出现；±为细胞病变少于整个单层细胞的10%；+为细胞病变约占整个单层细胞的25%；+ +为细胞病变约占整个单层细胞的50%；+ + +为细胞病变约占整个单层细胞的75%：+ + + +为细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。用Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC50)，并以选择指数SI表示（SI=TC50/IC50）, SI>2表示低毒高 效；SI：1～2表示高毒低效；SI<1表示无效。
三、            实验结果
1 药材溶解情况
药材Ⅰ和药材Ⅱ提取物和均可以水溶解，经0.22μm滤膜过滤后，药物溶液均呈深褐色澄清，4℃保存。
2 药材对细胞的毒性作用
药材Ⅰ和药材Ⅱ提取物在MDCK细胞的半数有毒浓度（TC50）分别为3.07、和4.63mg/mL。
3药材对普通甲型H1N1流感病毒PR8株的抑制作用
治疗模式中，药材Ⅰ、Ⅱ提取物和对普通甲型H1N1流感病毒PR8株均有抑制作用（IC50分别为0.73和1.42mg/mL）；预防模式中，药材Ⅱ提取物对普通甲型H1N1流感病毒PR8株有抑制作用（IC50为0.31mg/mL）；在直接模式中，药材Ⅱ对普通甲型H1N1流感病毒PR8株均有抑制作用（IC50为2.64mg/mL）。
表1.   二种药材抗甲型流感病毒（A/PR/8/34,H1N1）作用筛选
Figure 2014100444248100002DEST_PATH_IMAGE002
注：A为预防模式；B为治疗模式；C为直接模式；NT：Not Tested,未测试。
选择指数（SI），SI >2表示低毒高效；SI：1～2表示高毒低效；SI<1表示无效。
四、            结论
药材Ⅰ、和药材Ⅱ提取物均具有抑制普通甲型H1N1流感病毒PR8株的作用，其中药材Ⅱ提取物效果比药材Ⅰ更明显，而药材Ⅰ在预防模式中没有抑制普通甲型H1N1流感病毒PR8株的作用。
利用小鼠流感病毒肺炎模型评价臭灵丹复方药物体内抗病毒药效实验---动物体内活性评价
一、材料与方法
受试药物：臭灵丹组方药物（药材I，粉末状，以下简称臭灵丹复方药物）。阳性对照药物利巴韦林购自广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，批号：L071051。
动物：SPF 级昆明小鼠，6～8 周龄，体重15~16g，购自广东省实验动物中心（许可证号：SCXK（粤）2003-0002，粤监证字2008A023）。
病毒株：甲1 型流感病毒FM1株鼠肺适应株（A /FM/1 /47，H1N1)，用病毒液感染鼠肺反复传代获得。按照Reed Muench 的方法测定LD50（半数致死量）为10-4.5
1.      方法
1.1       臭灵丹复方药物的体内抗病毒肺炎试验
2.2.1 动物分组 
将小鼠随机分成6 组，每组10 只，均为雌性，随机分为正常对照组，病毒对照组，利巴韦林组（75mg/kg·d），臭灵丹复方药物溶于水，分别配制低、中、高剂量组（分别为400、800 和1600mg/kg·d）。
2.2.2 造模方法 
除正常组外，各组小鼠在乙醚轻度麻醉下，以5个LD50 的FM1 病毒尿囊液滴鼻感染小鼠，每只50μL，正常对照同法滴入无菌生理盐水。
2.2.3 给药方法 
小鼠感染后2h，药物组每只灌胃给药0.2mL，正常对照组和病毒对照组给予0.2mL生理盐水，每天1 次，连续给药5d。
2.2.4 肺指数测定 
感染后每天称体重、观察小鼠反应及死亡情况并做记录，共观察7天。7天后，麻醉处死小鼠，解剖观察肺部病变，并称量体重、肺重，测定其肺指数（肺指数=肺脏重量(g) /体质量(g)×100）。
2.3.5 肺组织病理检查 
上述称量肺重量后，将肺组织用4％多聚甲醛固定，常规取材、脱水、石蜡包埋、切片(厚约4～5txm)，用苏木精-伊红( HE) 染色，光镜下观察肺组织的变化。
2.3.6 使用GraphPad Prism5.0统计学软件分析
     使用GraphPad Prism5.0对，对体重变化、肺指数、以及肺组织病毒拷贝数做统计学分析。
二、实验结果
3.1 观察小鼠体重变化 
每日记录各组小鼠的体重变化，观察7天。结果发现，臭灵丹复方药物组低、中、高剂量组体重逐日下降，与病毒组，无显著差异（P>0.05）；而利巴韦林组与病毒组比较，P值为0.0072，有显著差异(P<0.05)，表明该模型成立。见图26
3.2臭灵丹复方药物体内抗病毒药效（肺指数的影响）
用GraphPad Prism5.0对肺指数结果统计分析，臭灵丹复方药物低、中、高剂量组肺指数与病毒对照组相比较，P值分别为0.012、0.039、0.047，具有显著性差异（p<0.05）；病毒组与正常组、利巴韦林组比较，P值<0.0001，具有显著性差异，该模型成立。具体见下表.
