CN113209203A - 一种抗病毒复方精油及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种抗病毒复方精油及其应用。该抗病毒复方精油，按重量份数计，包括如下原料：月桂精油10~20份、丁香精油10~20份、肉桂精油10~20份、石菖蒲精油5~10份、川芎精油5~10份、白芷精油5~10份、薄荷精油5~10份、佩兰精油5~10份、紫苏精油5~10份、香樟精油5~10份。本发明以月桂精油、丁香精油、肉桂精油、石菖蒲精油、川芎精油、白芷精油、薄荷精油、佩兰精油、紫苏精油、香樟精油混合制成复方精油，各精油组分的有效成分不一，各组分协同作用，可有效人冠状病毒治疗病毒引起的各种疾病，且毒副作用小，复发率低，患者耐受性好。

Description

一种抗病毒复方精油及其应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，特别涉及一种抗病毒复方精油及其应用。
背景技术
流行性感冒是一种由流感病毒引发的急性呼吸道传染病，春、秋季节高发。由于流感病毒基因容易发生变异，病毒基因重组过程复杂且无法预测，易突变成新的流感病毒变异株。此外，禽流感病毒（AIV）频繁地从禽类跨物种直接感染人类，甚至曾经引发全球范围内的大流行，为人类健康和公共卫生安全埋下了巨大隐患。人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的。甲型流感病毒经常发生抗原变异，可以进一步分为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亚型。H1N1是一种RNA病毒，属于正黏液病毒科。它的宿主是鸟类和一些哺乳动物。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。例如1918~1919年的大流行中，全世界至少有2000万~4000万人死于流感。
人冠状病毒229E属α群正链RNA病毒冠状病毒，主要引起人类呼吸道感染。人冠状病毒感染呈全球性分布，人群普遍易感，多项血清学研究结果表明，几乎100%的儿童在幼年早期均感染过HcoV-229E和NL63。HCoV-229E主要感染呼吸道和肠黏膜表面。感染呼吸道主要引起轻度呼吸道感染症状，典型表现为流涕、咽喉肿痛、咳嗽、头痛、发热等普通感冒症状，少部分病例因上呼吸道感染住院。研究表明，引起呼吸道感染的病例中，出现呼吸困难症状66.6%是由HcoV-229E引起的。
目前，治疗由上述人冠状病毒引起的疾病的药物多为合成药物，例如阿昔洛韦、红霉素等，虽然这类药物的效果可观，但是其生物利用度低，药物代谢周期长，药物毒性大，可能还是复发，最重要的是容易产生耐药性。中医药从辨证论治和整体观念两个角度出发，可有效治疗病毒引起的各种疾病，且毒副作用小、复发率低，患者耐受性好。中药精油是中药重要的有效组分，从中药提取出的精油受到越来越多的关注，但是，目前现有的复方精油制剂对由人冠状病毒引起的疾病的治疗效果还不是很明显。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗病毒复方精油及其应用，以解决上述技术问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供的一种抗病毒复方精油，按重量份数计，包括如下原料：月桂精油10~20份、丁香精油10~20份、肉桂精油10~20份、石菖蒲精油5~10份、川芎精油5~10份、白芷精油5~10份、薄荷精油5~10份、佩兰精油5~10份、紫苏精油5~10份、香樟精油5~10份。
优选的，抗病毒复方精油，按重量份数计，包括如下原料：月桂精油15~18份、丁香精油15~18份、肉桂精油12~14份、石菖蒲精油6~8份、川芎精油6~8份、白芷精油6~8份、薄荷精油7~9份、佩兰精油6~8份、紫苏精油7~9份、香樟精油6~8份。
优选的，所述抗病毒复方精油为月桂精油、丁香精油、肉桂精油、石菖蒲精油、川芎精油、白芷精油、薄荷精油、佩兰精油、紫苏精油、香樟精油混合均匀而得到。
优选的，所述月桂精油、丁香精油、肉桂精油、石菖蒲精油、川芎精油、白芷精油、薄荷精油、佩兰精油、紫苏精油、香樟精油是分别选用月桂叶片、丁香花蕾、肉桂树皮、石菖蒲根茎、川芎根茎、白芷根、薄荷叶片、佩兰全草、紫苏叶片、香樟树皮原料依次洗净、超声辅助水蒸气蒸馏法提取而得到的。
进一步优选的，所述月桂精油、丁香精油、薄荷精油、佩兰精油和紫苏精油分别采用下述方法制得：将原料洗净后干燥至水分不高于20%，粉碎至100~500目得到粉末，将得到的粉末加入3~6倍重量的水中，在功率300~500W、温度60~80℃下超声处理20~60min，再控温90~100℃水蒸气蒸馏3~6h，收集蒸馏液，待蒸馏液冷却至20~35℃后，将蒸馏液进行超临界二氧化碳萃取，萃取压力为15~18MPa，萃取时间为70~80min，萃取温度为45~55℃，二氧化碳的流速为20~40L/h。
