CN101744794A - 天然金丝桃素抗病毒新药 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种以目前市场所售的普通贯叶连翘提取物为原料，用自创的分子捕获技术提取得到高含量的金丝桃素hypericin，并且活性可测成份30％-100％。这个天然的含量为30％-100％金丝桃素新药有抗病毒效果，这样的金丝桃素对广谱的病毒有杀灭作用，并且去除了金丝桃素光敏副作用。其金丝桃素(hypericin)含量经过HPLC检测达到30％-100％。并且本发明的制备方法操作简便快捷，产品质量均一稳定，大生产容易实现，符合工业化生产。分子结构：
Description
(一)技术领域
本发明所涉及的是一种以目前市场所售的普通贯叶连翘提取物为原料，从中提取得到高含量的金丝桃素hypericin，并且活性可测成份≥30％-100％。
(二)背景技术
贯叶连翘提取物是目前继银杏叶提取物之后的国外厂商所青睐的产品之一。在国外用做抗抑郁药已有百余年历史。而金丝桃素(hypericin)是贯叶连翘提取物中抗病毒的主要活性成份。近年来随着对贯叶连翘在抗病毒、抗癌、抗抑郁机制等方面的研究深入，使其成为当前汇集研究开发热点课题之一。为此，贯叶连翘提取物的活性成份的提取和纯化工艺也普遍受到大家的关注。
目前国内主要有醇提法、碱水提。以乙醇为溶剂提取金丝桃素(hypericin)是比较常规的方法，但提取物中金丝桃素(hypericin)含量受提取条件影响很大，且提取物易吸湿粘结成块，通过加除杂剂、调PH值等解决了产品的吸湿性，但是产品中金丝桃素(hypericin)的含量只有0.7％，金丝桃素基本上被破坏。如果使用大孔树脂或溶剂等手段进行精制分离，虽然能得到含量较高的有效成分提取物，但成本太高，耗时相当长，作为普通的提取物干粉其生产成本难以被市场接受。也有报道，在实验室理，金丝桃素含量提高到28％，但无法工艺化。本发明是通过自创的分子捕获技术有效的富集金丝桃素成份，使金丝桃素含量(hypericin)≥30％-100％。
(三)发明内容
本发明是以市场上销售的天然植物贯叶连翘为提取原料，用自创的分子捕获技术提取到的含量为30％-100％天然金丝桃素。这个天然的含量为30％-100％金丝桃素有抗病毒效果，这样的金丝桃素对广谱的病毒有杀灭作用，并且去除了金丝桃素光敏副作用。
分子结构：
本发明天然金丝桃素的提取方法包括以下步骤：
(1)称取一定量的贯叶连翘提取物，(10～20)倍量的(1％～5％)二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通过滤布(100～400目)过滤，以此避光。
(2)滤液以一定的流速通过吸附柱(cht30)，然后依次以(10～20)倍量水、0.1％～0.5％纯碱溶液冲洗吸附柱(cht30)，直至纯碱洗脱下来的溶液在350nm处的吸收度≤0.3，纯碱溶液冲洗完毕后，又依次再加(10～20)倍量(0.5％～1.5％)柠檬酸溶液、(10～20)倍量水、(15～30)倍量的(70％～80％)乙醇溶液冲洗柱子，弃去洗脱液。
(3)以(15～30)倍量0.5％二乙醇胺乙醇(80％乙醇)溶液洗脱金丝桃素，收集金丝桃素洗脱液。
(4)金丝桃素洗脱液低温(＜45℃)真空浓缩，浓缩至无乙醇味，所得浓缩液趁热过滤(先过滤纸，再过0.45μm膜)，得沉淀A.