臭灵丹药物抗甲1型流感病毒FM1株感染小鼠肺指数结果
组别 体重 肺重 肺指数
臭灵丹药物（1600mg/kg·d） 12.35±1.31 0.2231±0.025 1.832±0.342*
臭灵丹药物（800mg/kg·d） 12.82±1.22 0.2296±0.033 1.817±0.371*
臭灵丹药物（400mg/kg·d） 11.86±0.74 0.2092±0.014 1.768±0.148*
利巴韦林（75 mg/kg·d） 14.78±1.03 0.1645±0.027 1.117±0.198***
病毒组 11.81±0.68 0.2737±0.027 2.321±0.206
正常组 17.22±1.27 0.1039±0.009 0.604±0.049***
注：***表示与病毒组比较，P<0.001；*表示与病毒组比较，P<0.05。
3.3 甲1型流感病毒感染鼠肺的病理检查
各组小鼠肺组织病理学改变结果如图2所示，正常对照组（图27-A）小鼠肺组织肺泡壁相对正常，肺泡腔完整，无炎性细胞浸润；病毒对照组中（图 27-B），肺组织改变表现为肺间质的炎症，镜下，肺泡间隔明显增宽，肺间质内血管扩张、水肿，淋巴细胞浸润及浆细胞浸润，部分有纤维素渗出。利巴韦林阳性对照组（图27-C）显示肺泡壁增厚不明显, 炎性反应较轻, 细支气管腔内无渗出物。臭灵丹复方药物高、中剂量组（图27-D、E）小鼠肺间质的充血水肿症状较为明显，其病变范围、程度均较正常对照组及阳性对照组严重。低剂量组（图27- F）肺组织病理炎症性改变较病毒对照组有一定程度的减轻，肺间质内有少量充血及炎细胞浸润。
三、结论
1、通过记录各组小鼠每日体重变化，结果显示，臭灵丹复方药物高、中、低剂量组均未能有效缓解流感病毒感染小鼠的体重下降。
2、通过计算各组肺指数，结果显示，臭灵丹复方药物高、中、低剂量组可以有效降低流感病毒感染小鼠肺指数，对小鼠病毒性肺炎有一定的抑制作用。
3、鼠肺组织病理结果显示，低剂量组可以缓解肺部病理性炎症。

Claims (5)

1.一种臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感药物中的应用，将臭灵丹提取物及其组合物制备成抗甲型病毒性流感的药物。
2.根据权利要求1所述的臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感中的应用，其特征在于所述的臭灵丹提取物活性成分含以下化合物： 3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4’,5-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮、5,6-二羟基-3,4’,7-三甲氧基黄酮、4’,5-二羟基-3,6,7-三甲氧基黄酮、5-羟基-3,3’,4’,6,7-五甲氧基黄酮、4’,5-二羟基-3,3’,6,7-四甲氧基黄酮、3’,5-二羟基-3,4’,6,7-四甲氧基黄酮。
3.根据权利要求1所述的臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感中的应用，其特征在于所述的臭灵丹提取物组合物为：臭灵丹提取物70～80、贯众10～15、金银花10～15，必要的药用赋形剂组合成药物组合物。
4.根据权利要求1所述的臭灵丹提取物及其组合物在抗甲型病毒性流感中的应用，其特征在于所述药物为：片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、散剂、丸剂、合剂、颗粒剂、冲剂、滴丸剂、膏剂、口服液，或控释、缓释、纳米制剂。
5.如权利要求1所述的臭灵丹提取物的提取方法，其特征在于用臭灵丹药材，加入臭灵丹药材10倍重量乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种，用冷浸或渗滤、回流加热、超声提取回收溶剂后得到初提物；该初提物按以下方法处理：加初提物2～3倍重量的水，放置2～3小时，滤去不溶物叶绿素、树脂状物，水液减压浓缩，加入浓缩物2～3倍量的无水乙醇，放置4～5小时，滤除醇不溶物；醇溶液再次重复去除水不溶物，或直接回收溶剂至干得臭灵丹提取物；或者初提物上大孔树脂柱或活性炭柱，水洗，除去水溶性杂质，再用20%-95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物；或者初提物溶液通过聚酰胺柱或葡聚糖凝胶柱，依次用水、95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干即可得臭灵丹提取物。
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