进一步优选的，所述肉桂精油和香樟精油分别为采用下述方法制得：将原料洗净后干燥至水分不高于15%，粉碎至50~200目得到粉末，将得到的粉末加入5~10倍重量的水中，然后在功率300~500W、温度70~90℃下超声处理1~2h，再控温100~110℃水蒸气蒸馏4~8h，收集蒸馏液，待蒸馏液冷却至20~35℃后，将蒸馏液进行超临界二氧化碳萃取，萃取压力为55~58MPa，萃取时间为60~70min，萃取温度为30~35℃，二氧化碳的流速为20~40L/h。
进一步优选的，所述石菖蒲精油、川芎精油和白芷精油分别采用下述方法制得：将原料洗净后干燥至水分不高于20%，粉碎至50~200目得到粉末，将得到的粉末加入5~10倍重量的水中，然后在功率300~500W、温度60~80℃下超声处理30~60min，再控温95~105℃水蒸气蒸馏2~4h，收集蒸馏液，待蒸馏液冷却至20~35℃后，将蒸馏液进行超临界二氧化碳萃取，萃取压力为35~38MPa，萃取时间为60~120min、萃取温度为35~55℃，二氧化碳的流速为20~40L/h。
第二方面，本发明提供的一种如第一方面所述的抗病毒复方精油在制备抗病毒药物中的应用。
优选的，所述抗病毒药物是由药学可接受的载体与所述抗病毒复方精油制备而成的剂型。
进一步优选的，所述药学上可接受的载体选自赋形剂、黏合剂、填充剂、润滑剂、抗氧剂、防腐剂和增稠剂中的一种或多种。
进一步优选的，所述剂型选自喷雾剂、气雾剂、滴鼻剂、凝胶剂、膏剂、贴剂、搽剂、酊剂、洗剂、涂膜剂和贴膏剂中的任意一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明以月桂精油、丁香精油、肉桂精油、石菖蒲精油、川芎精油、白芷精油、薄荷精油、佩兰精油、紫苏精油、香樟精油混合制成复方精油，各精油组分的有效成分不一，各组分协同作用，可有效人冠状病毒治疗病毒引起的各种疾病，且毒副作用小、复发率低，患者耐受性好。
月桂：木犀科植物，其精油成分主要含有α-乙酸松油酯、肉桂醛、1,8-桉叶素、β-桉叶油醇、β-石竹烯、丁香酚甲醚等化合物，具有抗炎、抗氧化、降低血糖、抗菌等药理活性，可治疗头痛、偏头痛、胃溃疡、感染性疾病等；
丁香：木犀科植物，其精油主要含有丁香酚，可有效对抗烟草花叶病毒和新型冠状病毒；
肉桂：樟科植物，其精油主要含有反式-肉桂醛、γ-松油烯、γ-松油烯、石竹烯、β-红没药烯、视黄醇乙酸酯等化合物，对流感病毒有着不错的抑制作用；
石菖蒲：天南星科，其精油主要含有β-细辛醚、γ-细辛醚,α-细辛醚、甲基丁香酚、顺式-甲基异丁香酚、反式甲基异丁香酚等有效成分，有着提神醒脑的功效，也有着抗炎、抗病毒作用。
川芎：伞形科植物，精油种藁本内酯含量相当高，其他成分还有如3-丁基苯酞、香松烯、α-宁烯、α-蒎烯、莰烯、月桂烯、α-水芹烯、δ-3-蒈烯、α-萜品烯、β-罗勒烯、γ-萜品烯、α-萜品油烯、对-聚伞花素、η-辛醇、芳樟醇和月桂烯醇等，有镇痛，抗肿瘤，抗炎，抗氧化，抗抑郁等作用；
白芷：伞形科植物，其精油主要含有十五烷醇、十二烷醇、油醇3种挥发性成分，主要是醇类化合物，有抗炎、抗菌、美白、抗肿瘤、抗病毒作用；
薄荷：唇形科植物，其精油主要含有薄荷脑、薄荷醇、胡薄荷酮、木犀草素-7-葡萄糖苷、迷迭香酸等有效物质，可有效抑制HSV-2、呼吸道合胞病；
佩兰：菊科植物，精油的主要含有单萜、倍半萜及芳香类、脂肪类化合物。含量较高的石竹烯就是倍半萜成分。佩兰精油能有效抑制流行性感冒病毒，此外尚能抑制轮状病毒；
紫苏：唇形科植物，主要用到的是紫苏叶，主要根据不同的化学型各自含有着紫苏醛、柠檬烯、紫苏酮、香薷酮、反式柠檬醛等化合物，主要发挥其抑菌作用，提高免疫系统的能力，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎作用；
香樟：樟科植物，其精油含量众多，包括α-蒎烯、β-石竹烯等，还含有众多倍半萜，有抗菌、抗肿瘤、免疫抑制、昆虫拒食剂等活性。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
月桂精油、丁香精油、薄荷精油、佩兰精油和紫苏精油是分别选用月桂叶片、丁香花蕾、薄荷叶片、佩兰全草、紫苏叶片为原料，分别采用下述方法制得：将原料洗净后干燥至水分为12~15%，粉碎至400目得到粉末，将得到的粉末加入5倍重量的水中，在功率400W、温度75℃下超声处理45min，再控温95℃水蒸气蒸馏5h，收集蒸馏液，待蒸馏液冷却至30℃后，将蒸馏液进行超临界二氧化碳萃取，萃取压力为15MPa，萃取时间为75min，萃取温度为50℃，二氧化碳的流速为28L/h。
肉桂精油和香樟精油是分别选用肉桂树皮和香樟树皮为原料，分别为采用下述方法制得：将原料洗净后干燥至水分至10~15%，粉碎至100目得到粉末，将得到的粉末加入8倍重量的水中，然后在功率500W、温度85℃下超声处理1.5h，再控温105℃水蒸气蒸馏6h，收集蒸馏液，待蒸馏液冷却至30℃后，将蒸馏液进行超临界二氧化碳萃取，萃取压力为55MPa，萃取时间为65min，萃取温度为35℃，二氧化碳的流速为35L/h。