(5)滤液用18％盐酸ph值调至(1～2)，析出沉淀，常温静置。待沉淀完全后离心，废弃离心上清，得沉淀B。
(6)用蒸馏水清洗离心沉淀B，直至中性。
(7)清洗好的沉淀B和沉淀A放入真空干燥箱内，40℃真空干燥即得到金丝桃素成品。
采用本发明的工艺制备的贯叶连翘提取物，其金丝桃素含量经过HPLC检测达到30％-100％以上，并且工艺中所使用到的试剂都为国家规定的常规试剂，适合工业化生产。
使用本发明制备的贯叶连翘提取物和使用其他方法提取的质量比较如下表：
| 样品名 | 性状 | 金丝桃素含量 |
| 本发明提取 | 紫黑色小颗粒 | 30％-100％ |
| 其它方法提取 | 棕黑色小颗粒 | ≥4％ |
(四)附图说明
图1：含量90％金丝桃素和30％金丝桃素对甲1亚型流感病毒PR8感染小鼠(♂)死亡的治疗保护作用
图2：含量90％金丝桃素和30％金丝桃素对甲1亚型流感病毒PR8感染小鼠肺指数的影响
图3：采用了比较直观的工艺流程简图来表示本发明工艺过程。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
90％含量金丝桃素和30％含量金丝桃素对小鼠体内感染流感病毒的保护实验
摘要：
取17～19g的ICR小鼠70只，雄性，按体重随机分成7组，即空白对照组、模型对照组、90％金丝桃素低剂量组(1.5mg·kg-1)、90％金丝桃素高剂量组(3.0mg·kg-1)、30％金丝桃素低剂量组(75mg·kg-1)、30％金丝桃素高剂量组(150mg·kg-1)和阳性对照组(达菲10mg·kg-1)。各组小鼠自感染病毒前1天开始每日给予相应药物，观察90％金丝桃素和30％金丝桃素对ICR小鼠体内感染流感病毒的死亡保护作用，并与阳性药-10mg·kg-1达菲进行比较。
试验结果发现，(1)3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素具有较高的死亡保护率、延长生命率；(2)在甲1亚型流感病毒PR8感染第4天，各试药组中，3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素组小鼠出现的死亡时间最晚(第4天)，而1.5mg·kg-1含量90％金丝桃素组的死亡率较高(80％)；(3)感染第5天，150mg·kg-1含量30％金丝桃素组出现较高死亡率(70％)；(4)在感染第8天，各给药组病毒感染小鼠的存活率明显高于模型对照组，其中3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素组和150mg·kg-1含量30％金丝桃素组效果较好；(5)在感染第14天，3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素组小鼠的存活率最高(60％)。
以上试验结果表明，给予90％金丝桃素和30％金丝桃素，能降低病毒感染小鼠的死亡率，对流感病毒致死小鼠有明显的保护作用，其作用效果存在一定的剂量关系。其综合作用效果，90％含量金丝桃素的抗病毒效果明显优于30％含量金丝桃素，两者作用强度弱于10mg·kg-1达菲。
1.试验目的
观察90％金丝桃素和30％金丝桃素对ICR小鼠感染流感病毒的死亡保护作用，并与阳性对照品-10mg·kg-1达菲进行比较，为评价90％金丝桃素到30％金丝桃素的临床前药效学研究提供初步的依据。
2.受试药物
2.1测试样品：
2.1130％含量金丝桃素提取
(1)称取1kg含量为0.3％的贯叶连翘提取物，20倍量的3％二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通过滤布(100～400目)过滤，避光操作。滤液以20-40ml/hr流速通过吸附柱(cht30)，然后依次以20倍量水、0.35％纯碱溶液冲洗吸附柱(cht30)，直至纯碱洗脱下来的溶液在350nm处的吸收度≤0.3，纯碱溶液冲洗完毕后，又依次再加20倍量1.0％柠檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75％乙醇溶液冲洗柱子，弃去洗脱液。然后以20倍量0.5％二乙醇胺乙醇(80％乙醇)溶液洗脱金丝桃素，收集金丝桃素洗脱液。金丝桃素洗脱液低温(＜45℃)真空浓缩，浓缩至无乙醇味，所得浓缩液趁热过滤(先过滤纸，再过0.45μm膜)，得沉淀A。