石菖蒲精油、川芎精油和白芷精油是分别选用石菖蒲根茎、川芎根茎、白芷根为原料，采用下述方法制得：将原料洗净后干燥至水分至12~15%，粉碎至150目得到粉末，将得到的粉末加入8倍重量的水中，然后在功率450W、温度70℃下超声处理45min，再控温100℃水蒸气蒸馏3.5h，收集蒸馏液，待蒸馏液冷却至30℃后，将蒸馏液进行超临界二氧化碳萃取，萃取压力为35MPa，萃取时间为90min、萃取温度为45℃，二氧化碳的流速为25L/h。
称取下述按重量份数计的原料：月桂精油18份、丁香精油18份、肉桂精油14份、石菖蒲精油7份、川芎精油7份、白芷精油7份、薄荷精油9份、佩兰精油7份、紫苏精油9份、香樟精油7份，将各精油混合均匀得到抗病毒复方精油。
（一）混合精油治疗流感病毒H1N1/FM1株感染小鼠的作用研究
1.实验材料
1.1 动物及分组
选用SPF级ICR小鼠50只，雌雄各半，9-12周龄，体重13-15g，购于江西中医药大学实验动物科技中心[合格证号：SCXK（赣）2018-0003]。清洁级动物房饲养，统一光照时间为06:00～18:00，恒温，恒湿，自由饮水，饲固体饲料。适应性喂养3 d后用于实验。按随机数字表法分为以下5组，每组10只：
正常对照组
模型对照组
复方精油大、中、小三个剂量组
1.2 实验药物
复方精油由实施例1的方法制得。
1.3 主要试剂
Trizol Reagent购于Ambion by life technology（批号：257403）、InfluenzaVirus A Real Time RT-PCR Kit购于上海之江生物科技股份有限公司（批号：NOP20200101）、乙醚购于上海市鸿盛精细化工有限公司（批号：20181009）、小鼠α干扰素（IFN-α）酶联免疫分析购于上海酶联生物科技有限公司（批号：NO03/2019）、小鼠MDA酶联免疫分析购于上海酶联生物科技有限公司（批号：NO07/2020）、小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析购于美国bio-techne（批号：NO546999）。
1.4主要仪器
A2型生物安全柜（型号：Thermo MSC1.8），A2型生物安全柜（型号：Thermo MSC1.2）均购于美国Thermo公司，A2型生物安全柜（型号：Nuaire NU-425-400E）购于美国Nuaire，电子天平（型号：YP1002 MAX100g）购于上海越平科学仪器有限公司，电子分析天平（型号：Ltem-AR 1140 MAX110g）购于Ohaus Corp. Brock. WJ. USA，电子天平（型号：AL204）购于梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，Real-Time PCR Instrument（型号：QuantStudio 5）购于Applied biosystems，八连排管迷你离心机（型号：LX-300）购于Kylin-Bell LabInstruments，迷你涡旋振荡器（型号：QL-901）购于海门市其林贝尔仪器制造有限公司，低温高速离心机（型号Eppendorf-5810R）购于eppendorf，电子分析天平（型号：AR1140）购于Ohaus Corp.Brock.NJ.USA，多功能酶标仪（型号Enspire）购于PerkinElmer，超声细胞破碎仪（型号：SONIC RUPTOR 400）购于MONI homogenizer company，震荡裂解仪（型号：FastprepTM-24）购于MP Biomedicals，IVC小鼠饲养笼（型号：ZJ-4）购于苏州市冯氏实验动物设备有限公司。
2.实验方法
2.1 模型的建立
除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以15个LD50流感病毒液（H1N1/FM1株）滴鼻感染，每只35μl。感染当天开始给药，大、中、小剂量组每只每次滴鼻给药，给药剂量参见表1~3，每天1次，连续4天，正常对照组和模型对照组在同等条件下蒸馏水滴鼻。第5天称重后解剖。取肺称肺重，计算肺指数及肺指数抑制率。结果采用组间比较t检验进行统计学处理。计算公式如下：
肺指数(%)=[肺湿重(g) / 体重(g)] ×100%；
肺指数抑制率(%)=[模型对照组肺重(g)-给药组肺重(g)]/[模型对照组肺重(g)-正常对照组肺重(g)]×100%。
2.2对肺组织核酸病毒载量的影响
小鼠解剖后将肺组织分装置于-80℃低温冰箱中保存，检测时从-80℃低温冰箱中取出，置于含有裂解介质的裂解管中，加入1ml TRIzol Reagent，旋紧管盖，将裂解光置于震荡裂解仪上，震荡裂解20s后取下，室温孵育10min，4℃，12000rpm，离心10min；将澄清上清液移入新的1.5ml离心管中；加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，用力摇动离心管15s，室温孵育2-3min至液体分层；4℃，12000rpm，离心15min；将透明上清液小心移入新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min；4℃，12000rpm，离心10min；弃去上清，用1ml75%乙醇轻洗沉淀（使白色沉淀轻轻飘起）；4℃，7500rpm，离心5min；吸尽上清液，短暂干燥RNA沉淀5-10min；用30μl DEPC水溶解沉淀，﹣80℃低温冰箱保存。
检测前对样品的处理：将各样本稀释1000倍后再上机检测。
对照品核酸处理：DEPC-H2O作为阴性对照。阳性对照品进行10、100、1000倍梯度稀释。
试剂配制：取n×18µl IFVA核酸荧光PCR检测混合液，n×1µl内部对照品，与n×1µl RT-PCR酶（n为反应管数），振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。
加样：取上述混合液20µl置于PCR管中，然后将样品核酸提取液、DEPC-H2O、阳性对照品各5µl分别加入PCR管中，盖紧管盖，离心数秒使所有液体置于底部，立即进行PCR扩增反应。
循环参数设置为：45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为25µl。
2.3对肺组织中炎性因子的影响（Elisa法）
小鼠取肺组织称重后，收集小鼠肺组织，-4 ℃保存。称量50 mg肺组织加入500 μL生理盐水后，使用超声细胞破碎仪匀浆组织，使用低温高速离心机-4 ℃ 1000 g 离心10分钟。吸取上清液之后分装，保存于-80 ℃冰箱贮存备用。检测时按照试剂盒说明书操作，酶标仪450nm吸光度检测各指标。
2.5 统计方法
采用SPSS 22.0软件进行统计，组间比较采用对照t检验和单因素方差分析，以`x±s表示，采用独立样本t检验或单因素方差分析（ANOVA），然后进行Dunnet检验用于多重比较组间差异，以P<0.05表示统计结果差异具有统计学意义。
3 实验结果
表1 对流感病毒H1N1/FM1株感染小鼠肺炎模型的治疗作用
Figure DEST_PATH_IMAGE002
注：与正常组比较## P<0.01；与模型对照组比较，** P<0.01
表2 复方精油对甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺组织病毒载量的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE004
注：与正常对照组比较，## P < 0.01；与模型对照组比较，* P < 0.05，** P < 0.01。
表3 复方精油对甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺组织中炎性因子含量的影响(n=6)
Figure DEST_PATH_IMAGE006
注：与正常对照组比较，# P < 0.05，## P < 0.01；与疫毒袭肺模型组比较，* P <0.05，** P < 0.01。
4 结论
表1结果显示：采用甲型H1N1流感病毒FM1株病毒感染小鼠后，小鼠肺指数明显增高，与正常对照组比较有明显性差异（P<0.01）；感染当天开始给予复方精油治疗4天后，所试的中剂量组肺指数明显降低，与模型对照组比较均有明显性差异（P<0.01），其抑制率高达51.39%。
表2结果显示：正常对照组动物肺组织中无甲型H1N1流感病毒核酸表达；模型对照组小鼠肺组织中有显著核酸表达，与正常组对比有显著性差异（P<0.01）；复方精油三个剂量组均可显著降低肺组织中病毒核酸表达量，与模型组对比有显著性差异（P<0.01）。
表3结果显示：模型对照组小鼠肺组织中炎性因子MDA和TNF-a含量均显著增高，与正常对照组比较有显著性差异（P<0.01），小鼠肺组织中炎性因子IFN-α含量显著降低，与正常对照组比较有显著性差异（P<0.05）；复方精油小剂量组可显著降低肺组织中MDA含量，与模型对照组比较有显著性差异（P<0.05），复方精油三个剂量组可显著降低肺组织中TNF-α含量，与模型对照组比较有显著性差异（P<0.01）。
（二）复方精油对流感病毒H1N1/FM1株致小鼠死亡的保护作用
1.实验材料
1.1 动物及分组
选用SPF级ICR小鼠80只，雌雄各半，9-12周龄，体重13-15g，购于江西中医药大学实验动物科技中心[合格证号：SCXK（赣）2018-0003]。清洁级动物房饲养，统一光照时间为06:00～18:00，恒温，恒湿，自由饮水，饲固体饲料。适应性喂养3 d后用于实验。按随机数字表法分为以下4组，每组20只：
模型对照组
复方精油大、中、小三个剂量组
1.2 实验药物
复方精油由实施例1的方法制得。
1.3 主要试剂
Trizol Reagent购于Ambion by life technology（批号：257403）、InfluenzaVirus A Real Time RT-PCR Kit购于上海之江生物科技股份有限公司（批号：NOP20200101）、乙醚购于上海市鸿盛精细化工有限公司（批号：20181009）、小鼠α干扰素（IFN-α）酶联免疫分析购于上海酶联生物科技有限公司（批号：NO03/2019）、小鼠MDA酶联免疫分析购于上海酶联生物科技有限公司（批号：NO07/2020）、小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析购于美国bio-techne（批号：NO546999）。