(2)滤液用18％盐酸pH值调至(1～2)，析出沉淀，常温静置。待沉淀完全后离心，废弃离心上清，得沉淀B。用蒸馏水清洗离心沉淀B，直至中性。
(3)清洗好的沉淀B和沉淀A放入真空干燥箱内，40℃真空干燥即得到金丝桃素成品：
A 0.52g，B 1.01g。
HPLC含量测定：30％成品得率：1.53g
2.1290％含量金丝桃素提取
(1)称取1kg含量为0.3％的贯叶连翘提取物，20倍量的3％二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通过滤布(100～400目)过滤，避光操作。滤液以20-40ml/hr流速通过吸附柱(cht30)，然后依次以20倍量水、0.35％纯碱溶液冲洗吸附柱(cht30)，直至纯碱洗脱下来的溶液在350nm处的吸收度≤0.3，纯碱溶液冲洗完毕后，又依次再加20倍量1.0％柠檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75％乙醇溶液冲洗柱子，弃去洗脱液。然后以20倍量0.5％二乙醇胺乙醇(80％乙醇)溶液洗脱金丝桃素，收集金丝桃素洗脱液。金丝桃素洗脱液低温(＜45℃)真空浓缩。
(2)浓缩后的液体加水，20倍量的3％二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通过滤布(100～400目)过滤，避光操作。滤液以20-40ml/hr流速通过吸附柱(cht30)，然后依次以20倍量水、0.35％纯碱溶液冲洗吸附柱(cht30)，直至纯碱洗脱下来的溶液在350nm处的吸收度≤0.3，纯碱溶液冲洗完毕后，又依次再加20倍量1.0％柠檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75％乙醇溶液冲洗柱子，弃去洗脱液。然后以20倍量0.5％二乙醇胺乙醇(80％乙醇)溶液洗脱金丝桃素，收集金丝桃素洗脱液。金丝桃素洗脱液低温(＜45℃)真空浓缩。
浓缩至无乙醇味，所得浓缩液趁热过滤(先过滤纸，再过0.45μm膜)，得沉淀A.
(3)滤液用18％盐酸pH值调至(1～2)，析出沉淀，常温静置。待沉淀完全后离心，废弃离心上清，得沉淀B。用蒸馏水清洗离心沉淀B，直至中性。
(4)清洗好的沉淀B和沉淀A放入真空干燥箱内，40℃真空干燥即得到金丝桃素成品：A0.13g B 0.22g。
HPLC含量测定：90％成品得率：0.35g
2.1390％含量金丝桃素：紫黑色小颗粒，避光常温干燥保存，先以一定量无水乙醇溶解，再用蒸馏水配制至所需浓度；
30％含量金丝桃素：黄白色絮状物，避光常温干燥保存，用蒸馏水溶解至所需浓度。
2.2阳性对照品：
达菲(磷酸奥司他韦胶囊)：1粒胶囊含75mg奥司他韦；产品批号：B1058，分装批号：SH0009；性状：为灰白色和浅黄色双色胶囊，内容物为白色至黄白色粉末；由瑞士巴赛尔豪夫迈·罗氏有限公司生产，以蒸馏水配制至所需浓度。
2.3阴性对照品：蒸馏水，浙江中医药大学自制。
3.试验动物
ICR小鼠，清洁级，体重17～19g，70只，雄性，由中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司提供，生产许可证：SCXK(沪)2003-0003。
4.实验条件
屏障系统小鼠实验饲养室，温度：22±1℃，湿度：50-70％，光照：150-200Lx，12小时明暗交替，噪音＜50dB，使用许可证：SYXK(浙)2003-0003。
自来水过滤灭菌，置于高压灭菌的饮水瓶中自由饮用，用灭菌小鼠全价营养颗粒饲料饲喂。
饲养方式：自由饮食，小鼠饲养笼中给予充足的饲料和水，每笼饲养5只小鼠，试验前，每只小鼠称重、标记编号。
5.剂量设置
90％含量金丝桃素高剂量组：3.0mg·kg-1(相当于人临床拟用剂量30倍)
90％含量金丝桃素低剂量组：1.5mg·kg-1(相当于人临床拟用剂量15倍)
30％含量金丝桃素高剂量组：150mg·kg-1(相当于人临床拟用剂量30倍)
30％含量金丝桃素低剂量组：75mg·kg-1(相当于人临床拟用剂量15倍)
阳性对照组：达菲10mg·kg-1(相当于人用剂量4倍)
模型对照组：蒸馏水10ml·kg-1
空白对照组：蒸馏水10ml·kg-1
6.给药途径和容量
给药途径：经口灌胃给药
给药容量：10ml·kg-1体重
7.仪器与试剂：
7.1甲1亚型流感病毒PR8鼠肺适应株，由浙江省疾病预防控制中心提供；
7.2乙醚：无色易挥发液体，规格：500ml/瓶，上海马陆制药厂，批号：20040319；
7.3微量进样器(25ul)：上海医用激光仪器厂；
7.4无水乙醇：无色易挥发液体，规格：500ml/瓶，杭州化学试剂有限公司，批号：200510；
8.试验方法
取17～19g的ICR小鼠70只，雄性，按体重随机分为7组，每组10只，即空白对照组、模型对照组、90％金丝桃素低剂量组、90％金丝桃素高剂量组、30％金丝桃素低剂量组、30％金丝桃素高剂量组和阳性对照组(达菲)。各组小鼠自感染病毒前1天开始分别给予相应药物10ml·kg-1，空白对照组、模型对照组给予相应容积的蒸馏水10ml·kg-1。感染病毒当日，给药1小时后，各组小鼠在乙醚的浅麻醉下，分别以流感病毒5LD50滴鼻感染，每鼠20μl，空白对照组滴鼻给予生理盐水。自感染后连续给药两周，，观察ICR小鼠感染流感病毒后发病及死亡情况，死亡小鼠解剖后肉眼观察，以肺病变“+++”以上的程度为判断标准，记录14天内死亡数，计算死亡率％、死亡保护率％、延长生命率％。
9.数据处理
用NDST8.8W软件进行统计分析，计量资料应用X2检验评价试验结果。
10.试验结果
10.190％含量金丝桃素和30％金丝桃素对甲1亚型流感病毒PR8感染小鼠(♂)的影响
由表1可见，75mg·kg-1含量30金丝桃素组小鼠死亡率和死亡保护率与模型对照组相同。其余各给药组与模型对照组比较，给予试验药物后，病毒感染小鼠的死亡率降低，死亡保护率、延长生命率均有提高，说明试药对雄性ICR小鼠有一定的保护作用。其中3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素具有较高的死亡保护率、延长生命率(P＜0.05)，但其作用效果弱于10mg·kg-1达菲(P＜0.01)；1.5mg·kg-1含量90％丝桃素组和150mg·kg-1含量30％金丝桃素组具有相似的作用效果，都弱于10mg·kg-1达菲。
由表2和图1显示，3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素组出现死亡时间最晚(感染第4天)；在流感病毒感染第4天，1.5mg·kg-1含量90％金丝桃素组死亡率较高；感染第5天，150mg·kg-1含量30％金丝桃素组出现较高死亡率；感染第8天，各给药组病毒感染小鼠的存活率明显增高，其中3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素组和150mg·kg-1含量90％金丝桃素组效果较好；在感染后14天3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素组内小鼠的存活率最高，75mg·kg-1含量30％金丝桃素组存活率与模型组相当。
表1 含量90％金丝桃素和30％金丝桃素对甲1亚型流感病毒PR8感染小鼠(♂)的影响
注：与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表2含量90％金丝桃素和30％金丝桃素对甲1亚型流感病毒PR8感染小鼠(♂)存活率的影响
| 病毒感染天数(天) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 |