1.4主要仪器
A2型生物安全柜（型号：Thermo MSC1.8），A2型生物安全柜（型号：Thermo MSC1.2）均购于美国Thermo公司，A2型生物安全柜（型号：Nuaire NU-425-400E）购于美国Nuaire，电子天平（型号：YP1002 MAX100g）购于上海越平科学仪器有限公司，电子分析天平（型号：Ltem-AR 1140 MAX110g）购于Ohaus Corp. Brock. WJ. USA，电子天平（型号：AL204）购于梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，Real-Time PCR Instrument（型号：QuantStudio 5）购于Applied biosystems，八连排管迷你离心机（型号：LX-300）购于Kylin-Bell LabInstruments，迷你涡旋振荡器（型号：QL-901）购于海门市其林贝尔仪器制造有限公司，低温高速离心机（型号Eppendorf-5810R）购于eppendorf，电子分析天平（型号：AR1140）购于Ohaus Corp.Brock.NJ.USA，多功能酶标仪（型号Enspire）购于PerkinElmer，超声细胞破碎仪（型号：SONIC RUPTOR 400）购于MONI homogenizer company，震荡裂解仪（型号：FastprepTM-24）购于MP Biomedicals，IVC小鼠饲养笼（型号：ZJ-4）购于苏州市冯氏实验动物设备有限公司。
2.实验方法
2.1病毒感染量的确定：取流感病毒H1N1/FM1株液20µl接种于装有10ml培养液瓶中，将瓶放入培养箱中，37℃培养24小时后，测定病毒滴度。然后将病毒液用生理盐水做10倍倍比稀释，共6个浓度梯度，用于感染小鼠，每个浓度10只，观察感染后2周内动物死亡情况，取死亡率为90~95%的浓度作为正式试验时动物的感染浓度。
2.2各组小鼠用乙醚轻度麻醉，以2个LD50流感病毒液（FM1株）滴鼻感染，每只30μl。感染当天开始给药，大、中、小剂量组每只每次滴鼻给药，给药剂量参见表4，每天1次，连续5天，模型对照组在同等条件下蒸馏水滴鼻。观察感染后2周内动物的死亡情况，计算死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率。结果采用组间比较卡方检验和t检验进行统计学处理。计算公式如下：
死亡率(%) =[死亡数/动物总数]×100%；
死亡保护率(%) =[(模型对照组死亡率-给药组死亡率)/模型对照组死亡率]×100%；
生命延长率(%) =[(给药组存活天数-模型对照组存活天数)/模型对照组存活天数]×100%。
2.3统计方法
采用SPSS 22.0软件进行统计，组间比较采用对照t检验和单因素方差分析，以`x±s表示，采用独立样本t检验或单因素方差分析（ANOVA），然后进行Dunnet检验用于多重比较组间差异，以P<0.05表示统计结果差异具有统计学意义。
3实验结果
表4 对流感病毒H1N1/FM1株感染小鼠肺炎模型的死亡保护作用
Figure DEST_PATH_IMAGE008
注：与模型对照组比较，**P<0.01，*P<0.05
4讨论
采用甲型H1N1流感病毒FM1株病毒感染小鼠2周内，模型对照组动物死亡率为95%，平均存活天数为8.15天；感染当天开始给予复方精油，连续5天，复方精油大剂量组小鼠死亡率显著性降低，与模型组比较有显著性差异（P<0.05）；复方精油三个剂量组均可以延长小鼠存活天数，与模型对照组比较均有明显性差异（P<0.05，P<0.01），生命延长率达到25.15%、20.24%和12.88%。
（三）混合精油治疗人冠状病毒229E病毒株感染小鼠的作用研究
1.实验材料
1.1 动物及分组
选用SPF级ICR小鼠50只，雌雄各半，9-12周龄，体重13-15g，购于江西中医药大学实验动物科技中心[合格证号：SCXK（赣）2018-0003]。清洁级动物房饲养，统一光照时间为06:00～18:00，恒温，恒湿，自由饮水，饲固体饲料。适应性喂养3 d后用于实验。按随机数字表法分为以下5组，每组10只：
正常对照组
模型对照组
复方精油大、中、小3个剂量组
1.2 实验药物
复方精油由实施例1的方法制得。
1.3 主要试剂