| 空白对照组(蒸馏水) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 模型对照组(蒸馏水) | 100 | 100 | 100 | 90 | 60 | 60 | 40 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| 含量90％金丝桃素低剂量组(1.5mg·kg-1) | 100 | 100 | 100 | 80 | 70 | 70 | 60 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| 含量90％金丝桃素高剂量组(3.0mg·kg-1) | 100 | 100 | 100 | 100 | 90 | 80 | 70 | 70 | 60 | 60 | 60 | 60 | 60 | 60 |
| 含量30％金丝桃素低剂量组(75mg·kg-1) | 100 | 100 | 100 | 90 | 80 | 60 | 50 | 40 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| 含量30％金丝桃素高剂量组(150mg·kg-1) | 100 | 100 | 100 | 90 | 60 | 60 | 60 | 60 | 60 | 60 | 50 | 50 | 50 | 50 |
| 阳性对照组(达菲10mg·kg-1) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 90 | 90 | 80 | 80 | 80 | 70 | 70 | 70 | 70 |
各剂量组的存活率曲线对比请看说明书附图中图1所示。
11.讨论
流行性感冒病毒是由流感病毒引起的一种常见急性呼吸道传染病，目前对流感病毒治疗的有效药物不多，国内外用于抗甲型流感病毒的药物有金刚烷胺和甲基金刚烷胺、利巴韦林、病毒唑和干扰素等，但这些药物在使用中常常受到许多条件的限制，同时由于流感病毒的变异性以及药物的耐药等因素，使当前流感的防治形势，依然相当严峻。
本试验选用的小鼠流感病毒性肺炎是用流感病毒小鼠适应株所致的出血性肺炎的模型，是最常用的病毒致整体动物感染模型。小鼠感染病毒后引起肺炎，导致肺组织内炎症细胞渗出增多，形成肝样实变。本试验结果发现，小鼠感染流感病毒后第2天起开始出现明显症状，表现为采食量下降，消瘦，活动减少，耸毛，毛松，倦缩，并出现不同程度的呼吸困难。感染发病后4～5天开始发生死亡，一直持续到感染后12～14天。本试验结果显示，与模型对照组比较，经口灌胃给予不同浓度的金丝桃素后，均能不同程度地降低病毒感染小鼠的死亡率，提高流感病毒感染小鼠的死亡保护率和延长生命率。试验结果表明高含量的金丝桃素对流感病毒具有一定的抑制作用，在90％金丝桃素和30％金丝桃素各剂量组中，3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素组出现死亡时间最晚，死亡率最低、死亡保护率和延长生命率均较高，具有较好的抗流感病毒作用；其中1.5mg·kg-1含量90％金丝桃素组和150mg·kg-1含量30％金丝桃素组作用效果相当。在甲型流感病毒PR8感染中期(感染8天)，各给药组病毒感染小鼠的存活率明显增高，其中，3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素组存活率最高，其次是1.5mg·kg-1含量90％金丝桃素组和150mg·kg-1含量30％金丝桃素组。
综上所述，给予含量90％金丝桃素和含量30％金丝桃素，能降低病毒感染小鼠的死亡率，对病毒致死小鼠有明显的保护作用，其效果，含量90％金丝桃素作用较佳，含量30％金丝桃素次之，但均弱于10mg·kg-1达菲。
12.结论
以上试验结果表明，给予含量90％金丝桃素和含量30％金丝桃素，能降低病毒感染小鼠的死亡率，对病毒致死小鼠有明显的保护作用，其综合效果，高含量90％金丝桃素的作用较佳，含量30％金丝桃素次之，但均弱于10mg·kg-1达菲。
实施例2：
金丝桃素和异金丝桃素对流感病毒感染小鼠肺指数的影响
摘要
取17～19g的ICR小鼠70只，雄性，按体重随机分组，即为空白对照组、模型对照组、90％金丝桃素低剂量组、90％金丝桃素高剂量组、30％金丝桃素低剂量组、30％金丝桃素高剂量组和阳性对照组(达菲)。各组小鼠自感染病毒前1天开始每日给予相应药物，观察含量90％金丝桃素30％金丝桃素对ICR小鼠流感病毒感染肺指数的影响，并与阳性药-10mg·kg-1达菲进行比较。
试验结果发现，(1)给予不同浓度的含量90％金丝桃素后能降低流感病毒感染小鼠的肺指数值，升高肺指数抑制率，3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素的作用效果相当于10mg·kg-1达菲。(2)给予不同浓度的含量30％金丝桃素后亦能降低流感病毒感染小鼠的肺指数值，升高肺指数抑制率，但其作用效果弱于10mg·kg-1达菲。(3)含量30％金丝桃素有一定的抑制小鼠流感病毒的作用，但对病情严重的小鼠保护作用弱。
以上试验结果表明，3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素和150mg·kg-1含量30％金丝桃素对小鼠的死亡保护作用较佳。
1.试验目的
观察含量90％金丝桃素和30％金丝桃素对ICR小鼠流感病毒感染肺指数的影响，并与阳性对照品-10mg·kg-1达菲进行比较，为评价含量90％金丝桃素到30％金丝桃素的研究开发提供初步的依据。
2.受试药物
2.1测试样品：
2.1130％含量金丝桃素提取
(1)称取1kg含量为0.3％的贯叶连翘提取物，20倍量的3％二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通过滤布(100～400目)过滤，避光操作。滤液以20-40m1/hr流速通过吸附柱(cht30)，然后依次以20倍量水、0.35％纯碱溶液冲洗吸附柱(cht30)，直至纯碱洗脱下来的溶液在350nm处的吸收度≤0.3，纯碱溶液冲洗完毕后，又依次再加20倍量1.0％柠檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75％乙醇溶液冲洗柱子，弃去洗脱液。然后以20倍量0.5％二乙醇胺乙醇(80％乙醇)溶液洗脱金丝桃素，收集金丝桃素洗脱液。金丝桃素洗脱液低温(＜45℃)真空浓缩，浓缩至无乙醇味，所得浓缩液趁热过滤(先过滤纸，再过0.45μm膜)，得沉淀A。
(2)滤液用18％盐酸pH值调至(1～2)，析出沉淀，常温静置。待沉淀完全后离心，废弃离心上清，得沉淀B。用蒸馏水清洗离心沉淀B，直至中性。
(3)清洗好的沉淀B和沉淀A放入真空干燥箱内，40℃真空干燥即得到金丝桃素成品：
A 0.52g，B 1.03g。
HPLC含量测定：30％成品得率：1.55g
2.1290％含量金丝桃素提取
(1)称取1kg含量为0.3％的贯叶连翘提取物，20倍量的3％二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通过滤布(100～400目)过滤，避光操作。滤液以20-40ml/hr流速通过吸附柱(cht30)，然后依次以20倍量水、0.35％纯碱溶液冲洗吸附柱(cht30)，直至纯碱洗脱下来的溶液在350nm处的吸收度≤0.3，纯碱溶液冲洗完毕后，又依次再加20倍量1.0％柠檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75％乙醇溶液冲洗柱子，弃去洗脱液。然后以20倍量0.5％二乙醇胺乙醇(80％乙醇)溶液洗脱金丝桃素，收集金丝桃素洗脱液。金丝桃素洗脱液低温(＜45℃)真空浓缩。
(2)浓缩后的液体加水，20倍量的3％二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通过滤布(100～400目)过滤，避光操作。滤液以20-40ml/hr流速通过吸附柱(cht30)，然后依次以20倍量水、0.35％纯碱溶液冲洗吸附柱(cht30)，直至纯碱洗脱下来的溶液在350nm处的吸收度≤0.3，纯碱溶液冲洗完毕后，又依次再加20倍量1.0％柠檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75％乙醇溶液冲洗柱子，弃去洗脱液。然后以20倍量0.5％二乙醇胺乙醇(80％乙醇)溶液洗脱金丝桃素，收集金丝桃素洗脱液。金丝桃素洗脱液低温(＜45℃)真空浓缩。
浓缩至无乙醇味，所得浓缩液趁热过滤(先过滤纸，再过0.45μm膜)，得沉淀A.