Trizol Reagent购于Ambion by life technology（批号：257403）、InfluenzaVirus A Real Time RT-PCR Kit购于上海之江生物科技股份有限公司（批号：NOP20200101）、乙醚购于上海市鸿盛精细化工有限公司（批号：20181009）、小鼠α干扰素（IFN-α）酶联免疫分析购于上海酶联生物科技有限公司（批号：NO03/2019）、小鼠MDA酶联免疫分析购于上海酶联生物科技有限公司（批号：NO07/2020）、小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析购于美国bio-techne（批号：NO546999）。
1.4主要仪器
A2型生物安全柜（型号：Thermo MSC1.8），A2型生物安全柜（型号：Thermo MSC1.2）均购于美国Thermo公司，A2型生物安全柜（型号：Nuaire NU-425-400E）购于美国Nuaire，电子天平（型号：YP1002 MAX100g）购于上海越平科学仪器有限公司，电子分析天平（型号：Ltem-AR 1140 MAX110g）购于Ohaus Corp. Brock. WJ. USA，电子天平（型号：AL204）购于梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，Real-Time PCR Instrument（型号：QuantStudio 5）购于Applied biosystems，八连排管迷你离心机（型号：LX-300）购于Kylin-Bell LabInstruments，迷你涡旋振荡器（型号：QL-901）购于海门市其林贝尔仪器制造有限公司，低温高速离心机（型号Eppendorf-5810R）购于eppendorf，电子分析天平（型号：AR1140）购于Ohaus Corp.Brock.NJ.USA，多功能酶标仪（型号Enspire）购于PerkinElmer，超声细胞破碎仪（型号：SONIC RUPTOR 400）购于MONI homogenizer company，震荡裂解仪（型号：FastprepTM-24）购于MP Biomedicals，IVC小鼠饲养笼（型号：ZJ-4）购于苏州市冯氏实验动物设备有限公司。
2.实验方法
2.1病毒传代
取已长成单层RAW264.7细胞的25 cm2培养瓶，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，加入hCoV-229E的病毒液200 ml，置37℃ 5% CO2培养箱中培，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，72-96h，直至80%细胞出现明显病变（CPE）后，将细胞培养瓶置于-80℃低温冰箱冻存，病毒液反复冻融3次后，用于检测病毒毒力。
2.2病毒滴度测定
取已长成单层RAW264.7细胞的培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，按10倍稀释接种不同滴度的hCoV-229E病毒液，10-1-10-8共8个稀释度，100ml/孔，每个浓度4个复孔，同时设正常细胞对照。置37 ℃ 5%CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，72-96h记录各孔的细胞病变情况。按Reed-Muench计算50%细胞病变浓度（TCID50）。计算公式如下：
肺指数(%)=[肺湿重(g) / 体重(g)] ×100%；
肺指数抑制率(%)=[模型对照组肺重(g)-给药组肺重(g)]/[模型对照组肺重(g)-正常对照组肺重(g)]×100%。
2.3模型建立及实验方法
取ICR小鼠180只，SPF级，体重13-15 g，雌雄各半，按体重等级随机分为正常组，hCoV-229E感染模型组（以下简称模型组），复方精油大、中、小剂量组，每组10只。除正常组外，其余小鼠用乙醚轻度麻醉后，以100 TCID50 hCoV-229E病毒液滴鼻感染，40 μL/只，在实验的第2天，重复感染1次。感染当天开始滴鼻给药，大、中、小剂量组每只每天滴鼻给药，给药剂量参见表5，每日1次，连续4天，正常组、模型组在同等情况下滴鼻给予生理盐水20μL/只。感染第5天称重后解剖进行检测。
2.4 统计方法
采用SPSS 22.0软件进行统计，组间比较采用对照t检验和单因素方差分析，以`x±s表示，采用独立样本t检验或单因素方差分析（ANOVA），然后进行Dunnet检验用于多重比较组间差异，以P<0.05表示统计结果差异具有统计学意义。
3 实验结果
表5 药物对人冠状病毒229E感染BALB/c小鼠肺炎模型的治疗作用
Figure DEST_PATH_IMAGE010
注：与正常组比较， ## P<0.01；与模型组比较，* P<0.05，** P<0.01。
4 结论
由表1可知，与正常组比较，模型组小鼠肺指数显著增加（P<0.01）；与模型组比较，复方精油在中、小剂量下可降低模型小鼠肺指数，有明显的统计学差异（P＜0.01，P＜0.05），且有较好的量效关系，肺指数抑制率分别为47.46%、44.17%。
结果显示：复方精油精油对人冠状病毒229E（hCoV-229E）感染ICR小鼠肺炎模型有明显的治疗作用。
实施例2