(3)滤液用18％盐酸pH值调至(1～2)，析出沉淀，常温静置。待沉淀完全后离心，废弃离心上清，得沉淀B。用蒸馏水清洗离心沉淀B，直至中性。
(4)清洗好的沉淀B和沉淀A放入真空干燥箱内，40℃真空干燥即得到金丝桃素成品：
A 0.11g B 0.23g。
HPLC含量测定：90％成品得率：0.34g
2.13含量90％金丝桃素：紫黑色小颗粒，避光常温干燥保存，先以一定无水乙醇溶解，再用蒸馏水配制至所需浓度；
含量30％金丝桃素：黄白色絮状物，避光常温干燥保存，用蒸馏水溶解至所需浓度。
2.2阳性对照品：
达菲(磷酸奥司他韦胶囊)：1粒胶囊含75mg奥司他韦；产品批号：B1058，分装批号：SH0009；性状：为灰白色和浅黄色双色胶囊，内容物为白色至黄白色粉末；由瑞士巴赛尔豪夫迈·罗氏有限公司生产，以蒸馏水配制至所需浓度。
2.3阴性对照品：蒸馏水，浙江中医药大学自制。
3.试验动物
ICR小鼠，清洁级，体重17～19g，70只，雄性。由中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司提供，生产许可证：SCXK(沪)2003-0003。
4.实验条件
屏障系统小鼠实验饲养室，温度：22±1℃，湿度：50-70％，光照：150-200Lx，12小时明暗交替，噪音＜50dB，使用许可证：SYXK(浙)2003-0003。
自来水过滤灭菌，置于高压灭菌的饮水瓶中自由饮用，用灭菌小鼠全价营养颗粒饲料饲喂。
饲养方式：自由饮食，小鼠饲养笼中给予充足的饲料和水，每笼饲养5只小鼠，试验前，每只小鼠称重、标记编号。
5.剂量设置
含量90％金丝桃素高剂量组：3.0mg·kg-1(相当于人临床拟用剂量30倍)
含量90％金丝桃素低剂量组：1.5mg·kg-1(相当于人临床拟用剂量15倍)
含量30％金丝桃素高剂量组：150mg·kg-1(相当于人临床拟用剂量30倍)
含量30％金丝桃素低剂量组：75mg·kg-1(相当于人临床拟用剂量15倍)
阳性对照组：达菲10mg·kg-1(相当于人用剂量4倍)
模型对照组：蒸馏水10ml·kg-1
空白对照组：蒸馏水10ml·kg-1
6.给药途径和容量
给药途径：经口灌胃给药
给药容量：10ml·kg-1体重
7.仪器与试剂：
7.1甲1亚型流感病毒PR8鼠肺适应株由浙江省疾病预防控制中心提供
7.2乙醚：无色易挥发液体，规格：500ml/瓶，上海马陆制药厂，批号：20040319
7.3微量进样器(25ul)：上海医用激光仪器厂
7.4无水乙醇：无色易挥发液体，规格：500ml/瓶，杭州化学试剂有限公司，批号：200510；
7.5分析天平：JA2103N精密天平，上海民桥精密科学仪器有限公司
8.试验方法
取17～19g的ICR小鼠70只，雄性，按体重随机分为7组，每组10只，即空白对照组、模型对照组、90％金丝桃素低剂量组、90％金丝桃素高剂量组、30％金丝桃素低剂量组、30％金丝桃素高剂量组和阳性对照组(达菲)。各组小鼠自感染病毒前1天开始分别给予相应药物。感染病毒当日，给药后1小时，各组小鼠在乙醚的浅麻醉下，分别以流感病毒5LD50滴鼻感染，每鼠20ul，空白对照组滴鼻给予生理盐水。感染后第4天称重并处死，摘取肺脏称重，逐个计算肺指数值和肺指数抑制率。
9.数据处理
用NDST8.8W软件进行统计分析，计量资料应用X2检验评价试验结果。
10.试验结果
由表1和图1可见，与空白对照组比较，模型对照组小鼠肺指数值差异显著(P＜0.01)。与模型对照组比较，各试药组的肺指数值均小于模型对照组，肺指数抑制率均大于模型对照组。其中3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素组、150mg·kg-1含量30％金丝桃素组小鼠的肺指数值均小于模型对照组(P＜0.05)；各试验药物组比较，3.0mg·kg-1含量90％金丝桃素组效果最佳，其作用效果相当于10mg·kg-1达菲；150mg·kg-1含量30％金丝桃素组对小鼠有一定的保护作用，但对病情严重的小鼠保护作用弱，感染后第4天已有小鼠死亡，且作用效果弱于10mg·kg-1达菲。
表1含量90％金丝桃素和30％金丝桃素对甲1亚型流感病毒PR8感染小鼠肺指数的影响
注：与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与空白对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
各剂量对照组肺指数的矩形图请看说明书附图中的图2所示。
11.讨论
小鼠流感病毒性肺炎是用流感病毒小鼠适应株所致的出血性肺炎的模型，是最常用的病毒致整体动物感染模型。小鼠感染病毒后引起肺炎，导致肺组织内炎症细胞渗出增多，形成肝样实变，使全部肺质量增加，肺质量增加和肺炎的严重程度相关。
本实验采用流感病毒体内实验方法，模型对照组小鼠感染流感病毒后第2天起开始出现明显症状，表现为采食量下降，消瘦，活动减少，耸毛，毛松，倦缩，并出现不同程度的呼吸困难。感染发病后4～5天开始发生死亡，一直持续到感染后12～14天。与模型对照组相比，实验小鼠给予不同浓度的金丝桃素后能降低感染流感病毒小鼠的肺指数值，升高肺指数抑制率，说明含量90％金丝桃素和30％金丝桃素有较好地抑制小鼠流感病毒的作用，能抑制病毒所致肺炎发生、发展，使其炎症减轻。两种含量中，90％金丝桃素对小鼠的死亡保护作用较佳；30％金丝桃素有一定的抑制小鼠流感病毒的作用，但对病情严重的小鼠保护作用弱，实验第四天高低剂量30％金丝桃素组均出现小鼠死亡情况。
12.结论
以上试验结果表明，含量90％金丝桃素和30％金丝桃素均有较好的体内抗病毒作用，其中，含量90％金丝桃素对小鼠的死亡保护作用较佳，其效果相当于10mg·kg-1达菲；含量30％金丝桃素对病情严重的小鼠保护作用较弱，对中等病情的小鼠能较好地抑制其病毒所致肺炎发生，作用效果略弱于10mg·kg-1达菲。
Claims (7)
1.含量为30％-100％天然金丝桃素有抗病毒的效果。从天然植物贯叶连翘中用自创的分子捕获技术提取的含量为30％-100％的金丝桃素，这样的金丝桃素对广谱的病毒有杀灭作用，并且去除了金丝桃素光敏副作用。
2.根据权利要求1所述其特征是：从天然植物贯叶连翘中提取的含量30％-100％的金丝桃素。
3.根据权利要求1所述其特征是：30％-100％的金丝桃素对广谱的病毒有杀灭作用。
4.根据权利要求1所述其特征是：30％-100％的金丝桃素已经去除了光敏副作用。
5.根据权利要求1所述其特征是：所指病毒是感冒病毒、艾滋病毒、肝炎病毒、非典病毒、禽流感病毒、人类乳头瘤病毒、疱疹病毒。
6.根据权利要求1所述其分子结构是：
7.根据权利要求1所述其异构体分子结构是：
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