称取下述按重量份数计的原料：月桂精油18份、丁香精油18份、肉桂精油14份、石菖蒲精油6份、川芎精油6份、白芷精油6份、薄荷精油9份、佩兰精油8份、紫苏精油9份、香樟精油8份，将各精油混合均匀得到抗病毒复方精油。
实施例3
称取下述按重量份数计的原料：月桂精油15份、丁香精油15份、肉桂精油12份、石菖蒲精油6份、川芎精油6份、白芷精油6份、薄荷精油9份、佩兰精油6份、紫苏精油9份、香樟精油6份，将各精油混合均匀得到抗病毒复方精油。
实施例4
称取下述按重量份数计的原料：月桂精油15份、丁香精油15份、肉桂精油12份、石菖蒲精油8份、川芎精油8份、白芷精油8份、薄荷精油7份、佩兰精油6份、紫苏精油7份、香樟精油6份，将各精油混合均匀得到抗病毒复方精油。
实施例5
称取下述按重量份数计的原料：月桂精油20份、丁香精油20份、肉桂精油10份、石菖蒲精油5份、川芎精油5份、白芷精油5份、薄荷精油10份、佩兰精油10份、紫苏精油10份、香樟精油10份，将各精油混合均匀得到抗病毒复方精油。
实施例6
称取下述按重量份数计的原料：月桂精油10份、丁香精油10份、肉桂精油20份、石菖蒲精油10份、川芎精油10份、白芷精油10份、薄荷精油5份、佩兰精油5份、紫苏精油5份、香樟精油5份，将各精油混合均匀得到抗病毒复方精油。
对比例1
为了进一步说明本发明的有益效果，本对比例称取下述按重量份数计的原料：月桂精油18份、肉桂精油14份、石菖蒲精油7份、川芎精油7份、白芷精油7份、佩兰精油7份、香樟精油7份，将各精油混合均匀得到抗病毒复方精油。
对比例2
称取下述按重量份数计的原料：丁香精油18份、肉桂精油14份、石菖蒲精油7份、白芷精油7份、薄荷精油9份、佩兰精油7份、紫苏精油9份、香樟精油7份，将各精油混合均匀得到抗病毒复方精油。
对比例3
为了进一步说明本发明的有益效果，按照实施例1中的方法制得各中药的蒸馏液，将各蒸馏液作为原料，称取下述按重量份数计的原料：月桂蒸馏液18份、丁香蒸馏液18份、肉桂蒸馏液14份、石菖蒲蒸馏液7份、川芎蒸馏液7份、白芷蒸馏液7份、薄荷蒸馏液9份、佩兰蒸馏液7份、紫苏蒸馏液9份、香樟蒸馏液7份，将各蒸馏液混合均匀即得成品。
（四）各实施例和对比例对人冠状病毒229E感染BALB/c小鼠肺炎模型的治疗作用
为了进一步说明本发明的有益效果，按照实施例1的试验方法，对上述实施例2~6及对比例1~3所得产品的药效进行测试，测试结果如下表6~10所示。
表6 药物对流感病毒H1N1/FM1株感染小鼠肺炎模型的治疗作用
Figure DEST_PATH_IMAGE012
注：与正常组比较## P<0.01；与模型对照组比较，** P<0.01
表6的结果显示：感染当天开始给予复方精油治疗4天后，所试的实施例1~6的肺指数明显降低，与模型对照组比较均有明显性差异（P<0.01），其抑制率为46%以上。
表7药物对甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺组织病毒载量的影响
组别 药物来源 剂量（mg/kg/d） 动物数（只） 病毒载量（copies）
正常对照组 - - 10 阴性
模型对照组 - - 10 9.22±1.00×10<sup>10 ##</sup>
1 实施例1 10 10 3.47±0.12×10<sup>10 **</sup>
2 实施例2 10 10 3.56±0.25×10<sup>10 **</sup>
3 实施例3 10 10 3.64±0.15×10<sup>10 **</sup>
4 实施例4 10 10 3.48±0.18×10<sup>10 **</sup>
5 实施例5 10 10 4.12±0.26×10<sup>10 **</sup>
6 实施例6 10 10 4.32±0.24×10<sup>10 **</sup>
7 对比例1 10 10 4.94±0.36×10<sup>10 *</sup>
8 对比例2 10 10 4.75±0.50×10<sup>10 *</sup>
9 对比例3 10 10 5.18±0.58×10<sup>10 *</sup>
注：与正常对照组比较，## P < 0.01；与模型对照组比较，* P < 0.05，** P < 0.01。
表7结果显示：与模型对照组比较，实施例1~6的复方精油均可降低肺组织中病毒核酸表达量，且与模型组对比有显著性差异（P<0.01），其中，实施例1~4的复方精油的效果明显优于其它组药物更好。
表8 药物对甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺组织中炎性因子含量的影响(n=6)
Figure DEST_PATH_IMAGE014
注：与正常对照组比较，# P < 0.05，## P < 0.01；与疫毒袭肺模型组比较，* P <0.05，** P < 0.01。
表8结果显示：与模型对照组比较，实施例1~6的复方精油可显著降低肺组织中MDA含量、IFN-α含量及TNF-α含量，其中，实施例1~4的复方精油的效果明显优于其它组药物更好。
表9 药物对流感病毒H1N1/FM1株感染小鼠肺炎模型的死亡保护作用
Figure DEST_PATH_IMAGE016
注：与模型对照组比较，**P<0.01，*P<0.05
表9的结果显示：使用实施例1~6的复方精油，小鼠死亡率显著性降低，可以延长小鼠存活天数，与模型对照组比较均有明显性差异（P<0.05，P<0.01），其中，实施例1~4的复方精油的治疗效果明显好于其它组药物。
表10 药物对人冠状病毒229E感染BALB/c小鼠肺炎模型的治疗作用
Figure DEST_PATH_IMAGE018
注：与正常组比较， ## P<0.01；与模型组比较，* P<0.05，** P<0.01。
表10的结果显示：与模型组比较，实施例1~6复方精油均可降低模型小鼠肺指数，有明显的统计学差异（P＜0.01，P＜0.05），且有较好的量效关系，其中，实施例1~4的复方精油的治疗效果明显好于其它组药物。
分析上述实施例1、对比例1~3的结果可知，本发明实施例1复方精油采用了多种精油组分，各组分的有效成分不同，各精油组分之间协同增效，对人冠状病毒感染的多种疾病均有明显的治疗作用，其治疗效果明显好于对比例1~2所得药物。此外，在相同剂量下，本发明实施例1通过特定工艺提取得到的精油组分，纯度更高，对人冠状病毒感染的多种疾病的治疗效果明显好于对比例3所得药物。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗病毒复方精油，其特征在于，按重量份数计，包括如下原料：月桂精油10~20份、丁香精油10~20份、肉桂精油10~20份、石菖蒲精油5~10份、川芎精油5~10份、白芷精油5~10份、薄荷精油5~10份、佩兰精油5~10份、紫苏精油5~10份、香樟精油5~10份。
2.根据权利要求1所述的抗病毒复方精油，其特征在于，所述抗病毒复方精油，按重量份数计，包括如下原料：月桂精油15~18份、丁香精油15~18份、肉桂精油12~14份、石菖蒲精油6~8份、川芎精油6~8份、白芷精油6~8份、薄荷精油7~9份、佩兰精油6~8份、紫苏精油7~9份、香樟精油6~8份。
3.根据权利要求1所述的抗病毒复方精油，其特征在于，所述抗病毒复方精油为月桂精油、丁香精油、肉桂精油、石菖蒲精油、川芎精油、白芷精油、薄荷精油、佩兰精油、紫苏精油、香樟精油混合均匀而得到。
4.根据权利要求1所述的抗病毒复方精油，其特征在于，所述月桂精油、丁香精油、肉桂精油、石菖蒲精油、川芎精油、白芷精油、薄荷精油、佩兰精油、紫苏精油、香樟精油是分别选用月桂叶片、丁香花蕾、肉桂树皮、石菖蒲根茎、川芎根茎、白芷根、薄荷叶片、佩兰全草、紫苏叶片、香樟树皮原料依次洗净、超声辅助水蒸气蒸馏法提取而得到的。
5.根据权利要求4所述的抗病毒复方精油，其特征在于，所述月桂精油、丁香精油、薄荷精油、佩兰精油和紫苏精油分别采用下述方法制得：将原料洗净后干燥至水分不高于20%，粉碎至100~500目得到粉末，将得到的粉末加入3~6倍重量的水中，在功率300~500W、温度60~80℃下超声处理20~60min，再控温90~100℃水蒸气蒸馏3~6h，收集蒸馏液，待蒸馏液冷却至20~35℃后，将蒸馏液进行超临界二氧化碳萃取，萃取压力为15~18MPa，萃取时间为70~80min，萃取温度为45~55℃，二氧化碳的流速为20~40L/h。
6.根据权利要求4所述的抗病毒复方精油，其特征在于，所述肉桂精油和香樟精油分别为采用下述方法制得：将原料洗净后干燥至水分不高于15%，粉碎至50~200目得到粉末，将得到的粉末加入5~10倍重量的水中，然后在功率300~500W、温度70~90℃下超声处理1~2h，再控温100~110℃水蒸气蒸馏4~8h，收集蒸馏液，待蒸馏液冷却至20~35℃后，将蒸馏液进行超临界二氧化碳萃取，萃取压力为55~58MPa，萃取时间为60~70min，萃取温度为30~35℃，二氧化碳的流速为20~40L/h。
7.根据权利要求4所述的抗病毒复方精油，其特征在于，所述石菖蒲精油、川芎精油和白芷精油分别采用下述方法制得：将原料洗净后干燥至水分不高于20%，粉碎至50~200目得到粉末，将得到的粉末加入5~10倍重量的水中，然后在功率300~500W、温度60~80℃下超声处理30~60min，再控温95~105℃水蒸气蒸馏2~4h，收集蒸馏液，待蒸馏液冷却至20~35℃后，将蒸馏液进行超临界二氧化碳萃取，萃取压力为35~38MPa，萃取时间为60~120min、萃取温度为35~55℃，二氧化碳的流速为20~40L/h。
8.一种如权利要求1~7中任一项所述的抗病毒复方精油在制备抗病毒药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗病毒药物是由药学可接受的载体与所述抗病毒复方精油制备而成的剂型。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述剂型选自喷雾剂、气雾剂、滴鼻剂、凝胶剂、膏剂、贴剂、搽剂、酊剂、洗剂、涂膜剂和贴膏剂中的任意一种。
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